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Biochemistry

Purificazione delle proteine ubiquitinate p53 da cellule di mammifero

Published: March 21, 2022 doi: 10.3791/63602
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Translational Medicine, The Affiliated Zhangjiagang Hospital of Soochow University

Summary

Il protocollo descrive un metodo passo-passo per purificare le proteine ubiquitinate dalle cellule di mammifero usando la proteina oncosoppressore p53 come esempio. Le proteine p53 ubiquitinate sono state purificate dalle cellule in rigorose condizioni di non denaturazione e denaturazione.

Abstract

L'ubiquitinazione è un tipo di modificazione post-traduzionale che regola non solo la stabilità, ma anche la localizzazione e la funzione di una proteina substrato. Il processo di ubiquitinazione avviene intracellulare negli eucarioti e regola quasi tutti i processi biologici cellulari di base. La purificazione delle proteine ubiquitinate aiuta lo studio del ruolo dell'ubiquitinazione nel controllo della funzione delle proteine substrato. Qui, una procedura passo-passo per purificare le proteine ubiquitinate nelle cellule di mammifero è descritta con la proteina oncosoppressore p53 come esempio. Le proteine p53 ubiquitinate sono state purificate in rigorose condizioni di non denaturazione e denaturazione. La proteina p53 cellulare totale Flag-tagged è stata purificata con agarosio coniugato con anticorpi anti-Flag in condizioni non denaturanti. In alternativa, la proteina ubiquitinata cellulare totale marcata con His-è stata purificata utilizzando resina carica di nichel in condizioni di denaturazione. Le proteine p53 ubiquitinate negli eluati sono state rilevate con successo con anticorpi specifici. Utilizzando questa procedura, le forme ubiquitinate di una data proteina possono essere efficacemente purificate dalle cellule di mammifero, facilitando gli studi sui ruoli dell'ubiquitinazione nella regolazione della funzione proteica.

Introduction

L'ubiquitina è una proteina evolutivamente conservata di 76 aminoacidi 1,2,3. L'ubiquitina lega covalentemente i residui di lisina sulle proteine bersaglio attraverso cascate che coinvolgono gli enzimi attivanti (E1), coniuganti (E2) e ligasi (E3). L'ubiquitina viene prima attivata dall'enzima E1 e quindi trasferita agli enzimi coniuganti E2. Successivamente, le ubiquitina ligasi E3 interagiscono sia con gli enzimi E2 caricati con ubiquitina che con le proteine del substrato e mediano la formazione di un legame isopeptidico tra il C-terminale dell'ubiquitina e un residuo di lisina nel substrato 1,2,3,4,5. L'ubiquitinazione comporta l'attaccamento delle frazioni di ubiquitina ai residui di lisina sulle proteine del substrato o a se stessa, portando alla monoubiquitinazione o alla poliubiquitinazione delle proteine. Questo processo di ubiquitinazione avviene intracellulare negli eucarioti e regola una grande varietà di processi biologici. L'ubiquitinazione provoca la degradazione delle proteine del substrato attraverso il sistema ubiquitina-proteasoma 1,2,3,4,5. Inoltre, l'ubiquitinazione modula la localizzazione subcellulare delle proteine, la formazione di complessi proteici e il traffico proteico nelle cellule 3,5. Le frazioni di ubiquitina legate alle proteine del substrato possono essere rimosse dagli enzimi deubiquitinanti (DUB)6,7. In particolare, i diversi modi in cui le catene di ubiquitina sono assemblate forniscono una miriade di mezzi per regolare vari processi biologici 1,5. I ruoli esatti dell'ubiquitinazione nella regolazione della funzione proteica del substrato rimangono incompletamente compresi fino ad ora. La purificazione delle proteine ubiquitinate contribuisce alla spiegazione degli effetti dell'ubiquitinazione delle proteine su una varietà di processi cellulari.

La proteina p53 è una delle più importanti proteine oncosoppressori e presenta mutazioni genetiche o inattivazione in quasi tutti i tumori umani 8,9,10,11. La stabilità e l'attività di p53 sono delicatamente regolate in vivo da modificazioni post-traduzionali, tra cui ubiquitinazione, fosforilazione, acetilazione e metilazione12,13. La proteina p53 ha una breve emivita che va da 6 min a 40 min in varie cellule, che deriva principalmente dalla sua poliubiquitinazione e successiva degradazione proteasomica10,12. Il doppio minuto 2 del topo (Mdm2) è una ubiquitina ligasi E3 di p53 che si lega al N-terminale di p53 per inibire la sua attività trascrizionale12,14,15. Mdm2 promuove la poliubiquitinazione e la degradazione proteasomica di p53 per controllarne la stabilità e induce la monoubiquitinazione di p53 per facilitare la sua esportazione nucleare12,14,15,16. Qui, l'ubiquitinazione di p53 mediata da Mdm2 viene utilizzata come esempio per introdurre in dettaglio un metodo per la purificazione delle proteine ubiquitinate dalle cellule di mammifero. I regolatori che influenzano lo stato di ubiquitinazione delle proteine bersaglio possono essere identificati utilizzando questo test di ubiquitinazione in vivo quando sono sovraespressi o abbattuti / eliminati nelle cellule di mammifero. Inoltre, le proteine ubiquitinate possono essere utilizzate come substrati per il saggio di deubiquitinazione in vitro. È possibile eseguire uno screening ad alto rendimento per identificare DUB specifici per le proteine bersaglio incubando substrati ubiquitinati con singoli DUB. Le proteine ubiquitinate possono agire come un'impalcatura per reclutare proteine di segnalazione a valle nelle cellule. Un complesso proteico bersaglio ubiquitinata può essere purificato mediante immunoprecipitazione sequenziale in condizioni di purificazione native e identificato mediante spettrometria di massa. L'attuale protocollo può essere ampiamente utilizzato per studiare le proteine cellulari regolate dall'ubiquitinazione.

Sono stati stabiliti diversi metodi per purificare le proteine ubiquitinate, che includono l'uso di ubiquitina marcata per affinità, anticorpi ubiquitina, proteine leganti l'ubiquitina e domini isolati leganti l'ubiquitina (UBD)17. Qui, forniamo un protocollo che utilizza ubiquitina marcata di affinità come mediatore per purificare le proteine ubiquitinate nelle cellule di mammifero. L'uso di ubiquitina poli-His-marcata offre vantaggi rispetto agli altri metodi. Le proteine ubiquitinate vengono purificate in presenza di forti denaturanti, che riducono il legame non specifico alla resina carica di nichel linearizzando le proteine cellulari e interrompendo le interazioni proteina-proteina. Al contrario, l'uso di anticorpi ubiquitina, proteine leganti l'ubiquitina e UBD isolati come mediatori non può escludere efficacemente i partner leganti dalla proteina bersaglio perché la purificazione deve essere eseguita in condizioni meno rigorose. Inoltre, la purificazione può anche portare ad un maggiore legame di proteine non correlate usando questi mediatori. Inoltre, vi è una propensione al legame per vari tipi di legame dell'ubiquitina e per la mono- e poli-ubiquitinazione da parte di proteine leganti l'ubiquitina o UBD isolate17. L'uso di ubiquitina poli-His-marcata contribuisce ad abbattere tutte le proteine ubiquitinate cellulari. In alternativa, l'uso di agarosio coniugato con anticorpi anti-Flag o anti-HA disponibili in commercio rende più facile immunoprecipitare proteine bersaglio marcate con Flag o HA su larga scala in condizioni non denaturanti. Una seconda fase di purificazione, ad esempio, mediante resina carica di nichel mirata all'ubiquitina poli-His-marcata, può essere utilizzata per acquisire proteine bersaglio ubiquitinate con un'elevata purezza per esperimenti a valle. In particolare, una strategia di purificazione dell'epitopo può essere adattata quando un anticorpo specifico non può essere acquisito per immunoprecipitare efficacemente le proteine bersaglio. Infine, la purificazione delle proteine ubiquitinate nelle cellule di mammifero, rispetto alla purificazione in vitro, mantiene la modalità di legame ubiquitina delle proteine bersaglio in condizioni più fisiologiche.

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Protocol

NOTA: Le cellule H1299 sono state gentilmente fornite dalla Banca delle cellule staminali, Accademia cinese delle scienze e si sono dimostrate negative per la contaminazione da micoplasma.

1. Coltura cellulare

  1. Per la coltura iniziale, posizionare 1 x 106 cellule della linea cellulare di adenocarcinoma polmonare umano, H1299 in una capsula di Petri da 10 cm con 10-12 ml di terreno RPMI 1640 integrato con siero bovino fetale (FBS) al 1%, additivo glutamminico all'1%, piruvato di sodio all'1% e antibiotici (100 U/mL di penicillina e 100 μg/ml di streptomicina). Mantenere le celle a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO2. Dividere le celle ogni 2-3 giorni a seconda di quando raggiungono l'80% -90% di confluenza.
  2. Un giorno prima della trasfezione, preparare 6-9 x 10 6 celle per tre piastre di Petri e placcare 2-3 x 106 celle in un'unica capsula di Petri da 10 cm contenente 10-12 ml di terreno per ottenere una confluenza del 70%-90% durante la trasfezione.
    NOTA: Le cellule HEK293T possono anche essere utilizzate per purificare le proteine ubiquitinate grazie alla loro elevata efficienza di trasfezione e al livello di espressione proteica.

2. Trasfezione plasmidica

  1. Aggiungere 1,5 mL di mezzo sierico ridotto in tre provette da centrifuga da 15 ml.
  2. Aggiungere DNA plasmidico pronto per la trasfezione a ciascuna provetta per effettuare diluizioni come segue. Tubo 1: 1 μg di plasmide Flag-p53, 12 μg di vettore vuoto; Tubo 2: 1 μg di plasmide Flag-p53, 3 μg di plasmide His-HA-Ub (HH-Ub) e 9 μg di vettore vuoto; Tubo 3: 1 μg di plasmide Flag-p53, 3 μg di plasmide HH-Ub e 9 μg di plasmide Mdm2. Aggiungere un totale di 0,2 μg di plasmide di proteina fluorescente verde (GFP) a ciascun tubo per monitorare l'efficienza di trasfezione.
    NOTA: È necessario eseguire un esperimento pilota per determinare le quantità ottimali di plasmidi necessarie per ottenere un'espressione efficiente delle proteine bersaglio nelle cellule.
  3. Aggiungere 78 μL di reagente di trasfezione liposomica a 4,5 ml di mezzo sierico ridotto in un'altra provetta da centrifuga per diluire i liposomi. Mescolare accuratamente facendo scorrere il tubo e lasciare riposare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
  4. Aggiungere 1,5 mL della soluzione liposomica diluita in ciascuna provetta del punto 2.2 contenente 1,5 mL della soluzione di DNA diluito. Mescolare accuratamente e reticolare i plasmidi con i liposomi per almeno 20 minuti a RT. Utilizzare un rapporto plasmide DNA: liposoma di 1: 2 (μg: μL) per ogni trasfezione.
  5. Scartare il mezzo originale dalle piastre di Petri e aggiungere 9 ml di terreno sierico ridotto in ogni piatto. Aggiungere 3 ml della miscela liposoma-DNA a ciascun piatto e mescolare la soluzione agitando delicatamente la piastra avanti e indietro 3x, quindi a sinistra e a destra 3x per una distribuzione uniforme della miscela nella piastra.
  6. Coltura delle cellule in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2. Sostituire il mezzo dopo 4-6 ore e continuare a coltivare le cellule per 24-36 ore.

3. Raccolta delle cellule

  1. Dopo 24-36 ore, trattare le cellule con MG132 ad una concentrazione finale di 10 μM per 4-6 ore.
    NOTA: MG132 è un'aldeide peptidica che blocca efficacemente l'attività proteolitica del complesso proteasoma 26S. La quantità di proteine ubiquitinate con catene di poliubiquitina legate alla lisina-48 (K48) può essere aumentata dopo che le cellule sono state trattate con MG132 o altri inibitori del proteasoma.
  2. Scartare il terreno, lavare le cellule 2 volte (facendo attenzione a non lavare le cellule) con soluzione salina tamponata fosfato ghiacciata (PBS) e aspirare le cellule con pipet sierologici.
  3. Aggiungere 1 mL di PBS al piatto, rimuovere le cellule raschiando con un raschietto pulito e trasferire la sospensione cellulare in provette di microcentrifuga. Centrifugare a 700 x g per 5 minuti per raccogliere i pellet cellulari.

4. Purificazione di proteine ubiquitinate in condizioni di non denaturazione

  1. Preparare il tampone di lisi Flag (50 mM Tris-HCl (pH 7,9), 137 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM acido etilendiammiamminotetraacetico (EDTA), 1% Triton X-100, 0,2% sarkosyl e 10% glicerolo) appena integrato con cocktail inibitore della proteasi prima dell'uso.
  2. Aggiungere 800 μL di tampone di lisi Flag ghiacciato alle celle di ciascuna provetta, mescolare le celle usando un oscillatore a vortice o una pistola per pipette, quindi incubare la miscela su un rotatore a 4 °C per 30 minuti.
  3. Sottoporre la miscela a 5-10 brevi impulsi di ultrasuoni. Eseguire l'ultrasonicazione sul ghiaccio ad una frequenza di sonicazione di 20 kHZ e 80% di ampiezza con ogni impulso della durata di 1 s. Incubare la miscela su un rotatore a 40 giri al minuto (rpm) a 4 °C per 30 minuti.
  4. Centrifugare i campioni ultrasonicati a 8.000 x g per 20-30 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga.
  5. Aliquot 80 μL (1/10) dell'estratto cellulare e miscelare con 20 μL di tampone di carico 5x sodio dodecilsolfato (SDS). Far bollire i campioni a 98 °C per 5 minuti, raffreddare su ghiaccio per 2 minuti e conservare a -20 °C fino all'uso. Utilizzare questi campioni come gruppo di input per monitorare l'espressione proteica.
  6. Aggiungere 30 μL di perle anticorpo-coniugate anti-Flag M2 (Flag/M2) agli estratti cellulari rimanenti e incubare su un rotatore a 4 °C per almeno 4 ore o per tutta la notte.
  7. Centrifugare a 1.500 x g per 2 minuti a 4 °C per raccogliere le perle. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi Flag ghiacciato alle perle e mescolare capovolgendo il tubo più volte.
  8. Centrifugare a 1.500 x g per 2 minuti a 4 °C per raccogliere le perle. Ripetere il passaggio 4.7 per 4-6 volte.
  9. Aggiungere 40 μL di peptidi Flag ad una concentrazione finale di 200 ng/μL alle sfere e incubare su un rotatore a 4 °C per 2 ore per eluire le proteine legate.
  10. Centrifugare a 1.500 x g per 5 minuti a 4 °C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga.
  11. Aggiungere 10 μL di tampone di carico 5x SDS, far bollire la miscela a 98 °C per 5 minuti, raffreddare su ghiaccio per 2 minuti e conservare a -20 °C per il Western blotting. In alternativa, conservare l'eluato dal punto 4.10 direttamente a -80 °C per altri esperimenti a valle.
    NOTA: La quantità di proteine ubiquitinate purificate può essere aumentata aumentando il numero di cellule e la quantità di plasmidi trasfettati. Una strategia di marcatura degli epitopi può essere adattata per purificare i complessi cellulari che si legano specificamente a p53 ubiquitinata in condizioni di purificazione native. Co-esprimendo Flag-p53, mdm2 e HA-ubiquitina, il complesso proteico p53 ubiquitinata può essere immunoprecipitato mediante agarosio sequenziale coniugato con anticorpi Flag e HA da cellule di mammifero. Per mantenere i partner leganti delle proteine p53 ubiquitinate, durante il processo di purificazione deve essere utilizzato il tampone di lisi BC100 meno rigoroso (20 mM Tris-HCl (pH 7,9), 100 mM NaCl, 10% glicerolo, 0,2 mM EDTA, 0,2% Triton X-100 e 1x inibitore della proteasi). L'eluato del peptide HA viene sottoposto a spettrometria di massa per identificare tutti i partner che si legano specificamente a p53 ubiquitinata.

5. Purificazione delle proteine ubiquitinate in condizioni di denaturazione

  1. Aggiungere 1 mL di PBS ghiacciato ai pellet cellulari ottenuti al punto 3.3 e mescolare uniformemente. Aliquot 100 μL (1/10 di volume) della sospensione cellulare in una provetta di microcentrifuga come campione di ingresso.
  2. Centrifugare a 700 x g per 5 minuti a 4 °C per raccogliere i pellet cellulari. Aggiungere 80 μL di tampone di lisi Flag al campione di ingresso, mescolare le celle usando un oscillatore a vortice o una pistola per pipette e lisare le celle sul ghiaccio per 1 ora.
  3. Centrifugare a 8.000 x g per 20-30 minuti a 4 °C. Aliquot 80 μL del surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga.
  4. Aggiungere 20 μL di 5x tampone di carico SDS al surnatante, far bollire a 98 °C per 5-10 minuti, raffreddare su ghiaccio per 2 minuti e conservare a -20 °C fino all'uso.
  5. Centrifugare i restanti 900 μL della sospensione cellulare a 700 x g per 5 minuti a 4 °C per raccogliere il pellet cellulare. Aggiungere 1 mL di ubiquitina tampone 1 (tampone UB 1; 6 M guanidina-HCI, 0,1 M Na 2 HPO 4, 6,8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) e0,2% Triton X-100, appena integrato con 10 mM β-mercaptoetanolo e 5 mM imidazolo) ai pellet cellulari e mescolare più volte pipettando su e giù per distribuire uniformemente le cellule.
    NOTA: La concentrazione di imidazolo può variare da 5 mM a 20 mM per ridurre il legame proteico non specifico sulla resina carica di nichel. Il tampone di ubiquitina contiene guanidina cloridrato, che inattiva sia le ligasi che i DUB. β-mercaptoetanolo è un liquido chiaro e incolore con un odore forte e sgradevole simile alle uova marce. Una soluzione ad alta concentrazione causerà gravi danni alla mucosa, al tratto respiratorio superiore, alla pelle e agli occhi. Indossare guanti e occhiali e operare nella cappa aspirante.
  6. Sottoporre i lisati cellulari a 10-20 cicli di ultrasuoni fino a quando la soluzione non è più viscosa. Eseguire l'ultrasonicazione sul ghiaccio ad una frequenza di sonicazione di 20 kHZ e 80% di ampiezza con ogni impulso della durata di 1 s. Centrifugare a 8.000 x g per 20-30 minuti a RT e trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga.
  7. Aggiungere 30 μL di resina carica di nichel al surnatante e incubare su un rotatore impostato a 15 giri / min per 4 ore o durante la notte a RT. Centrifugare a 1.500 x g per 2 minuti a RT per raccogliere le perle.
  8. Aggiungere 1 mL di tampone UB 1, incubare con rotazione in uno shaker per 10 minuti a RT e centrifugare a 1.500 x g per 2 minuti a RT per raccogliere le perle.
  9. Aggiungere 1 mL di ubiquitina tampone 2 (tampone UB 2; 8 M urea, 0,1 M Na 2 HPO 4, 6,8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) e 0,2% Triton X-100) alle perle, incubare con rotazione in uno shaker per 10 minuti a RT e centrifugare a 1.500 x g per2minuti per raccogliere le perle. Ripeti ancora una volta.
  10. Alle perle, aggiungere 1 mL di PBS, incubare con rotazione in uno shaker per 10 minuti a RT e centrifugare a 1.500 x g per 2 minuti a RT per raccogliere le perle. Ripeti ancora una volta.
  11. Eluire le proteine legate incubando le perle con 40 μL di imidazolo ad una concentrazione finale di 0,5 M per 1 ora a RT. Centrifugare a 1.500 x g per 2 minuti a RT.
  12. Trasferire il surnatante in una provetta di microcentrifuga pulita, aggiungere 10 μL di tampone di carico 5x SDS, far bollire a 98 °C per 5 minuti, raffreddare su ghiaccio per 2 minuti e conservare a -20 °C per il Western blotting. In alternativa, conservare l'eluato non trattato a -80 °C per altri esperimenti a valle.

6. Individuazione di proteine ubiquitinate purificate mediante Western blotting

  1. Risolvere i campioni dei punti 4.11 e 5.12 mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide dodecilsolfato di sodio (SDS-PAGE), quindi trasferirli su una membrana di nitrocellulosa mediante Western blotting per rilevare le proteine bersaglio utilizzando gli anticorpi corrispondenti come descritto18.
  2. In breve, incubare la membrana immergendola in 20 mL di soluzione bloccante contenente il 5% di latte defat in polvere in tampone TBST (15 mM Tris-HCI; pH = 7,6, 4,6 mM Tris-base, 150 mM NaCI, appena integrato con 0,1% Tween-20 prima dell'uso) a RT per 1 ora. Quindi, incubare la membrana con anticorpi primari a RT per 2 ore o durante la notte a 4 °C. Utilizzare i seguenti anticorpi per ogni set. Tutti gli anticorpi primari sono stati utilizzati ad una diluizione di 1:1000.
    1. Rilevare la proteina p53 totale, inclusa p53 ubiquitinata, con un anticorpo monoclonale anti-p53 dopo immunoprecipitazione con perle di agarosio Flag/M2.
    2. Rilevare le proteine p53 ubiquitinate con un anticorpo anti-HA o anticorpo anti-ubiquitina dopo immunoprecipitazione con perle di agarosio Flag/M2.
    3. Rileva le proteine p53 ubiquitinate con un anticorpo monoclonale anti-p53 dopo il pulldown della resina carica di nichel.
    4. Rilevare la proteina ubiquitinata totale con un anticorpo anti-HA o anticorpo anti-ubiquitina dopo il pulldown della resina carica di nichel.
  3. Incubare la membrana con anticorpi secondari coniugati con perossidasi di rafano (HRP) a RT per 1 ora dopo aver lavato 3 volte con tampone TBST per 5 minuti ciascuno. Tutti gli anticorpi secondari sono stati utilizzati ad una diluizione di 1:3000. Quindi, lavare la membrana con tampone TBST 3x per 5 minuti ciascuno con delicata agitazione.
  4. Avviare il sistema di imaging a chemiluminescenza per rilevare i segnali dal Western blotting. Preparare la soluzione di substrato per HRP miscelando le soluzioni A e B in un rapporto di 1:1.
  5. Posizionare la membrana di nitrocellulosa nella camera oscura a faccia in su e rivestire uniformemente la soluzione del substrato sulla membrana usando una pistola pipettaggio. Selezionare la procedura di esposizione automatica per acquisire i segnali chemiluminescenti e regolare manualmente il tempo di esposizione fino a quando non viene acquisito un segnale ideale.

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Representative Results

Il diagramma schematico mostra le proteine p53 marcate con bandiera (Flag-p53) e ubiquitina (HH-Ub) con doppia marcatura His/HA (Figura 1A). Le procedure utilizzate per purificare le proteine ubiquitinate sono riassunte nella Figura 1B. L'ubiquitina Poly-His-taggata può essere legata alle proteine bersaglio nelle cellule di mammifero. Le proteine ubiquitinate possono essere purificate con sfere Flag/M2 in condizioni di non denaturazione o mediante cromatografia di affinità di ioni metallici immobilizzati (IMAC) in condizioni di denaturazione (Figura 1B). La proteina p53 totale, inclusa la p53 ubiquitinata, è stata immunoprecipitata con perline Flag/M2 da cellule H1299 in condizioni non denaturanti. Il segnale della proteina p53 ubiquitinata, che appare come una banda spalmata da basso ad alto peso molecolare, è stato marcatamente aumentato quando Mdm2 è stato espresso ectopicamente in queste cellule, suggerendo che la proteina p53 ubiquitinata è stata efficacemente purificata dalle cellule (Figura 2). Successivamente, le cellule sono state lisate in condizioni di denaturazione e la proteina ubiquitinata cellulare totale è stata tirata giù con resina carica di nichel. La proteina cellulare totale è stata rilevata mediante Western blotting utilizzando un anticorpo monoclonale anti-HA e la proteina p53 ubiquitinata è stata rilevata utilizzando un anticorpo monoclonale anti-p53. I risultati hanno mostrato che il livello totale di proteina ubiquitinata era invariato, ma il livello di proteina p53 ubiquitinata era drammaticamente aumentato dopo che Mdm2 era sovraespresso in queste cellule. Questi risultati hanno indicato che le proteine ubiquitina totali contenenti p53 ubiquitinata sono state effettivamente estratte dai lisati cellulari in condizioni di denaturazione (Figura 3).

Figure 1
Figura 1: Una sintesi delle procedure utilizzate per purificare le proteine ubiquitinate . (A) Diagramma schematico delle proteine p53 marcate con bandiera (Flag-p53) e ubiquitina (HH-Ub) con doppia marcatura His/HA. (B) Le proteine ubiquitinate possono essere purificate con sfere Flag/M2 in condizioni di non denaturazione e mediante IMAC in condizioni di denaturazione. Abbreviazioni: His/HA = poliistidina/emoagglutinina; Ub = ubiquitina; Perle bandiera/M2 = perline coniugate con anticorpi M2 anti-bandiera; IMAC = cromatografia di affinità di ioni metallici immobilizzata. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Le proteine p53 ubiquitinate sono state purificate in condizioni di non denaturazione. Il plasmide di espressione Flag-p53 è stato trasfettato da solo, con HH-Ub, o con Mdm2 e HH-Ub in cellule H1299. Le proteine p53 totali e le forme ubiquitinate sono state immunoprecipitate da perle Flag/M2 da estratti cellulari. L'eluato è stato sottoposto a Western blotting con anticorpi monoclonali anti-p53 (A) e anti-HA (B). (C) Gli estratti di cellule grezze (Input) sono stati sottoposti a Western blotting con anticorpi monoclonali anti-p53 e anti-Mdm2. GFP è stato utilizzato come controllo del carico. Abbreviazioni: HH-Ub = His/HA double-tagged ubiquitin; HA = emoagglutinina; Perle bandiera/M2 = perline coniugate con anticorpi M2 anti-bandiera; GFP = proteina fluorescente verde. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Le proteine p53 ubiquitinate sono state purificate in condizioni di denaturazione. Il plasmide di espressione Flag-p53 è stato trasfettato da solo, con HH-Ub, o con Mdm2 e HH-Ub in cellule H1299. Le proteine ubiquitinate cellulari totali sono state abbattute con resina carica di nichel e sono state quindi sottoposte a Western blotting con anticorpi monoclonali anti-p53 e anti-HA. (A) La proteina p53 ubiquitinata è stata rilevata utilizzando un anticorpo anti-p53. (B) La proteina ubiquitinata totale è stata rilevata utilizzando un anticorpo anti-HA. (C) Gli estratti di cellule grezze (Input) sono stati sottoposti a Western blotting con anticorpi monoclonali anti-p53 e anti-Mdm2. GFP è stato utilizzato come controllo del carico. Abbreviazioni: HH-Ub = His/HA double-tagged ubiquitin; HA = emoagglutinina; GFP = proteina fluorescente verde. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

L'ubiquitinazione svolge un ruolo critico in quasi tutti i processi cellulari fisiologici e patologici2. Negli ultimi anni, sono stati fatti grandi progressi nella comprensione del ruolo molecolare dell'ubiquitina nelle vie di segnalazione e di come i cambiamenti nel sistema dell'ubiquitina portino a diverse malattie umane2. La purificazione delle proteine ubiquitinate contribuisce a fornire informazioni sui ruoli esatti dell'ubiquitinazione in questi processi. Le miscele di proteine coniugate con ubiquitina possono essere purificate dalle cellule in condizioni di non denaturazione e denaturazione. IMAC utilizzando resine di nichel può essere utilizzato per purificare le proteine poli-His-marcate in condizioni di denaturazione. L'obiettivo di purificare le proteine ubiquitinate in condizioni di denaturazione è quello di scartare i partner di interazione dalle proteine bersaglio. Tutti i componenti cellulari che si legano alle proteine bersaglio saranno eliminati dall'eluizione in condizioni di denaturazione. Al contrario, alcune proteine cellulari che si legano alle proteine bersaglio possono essere mantenute nell'eluizione in condizioni native, il che può interferire con gli esperimenti a valle. Le proteine ubiquitinate possono essere purificate anche in presenza di forti denaturanti, il che riduce notevolmente il legame proteico non specifico alle resine di nichel. Al contrario, le proteine bersaglio totali, comprese le loro forme ubiquitinate, possono essere purificate mediante strategie di marcatura degli epitopi utilizzando perle di agarosio coniugate con anticorpi in condizioni non denaturanti. Le proteine sono state purificate in condizioni meno rigorose perché durante questo processo è stata utilizzata la purificazione di affinità mediata da anticorpi. Le proteine bersaglio e le loro forme ubiquitinate sono state rilevate con anticorpi specifici per proteine o ubiquitina. Le proteine marcate con HA e Myc possono essere convenientemente purificate utilizzando la stessa procedura con perle di agarosio coniugate con anticorpi. In particolare, è più facile rilevare proteine con catene monoubiquitine singole o multiple rispetto a quelle con catene di poliubiquitina con anticorpi specifici per proteine. Al contrario, le proteine con catene di poliubiquitina possono essere più facilmente riconosciute dagli anticorpi specifici dell'ubiquitina.

Per purificare efficacemente le proteine ubiquitinate, il livello di espressione delle proteine bersaglio dovrebbe essere elevato nelle cellule di mammifero. I vettori di espressione con forti promotori del CMV possono essere utilizzati per raggiungere alti livelli di espressione proteica nelle cellule. Inoltre, l'ubiquitina ligasi E3 e l'ubiquitina possono essere co-espresse con le proteine bersaglio. Aggiungerà ubiquitina in modo più efficace alle proteine. L'attività del proteasoma 26S può essere bloccata dall'inibitore di piccole molecole per accumulare proteine ubiquitinate nelle cellule. Per rendere le proteine ubiquitinate efficacemente legate alla resina, gli estratti cellulari dovrebbero essere brevemente sonicati per interrompere il complesso del DNA per rendere la soluzione non viscosa. Per ridurre il legame non specifico, una bassa concentrazione di imidazolo deve essere aggiunta al tampone di lisi in condizioni di denaturazione. Le proteine ubiquitinate ad altissimo peso molecolare sono più facili da legare con la resina dopo la procedura di denaturazione e ripiegatura. Al fine di aumentare l'efficienza dell'eluizione, provare a utilizzare una maggiore concentrazione di imidazolo. Se le efficienze dell'eluizione fossero ancora estremamente basse, provare a eluire le proteine ubiquitinate facendo bollire direttamente nel tampone di carico SDS Laemml. La maggior parte delle proteine ubiquitinate legate alla resina possono essere eluite in questo forte tampone denaturante. Per ottenere una maggiore purezza delle proteine ubiquitinate, è possibile adattare una purificazione di affinità in due fasi. Dopo l'immunoprecipitazione Flag/M2 in condizioni non denaturanti, una seconda fase di purificazione con resina carica di nichel può essere utilizzata per abbattere la proteina ubiquitinata marcata con His-ed eliminare i substrati non ubiquitinati. Al contrario, dopo il pull-down della resina carica di nichel in condizioni di denaturazione, una seconda fase di purificazione dell'affinità può essere adattata per immunoprecipitare le proteine bersaglio utilizzando la strategia di marcatura dell'epitopo mediante perle di agarosio coniugate anti-Flag o anti-HA.

Abbiamo usato immunoblotting più sensibile invece della colorazione dell'argento o della colorazione di Coomassie per rilevare le proteine ubiquitinate perché abbiamo eseguito una piccola scala di purificazione in questo studio. Infatti, sebbene alcune proteine cellulari siano facilmente ubiquitinate nelle cellule, solo una piccola parte delle proteine può essere legata con porzioni ubiquitina. Per rilevare con successo queste proteine mediante colorazione dell'argento o colorazione di Coomassie, è necessario eseguire una purificazione su larga scala. Per aumentare la purezza delle proteine ubiquitinate, dovrebbe essere eseguita anche una seconda fase di purificazione dell'affinità. Non abbiamo eseguito questi esperimenti perché le proteine ubiquitinate purificate attraverso questo protocollo soddisfano completamente il requisito delle analisi a valle. Ad esempio, al fine di identificare DUB specifici per una proteina bersaglio regolata dall'ubiquitinazione, abbiamo bisogno di purificare una grande quantità di proteine bersaglio ubiquitinate. Queste proteine possono essere incubate con singoli DUB purificati da cellule di mammifero in un tampone di deubiquitinazione. Con questo screening in vitro ad alto rendimento, possiamo identificare i DUB specifici per una proteina bersaglio nelle cellule di mammifero.

Ci sono diverse limitazioni della tecnica. Le proteine ubiquitinate rappresentano una parte molto piccola delle proteine bersaglio, è difficile purificare una grande quantità di proteine bersaglio ubiquitinate. Cerca di aumentare l'espressione proteica nelle cellule per ottenere un'elevata efficienza di purificazione. Un'alternativa è quella di eseguire una reazione di ubiquitinazione in vitro per acquisire più proteine ubiquitinate. Alcune proteine sono difficili da esprimere nelle cellule dei mammiferi, il che pone un'altra limitazione alla purificazione di quantità più elevate di proteine ubiquitinate. Infine, l'attuale protocollo si limita alla purificazione delle proteine marcate che sono sovraespresse utilizzando il DNA plasmide. I livelli di espressione delle proteine bersaglio sono superiori a quelli delle proteine bersaglio endogene. Per valutare lo stato di ubiquitinazione endogena di una proteina bersaglio, le proteine con le loro forme ubiquitinate possono essere direttamente immunoprecipitate da anticorpi specifici della proteina bersaglio dalle cellule. Gli anticorpi anti-ubiquitina possono essere utilizzati per determinare lo stato di ubiquitinazione della proteina bersaglio. Tuttavia, in alcune circostanze, il livello di espressione inferiore, il livello di ubiquitinazione inferiore della proteina bersaglio o la minore efficienza di immunoprecipitazione di anticorpi specifici possono limitare la rilevazione dello stato di ubiquitinazione delle proteine bersaglio endogene da cellule di mammifero. L'attuale protocollo potrebbe invece fornire un sistema sperimentale.

La proteina oncosoppressore p53 svolge un ruolo fondamentale nel prevenire la trasformazione maligna delle cellule normali 8,9,10,11. La stabilità di p53 è strettamente regolata dalla degradazione mediata dall'ubiquitinazione nelle cellule. Mdm2 agisce come una ubiquitina ligasi E3 per promuovere la mono- e poliubiquitinazione di p53 in modo dose-dipendente16. Qui, le proteine p53 ubiquitinate sono state purificate in condizioni di denaturazione e non denaturazione in cellule di mammifero in presenza di sovraespressione di Mdm2. Le proteine p53 monoubiquitinate sono state individuate preferenzialmente con anticorpi monoclonali anti-p53, mentre le forme poliubiquitinate sono state facilmente rilevate con anticorpi ubiquitina-specifici. I livelli di forme poliubiquitinate possono essere efficacemente aumentati elevando l'espressione di Mdm2 nelle cellule. Questo articolo fornisce un sistema sperimentale ideale per la preparazione di proteine ubiquitinate al fine di chiarire il ruolo dell'ubiquitinazione nella modulazione della funzione proteica. Le proteine ubiquitinate possono essere utilizzate per identificare DUB specifici per una proteina bersaglio e per rivelare i ruoli di diversi tipi di catene ubiquitina, ad esempio le catene legate a K48 e K63, nella segnalazione. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare i ruoli dell'ubiquitinazione nell'interazione proteina-proteina e nella formazione di complessi proteici.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della National Natural Science Foundation of China (81972624) a D.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-mercaptoethanol Sangon Biotech M6250
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE healthcare NA931 Secondary antibdoy
Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE healthcare NA935 Secondary antibdoy
Anti-Flag M2 Affinity Gel Sigma-Aldrich A2220 FLAG/M2 beads
Anti-GFP monocolonal antibody Santa cruz sc-9996 Primary antibody
Anti-HA High Affinity Roche 11867423001 Primary antibody
Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14) Santa cruz sc-965 Primary antibody
Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1) Santa cruz sc-126 Primary antibody
EDTA Sigma-Alddich E5134 solvent
Fetal Bovine Serum VivaCell C04001-500 FBS
FLAG Peptide Sigma-Alddich F3290 Prepare elution buffer
GlutaMAX Gibco 35050-061 supplement
Guanidine-HCI Sangon Biotech A100287-0500 solvent
H1299 Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences
Image Lab Bio-rad software
Immidazole Sangon Biotech A500529-0100 solvent
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Lipofectamine 2000 reagents Invitrogen 11668019 Transfection reagent
MG132 MedChemExpress HY-13259 Proteasome inhibitor
Na2HPO4 Sangon Biotech A501727-0500 solvent
NaCl Sangon Biotech A610476-0005 solvent
NaF Sigma-Alddich 201154 solvent
NaH2PO4 Sangon Biotech A501726-0500 solvent
Ni-NTA Agarose QIAGEN 30230 nickel-charged resin
Nitrocellulose Blotting membrane GE healthcare 10600002 0.45 µm pore size
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985-070 Transfection medium
PBS Corning 21-040-cv
Penicillin-Streptomycin Solution Sangon Biotech E607011-0100 antibiotic
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340
RPMI 1640 Biological Industries 01-100-1ACS medium
Sarkosyl Sigma-Alddich L5777 solvent
SDS Loading Buffer Beyotime P0015L
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070 supplement
Tris-base Sangon Biotech A501492-0005 solvent
Tris-HCI Sangon Biotech A610103-0250 solvent
Triton X-100 Sangon Biotech A110694-0500 reagent
Tween-20 Sangon Biotech A100777-0500 supplement
Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System Bio-rad ChemiDoc XRS+
Urea Sangon Biotech A510907-0500 solvent

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References

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Biochimica Numero 181
Purificazione delle proteine ubiquitinate p53 da cellule di mammifero
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Wu, D., He, M., Li, D. Purification… More

Wu, D., He, M., Li, D. Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (181), e63602, doi:10.3791/63602 (2022).

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