Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Очистка убиквитинированных белков p53 из клеток млекопитающих

Published: March 21, 2022 doi: 10.3791/63602
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Translational Medicine, The Affiliated Zhangjiagang Hospital of Soochow University

Summary

Протокол описывает пошаговый метод очистки убиквитинированных белков из клеток млекопитающих с использованием белка-супрессора опухоли p53 в качестве примера. Убиквитинированные белки р53 были очищены из клеток в строгих условиях неденатурации и денатурации.

Abstract

Убиквитинация — это тип посттрансляционной модификации, которая регулирует не только стабильность, но и локализацию и функцию субстратного белка. Процесс убиквитинирования происходит внутриклеточным образом у эукариот и регулирует практически все основные клеточные биологические процессы. Очистка убиквитинированных белков помогает исследовать роль убиквитинирования в контроле функции субстратных белков. Здесь описана пошаговая процедура очистки убиквитинированных белков в клетках млекопитающих с помощью белка-супрессора опухоли p53 в качестве примера. Убиквитинированные белки р53 очищали в строгих условиях неденатурации и денатурации. Общий клеточный белок p53, помеченный флагом, очищали антифланг-конъюгированной агарозой в неденатурирующих условиях. Альтернативно, общий клеточный убиквитинированный белок, помеченный His, очищали с использованием никелевой смолы в условиях денатурации. Убиквитинированные белки р53 в элюатах были успешно обнаружены со специфическими антителами. Используя эту процедуру, убиквитинированные формы данного белка могут быть эффективно очищены от клеток млекопитающих, что облегчает исследования роли убиквитинирования в регулировании функции белка.

Introduction

Убиквитин представляет собой эволюционно сохраненный белок из 76 аминокислот 1,2,3. Убиквитин ковалентно связывает остатки лизина с белками-мишенями через каскады, включающие активирующие (E1), конъюгирующие (E2) и лигазные (E3) ферменты. Убиквитин сначала активируется ферментом E1, а затем переносится на конъюгирующие ферменты E2. Впоследствии лигазы убиквитина Е3 взаимодействуют как с убиквитин-нагруженными ферментами Е2, так и с белками субстрата и опосредуют образование изопептидной связи между С-терминалом убиквитина и остатком лизина в субстрате 1,2,3,4,5. Убиквитинирование включает в себя присоединение фрагментов убиквитина к остаткам лизина на белках субстрата или к самому себе, что приводит к моноубиквитинированию белка или полиубиквитинированию. Этот процесс убиквитинирования происходит внутриклеточным образом у эукариот и регулирует большое разнообразие биологических процессов. Убиквитинирование приводит к деградации белков субстрата через убиквитин-протеасомную систему 1,2,3,4,5. Кроме того, убиквитинирование модулирует субклеточную локализацию белка, образование белкового комплекса и незаконный оборот белка в клетках 3,5. Фрагменты убиквитина, лигированные белкам субстрата, могут быть удалены деубиквитинирующими ферментами (DUBs)6,7. Примечательно, что различные способы, которыми собраны цепи убиквитина, обеспечивают множество средств для регулирования различных биологических процессов 1,5. Точные роли убиквитинирования в регуляции функции субстратного белка до сих пор остаются не полностью изученными. Очистка убиквитинированных белков способствует выяснению влияния убиквитинирования белка на различные клеточные процессы.

Белок p53 является одним из наиболее важных белков-супрессоров опухолей и проявляет генетические мутации или инактивацию почти во всех раковых заболеваниях человека 8,9,10,11. Стабильность и активность p53 деликатно регулируются in vivo посттрансляционными модификациями, включая убиквитинирование, фосфорилирование, ацетилирование и метилирование12,13. Белок p53 имеет короткий период полувыведения от 6 мин до 40 мин в различных клетках, что является результатом в основном его полиубиквитинирования и последующей протеасомальной деградации10,12. Мышиная двойная минута 2 (Mdm2) представляет собой E3-убиквитин-лигазу p53, которая связывается с N-концом p53 для ингибирования его транскрипционной активности 12,14,15. Mdm2 способствует полиубиквитинированию и протеасомальной деградации р53 для контроля его стабильности и индуцирует моноубиквитинацию р53 для облегчения его ядерного экспорта 12,14,15,16. Здесь Mdm2-опосредованная p53 убиквитинация используется в качестве примера для введения способа очистки убиквитинированных белков из клеток млекопитающих в деталях. Регуляторы, которые влияют на статус убиквитинации белков-мишеней, могут быть идентифицированы с помощью этого анализа убиквитинирования in vivo, когда они чрезмерно экспрессируются или сбиваются / выбиваются в клетках млекопитающих. Кроме того, убиквитинированные белки могут быть использованы в качестве субстратов для анализа деубиквитинации in vitro. Высокопроизводительный скрининг может быть выполнен для идентификации конкретных DUB для целевых белков путем инкубации убиквитинированных субстратов с отдельными DUB. Убиквитинированные белки могут действовать как каркас для набора нисходящих сигнальных белков в клетках. Убиквитинированный целевой белковый комплекс может быть очищен последовательным иммунопреципитацией в условиях нативной очистки и идентифицирован масс-спектрометрией. Текущий протокол может быть широко использован для исследования клеточных белков, регулируемых убиквитинацией.

Было установлено несколько методов очистки убиквитинированных белков, которые включают использование аффинно-меченого убиквитина, антител убиквитина, убиквитин-связывающих белков и изолированных убиквитин-связывающих доменов (UBD)17. Здесь мы предоставляем протокол, использующий убиквитин с аффинными метками в качестве медиатора для очистки убиквитинированных белков в клетках млекопитающих. Использование поли-Гис-меченого убиквитина дает преимущества по сравнению с другими методами. Убиквитинированные белки очищаются в присутствии сильных денатурантов, что снижает неспецифическое связывание с никелевой смолой путем линеаризации клеточных белков и нарушения белково-белковых взаимодействий. Напротив, использование убиквитиновых антител, убиквитин-связывающих белков и изолированных UBD в качестве медиаторов не может эффективно исключать связывающих партнеров из целевого белка, потому что очистка должна выполняться в менее строгих условиях. Кроме того, очистка может также привести к усилению связывания несвязанных белков с использованием этих медиаторов. Кроме того, существует склонность к связыванию для различных типов связей убиквитина, а также моно- и полиубиквитинирования убиквитин-связывающими белками или изолированными UBDs17. Использование поли-Гис-меченого убиквитина способствует снижению всех клеточных убиквитинированных белков. Альтернативно, использование коммерчески доступной анти-Флаг или анти-ГК антитело-конъюгированной агарозы облегчает иммунопреципитацию крупномасштабных флаг- или ГК-меченых целевых белков в неденатурирующих условиях. Вторая стадия очистки, например, никелевой смолой, нацеленной на поли-Гис-меченый убиквитин, может быть использована для получения убиквитинированных целевых белков с высокой чистотой для последующих экспериментов. Примечательно, что стратегия очистки эпитопных меток может быть адаптирована, когда специфическое антитело не может быть приобретено для эффективного иммунопреципитации белков-мишеней. Наконец, очистка убиквитинированных белков в клетках млекопитающих, по сравнению с очисткой in vitro, сохраняет режим убиквитиновой связи белков-мишеней в более физиологических условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки H1299 были любезно предоставлены Банком стволовых клеток Китайской академии наук и оказались отрицательными для загрязнения микоплазмой.

1. Клеточная культура

  1. Для первоначальной культуры поместите 1 х 106 клеток клеточной линии аденокарциномы легких человека, H1299 в чашку Петри 10 см с 10-12 мл среды RPMI 1640, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 1% добавкой глутамина, 1% пируватом натрия и антибиотиками (100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина). Поддерживайте клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2. Расщепляйте клетки каждые 2-3 дня в зависимости от того, когда они достигают 80-90% конфлюзии.
  2. За сутки до трансфекции подготовьте 6-9 х 106 клеток для трех чашек Петри и пластину 2-3 х 106 клеток в одной чашке Петри размером 10 см, содержащей 10-12 мл среды, для достижения конфьюляции 70%-90% при трансфекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки HEK293T также могут быть использованы для очистки убиквитинированных белков из-за их высокой эффективности трансфекции и уровня экспрессии белка.

2. Плазмидная трансфекция

  1. Добавьте 1,5 мл восстановленной сывороточной среды в три 15 мл центрифужных пробирок.
  2. Добавьте плазмидную ДНК, готовую к трансфекции, в каждую трубку, чтобы сделать разбавления следующим образом. Трубка 1: 1 мкг плазмиды Flag-p53, 12 мкг пустого вектора; Трубка 2: 1 мкг плазмиды Flag-p53, 3 мкг плазмиды His-HA-Ub (HH-Ub) и 9 мкг пустого вектора; Трубка 3: 1 мкг плазмиды Flag-p53, 3 мкг плазмиды HH-Ub и 9 мкг плазмиды Mdm2. Добавьте в общей сложности 0,2 мкг плазмиды зеленого флуоресцентного белка (GFP) в каждую трубку для мониторинга эффективности трансфекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пилотный эксперимент должен быть выполнен для определения оптимального количества плазмид, необходимого для достижения эффективной экспрессии целевого белка в клетках.
  3. Добавьте 78 мкл реагента трансфекции липосом к 4,5 мл восстановленной сывороточной среды в другой центрифужной трубке для разбавления липосом. Тщательно перемешать, щелкнув тюбиком и дать постоять 5 мин при комнатной температуре (RT).
  4. Добавьте 1,5 мл разбавленного раствора липосом в каждую пробирку со стадии 2,2, содержащую 1,5 мл разбавленного раствора ДНК. Тщательно перемешайте и смешайте плазмиды с липосомами в течение не менее 20 минут при RT. Используйте плазмидную ДНК: соотношение липосом 1:2 (мкг:мкл) для каждой трансфекции.
  5. Выбрасывайте исходную среду из чашки Петри и добавляйте в каждую чашку 9 мл восстановленной сывороточной среды. Добавьте 3 мл смеси липосом-ДНК в каждое блюдо и перемешайте раствор, осторожно встряхнув тарелку вперед и назад 3x, а затем влево и вправо 3x для равномерного распределения смеси в тарелке.
  6. Культивируйте клетки в увлажненном инкубаторе при 37 °C с 5% CO2. Заменяют среду через 4-6 ч и продолжают культивировать клетки в течение 24-36 ч.

3. Коллекция ячеек

  1. Через 24-36 ч обрабатывают клетки MG132 в конечной концентрации 10 мкМ в течение 4-6 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: MG132 представляет собой пептидный альдегид, который эффективно блокирует протеолитическую активность протеасомного комплекса 26S. Количество белков, убиквитинированных полиубиквитиновыми цепями, связанными с лизином-48 (K48), может быть увеличено после обработки клеток MG132 или другими ингибиторами протеасомы.
  2. Отбросьте среду, промыть клетки в 2 раза (заботясь о том, чтобы не вымыть клетки) ледяным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) и аспирировать клетки серологическими пипетками.
  3. Добавьте в чашку 1 мл PBS, удалите ячейки путем соскабливания чистым скребком и перенесите клеточную суспензию в микроцентрифужные трубки. Центрифуга при 700 х г в течение 5 мин для сбора гранул клеток.

4. Очистка убиквитинированных белков в неденатурирующих условиях

  1. Перед использованием приготовьте буфер лизиса Флага (50 мМ Tris-HCl (рН 7,9), 137 мМ NaCl, 10 мМ NaF, 1 мМ этилендиаминовой тетрауксусной кислоты (ЭДТА), 1% тритона X-100, 0,2% саркосила и 10% глицерина), только что добавленный коктейлем ингибитора протеазы.
  2. Добавьте 800 мкл ледяного буфера лизиса Flag к ячейкам в каждой трубке, перемешайте клетки с помощью вихревого генератора или пипетки, а затем инкубируйте смесь на ротаторе при 4 °C в течение 30 мин.
  3. Подвергайте смесь 5-10 коротким импульсам ультразвука. Выполняют ультразвуковую обработку на льду на частоте ультразвуковой обработки 20 кГц и амплитуде 80% с каждым импульсом продолжительностью 1 с. Инкубировать смесь на ротаторе со скоростью 40 оборотов в минуту (об/мин) при 4 °C в течение 30 мин.
  4. Центрифугирование ультразвуковых образцов при 8 000 х г в течение 20-30 мин при 4 °C. Перенесите супернатант в новую микроцентрифужную трубку.
  5. Аликвота 80 мкл (1/10) клеточного экстракта и смешивается с 20 мкл 5x буфера нагрузки додецилсульфата натрия (SDS). Вскипятите образцы при 98 °C в течение 5 мин, охладите на льду в течение 2 мин и храните при -20 °C до использования. Используйте эти образцы в качестве входной группы для мониторинга экспрессии белка.
  6. Добавьте 30 мкл анти-Flag M2-конъюгированных антител (Flag/M2) шариков к оставшимся клеточным экстрактам и инкубируйте на ротаторе при 4 °C в течение не менее 4 ч или на ночь.
  7. Центрифуга при 1 500 х г в течение 2 мин при 4 °C для сбора шариков. Добавьте 1 мл ледяного буфера лизиса Flag к шарикам и перемешайте, перевернув трубку несколько раз.
  8. Центрифуга при 1 500 х г в течение 2 мин при 4 °C для сбора шариков. Повторите шаг 4.7 4-6 раз.
  9. Добавьте 40 мкл пептидов Флага в конечной концентрации 200 нг/мкл к шарикам и инкубируйте на ротаторе при 4 °C в течение 2 ч для элюирования связанных белков.
  10. Центрифуга при 1,500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Перенесите супернатант в новую микроцентрифужную трубку.
  11. Добавьте 10 мкл 5x SDS загрузочного буфера, отварите смесь при 98 °C в течение 5 минут, охладите на льду в течение 2 минут и храните при -20 °C для вестерн-блоттинга. В качестве альтернативы, храните элюат из шага 4.10 непосредственно при -80 °C для других последующих экспериментов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество очищенных убиквитинированных белков может быть увеличено за счет увеличения количества клеток и количества трансфектированных плазмид. Стратегия маркировки эпитопов может быть адаптирована для очистки клеточных комплексов, которые связываются специфически с убиквитинированным р53 в условиях нативной очистки. Путем совместной экспрессии Flag-p53, mdm2 и HA-убиквитина, убиквитинированный белковый комплекс p53 может быть иммунопреципитирован последовательной агарозой Flag и HA-конъюгированной антителами из клеток млекопитающих. Для сохранения партнеров по связыванию убиквитинированных белков р53 во время процесса очистки следует использовать менее строгий буфер лизиса BC100 (20 мМ Tris-HCl (рН 7,9), 100 мМ NaCl, 10% глицерина, 0,2 мМ ЭДТА, 0,2% тритона X-100 и ингибитор протеазы 1x). Элюат из пептида ГК подвергают масс-спектрометрии для идентификации всех партнеров, которые связываются специфически с убиквитинированным р53.

5. Очистка убиквитинированных белков в условиях денатурации

  1. Добавьте 1 мл ледяного PBS к гранулам клеток, полученным на стадии 3.3, и равномерно перемешайте. Аликвота 100 мкл (1/10 объема) клеточной суспензии в микроцентрифужную трубку в качестве входного образца.
  2. Центрифуга при 700 х г в течение 5 мин при 4 °С для сбора гранул ячейки. Добавьте 80 мкл буфера лизиса Флага во входной образец, перемешайте ячейки с помощью вихревого генератора или пипетки и лизируйте ячейки на льду в течение 1 ч.
  3. Центрифуга при 8 000 х г в течение 20-30 мин при 4 °C. Aliquot 80 мкл супернатанта в новую микроцентрифужную трубку.
  4. Добавьте 20 мкл 5x SDS загрузочного буфера к супернатанту, прокипятите при 98 °C в течение 5-10 мин, охладите на льду в течение 2 мин и храните при -20 °C до использования.
  5. Центрифугируют оставшиеся 900 мкл клеточной суспензии при 700 х г в течение 5 мин при 4°С для сбора клеточной гранулы. Добавьте 1 мл убиквитинового буфера 1 (UB-буфер 1; 6 M гуанидин-HCI, 0,1 M Na2HPO4, 6,8 мМ2PO4, 10 мМ Tris-HCI (pH 8,0) и 0,2% Triton X-100, только что дополненный 10 мМ β-меркаптоэтанола и 5 мМ имидазола) к клеточным гранулам и перемешайте несколько раз путем пипетирования вверх и вниз для равномерного распределения клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация имидазола может варьироваться от 5 мМ до 20 мМ для уменьшения неспецифического связывания белка на никелевой смоле. Буфер убиквитина содержит гуанидина гидрохлорид, который инактивирует как лигазы, так и DUBs. β-меркаптоэтанол представляет собой прозрачную, бесцветную жидкость с сильным, неприятным запахом, похожим на тухлые яйца. Раствор высокой концентрации нанесет серьезный ущерб слизистой оболочке, верхним дыхательным путям, коже и глазам. Надевайте перчатки и очки и работайте в вытяжном капюшоне.
  6. Подвергайте клетку лизатам 10-20 раундов ультразвуковой обработки до тех пор, пока раствор не перестанет быть вязким. Выполняют ультразвуковую обработку на льду на частоте ультразвуковой обработки 20 кГц и амплитуде 80% с каждым импульсом продолжительностью 1 с. Центрифуга при 8 000 х г в течение 20-30 мин при РТ и перенос супернатанта в новую микроцентрифужную трубку.
  7. Добавьте 30 мкл никелевой смолы к супернатанту и инкубируйте на ротаторе, установленном при 15 об/мин в течение 4 ч или на ночь при RT. Центрифуга при 1 500 х г в течение 2 мин при RT для сбора шариков.
  8. Добавьте 1 мл UB-буфера 1, инкубируйте с вращением в шейкере в течение 10 мин при RT и центрифугу при 1,500 x g в течение 2 мин на RT для сбора шариков.
  9. Добавьте 1 мл убиквитинового буфера 2 (UB-буфер 2; 8 М мочевины, 0,1 М Na2HPO4, 6,8 мМ2PO4, 10 мМ Tris-HCI (рН 8,0) и 0,2% Тритона X-100) в бусины, инкубируйте с вращением в шейкере в течение 10 мин при RT и центрифугу при 1,500 х г в течение 2 мин для сбора шариков. Повторите это еще раз.
  10. К шарикам добавить 1 мл PBS, инкубировать с вращением в шейкере в течение 10 мин при RT и центрифугу при 1 500 x g в течение 2 мин на RT для сбора шариков. Повторите это еще раз.
  11. Элюдируют связанные белки путем инкубации шариков с 40 мкл имидазола в конечной концентрации 0,5 М в течение 1 ч при RT. Центрифуга при 1,500 х г в течение 2 мин при RT.
  12. Переложите супернатант в чистую микроцентрифужную трубку, добавьте 10 мкл 5x SDS нагрузочного буфера, прокипятите при 98 °C в течение 5 мин, охладите на льду в течение 2 мин и храните при -20 °C для вестерн-блоттинга. В качестве альтернативы можно хранить необработанный элюат при -80 °C для других последующих экспериментов.

6. Обнаружение очищенных убиквитинированных белков методом вестерн-блоттинга

  1. Разрешите образцы из этапов 4.11 и 5.12 методом электрофореза полиакриламидного геля додецилсульфата натрия (SDS-PAGE), а затем перенесите их на нитроцеллюлозную мембрану с помощью вестерн-блоттинга для обнаружения белков-мишеней с использованием соответствующих антител, как описано18.
  2. Вкратце инкубируют мембрану путем погружения в 20 мл блокирующего раствора, содержащего 5% дефатное сухое молоко в буфер TBST (15 мМ Tris-HCI; рН = 7,6, 4,6 мМ Tris-основание, 150 мМ NaCI, только что дополненное 0,1% Tween-20 перед применением) на RT в течение 1 ч. Затем инкубируют мембрану с первичными антителами при RT в течение 2 ч или на ночь при 4 °C. Используйте следующие антитела для каждого набора. Все первичные антитела использовали в разведении 1:1000.
    1. Обнаружение общего белка p53, включая убиквитинированный p53, с анти-p53 моноклональным антителом после иммунопреципитации шариками агарозы Flag/M2.
    2. Обнаружение убиквитинированных белков р53 с антителом против ГК или антиубиквитиновым антителом после иммунопреципитации шариками агарозы Флага/М2.
    3. Обнаружение убиквитинированных белков p53 с моноклональным антителом против p53 после вытягивания заряженной никелем смолы.
    4. Обнаружение общего убиквитинированного белка с антителом против ГК или антиубиквитиновым антителом после вытягивания заряженной никелем смолы.
  3. Инкубируют мембрану с пероксидазой хрена (HRP)-конъюгированными вторичными антителами на RT в течение 1 ч после промывки 3x с буфером TBST в течение 5 мин каждый. Все вторичные антитела использовали в разведении 1:3000. Затем промыть мембрану с буфером TBST 3x в течение 5 мин каждый с легким перемешиванием.
  4. Запустите систему визуализации хемилюминесценции для обнаружения сигналов от вестерн-блоттинга. Готовят раствор субстрата для HRP путем смешивания растворов А и В в соотношении 1:1.
  5. Поместите нитроцеллюлозную мембрану в камеру-обскуру лицевой стороной вверх и равномерно покройте раствор подложки на мембрану с помощью пипеточного пистолета. Выберите автоматическую процедуру экспозиции для захвата хемилюминесцентных сигналов и вручную отрегулируйте время экспозиции до получения идеального сигнала.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На принципиальной схеме показаны помеченные флагом белки p53 (Flag-p53) и his/HA с двойными метками убиквитина (HH-Ub) (рисунок 1A). Процедуры, используемые для очистки убиквитинированных белков, обобщены на рисунке 1B. Убиквитин, помеченный поли-Гисом, может быть лигирован для целевых белков в клетках млекопитающих. Убиквитинированные белки могут быть очищены шариками Flag/M2 в условиях неденатурации или с помощью иммобилизованной ионной аффинной хроматографии металлов (IMAC) в условиях денатурации (рисунок 1B). Общий белок p53, включая убиквитинированный p53, был иммунопреципитирован шариками Flag/M2 из клеток H1299 в неденатурирующих условиях. Сигнал от убиквитинированного белка p53, который выглядит как размазанная полоса от низкой до высокой молекулярной массы, был заметно увеличен, когда Mdm2 был эктопически экспрессирован в этих клетках, предполагая, что убиквитинированный белок p53 был эффективно очищен из клеток (рисунок 2). Затем клетки были лизированы в условиях денатурации, и общий клеточный убиквитинированный белок был удален никелевой смолой. Общий клеточный белок был обнаружен путем вестерн-блоттинга с использованием моноклонального антитела против ГК, а убиквитинированный белок р53 был обнаружен с использованием моноклонального антитела против р53. Результаты показали, что общий уровень убиквитинированного белка не изменился, но уровень убиквитинированного белка p53 был резко увеличен после того, как Mdm2 был переэкспрессирован в этих клетках. Эти результаты показали, что общие белки убиквитина, содержащие убиквитинированный р53, эффективно извлекались из клеточных лизатов в условиях денатурации (рисунок 3).

Figure 1
Рисунок 1: Краткое изложение процедур, используемых для очистки убиквитинированных белков. (A) Принципиальная диаграмма помеченных флагом белков p53 (Flag-p53) и His/HA с двойной меткой убиквитина (HH-Ub). (B) Убиквитинированные белки могут быть очищены шариками Flag/M2 в неденатурирующих условиях и IMAC в условиях денатурации. Сокращения: His/HA = полигистидин/гемагглютинин; Ub = убиквитин; Бусины Flag/M2 = анти-Flag M2 антитело-конъюгированные бусины; IMAC = иммобилизованная аффинная хроматография ионов металлов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Убиквитинированные белки р53 были очищены в неденатурирующих условиях. Плазмида экспрессии Flag-p53 трансфектировалась отдельно, с HH-Ub или с Mdm2 и HH-Ub в клетки H1299. Общие белки p53 и убиквитинированные формы были иммунопреципитированы шариками Flag/M2 из клеточных экстрактов. Элюат подвергали вестерн-блоттингу анти-p53 (A) и анти-HA (B) моноклональными антителами. (C) Экстракты сырых клеток (Input) подвергали вестерн-блоттингу анти-p53 и анти-Mdm2 моноклональными антителами. В качестве регулятора загрузки использовался GFP. Сокращения: HH-Ub = Его/HA двойной меченый убиквитин; ГК = гемагглютинин; Бусины Flag/M2 = анти-Flag M2 антитело-конъюгированные бусины; GFP = зеленый флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Убиквитинированные белки р53 были очищены в условиях денатурации. Плазмида экспрессии Flag-p53 трансфектировалась отдельно, с HH-Ub или с Mdm2 и HH-Ub в клетки H1299. Общие клеточные убиквитинированные белки были удалены никелевой смолой, а затем подверглись западному блоттингу анти-p53 и анти-HA моноклональными антителами. (A) Убиквитинированный белок p53 был обнаружен с использованием антитела против p53. (B) Общий убиквитинированный белок был обнаружен с использованием антитела против ГК. (C) Экстракты сырых клеток (Input) подвергали вестерн-блоттингу анти-p53 и анти-Mdm2 моноклональными антителами. В качестве регулятора загрузки использовался GFP. Сокращения: HH-Ub = Его/HA двойной меченый убиквитин; ГК = гемагглютинин; GFP = зеленый флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Убиквитинация играет важнейшую роль практически во всех физиологических и патологических клеточных процессах2. В последние годы был достигнут большой прогресс в понимании молекулярной роли убиквитина в сигнальных путях и того, как изменения в системе убиквитина приводят к различным заболеваниям человека2. Очистка убиквитинированных белков способствует пониманию точной роли убиквитинирования в этих процессах. Смеси убиквитин-конъюгированных белков могут быть очищены из клеток в условиях неденатурации и денатурации. IMAC с использованием никелевых смол может быть использован для очистки поли-His-меченых белков в условиях денатурации. Цель очистки убиквитинированных белков в условиях денатурации состоит в том, чтобы отбросить партнеров по взаимодействию от белков-мишеней. Все клеточные компоненты, связывающиеся с белками-мишенями, будут удалены из элюирования в условиях денатурации. Напротив, некоторые клеточные белки, связывающиеся с белками-мишенями, могут удерживаться в элюировании в нативных условиях, что может мешать последующим экспериментам. Убиквитинированные белки могут быть очищены даже в присутствии сильных денатурантов, что значительно снижает неспецифическое связывание белка с никелевыми смолами. Напротив, общие белки-мишени, включая их убиквитинированные формы, могут быть очищены с помощью стратегий маркировки эпитопов с использованием конъюгированных антителами агарозных шариков в неденатурирующих условиях. Белки были очищены в менее строгих условиях, потому что во время этого процесса использовалась аффинная очистка, опосредованная антителами. Целевые белки и их убиквитинированные формы были обнаружены с белковыми или убиквитин-специфическими антителами. Белки, помеченные HA и Myc, могут быть удобно очищены с использованием той же процедуры с антителами-конъюгированными бусинами агарозы. Примечательно, что легче обнаружить белки с одной или несколькими моноубиквитиновыми цепями, чем с полиубиквитиновыми цепями с белково-специфическими антителами. Напротив, белки с полиубиквитиновыми цепями могут быть легче распознаны по убиквитин-специфическим антителам.

Чтобы эффективно очищать убиквитинированные белки, уровень экспрессии белков-мишеней должен быть высоким в клетках млекопитающих. Векторы экспрессии с сильными промоторами ЦМВ могут быть использованы для достижения высоких уровней экспрессии белка в клетках. Кроме того, Е3 убиквитин лигаза и убиквитин могут быть совместно экспрессированы с белками-мишенями. Он будет более эффективно добавлять фрагменты убиквитина к белкам. Активность протеасомы 26S может быть заблокирована низкомолекулярным ингибитором с целью накопления убиквитинированных белков в клетках. Чтобы убиквитинированные белки эффективно связывались со смолой, клеточные экстракты должны быть кратковременно обработаны ультразвуком, чтобы разрушить комплекс ДНК, чтобы сделать раствор невязким. Для уменьшения неспецифического связывания в буфер лизиса в условиях денатурации следует добавить низкую концентрацию имидазола. Убиквитинированные белки с очень высокой молекулярной массой легче связать со смолой после процедуры денатурации и повторного складывания. Для того чтобы повысить эффективность элюирования, попробуйте использовать более высокую концентрацию имидазола. Если эффективность элюирования все еще была чрезвычайно низкой, попробуйте элюировать убиквитинированные белки путем непосредственного кипячения в буфере загрузки SDS Laemmli. Большинство убиквитинированных белков, связанных со смолой, могут быть элюированы в этом сильном денатурирующем буфере. Для достижения более высокой чистоты убиквитинированных белков может быть адаптирована двухступенчатая аффинная очистка. После иммунопреципитации Flag/M2 в неденатурирующих условиях вторая стадия очистки никелевой смолой может быть использована для вытягивания убиквитинированного белка, помеченного His, и избавления от неубиквитинированных субстратов. В отличие от этого, после вытягивания заряженной никелем смолы в условиях денатурации вторая стадия очистки сродства может быть адаптирована для иммунопреципитации белков-мишеней с использованием стратегии мечения эпитопов конъюгированными бусинами агарозы анти-флага или анти-ГК.

Мы использовали более чувствительное иммуноблоттинг вместо окрашивания серебром или окрашивания Кумасси для обнаружения убиквитинированных белков, потому что мы выполнили небольшую шкалу очистки в этом исследовании. На самом деле, хотя некоторые клеточные белки легко убиквитинируются в клетках, только небольшая часть белков может быть перевязана убиквитиновыми фрагментами. Чтобы успешно обнаружить эти белки путем окрашивания серебром или окрашивания Кумасси, следует выполнить большую шкалу очистки. Чтобы повысить чистоту убиквитинированных белков, следует также провести второй этап аффинной очистки. Мы не проводили эти эксперименты, потому что убиквитинированные белки, очищенные с помощью этого протокола, полностью соответствуют требованиям последующих анализов. Например, чтобы идентифицировать специфические DUB для целевого белка, регулируемого убиквитинацией, нам необходимо очистить большое количество убиквитинированных белков-мишеней. Эти белки могут быть инкубированы с отдельными DUB, очищенными из клеток млекопитающих в буфере деубиквитинирования. С помощью этого высокопроизводительного скрининга in vitro мы можем идентифицировать DUB, специфичные для целевого белка в клетках млекопитающих.

Существует несколько ограничений техники. Убиквитинированные белки составляют очень небольшую часть белков-мишеней, трудно очистить большое количество убиквитинированных белков-мишеней. Попробуйте увеличить экспрессию белка в клетках, чтобы достичь высокой эффективности очистки. Альтернативой является выполнение реакции убиквитинирования in vitro для получения большего количества убиквитинированных белков. Некоторые белки трудно высоко экспрессировать в клетках млекопитающих, что накладывает еще одно ограничение на очистку больших количеств убиквитинированных белков. Наконец, текущий протокол ограничен очисткой помеченных белков, которые чрезмерно экспрессируются с помощью плазмидной ДНК. Уровни экспрессии белков-мишеней выше, чем у эндогенных белков-мишеней. Для оценки эндогенного статуса убиквитинирования белка-мишени белки с их убиквитинированными формами могут быть непосредственно иммунопреципитированы целевыми белково-специфическими антителами из клеток. Антиубиквитиновые антитела могут быть использованы для определения статуса убиквитинирования белка-мишени. Однако при некоторых обстоятельствах более низкий уровень экспрессии, более низкий уровень убиквитинирования белка-мишени или более низкая эффективность иммунопреципитации специфических антител могут ограничивать обнаружение статуса убиквитинирования эндогенных белков-мишеней из клеток млекопитающих. Вместо этого текущий протокол может предоставлять экспериментальную систему.

Белок-супрессор опухоли p53 играет решающую роль в предотвращении злокачественной трансформации нормальных клеток 8,9,10,11. Стабильность р53 жестко регулируется убиквитинизационно-опосредованной деградацией в клетках. Mdm2 действует как Е3 убиквитин лигаза, способствуя моно- и полиубиквитинированию р53 дозозависимым способом16. Здесь убиквитинированные белки р53 были очищены в условиях денатурации и неденатурации в клетках млекопитающих в присутствии сверхэкспрессии Mdm2. Моноубиквитинированные белки р53 преимущественно обнаруживались с моноклональными антителами против р53, тогда как полиубиквитинированные формы легко обнаруживались с помощью убиквитин-специфических антител. Уровни полиубиквитинированных форм могут быть эффективно увеличены путем повышения экспрессии Mdm2 в клетках. В данной работе представлена идеальная экспериментальная система для получения убиквитинированных белков с целью выяснения роли убиквитинирования в модуляции функции белка. Убиквитинированные белки могут быть использованы для идентификации специфических DUB для белка-мишени и для выявления роли различных типов убиквитиновых цепей, например, цепей, связанных с K48 и K63, в передаче сигналов. Этот протокол может быть использован для исследования роли убиквитинирования в белково-белковом взаимодействии и формировании белкового комплекса.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантом Национального фонда естественных наук Китая (81972624) D.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-mercaptoethanol Sangon Biotech M6250
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE healthcare NA931 Secondary antibdoy
Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE healthcare NA935 Secondary antibdoy
Anti-Flag M2 Affinity Gel Sigma-Aldrich A2220 FLAG/M2 beads
Anti-GFP monocolonal antibody Santa cruz sc-9996 Primary antibody
Anti-HA High Affinity Roche 11867423001 Primary antibody
Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14) Santa cruz sc-965 Primary antibody
Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1) Santa cruz sc-126 Primary antibody
EDTA Sigma-Alddich E5134 solvent
Fetal Bovine Serum VivaCell C04001-500 FBS
FLAG Peptide Sigma-Alddich F3290 Prepare elution buffer
GlutaMAX Gibco 35050-061 supplement
Guanidine-HCI Sangon Biotech A100287-0500 solvent
H1299 Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences
Image Lab Bio-rad software
Immidazole Sangon Biotech A500529-0100 solvent
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Lipofectamine 2000 reagents Invitrogen 11668019 Transfection reagent
MG132 MedChemExpress HY-13259 Proteasome inhibitor
Na2HPO4 Sangon Biotech A501727-0500 solvent
NaCl Sangon Biotech A610476-0005 solvent
NaF Sigma-Alddich 201154 solvent
NaH2PO4 Sangon Biotech A501726-0500 solvent
Ni-NTA Agarose QIAGEN 30230 nickel-charged resin
Nitrocellulose Blotting membrane GE healthcare 10600002 0.45 µm pore size
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985-070 Transfection medium
PBS Corning 21-040-cv
Penicillin-Streptomycin Solution Sangon Biotech E607011-0100 antibiotic
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340
RPMI 1640 Biological Industries 01-100-1ACS medium
Sarkosyl Sigma-Alddich L5777 solvent
SDS Loading Buffer Beyotime P0015L
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070 supplement
Tris-base Sangon Biotech A501492-0005 solvent
Tris-HCI Sangon Biotech A610103-0250 solvent
Triton X-100 Sangon Biotech A110694-0500 reagent
Tween-20 Sangon Biotech A100777-0500 supplement
Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System Bio-rad ChemiDoc XRS+
Urea Sangon Biotech A510907-0500 solvent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kwon, Y. T., Ciechanover, A. The ubiquitin code in the ubiquitin-proteasome system and autophagy. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 873-886 (2017).
  2. Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
  3. Zheng, N., Shabek, N. Ubiquitin ligases: Structure, function, and regulation. Annual Review of Biochemistry. 86, 129-157 (2017).
  4. Dikic, I., Wakatsuki, S., Walters, K. J. Ubiquitin-binding domains - from structures to functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 659-671 (2009).
  5. Oh, E., Akopian, D., Rape, M. Principles of ubiquitin-dependent signaling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 137-162 (2018).
  6. Clague, M. J., Urbe, S., Komander, D. Breaking the chains: deubiquitylating enzyme specificity begets function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 338-352 (2019).
  7. Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (1), 57-78 (2018).
  8. Vogelstein, B., Lane, D., Levine, A. J. Surfing the p53 network. Nature. 408 (6810), 307-310 (2000).
  9. Boutelle, A. M., Attardi, L. D. p53 and Tumor suppression: It takes a network. Trends In Cell Biology. 31 (4), 298-310 (2021).
  10. Levine, A. J. p53: 800 million years of evolution and 40 years of discovery. Nature Reviews Cancer. 20 (8), 471-480 (2020).
  11. Vousden, K. H., Prives, C. Blinded by the light: The growing complexity of p53. Cell. 137 (3), 413-431 (2009).
  12. Brooks, C. L., Gu, W. p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond. Molecular Cell. 21 (3), 307-315 (2006).
  13. Liu, Y., Tavana, O., Gu, W. p53 modifications: exquisite decorations of the powerful guardian. Journal Of Molecular Cell Biology. 11 (7), 564-577 (2019).
  14. Dobbelstein, M., Levine, A. J. Mdm2: Open questions. Cancer Science. 111 (7), 2203-2211 (2020).
  15. Kulikov, R., et al. Mdm2 facilitates the association of p53 with the proteasome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10038-10043 (2010).
  16. Li, M., et al. Mono- versus polyubiquitination: differential control of p53 fate by Mdm2. Science. 302 (5652), 1972-1975 (2003).
  17. Tomlinson, E., Palaniyappan, N., Tooth, D., Layfield, R. Methods for the purification of ubiquitinated proteins. Proteomics. 7 (7), 1016-1022 (2007).
  18. Green, M., Sambrook, J. Molecular Cloning A Laboratory Manual. (Fourth Edition). 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. 28 (2012).

Tags

Биохимия выпуск 181
Очистка убиквитинированных белков p53 из клеток млекопитающих
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, D., He, M., Li, D. Purification… More

Wu, D., He, M., Li, D. Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (181), e63602, doi:10.3791/63602 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter