Ce protocole se concentre sur l’endommagement de la surface oculaire du poisson-zèbre par abrasion pour évaluer la fermeture ultérieure de la plaie au niveau cellulaire. Cette approche exploite une bavure oculaire pour enlever partiellement l’épithélium cornéen et utilise la microscopie électronique à balayage pour suivre les changements dans la morphologie cellulaire pendant la fermeture de la plaie.
En tant que surface transparente de l’œil, la cornée est essentielle à une vision claire. En raison de son emplacement, ce tissu est sujet aux insultes environnementales. En effet, les lésions oculaires les plus fréquemment rencontrées cliniquement sont celles de la cornée. Bien que la cicatrisation des plaies cornéennes ait été largement étudiée chez les petits mammifères (c.-à-d. les souris, les rats et les lapins), les études de physiologie cornéenne ont négligé d’autres espèces, y compris le poisson-zèbre, bien que le poisson-zèbre soit un modèle de recherche classique.
Ce rapport décrit une méthode d’abrasion cornéenne sur le poisson-zèbre. La plaie est réalisée in vivo sur des poissons anesthésiés à l’aide d’une bavure oculaire. Cette méthode permet d’obtenir une plaie épithéliale reproductible, laissant le reste de l’œil intact. Après abrasion, la fermeture de la plaie est surveillée pendant 3 heures, après quoi la plaie est réépithélialisée. En utilisant la microscopie électronique à balayage, suivie du traitement de l’image, la forme des cellules épithéliales et les protubérances apicales peuvent être étudiées pour étudier les différentes étapes de la fermeture de la plaie épithéliale cornéenne.
Les caractéristiques du modèle du poisson-zèbre permettent d’étudier la physiologie du tissu épithélial et le comportement collectif des cellules épithéliales lorsque le tissu est mis à l’épreuve. De plus, l’utilisation d’un modèle privé de l’influence du film lacrymal peut produire de nouvelles réponses concernant la réponse cornéenne au stress. Enfin, ce modèle permet également la délimitation des événements cellulaires et moléculaires impliqués dans tout tissu épithélial soumis à une plaie physique. Cette méthode peut être appliquée à l’évaluation de l’efficacité des médicaments dans les tests précliniques.
Comme la plupart des épithéliums sont en contact avec l’environnement extérieur, ils sont sujets aux blessures physiques, ce qui les rend bien adaptés à l’étude des processus de cicatrisation des plaies. Parmi les tissus bien étudiés, la cornée est un modèle extrêmement utile dans l’étude des aspects cellulaires et moléculaires de la cicatrisation des plaies. En tant que surface externe transparente, il fournit une protection physique à l’œil et est le premier élément à concentrer la lumière sur la rétine. Bien que la structure et la composition cellulaire de la rétine diffèrent d’une espèceà l’autre, ces éléments de la cornée sont généralement similaires dans tous les yeux de type caméra, quelle que soit l’espèce.
La cornée est composée de trois couches principales2. La première couche et la plus externe est l’épithélium, qui est constamment renouvelé pour assurer sa transparence. La deuxième couche est le stroma, qui contient des cellules dispersées, appelées kératocytes, dans une épaisse couche de fibres de collagène strictement organisées. La troisième couche, la plus interne, est l’endothélium, qui permet la diffusion des nutriments et des liquides de la chambre antérieure vers les couches externes. Les cellules épithéliales et stromales interagissent via des facteurs de croissance et des cytokines3. Cette interaction est mise en évidence par l’apoptose rapide et la prolifération subséquente des kératocytes après une lésion épithéliale 4,5. En cas de plaie plus profonde, telle qu’une ponction, les kératocytes participent activement au processus de guérison6.
Étant en contact avec l’environnement extérieur, les blessures physiques cornéennes sont fréquentes. Beaucoup d’entre eux sont causés par de petits corps étrangers7, tels que le sable ou la poussière. Le réflexe de frottement des yeux peut entraîner des abrasions épithéliales étendues et un remodelage cornéen8. Selon la taille et la profondeur de la plaie, ces blessures physiques sont douloureuses et prennent plusieurs jours pour guérir9. Les caractéristiques optimales de cicatrisation d’un modèle facilitent la compréhension des aspects cellulaires et moléculaires de la fermeture de la plaie. En outre, de tels modèles se sont également révélés utiles pour tester de nouvelles molécules ayant le potentiel d’accélérer la guérison de la cornée, comme démontré précédemment10,11.
Le protocole décrit ici vise à utiliser le poisson-zèbre comme modèle pertinent pour étudier les lésions physiques cornéennes. Ce modèle est très pratique pour les études de dépistage pharmacologique car il permet d’ajouter des molécules directement à l’eau du réservoir et, par conséquent, d’entrer en contact avec une cornée cicatrisante. Les détails fournis ici aideront les scientifiques à effectuer leurs études sur le modèle du poisson-zèbre. La blessure in vivo est réalisée avec une bavure oculaire émoussée. L’impact sur les cellules épithéliales adjacentes ou éloignées de celui-ci peut être analysé en enlevant spécifiquement l’épithélium cornéen central. Au cours des dernières années, de nombreux rapports se sont concentrés sur une telle méthode sur la cornée de rongeurs 12,13,14,15,16,17; toutefois, à ce jour, un seul rapport a appliqué cette méthode au poisson-zèbre18.
En raison de sa simplicité, la plaie physique est utile pour délimiter le rôle des cellules épithéliales dans la fermeture de la plaie. Un autre modèle bien établi de lésion cornéenne est la brûlure chimique, en particulier la brûlure alcaline 19,20,21. Cependant, une telle approche endommage indirectement toute la surface de l’œil, y compris la cornée périphérique et le stroma cornéen19. En effet, les brûlures alcalines induisent potentiellement des ulcères cornéens, des perforations, une opacification épithéliale et une néovascularisation rapide22, et le résultat incontrôlable des brûlures alcalines disqualifie cette approche pour les études générales de cicatrisation des plaies. De nombreuses autres méthodes sont également utilisées pour étudier la cicatrisation des plaies cornéennes en fonction de l’objectif particulier de l’étude en question (par exemple, le débridement épithélial complet23, la combinaison de lésions chimiques et mécaniques pour la plaied’épaisseur partielle 24, l’ablation au laser excimère pour les plaies s’étendant jusqu’au stroma25). L’utilisation d’une bavure oculaire limite le point focal à la réponse épithéliale à la plaie et fournit une plaie hautement reproductible.
Comme pour chaque méthode d’infliction de plaie, l’utilisation d’une bavure oculaire présente des avantages et des inconvénients. Le principal inconvénient est que la réponse étant principalement épithéliale, elle ne reflète pas parfaitement les abrasions observées dans le cadre clinique. Cependant, cette méthode présente de nombreux avantages, notamment la facilité avec laquelle elle peut être mise en place et exécutée, sa précision, sa reproductibilité et le fait qu’elle est non invasive, ce qui en fait une méthode bien tolérée par les animaux.
Les blessures physiques cornéennes sont la cause la plus fréquente de visites de patients en ophtalmologie à l’hôpital. Par conséquent, il est important d’établir des modèles pertinents pour l’étude de différents aspects de la physiopathologie cornéenne. Jusqu’à présent, la souris est le modèle le plus couramment utilisé pour l’étude de la cicatrisation des plaies cornéennes. Cependant, l’ajout de gouttes oculaires sur les yeux blessés murins pour valider l’impact de médicaments spécifiqu…
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient Pertti Panula pour l’accès à l’unité Zebrafish et Henri Koivula pour les conseils et l’aide pour les expériences sur le poisson-zèbre. Cette recherche a été soutenue par l’Académie de Finlande, la Fondation Jane et Aatos Erkko, la Fondation culturelle finlandaise et le programme ATIP-Avenir. L’imagerie a été réalisée à l’unité de microscopie électronique et à l’unité de microscopie optique de l’Institut de biotechnologie, avec le soutien de HiLIFE et du Biocenter Finland.
0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 | in-house | Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4). | |
0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 | in-house | Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4). | |
0.5mm burr tips | Alger Equipment Company | BU-5S | |
1M Tris, pH 8.8 | in-house | ||
adhesive tabs | Agar Scientific | G3347N | |
Algerbrush burr, Complete instrument | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
Cotton swaps | Heinz Herenz Hamburg | 1030128 | |
Dissecting plate | in-house | ||
Dissecting tools | Fine Science Tools | ||
double-distilled water | in-house | ||
Eppedorf tubes, 2ml | any provider | ||
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma | A5040 | Caution: causes irritation. |
Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I | Sigma | G7651 | Caution: toxic. |
Lidocaine hydrochloride | Sigma | L5647 | Caution: toxic. |
mounts | Agar Scientific | G301P | |
Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
pH indicator strips | Macherey-Nagel | 92110 | |
Plastic spoons | any provider | ||
Plastic tubes, 15 ml | Greiner Bio-One | 188271 | |
Plastic tubes, 50 ml | Greiner Bio-One | 227261 | |
Scanning electron microscope | FEI | Quanta 250 FEG | |
Soft sponge | any provider | ||
Sputter coater | Quorum Technologies | GQ150TS | |
Stereomicroscope | Leica |