פרוטוקול זה מתמקד בפגיעה במשטח העין של דגי הזברה באמצעות שחיקה כדי להעריך את סגירת הפצעים הבאים ברמה התאית. גישה זו מנצלת בר עיני כדי להסיר חלקית את אפיתל הקרנית ומשתמשת במיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת כדי לעקוב אחר שינויים במורפולוגיה של התא במהלך סגירת הפצע.
כמשטח השקוף של העין, הקרנית היא אינסטרומנטלית לראייה ברורה. בשל מיקומו, רקמה זו נוטה עלבונות סביבתיים. ואכן, פציעות העיניים הנתקלות לעתים קרובות ביותר מבחינה קלינית הן אלה לקרנית. בעוד שריפוי פצעי קרנית נחקר בהרחבה ביונקים קטנים (כלומר, עכברים, חולדות וארנבות), מחקרים בפיזיולוגיה של הקרנית הזניחו מינים אחרים, כולל דגי זברה, למרות שדגי זברה הם מודל מחקר קלאסי.
דו”ח זה מתאר שיטה לביצוע שחיקה בקרנית על דגי זברה. הפצע מבוצע ב vivo על דגים מרדימים באמצעות בר עינית. שיטה זו מאפשרת פצע אפיתל לשחזור, משאיר את שאר העין ללא פגע. לאחר שחיקה, סגירת הפצע מנוטרת במהלך 3 שעות, ולאחר מכן הפצע הוא reepithelialized. באמצעות סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים, ואחריו עיבוד תמונה, צורת תא האפיתל, בליטות apical ניתן לחקור כדי לחקור את השלבים השונים במהלך סגירת פצע אפיתל הקרנית.
המאפיינים של מודל דגי הזברה מאפשרים לחקור את הפיזיולוגיה של רקמת האפיתל ואת ההתנהגות הקולקטיבית של תאי האפיתל כאשר הרקמה מאותגרת. יתר על כן, השימוש במודל שנמנע מהשפעת סרט הדמעות יכול לייצר תשובות חדשות לגבי תגובת הקרנית ללחץ. לבסוף, מודל זה מאפשר גם את התיחום של האירועים התאיים והמולקולריים המעורבים בכל רקמת אפיתל הנתונה לפצע פיזי. שיטה זו יכולה להיות מיושמת להערכה של יעילות התרופה בבדיקות פרה קליניות.
כמו רוב האפיתליה נמצאים במגע עם הסביבה החיצונית, הם נוטים לפגיעה גופנית, מה שהופך אותם מתאימים היטב לחקר תהליכי ריפוי הפצע. בין הרקמות הנחקרות היטב, הקרנית היא מודל שימושי ביותר בחקירת ההיבטים התאיים והמולקולריים של ריפוי פצעים. כמשטח חיצוני שקוף, הוא מספק הגנה פיזית לעין והוא האלמנט הראשון שממקד את האור ברשתית. בעוד המבנה והרכב התאים של הרשתית שונים בין מינים1, יסודות אלה של הקרנית דומים בדרך כלל בכל העיניים מסוג המצלמה, ללא קשר למינים.
הקרנית מורכבת משלוש שכבות עיקריות2. השכבה הראשונה והחיצונית ביותר היא האפיתל, המתחדש כל הזמן כדי להבטיח את שקיפותו. השכבה השנייה היא הסטרומה, המכילה תאים מפוזרים, הנקראים קרטוציטים, בתוך שכבה עבה של סיבי קולגן מאורגנים בקפדנות. השכבה השלישית והפנימית ביותר היא האנדותל, המאפשרת דיפוזיה תזונתית ונוזלית מהתא הקדמי לשכבות החיצוניות. תאי האפיתל והסטרומליים מתקשרים באמצעות גורמי גדילה וציטוקינים3. אינטראקציה זו מודגשת על ידי אפופטוזיס מהירה והתפשטות עוקבת של קרטוציטים לאחר פגיעה אפיתל 4,5. במקרה של פצע עמוק יותר, כגון ניקוב, קרטוציטים לוקחים חלק פעיל בתהליך הריפוי6.
להיות במגע עם הסביבה החיצונית, פציעות פיזיות הקרנית שכיחות. רבים מהם נגרמים על ידי חפצים זרים קטנים7, כגון חול או אבק. הרפלקס של שפשוף העיניים יכול להוביל לשריטות אפיתל נרחבות ושיפוץ הקרנית8. על פי גודל הפצע ועומקו, פציעות פיזיות אלה כואבות ולוקח כמה ימים לרפא9. מאפייני ריפוי הפצע האופטימליים של מודל מקלים על הבנת ההיבטים התאיים והמולקולריים של סגירת הפצע. יתר על כן, מודלים כאלה הוכיחו גם שימושי לבדיקת מולקולות חדשות עם פוטנציאל להאיץ את ריפוי הקרנית, כפי שהוכח בעבר10,11.
הפרוטוקול המתואר כאן נועד להשתמש בדגי זברה כמודל רלוונטי לחקר פגיעה גופנית בקרנית. מודל זה נוח מאוד למחקרי סינון פרמקולוגיים שכן הוא מאפשר להוסיף מולקולות ישירות למי הטנק, ולכן, לבוא במגע עם קרנית מרפאת. הפרטים המפורטים כאן יסייעו למדענים לבצע את מחקריהם על מודל דגי הזברה. הפציעה in vivo מבוצעת עם בר עיני קהה. ניתן לנתח את ההשפעה על תאי האפיתל הסמוכים או במרחק ממנו על ידי הסרה ספציפית של אפיתל הקרנית המרכזי. בשנים האחרונות, דיווחים רבים התמקדו בשיטה כזו על קרנית מכרסמים 12,13,14,15,16,17; עם זאת, עד כה, רק דו”ח אחד יישם שיטה זו על דגי זברה18.
בגלל הפשטות שלה, הפצע הפיזי שימושי בתיחום התפקיד של תאי אפיתל בסגירת הפצע. מודל מבוסס נוסף של פגיעה בקרנית הוא הכוויה הכימית, במיוחד לשרוף אלקלי 19,20,21. עם זאת, גישה כזו פוגעת בעקיפין בכל פני השטח של העין, כולל הקרנית ההיקפית וסטרומה הקרנית19. ואכן, כוויות אלקלי עלולות לגרום לכיבים בקרנית, ניקובים, אטימות אפיתל וניאווסקולריזציה מהירה22, והתוצאה הבלתי נשלטת של כוויות אלקליות פוסלת גישה זו למחקרי ריפוי פצעים כלליים. שיטות רבות אחרות משמשות גם כדי לחקור ריפוי פצעי קרנית על פי המוקד המסוים של המחקר המדובר (למשל, פסולת אפיתל מלאה23, שילוב של פגיעה כימית ומכאנית עבור פצעבעובי חלקי 24, אבלציה לייזר excimer עבור פצעים המשתרעים על סטרומה25). השימוש בבר עיני מגביל את המוקד לתגובת האפיתל לפצע ומספק פצע רב לשחזור.
כמו בכל שיטה של גרימת פצע, השימוש בר עינית יש יתרונות וחסרונות. החיסרון העיקרי הוא כי התגובה להיות בעיקר אפיתל, זה לא משקף באופן מושלם את השריטות לראות בסביבה הקלינית. עם זאת, לשיטה זו יש יתרונות רבים, כולל הקלות שבה ניתן להגדיר ולבצע אותה, הדיוק שלה, הרבייה שלה, והעובדה שהיא לא פולשנית, מה שהופך אותה לשיטה נסבלת היטב על ידי בעלי חיים.
פציעות גופניות בקרנית הן הגורם הנפוץ ביותר לביקורי חולי עיניים בבית החולים. לכן, חשוב להקים מודלים רלוונטיים לחקר היבטים שונים של פתולוגיה הקרנית. עד כה, העכבר הוא המודל הנפוץ ביותר לחקר ריפוי פצעי הקרנית. עם זאת, הוספת טיפות עיניים על עיניים פגועות מורין כדי לאמת את ההשפעה של תרופות ספציפ?…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים לפרטי פנולה על הגישה ליחידת דגי הזברה ולהנרי קויבולה על ההדרכה והעזרה בניסויי דגי הזברה. מחקר זה נתמך על ידי האקדמיה של פינלנד, קרן ג’יין ואטוס ארקו, קרן התרבות הפינית ותוכנית ATIP-Avenir. ההדמיה בוצעה ביחידת מיקרוסקופיית האלקטרונים וביחידת מיקרוסקופיית האור, המכון לביוטכנולוגיה, בתמיכת HiLIFE וביו סנטר פינלנד.
0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 | in-house | Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4). | |
0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 | in-house | Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4). | |
0.5mm burr tips | Alger Equipment Company | BU-5S | |
1M Tris, pH 8.8 | in-house | ||
adhesive tabs | Agar Scientific | G3347N | |
Algerbrush burr, Complete instrument | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
Cotton swaps | Heinz Herenz Hamburg | 1030128 | |
Dissecting plate | in-house | ||
Dissecting tools | Fine Science Tools | ||
double-distilled water | in-house | ||
Eppedorf tubes, 2ml | any provider | ||
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma | A5040 | Caution: causes irritation. |
Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I | Sigma | G7651 | Caution: toxic. |
Lidocaine hydrochloride | Sigma | L5647 | Caution: toxic. |
mounts | Agar Scientific | G301P | |
Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
pH indicator strips | Macherey-Nagel | 92110 | |
Plastic spoons | any provider | ||
Plastic tubes, 15 ml | Greiner Bio-One | 188271 | |
Plastic tubes, 50 ml | Greiner Bio-One | 227261 | |
Scanning electron microscope | FEI | Quanta 250 FEG | |
Soft sponge | any provider | ||
Sputter coater | Quorum Technologies | GQ150TS | |
Stereomicroscope | Leica |