Zebrafish Corneal Wound Healing: Fra slitasje til sårlukking imaging analyse

Summary

Denne protokollen fokuserer på å skade den okulære overflaten av sebrafisk gjennom slitasje for å vurdere den påfølgende sårlukkingen på cellenivå. Denne tilnærmingen utnytter en okulær burr for delvis å fjerne hornhinnen epitel og bruker skanning elektronmikroskopi for å spore endringer i cellemorfologi under sårlukking.

Abstract

Som den gjennomsiktige overflaten av øyet er hornhinnen medvirkende for klart syn. På grunn av sin plassering er dette vevet utsatt for miljømessige fornærmelser. Faktisk er øyeskadene som oftest oppstår klinisk, de til hornhinnen. Mens hornhinnen sår healing har blitt grundig studert i små pattedyr (dvs. mus, rotter og kaniner), hornhinnen fysiologi studier har forsømt andre arter, inkludert sebrafisk, til tross for sebrafisk er en klassisk forskningsmodell.

Denne rapporten beskriver en metode for å utføre en hornhinne slitasje på sebrafisk. Såret utføres in vivo på bedøvet fisk ved hjelp av en okulær burr. Denne metoden gir mulighet for et reproduserbart epitelsår, slik at resten av øyet er intakt. Etter slitasje overvåkes sårlukking i løpet av 3 timer, hvorpå såret reepithelialiseres. Ved å bruke skanning elektronmikroskopi, etterfulgt av bildebehandling, kan epitelcelleformen og apikale fremspring undersøkes for å studere de ulike trinnene under hornhinnen epitelial sårlukking.

Egenskapene til sebrafiskmodellen tillater studie av epitelvevsfysiologien og epitelcellens kollektive oppførsel når vevet utfordres. Videre kan bruken av en modell fratatt påvirkning av tårefilmen gi nye svar angående hornhinnen respons på stress. Til slutt tillater denne modellen også avgrensning av cellulære og molekylære hendelser involvert i ethvert epitelvev utsatt for et fysisk sår. Denne metoden kan brukes til evaluering av legemiddeleffektivitet i preklinisk testing.

Introduction

Siden det meste av epithelia er i kontakt med det ytre miljø, er de utsatt for fysisk skade, noe som gjør dem godt egnet for studiet av sårhelingsprosesser. Blant de godt studerte vevene er hornhinnen en ekstremt nyttig modell i undersøkelsen av de cellulære og molekylære aspektene ved sårheling. Som en gjennomsiktig ekstern overflate gir den fysisk beskyttelse mot øyet og er det første elementet som fokuserer lyset på netthinnen. Mens strukturen og cellesammensetningen av netthinnen varierer mellom art¹, er disse elementene i hornhinnen generelt like i alle kamera-type øyne, uavhengig av arter.

Hornhinnen består av tre hovedlag². Det første og ytterste laget er epitelet, som stadig fornyes for å sikre gjennomsiktighet. Det andre laget er stroma, som inneholder spredte celler, kalt keratocytter, innenfor et tykt lag av strengt organiserte kollagenfibre. Det tredje og innerste laget er endotelet, som tillater næringsstoff og flytende diffusjon fra det fremre kammeret til de ytre lagene. Epitelceller og stromale celler samhandler via vekstfaktorer og cytokiner³. Denne interaksjonen fremheves av rask apoptose og påfølgende spredning av keratocytter etter epitelskade ^4,5. Ved et dypere sår, for eksempel en punktering, tar keratocytter en aktiv rolle i helbredelsesprosessen⁶.

Å være i kontakt med det ytre miljø, hornhinnen fysiske skader er vanlig. Mange av dem er forårsaket av små fremmedlegemer⁷, for eksempel sand eller støv. Refleksen av øye gnidning kan føre til omfattende epitel slitasje og hornhinnen ombygging⁸. Ifølge sårstørrelse og dybde er disse fysiske skadene smertefulle og tar flere dager å helbrede⁹. De optimale sårhelingsegenskapene til en modell letter forståelsen av de cellulære og molekylære aspektene ved sårlukking. Videre har slike modeller også vist seg nyttige for å teste nye molekyler med potensial til å akselerere hornhinneheling, som tidligere demonstrert^10,11.

Protokollen beskrevet her tar sikte på å bruke sebrafisk som en relevant modell for å studere hornhinnen fysisk skade. Denne modellen er svært praktisk for farmakologiske screeningstudier, da den gjør det mulig å legge molekyler direkte til tankvannet og derfor komme i kontakt med en helbredende hornhinne. Detaljene som er gitt her, vil hjelpe forskere med å utføre sine studier på sebrafiskmodellen. In vivo-skaden utføres med en kjedelig okulær burr. Virkningen på epitelceller ved siden av eller i avstand fra det kan analyseres ved å spesifikt fjerne det sentrale hornhinnen epitel. I de senere år fokuserte mange rapporter på en slik metode på gnager hornhinne 12,13,14,15,16,17; Til dags dato har imidlertid bare en enkelt rapport brukt denne metoden på sebrafisk¹⁸.

På grunn av sin enkelhet er det fysiske såret nyttig for å avgrense rollen som epitelceller i sårlukking. En annen veletablert modell av hornhinneskade er kjemisk brenning, spesielt alkalisk brenning 19,20,21. Imidlertid skader en slik tilnærming indirekte hele øyeoverflaten, inkludert perifer hornhinne og hornhinnen stroma¹⁹. Faktisk, alkali brenner potensielt indusere hornhinnen sår, perforeringer, epitelial opacification, og rask neovascularization²², og det ukontrollerbare utfallet av alkali brenner diskvalifiserer den tilnærmingen for generelle sår healing studier. Tallrike andre metoder brukes også til å undersøke hornhinnen sårheling i henhold til det spesielle fokuset i den aktuelle studien (f.eks. fullstendig epitelial debridement²³, kombinasjonen av kjemisk og mekanisk skade for delvis tykkelse sår²⁴, excimer laser ablasjon for sår som strekker seg til stroma²⁵). Bruken av en okulær burr begrenser fokuspunktet til epitelresponsen på såret og gir et svært reproduserbart sår.

Som med hver metode for sårpåføring, har bruken av en okulær burr fordeler og ulemper. Den største ulempen er at responsen for det meste er epitelial, det gjenspeiler ikke perfekt slitasjene sett i den kliniske settingen. Denne metoden har imidlertid mange fordeler, inkludert hvor enkelt den kan settes opp og utføres, dens presisjon, dens reproduserbarhet og det faktum at den ikke er invasiv, noe som gjør den til en metode som tolereres godt av dyr.

Protocol

Alle eksperimenter ble godkjent av det nasjonale dyreeksperimentstavlen. 1. Forberedelser Forbered trikainbestandsløsningen som brukes til anestesi26 på forhånd (0,4% lagerløsning som brukes i denne protokollen). Bruk hansker og oppbevar materialene i en avtrekkshette når det er mulig. For 50 ml av en 0,4% løsning, vei 200 mg trikainpulver i et 50 ml rør. Løs pulveret i ca. 45 ml dobbeltdestillert vann. Juster pH i t…

Representative Results

Denne studien beskriver en metode ved hjelp av en oftalmisk burr i sebrafisk hornhinnen sår healing eksperimenter. Metoden er modifisert fra tidligere studier på mus, hvor burr ble vist å fjerne epitelcellelagene effektivt13. Utfordringene i sebrafisk hornhinnen sår inkluderer den relativt små størrelsen på øyet, og i tilfelle av tidkrevende eksperimenter, behovet for å opprettholde en konstant vannstrøm gjennom gjellene (som beskrevet av Xu og kolleger28). De vik…

Discussion

Hornhinnen fysiske skader er den vanligste årsaken til oftalmologi pasientbesøk til sykehuset. Derfor er det viktig å etablere relevante modeller for studiet av ulike aspekter av hornhinnen patofysiologi. Så langt er musen den mest brukte modellen for studiet av hornhinnen sårheling. Men å legge øyedråper på murine sårede øyne for å validere virkningen av spesifikke stoffer på hornhinnen sårheling kan være vanskelig. I denne forbindelse er sebrafiskmodellen spesielt nyttig for farmakologisk screening av mo…

Materials

0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4	in-house		Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4	in-house		Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4).
0.5mm burr tips	Alger Equipment Company	BU-5S
1M Tris, pH 8.8	in-house
adhesive tabs	Agar Scientific	G3347N
Algerbrush burr, Complete instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Cotton swaps	Heinz Herenz Hamburg	1030128
Dissecting plate	in-house
Dissecting tools	Fine Science Tools
double-distilled water	in-house
Eppedorf tubes, 2ml	any provider
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma	A5040	Caution: causes irritation.
Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I	Sigma	G7651	Caution: toxic.
Lidocaine hydrochloride	Sigma	L5647	Caution: toxic.
mounts	Agar Scientific	G301P
Petri dish	Thermo Scientific	101VR20
pH indicator strips	Macherey-Nagel	92110
Plastic spoons	any provider
Plastic tubes, 15 ml	Greiner Bio-One	188271
Plastic tubes, 50 ml	Greiner Bio-One	227261
Scanning electron microscope	FEI	Quanta 250 FEG
Soft sponge	any provider
Sputter coater	Quorum Technologies	GQ150TS
Stereomicroscope	Leica