Detta protokoll fokuserar på att skada zebrafiskens okulära yta genom nötning för att bedöma den efterföljande sårförslutningen på cellulär nivå. Detta tillvägagångssätt utnyttjar en okulär burr för att delvis avlägsna hornhinnans epitel och använder svepelektronmikroskopi för att spåra förändringar i cellmorfologi under sårförslutning.
Som ögats genomskinliga yta är hornhinnan avgörande för klar syn. På grund av sin plats är denna vävnad benägen för miljöförolämpningar. Faktum är att de ögonskador som oftast uppstår kliniskt är de till hornhinnan. Medan hornhinnans sårläkning har studerats i stor utsträckning hos små däggdjur (dvs. möss, råttor och kaniner), har hornhinnefysiologiska studier försummat andra arter, inklusive zebrafisk, trots att zebrafisk är en klassisk forskningsmodell.
Denna rapport beskriver en metod för att utföra en hornhinnnötning på zebrafisk. Såret utförs in vivo på sövd fisk med användning av en okulär burr. Denna metod möjliggör ett reproducerbart epitelsår och lämnar resten av ögat intakt. Efter nötning övervakas sårförslutning under 3 timmar, varefter såret reepitelialiseras. Genom att använda svepelektronmikroskopi, följt av bildbehandling, kan epitelcellformen och apikala utsprång undersökas för att studera de olika stegen under hornhinnans epitelsårstängning.
Egenskaperna hos zebrafiskmodellen möjliggör studier av epitelvävnadsfysiologin och epitelcellernas kollektiva beteende när vävnaden utmanas. Dessutom kan användningen av en modell som berövas tårfilmens inflytande ge nya svar om hornhinnans svar på stress. Slutligen tillåter denna modell också avgränsningen av de cellulära och molekylära händelserna som är involverade i någon epitelvävnad som utsätts för ett fysiskt sår. Denna metod kan tillämpas på utvärdering av läkemedelseffektivitet vid preklinisk testning.
Eftersom de flesta epitelerna är i kontakt med den yttre miljön är de benägna att skadas fysiskt, vilket gör dem väl lämpade för studier av sårläkningsprocesser. Bland de välstuderade vävnaderna är hornhinnan en extremt användbar modell vid undersökningen av de cellulära och molekylära aspekterna av sårläkning. Som en transparent yttre yta ger den fysiskt skydd för ögat och är det första elementet som fokuserar ljuset på näthinnan. Medan näthinnans struktur och cellsammansättning skiljer sig åt mellan arter1, är dessa element i hornhinnan i allmänhet lika i alla kameratypsögon, oavsett art.
Hornhinnan består av tre huvudlager2. Det första och yttersta lagret är epitelet, som ständigt förnyas för att säkerställa dess transparens. Det andra skiktet är stroma, som innehåller spridda celler, kallade keratocyter, inom ett tjockt lager av strikt organiserade kollagenfibrer. Det tredje och innersta skiktet är endotelet, vilket möjliggör närings- och vätskediffusion från den främre kammaren till de yttre skikten. Epitel- och stromacellerna interagerar via tillväxtfaktorer och cytokiner3. Denna interaktion framhävs av den snabba apoptosen och efterföljande proliferation av keratocyter efter epitelskada 4,5. Vid ett djupare sår, såsom en punktering, tar keratocyter en aktiv roll i läkningsprocessen6.
Att vara i kontakt med den yttre miljön är fysiska skador på hornhinnan vanliga. Många av dem orsakas av små främmande föremål7, såsom sand eller damm. Reflexen av ögongnuggning kan leda till omfattande epitelnötning och hornhinneremodellering8. Enligt sårstorlek och djup är dessa fysiska skador smärtsamma och tar flera dagar att läka9. De optimala sårläkningsegenskaperna hos en modell underlättar förståelsen av de cellulära och molekylära aspekterna av sårförslutning. Dessutom har sådana modeller också visat sig vara användbara för att testa nya molekyler med potential att påskynda hornhinneläkning, vilket tidigare visat 10,11.
Protokollet som beskrivs här syftar till att använda zebrafisk som en relevant modell för att studera fysisk skada på hornhinnan. Denna modell är mycket lämplig för farmakologiska screeningstudier eftersom den gör det möjligt att tillsätta molekyler direkt till tankvattnet och därför komma i kontakt med en helande hornhinna. Detaljerna som tillhandahålls här kommer att hjälpa forskare att utföra sina studier på zebrafiskmodellen. In vivo-skadan utförs med en tråkig okulär burr. Påverkan på epitelceller som gränsar till eller på avstånd från den kan analyseras genom att specifikt avlägsna det centrala hornhinneepitelet. Under de senaste åren har många rapporter fokuserat på en sådan metod på gnagare hornhinna 12,13,14,15,16,17; Hittills har dock endast en enda rapport tillämpat denna metod på zebrafisk18.
På grund av sin enkelhet är det fysiska såret användbart för att avgränsa epitelcellernas roll i sårförslutning. En annan väletablerad modell av hornhinneskada är den kemiska bränningen, särskilt alkaliförbränningen 19,20,21. Ett sådant tillvägagångssätt skadar emellertid indirekt hela ögonytan, inklusive perifer hornhinna och hornhinnan stroma19. Faktum är att alkalibrännskador potentiellt inducerar hornhinnesår, perforeringar, epitelial opacifiering och snabb neovaskularisering22, och det okontrollerbara resultatet av alkalibrännskador diskvalificerar det tillvägagångssättet för allmänna sårläkningsstudier. Många andra metoder används också för att undersöka sårläkning av hornhinnan enligt den aktuella studiens särskilda fokus (t.ex. fullständig epiteldebridering23, kombinationen av kemisk och mekanisk skada för partiell tjocklek sår24, excimerlaserablation för sår som sträcker sig till stroma25). Användningen av en okulär burr begränsar brännpunkten till epitelsvaret på såret och ger ett mycket reproducerbart sår.
Som med varje metod för sårföring har användningen av en okulär burr fördelar och nackdelar. Den största nackdelen är att svaret mestadels är epitelialt, det återspeglar inte perfekt de nötningar som ses i den kliniska miljön. Denna metod har emellertid många fördelar, inklusive den lätthet med vilken den kan ställas in och utföras, dess precision, dess reproducerbarhet och det faktum att den är icke-invasiv, vilket gör den till en metod som tolereras väl av djur.
Hornhinneskador är den vanligaste orsaken till oftalmologiska patientbesök på sjukhuset. Därför är det viktigt att fastställa relevanta modeller för studier av olika aspekter av hornhinnans patofysiologi. Hittills är musen den vanligaste modellen för studier av hornhinnans sårläkning. Att lägga till ögondroppar på murina sårade ögon för att validera effekten av specifika läkemedel på hornhinnans sårläkning kan dock vara svårt. I detta avseende är zebrafiskmodellen särskilt användbar för farmako…
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Pertti Panula för tillgången till zebrafiskenheten och Henri Koivula för vägledningen och hjälpen med zebrafiskexperimenten. Forskningen stöddes av Finlands Akademi, Jane och Aatos Erkkos Stiftelse, Finska kulturfonden och ATIP-Avenir-programmet. Avbildningen utfördes vid elektronmikroskopienheten och ljusmikroskopienheten, Institutet för bioteknik, med stöd av HiLIFE och Biocenter Finland.
0.1M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 | in-house | Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4). | |
0.2M Na-PO4 (sodium phosphate buffer), pH 7.4 | in-house | Solution is prepared from 1M sodium phosphate buffer (1M Na2HPO4 adjusted to pH 7.4 with 1M NaH2PO4). | |
0.5mm burr tips | Alger Equipment Company | BU-5S | |
1M Tris, pH 8.8 | in-house | ||
adhesive tabs | Agar Scientific | G3347N | |
Algerbrush burr, Complete instrument | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
Cotton swaps | Heinz Herenz Hamburg | 1030128 | |
Dissecting plate | in-house | ||
Dissecting tools | Fine Science Tools | ||
double-distilled water | in-house | ||
Eppedorf tubes, 2ml | any provider | ||
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma | A5040 | Caution: causes irritation. |
Glutaraldehyde, 50% aqueous solution, grade I | Sigma | G7651 | Caution: toxic. |
Lidocaine hydrochloride | Sigma | L5647 | Caution: toxic. |
mounts | Agar Scientific | G301P | |
Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
pH indicator strips | Macherey-Nagel | 92110 | |
Plastic spoons | any provider | ||
Plastic tubes, 15 ml | Greiner Bio-One | 188271 | |
Plastic tubes, 50 ml | Greiner Bio-One | 227261 | |
Scanning electron microscope | FEI | Quanta 250 FEG | |
Soft sponge | any provider | ||
Sputter coater | Quorum Technologies | GQ150TS | |
Stereomicroscope | Leica |