Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

توليد النمط لمجهر الجر المجهري

Published: February 17, 2022 doi: 10.3791/63628
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Boston University

Summary

نحن نصف التحسينات التي أدخلت على طريقة قياسية لقياس قوى الجر الخلوي ، استنادا إلى طباعة التلامس الدقيق مع خطوة نقش طرح واحدة من صفائف نقطية من بروتينات المصفوفة خارج الخلية على الهلاميات المائية اللينة. تسمح هذه الطريقة بتصنيع أبسط وأكثر اتساقا لأنماط الجزر ، وهو أمر ضروري للتحكم في شكل مجموعة الخلايا.

Abstract

يسمح الفحص المجهري للجر المجهري بالتحكم في شكل الخلايا المفردة ومجموعات الخلايا. علاوة على ذلك ، فإن القدرة على النمط على مقياس طول الميكرومتر تسمح باستخدام مناطق التلامس المنقوشة هذه لقياس قوى الجر ، حيث تسمح كل نقطة مجهرية بتكوين التصاق بؤري واحد يشوه بعد ذلك الهيدروجيل الناعم الأساسي. وقد استخدم هذا النهج لمجموعة واسعة من أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا البطانية، وخلايا العضلات الملساء، والخلايا الليفية، والصفائح الدموية، والخلايا الظهارية.

تصف هذه المراجعة تطور التقنيات التي تسمح بطباعة بروتينات المصفوفة خارج الخلية على هيدروجيل بولي أكريلاميد في مجموعة منتظمة من النقاط ذات الحجم والتباعد المحددين مسبقا. نظرا لأنه من الصعب طباعة أنماط مقياس الميكرومتر مباشرة على ركائز ناعمة ، يتم إنشاء الأنماط أولا على أغطية زجاجية صلبة يتم استخدامها بعد ذلك لنقل النمط إلى الهيدروجيل أثناء الهلام. أولا ، يتم وصف نهج الطباعة microcontact الأصلي لإنشاء صفائف من النقاط الصغيرة على coverslip. هناك حاجة إلى خطوة ثانية تزيل معظم النمط لترك جزر من النقاط الصغيرة للتحكم في أشكال الخلايا ومجموعات الخلايا على هذه المصفوفات من النقاط المنقوشة.

بعد ذلك ، يتم وصف تطور هذا النهج الذي يسمح بتوليد جزر من النقاط باستخدام خطوة نمط طرح واحدة. يتم تبسيط هذا النهج إلى حد كبير للمستخدم ولكن له عيب انخفاض العمر الافتراضي للقالب الرئيسي اللازم لصنع الأنماط. وأخيرا، يتم وصف النهج الحسابية التي تم تطويرها لتحليل صور النقاط النازحة وحقول الجر اللاحقة التي تولدها الخلايا، ويتم توفير نسخ محدثة من حزم التحليل هذه.

Introduction

تمارس معظم الأنماط الظاهرية للخلايا قوى الجر على بيئتها. يتم توليد قوى الجر هذه بواسطة الهيكل الخلوي المتقلص للخلية ، وهو عبارة عن شبكة من الأكتين والميوسين ، والبوليمرات الحيوية الخيطية الأخرى والبروتينات المتقاطعة1،2،3،4. يمكن أن تنتقل القوى المتولدة داخل الخلية إلى البيئة خارج الخلية أو الخلايا المجاورة ، في المقام الأول عن طريق البروتينات عبر الغشاء مثل integrins و cadherins ، على التوالي 5,6. إن كيفية انتشار الخلية أو انكماشها - وأحجام قوى الجر المرتبطة بتلك الحركات - هي نتيجة لمحادثة حميمة مع بيئتها ، والتي تعتمد إلى حد كبير على نوع وكمية البروتين الموجود في المصفوفة خارج الخلية (ECM) 7,8 وصلابة ECM. في الواقع ، أصبح الفحص المجهري لقوة الجر أداة لا تقدر بثمن لفهم استجابة الخلايا للمحفزات المحلية مثل صلابة الركيزة ، أو الضغوط الميكانيكية المفروضة والسلالات ، أو الاتصال بالخلايا الأخرى. هذه المعلومات ذات صلة مباشرة بفهم أمراض مثل السرطان والربو9،10،11،12.

مطلوب نظام يمكن استخدامه لقياس التشوه الناجم عن القوة لركيزة من خصائص المواد المعروفة لحساب قوى الجر. يجب تتبع هذه التغييرات بمرور الوقت ، مما يتطلب تقنيات التصوير ومعالجة الصور. كانت إحدى الطرق الأولى المستخدمة لتحديد قوى الجر الخلوي هي مراقبة وتحليل تقلص هيدروجيل الكولاجين المزروع بالخلايا ، على الرغم من أن هذه الطريقة كانت شبه كميةفقط 13. طريقة أخرى أكثر دقة هي قياس قوى الجر التي تمارسها الخلايا المفردة عن طريق تحديد القوى الناتجة عن تشوه ورقة رقيقة من السيليكون14. في وقت لاحق ، تم تطوير المزيد من تقنيات القياس الكمي ، وسمحت هذه الطرق أيضا باستخدام الهلاميات المائية اللينة مثل polyacrylamide (PAA) 12،15،16. عند استخدام هذه المواد اللينة ، يمكن تحديد قوى الجر من الإزاحة الناجمة عن القوة للخرز النازح عشوائيا المضمن في الهيدروجيل والخواص الميكانيكية للهلام16,17. وجاء تقدم آخر مع تطوير صفائف micropost مصنوعة من البولي ديميثيل سيلوكسان الناعم (PDMS) بحيث يمكن قياس انحرافها وتحويله إلى قوة باستخدام نظرية الحزمة18.

وأخيرا ، تم تطوير طرق للتنميط الدقيق للهيدروجيل اللينة لأن هذه الأساليب تسمح بالتحكم في مناطق التلامس للالتصاق الخلايا. من خلال قياس تشوه النمط المجهري داخل منطقة ملامسة الخلية ، يمكن بسهولة حساب قوى الجر لأن الصورة المرجعية الخالية من القوة ليست مطلوبة19. تم اعتماد هذه الطريقة على نطاق واسع لأنها تسمح بالتنميط غير المباشر لمجموعة منتظمة من نقاط التصاق البروتين الفلوري المنفصلة بحجم ميكرون على المواد الهلامية PAA لقياس قوى الجر الخلوي20. لحساب هذه القوى ، تم تطوير خوارزمية معالجة الصور ، والتي يمكنها تتبع حركات كل نقطة دقيقة دون الحاجة إلى إدخال المستخدم ،21.

في حين أن هذه الطريقة بسيطة لإنشاء شبكات كاملة من أنماط النقاط ، إلا أنها أكثر تعقيدا عندما تكون أنماط البقع المعزولة (أو الجزر) من النقاط مطلوبة. الجزر ذات الأنماط الدقيقة مفيدة عندما تكون هناك حاجة إلى التحكم في شكل مجموعات الخلايا ، وإلى حد ما من حيث الحجم. لإنشاء هذه الجزر ، تتطلب الطريقة المذكورة أعلاه للطباعة microcontact خطوتين متميزتين: i) استخدام ختم PDMS واحد لإنشاء نمط عالي الدقة من النقاط على غطاء ، ثم ii) استخدام ختم PDMS مختلف ثان لإزالة معظم تلك النقاط ، تاركا وراءه جزرا معزولة من النقاط21. وتتفاقم صعوبة إنشاء الجزر بهذه الطريقة الأصلية بسبب حقيقة أن إنشاء أنماط شبكة متسقة في الخطوة الأولى من العملية يمثل تحديا من تلقاء نفسه. تتكون طوابع الطباعة الدقيقة من مجموعة من الأعمدة الدقيقة الدائرية ، التي يتوافق قطرها مع حجم النقطة المطلوب. ثم يتم طلاء هذه الطوابع بطبقة متساوية من البروتين ثم يتم ختمها بكمية دقيقة من الضغط على الأغطية المعالجة لإنشاء النمط المطلوب. من ناحية ، يمكن أن يؤدي تطبيق الكثير من الضغط على الختم إلى نقل البروتين بشكل غير متساو وضعف دقة النمط بسبب التواء العمود أو ترهله بين الأعمدة ، مما يؤدي إلى ملامسة الزجاج. من ناحية أخرى ، يؤدي تطبيق ضغط قليل جدا إلى نقل البروتين أو عدم نقله على الإطلاق وضعف دقة الأنماط. لهذه الأسباب ، من المرغوب فيه إجراء عملية نقل يمكن استخدامها لإنشاء أنماط دقيقة عالية الجودة باستمرار لجزر النقاط المعزولة في خطوة واحدة فقط.

هنا ، يتم وصف طريقة للتنميط الدقيق غير المباشر لجزر من نقاط التصاق البروتين الفلوري بحجم ميكرون على هلام PAA أكثر اتساقا وتنوعا من الطرق التي تم تطويرها سابقا. في حين أن طرق التنميط المجهري غير المباشرة القديمة تعتمد على نقل أنماط البروتين من ختم PDMS إلى ركيزة وسيطة ، فإن الطريقة المقدمة هنا تستخدم طوابع PDMS بدلا من ذلك كوعاء لإزالة البروتين ، وليس الإضافة. يتم ذلك عن طريق تغيير هيكل طوابع PDMS المستخدمة بشكل أساسي. بدلا من صنع الطوابع التي تتكون من نمط من الأعمدة الدائرية المتباعدة بالتساوي ، تتكون الطوابع من نمط من الثقوب الدائرية المتباعدة بالتساوي في هذه الطريقة.

مع هذا الهيكل الجديد ، يمكن بعد ذلك معالجة سطح طوابع PDMS هذه باستخدام glutaraldehyde كما هو موضح سابقا20,29,30 ، مما يجعل الطابع قادرا على الارتباط تساهميا مع البروتين. عند استخدامها على غطاء زجاجي مطلي بالتساوي بالبروتين الفلورسنت ، يتم استخدام طوابع PDMS المعالجة بالغوتارالدهيد لإزالة معظم البروتين الموجود على سطح الغطاء ، تاركة وراءها فقط النمط المطلوب من النقاط المحددة مسبقا من خلال موقع الثقوب بحجم ميكرون على الختم. يزيد هذا التغيير من معدل النجاح لتوليد أنماط تتكون من شبكة شبه مستمرة من النقاط وإنشاء جزر معزولة من النقاط من خلال خطوة واحدة فقط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إنشاء سادة السيليكون

ملاحظة: تمت تغطية معظم عملية تصميم وإنشاء واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لسادة السيليكون للصب المتكرر لطوابع PDMS سابقا21 ، لذلك سيتم وصف الاختلافات الرئيسية فقط في هذا النهج الجديد هنا.

  1. قم بإنشاء تصميم قناع الصور باستخدام AutoCAD أو برنامج تصميم مشابه. قم بتغطية جانب واحد من القناع الضوئي ، وهو قطعة رقيقة من الزجاج ، بطبقة رقيقة من الكروم للتحكم في تشتت الأشعة فوق البنفسجية. صمم القناع الضوئي بحيث يؤدي تسليط ضوء الأشعة فوق البنفسجية من خلاله على مقاومة الضوء المختارة إلى إنشاء سيد سيليكون مع عكس الميزات المطلوبة على طوابع PDMS النهائية. انظر الشكل 1 لتصميم هذا القناع.
    ملاحظة: ما إذا كان ينبغي جعل الميزات المطلوبة أو المنطقة الموجودة خارجها شفافة على القناع الضوئي يعتمد على مقاومة الضوء المختارة. مقاومة الضوء المستخدمة هنا هي SU-8 2005 (تحذير: مهيجة للجلد والعين قابلة للاشتعال ؛ الابتعاد عن الحرارة / اللهب / الشرر واستخدام قفازات واقية ونظارات عند التعامل) ، وهي مقاومة سلبية للضوء قادرة على جعل ميزات طولها 5 ميكرومتر مع جدران جانبية شبه عمودية.
    1. علاج مقاومة الضوء السلبية عن طريق تعريضها للأشعة فوق البنفسجية وإزالة SU-8 غير المعالج بمذيب كيميائي. لذلك ، صمم الميزات الأساسية للقناع لتكون شفافة بينما تكون المنطقة المحيطة بالقناع غير شفافة.
    2. بالنسبة لطريقة الإزالة الجديدة هذه ، صمم القناع الضوئي بحيث يتكون من مربعين بحجم 1.5 × 1.5 سم (الشكل 1A) ، أحدهما مليء بشبكة متساوية من دوائر 2 ميكرومتر متباعدة من 6 ميكرومتر إلى الوسط ، والآخر يتكون من العديد من الجزر المربعة التي هي إصدارات أصغر ومعزولة من نفس نمط الشبكة (الشكل 1B). اصنع جزرا بالأحجام التالية: 6 × 6 نقاط ، 12 × 12 نقطة ، 25 × 25 نقطة ، و 42 × 42 نقطة.
      ملاحظة: تم اختيار قطر نقاط الالتصاق (2 ميكرومتر) بناء على دراسات سابقة قاست قوى الجر الخلوي22,23. القناع المستخدم هنا هو 101.6 × 101.6 مم وهو مطلي على جانب واحد بطبقة سميكة 0.06 ميكرومتر من الكروم ، وهو أمر موصى به بسبب الميزات الصغيرة للسيد. تم تكليف القناع الضوئي المستخدم هنا من شركة طباعة Photomask خارجية.
  2. داخل غرفة الأبحاث ، قم بتغطية رقاقة السيليكون المختارة بالتساوي بمقاومة للضوء. كخطوة اختيارية ، عالج الرقاقة السطحية في آشر البلازما قبل طلائها بالمقاومة.
    ملاحظة: هنا ، يتم استخدام رقائق قطرها 100 مم. العلاج في آشر البلازما يجعل الرقاقة أكثر قابلية للارتباط ب SU-8 ويساعد على منع إزالة SU-8 من الرقاقة.
  3. قم بتنفيذ الخطوات التالية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة للمقاومة للضوء:
    1. قم بتدوير الرقاقة المطلية لإنشاء سمك الميزة المطلوب ، مع تغيير وقت الدوران بناء على السمك المطلوب ونوع المقاومة. بالنسبة ل SU-8 2005 بسماكة 5 ميكرومتر ، قسم برنامج الدوران الموصى به إلى الخطوات الثلاث التالية:
      1. قم بتغطية الرقاقة بمقاومة للضوء عن طريق الدوران بسرعة 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان مع منحدر يبلغ 100 دورة في الدقيقة / ثانية.
      2. قلل سمك المقاومة إلى حوالي 5 ميكرومتر عن طريق تدوير الرقاقة عند 3000 دورة في الدقيقة مع منحدر يبلغ 300 دورة في الدقيقة / ثانية لمدة 30 ثانية.
      3. قم بإبطاء الرقاقة ببطء بعد الدوران عن طريق تقليل السرعة إلى 0 RMP مع منحدر يبلغ 500 دورة في الدقيقة / ثانية لمدة 1 ثانية.
    2. قم بإعداد المقاومة للتعرض للأشعة فوق البنفسجية عن طريق خبزها لفترة وجيزة على صفيحة ساخنة 95 درجة مئوية. تعديل الوقت المستغرق على السخان وفقا للسمك المطلوب للمقاومة ؛ وقت الخبز هو 2 دقيقة ل SU-8 2005 بسماكة 5 ميكرومتر.
    3. تعريض المقاومة للأشعة فوق البنفسجية لعلاج الميزات المطلوبة تماما. كن حذرا من التعرض المفرط ، لأن هذا يمكن أن يجعل SU-8 هشا ويؤثر على الجودة الشاملة للسيد الناتج.
      1. استخدم طاقة التعرض البالغة 105 مللي جول/سم2 لطائرة SU-8 2005 بسماكة 5 ميكرومتر. استنادا إلى قوة مصباح الأشعة فوق البنفسجية المتاح، احسب وقت التعرض عن طريق قسمة طاقة التعرض على قوة المصباح بالميجاوات.
        ملاحظة: نظرا لأن المصباح المستخدم هنا تبلغ قوته 8 ميجاوات، يجب أن يكون وقت التعرض 13.1 ثانية.
    4. لضبط ميزات SU-8 بعد التطوير ، اخبز مرة أخرى على صفيحة ساخنة 95 درجة مئوية ، هذه المرة لمدة 3 دقائق. انتظر حتى تظهر الميزات المطلوبة للسيد في غضون 1 دقيقة خلال خطوة الخبز هذه إذا تم الكشف عن المقاومة بشكل صحيح.
    5. قم بإزالة SU-8 غير المعالج من رقاقة السيليكون باستخدام مطور SU-8. كن دقيقا عند إزالة SU-8 غير المعالج ، حيث يمكن أن تتعثر بين الميزات بحجم ميكرون ومتباعدة على الرقاقة.
      تحذير: مطور SU-8 هو مهيج للجلد والعين قابل للاشتعال. احفظه بعيدا عن الحرارة / اللهب / الشرر واستخدم قفازات واقية ونظارات عند التعامل معه.
    6. بعد التطوير ، اشطف بالأسيتون لإزالة المطور الزائد على الرقاقة وتجفيفه تماما باستخدام مسدس رش النيتروجين.
      تحذير: الأسيتون هو مهيج للجلد والعين قابل للاشتعال. احفظه بعيدا عن اللهب / الشرر واستخدم قفازات واقية ونظارات عند التعامل معه.
    7. اختياريا ، بالنسبة ل SU-8 2005 ، اخبز على صفيحة ساخنة 200 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: يضيف هذا الخبز الصلب قوة ميكانيكية إلى مقاومة الضوء.
  4. بعد السماح لها بالتبريد، ضع الرقاقة في صينية حاملة للرقاقة ثم صبها في PDMS. أولا ، أكمل معالجة السيلانات على الرقاقة لجعل ميزات SU-8 لسيد السيليكون أقل عرضة للارتباط ب PDMS وبالتالي أقل عرضة للإزالة من سطح الرقاقة.
    1. لإكمال معالجة سطح السيلان، ضع السيلان وغطاء زجاجي صغير داخل مجفف مخصص للاستخدام مع السيلانات فقط. ضع 1-2 قطرات صغيرة من Trichloro (1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl) silane على الغطاء ، وأغلق المجفف ، وقم بتشغيله تحت الفراغ لمدة 30 دقيقة عند ضغط 4500 باسكال24.
      تحذير: تريكلورو (1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl) silane هو مهيج للجلد والعين قابل للاشتعال. احفظه بعيدا عن الحرارة / اللهب / الشرر ، واستخدم قفازات واقية ونظارات عند التعامل معها ، واعمل تحت غطاء الدخان.
    2. أطفئ الفراغ واترك المفتاح والغطاء في المجفف لمدة 30 دقيقة أخرى.
      ملاحظة: الرئيسي جاهز الآن للصب في PDMS.

2. طرح الطباعة microcontact

  1. امزج PDMS في النسبة الصحيحة لعامل المعالجة إلى القاعدة بناء على تعليمات الشركة المصنعة. اتركه في درجة حرارة الغرفة والضغط لمدة 15 دقيقة ؛ ثم ، degas تحت فراغ لمدة 15 دقيقة.
  2. صب PDMS في السيد ووضعها في حاضنة مضبوطة على 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها للعلاج.
  3. قم بإزالة المعلم من الحاضنة واتركه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
  4. بينما يبرد المعلم ، يقوم بتغطية سونيكات 25 مم في الإيثانول لمدة 10 دقائق. استخدم أكبر عدد ممكن من الأغطية مثل عدد الطوابع التي يتم إعدادها.
  5. اشطف الأغطية مقاس 25 مم جيدا بالماء منزوع الأيونات (DI) وجففها باستخدام مسدس هواء مفلتر.
  6. تعالج البلازما الأغطية لمدة 1 دقيقة باستخدام مكنسة بلازما تحت المكنسة الكهربائية على ارتفاع (قوة تردد لاسلكي تبلغ 30 واط). تأكد من تحرير الفراغ ببطء بعد العلاج لمنع انزلاقات الغطاء من التحرك داخل الغرفة.
    ملاحظة: تخدم المعالجة البلازمية لسطح الزجاج غرضين: فهي تنظف سطح الزجاج لإزالة الملوثات وتولد مجموعات قطبية قائمة على الأكسجين على سطح الزجاج لجعله كارها للماء25. هذا الكارهة للماء يجعل سطح الزجاج أكثر قابلية لربط البروتين.
  7. في غرفة خالية من أشعة الشمس المباشرة / الإضاءة العلوية ، قم بتغطية كل غطاء ب 100 ميكرولتر من محلول البروتين المسمى بالفلورسنت بتركيز لا يقل عن 100 ميكروغرام / مل ، وقم بتغطيته لحماية إضافية من الضوء واتركه لمدة 20 دقيقة.
    ملاحظة: هنا ، يتم استخدام الفيبرونيكتين المعزول من البلازما البشرية والمصبوغ باستخدام AlexaFluor 488.
    1. لصبغ الفيبرونيكتين ، اجمع بين الفيبرونيكتين غير المسمى بالتركيز والحجم المعروفين مع الكمية المناسبة من صبغة الفلورسنت في أنبوب 1.5 مل. قم بتغطية الأنبوب بورق الألومنيوم لحماية الصبغة من الضوء واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة ، مع خلطها بلطف كل 10 دقائق عن طريق قلب الأنبوب رأسا على عقب 5-10 مرات.
      ملاحظة: تختلف كمية الصبغة المطلوبة بناء على الصبغة المستخدمة وكتلة البروتين المستخدمة. راجع الملف التكميلي 1 للاطلاع على الآلة الحاسبة المستخدمة لتحديد الكمية المناسبة من صبغة الفيبرونيكتين الموسومة ب Alexa 488. وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، يمكن تصفية الصبغة الزائدة باستخدام أعمدة تحلية المياه (انظر جدول المواد).
  8. اشطف كل غطاء جيدا بماء DI ، وأزل الماء الزائد من السطح عن طريق النقر بلطف على جانبي كل غطاء على منشفة ورقية أو مادة ماصة مماثلة. اترك الأغطية مكشوفة في الظلام لمدة 30 دقيقة على الأقل للسماح لها بالجفاف تماما.
  9. بينما تجف الأغطية المغلفة بالبروتين ، قم بإزالة ختم PDMS من المعلم عن طريق قطعه بمشرط أو شفرة حادة أخرى.
    ملاحظة: من الأفضل عدم محاولة قطع PDMS في المحاولة الأولى ، لأن تطبيق هذا الضغط الكبير سيؤدي إلى كسر رقاقة السيليكون وإتلاف السيد.
  10. تعالج البلازما طوابع PDMS لمدة 2 دقيقة تحت الفراغ على ارتفاع (قوة تردد لاسلكي تبلغ 30 واط).
  11. داخل غطاء الدخان ، ضع الطوابع في حاوية ذات غطاء وقم بتغطية كل ختم بطبقة رقيقة جدا (<100 ميكرولتر) من 10٪ (3-aminopropyl) trimethoxysilane (3-APTMS) مخففة في الإيثانول بنسبة 100٪.
    تحذير: 3-APTMS هو مهيج للجلد والعين قابل للاشتعال. احفظه بعيدا عن اللهب / الشرر ، واستخدم قفازات واقية ونظارات عند التعامل معها ، واعمل تحت غطاء الدخان. سيؤدي الطلاء المفرط لمحلول 3-APTMS إلى تكوين فيلم برتقالي لاحقا في هذه العملية. تتضمن هذه المعالجة السطحية 3-APTMS وظيفة الأمين في سطح ختم PDMS ، مما سيسمح بمزيد من الاشتقاق لسطح الختم لاحقا في26.
  12. قم بتغطية الحاوية بالطوابع واسمح لها بالجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  13. باستخدام ماء DI ، اشطف جيدا كل ختم على كلا الجانبين.
  14. ضع الطوابع في وعاء نظيف وقم بتغطيتها بحرية بنسبة 2.5٪ glutaraldehyde في ماء DI.
    تحذير: الجلوتارالدهيد سام. استخدام القفازات الواقية والنظارات عند التعامل والعمل تحت غطاء الدخان). يوفر علاج الجلوتارالدهيد هذا إلى جانب علاج 3-APTMS السابق وظائف الألدهيد على سطح طوابع PDMS ، والتي يمكن أن تتفاعل مع مجموعات الأمين في البروتينات لإنشاء رابط أمين ثانوي ، وهو أمر بالغ الأهمية لعملية إزالة البروتين27.
  15. قم بتغطية الطوابع ، واتركها تجلس في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، ثم اشطفها جيدا بماء DI مرة أخرى. قم بإزالة الماء الزائد من سطح الطوابع بنفس طريقة الأغطية ، واسمح للطوابع بالجفاف غير المغطاة لمدة 30 دقيقة تقريبا.
  16. بعد 30 دقيقة ، تحقق مما إذا كانت كل من الأغطية المغلفة بالبروتين والطوابع جافة. إذا لم يكن أي منهما جافا تماما ، فاستخدم مسدس هواء مصفى لتجفيفه تماما ، مما يضمن عدم تعرض أغطية الغطاء للضوء لفترة طويلة.
  17. بمجرد أن تجف كل من الأغطية والطوابع ، ادفع نمط الطوابع جانبا لأسفل على الأغطية مع ضغط كاف بحيث تتلامس الطوابع تماما مع سطح الغطاء. اترك الطوابع على اتصال مع الأغطية لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: نظرا لرابطة الأميد التساهمية بين ختم الجلوتارالدهيد مع طبقة البروتين الموجودة على الغطاء الزجاجي - وهو أقوى بكثير من التفاعلات الضعيفة الكارهة للماء بين طبقة البروتين والغطاء الزجاجي - يجب أن تقشر البروتينات الزجاج وفقا للنمط الموجود على ختم PDMS بمجرد إزالته.
  18. بعد 15 دقيقة ، قشر بعناية طوابع PDMS من الأغطية.
    ملاحظة: إذا كانت عملية الإزالة تعمل بشكل صحيح ، فيجب ألا تخرج الطوابع من الأغطية دون مقاومة ولكن يجب أيضا ألا تكون عالقة بقوة في الأغطية بحيث لا يمكن إزالتها دون قوة مفرطة.
  19. تحقق من دقة الأغطية المنقوشة باستخدام المرشح المناسب على مجهر الفلورسنت (اعتمادا على صبغة الفلورسنت التي تتميز بها البروتينات).
  20. استخدم الأغطية المنقوشة على الفور أو احفظها وخزنها بعيدا عن الضوء المباشر.

3. الأغطية المنشطة

ملاحظة: يتم تصنيع الأغطية السفلية للاستخدام في الغرفة التجريبية للمواد الهلامية PAA في هذه الخطوة. تمت معالجة غطاء الغطاء السفلي هذا خصيصا للسماح لهلام PAA بالبقاء ملتصقا به بشكل آمن حيث تتم إزالة الغطاء العلوي المزخرف أثناء عملية النقش. كما يتم وصف تقنيات مماثلة في أماكن أخرى10،12،15،28.

  1. غطاء سونيكات 30 مم في الإيثانول 100٪ لمدة 10 دقائق ، وشطف بالماء DI ، ثم جفف تماما باستخدام مسدس هواء مصفى. قم بإعداد ما يصل إلى 6 أغطية في المرة الواحدة لكل دفعة في طبق من 6 آبار.
  2. تعالج البلازما الأغطية لمدة 1 دقيقة على ارتفاع (قوة تردد لاسلكي تبلغ 30 واط) ثم تضع كل غطاء في بئر من 6 ألواح بئر.
  3. قم بتغطية كل غطاء بطبقة رقيقة جدا من 5٪ APTMS في الإيثانول في غطاء الدخان.
    ملاحظة: سوف تتشكل بقايا برتقالية في حالة الطلاء المفرط في هذه العملية.
  4. قم بتغطية اللوحة المكونة من 6 آبار واترك الأغطية لمدة 5 دقائق.
  5. شطف الأغطية (كلا الجانبين) وداخل كل بئر جيدا بماء DI وإزالة المياه الزائدة داخل الآبار.
  6. ضع الغطاء مرة أخرى في الصفيحة المكونة من 6 آبار وأضف حوالي 2 مل من 0.5٪ glutaraldehyde في ماء DI.
  7. قم بتغطية اللوحة المكونة من 6 آبار واترك الأغطية تجلس في محلول glutaraldehyde لمدة 30 دقيقة ؛ ثم ، شطف جيدا كل من الأغطية وآبار كل طبق بماء DI.
  8. قم بتخزين الأغطية المعالجة في ماء DI داخل ألواح 6 آبار لمدة تصل إلى أسبوعين أو استخدمها على الفور. تأكد من أن الأغطية جافة تماما قبل الاستخدام.

4. تصنيع هلام PAA ونقل النمط

ملاحظة: بمجرد صنع أغطية منقوشة ، يجب استخدامها لنقل أنماط البروتين هذه إلى هيدروجيل PAA بعد فترة وجيزة (<24 ساعة) 1،29،30. الوصفة التالية هي لهلام PAA مع معامل يونغ من 3.6 كيلو باسكال. يمكن تنويع كميات ماء ثنائي الأكريلاميد والأكريلاميد و DI لضبط صلابة المواد الهلامية PAA12.

  1. قبل البدء في صنع سلائف هيدروجيل PAA ، قم بإزالة حمض الأكريليك N-hydroxysuccinimide (NHS)-ester من الثلاجة حتى يتمكن من الوصول إلى درجة حرارة الغرفة قبل فتحه. قم بإعداد طبق قابل للتبديل عن طريق تعقيمه بنسبة 70٪ من الإيثانول وتركه تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في خزانة السلامة البيولوجية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
    تحذير: NHS هو مهيج سام للجلد والعين. استخدام القفازات الواقية والنظارات عند التعامل معها ، والعمل تحت غطاء الدخان.
    1. أضف 1.25 مل من 40٪ أكريلاميد في ماء DI إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
      تحذير: مادة الأكريلاميد هي مادة سامة مهيجة للجلد والعين. استخدام القفازات الواقية والنظارات عند التعامل معها ، والعمل تحت غطاء الدخان.
    2. أضف 175 ميكرولتر من محلول ثنائي الأكريلاميد في ماء DI إلى نفس الأنبوب (الخطوة 4.1.1).
      تحذير: بيس أكريلاميد هو مهيج سام للجلد والعين. استخدام القفازات الواقية والنظارات عند التعامل معها ، والعمل تحت غطاء الدخان.
    3. أضف 500 ميكرولتر من 10x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
      تحذير: PBS هو مهيج للعين. استخدام القفازات الواقية والنظارات عند التعامل.
    4. أضف 2.915 مل من ماء DI.
  2. ماصة 969 ميكرولتر من هذا السلائف في أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل ، وتخزين الباقي عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
  3. قياس ~ 50-100 ملغ من كبريتات الأمونيوم (APS) في أنبوب آخر للطرد المركزي الدقيق وتخفيفه في ماء DI حتى 100 ملغ / مل ؛ ضعه جانبا للاستخدام لاحقا. افتح استر NHS (الآن في درجة حرارة الغرفة) في غطاء المحرك وقم بقياس ما يصل إلى 3 ملغ من NHS بعناية في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير. تمييع NHS-استر إلى 1 ملغ / مل في 1x PBS.
    تحذير: APS هو مهيج للجلد والعين. استخدام القفازات الواقية والنظارات عند التعامل معها ، والعمل تحت غطاء الدخان. سوف تتحلل كل من APS و NHS-ester بمرور الوقت ، مما يتسبب في اختلاف نشاط المواد الكيميائية في محلول المخزون. لذلك ، يجب إعداد هذين الحلين طازجين في كل مرة (على عكس بقية السلائف).
  4. قم بتنفيذ الخطوات الثلاث التالية في غطاء الدخان:
    1. أضف 2 ميكرولتر من رباعي ميثيل إيثيلين ديامين (TEMED) إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على أليكوت 969 ميكرولتر من سلائف PAA.
      تحذير: TEMED هو مهيج للجلد والعين قابل للاشتعال. احفظه بعيدا عن الحرارة / اللهب / الشرر ، واستخدم قفازات واقية ونظارات عند التعامل معها ، واعمل تحت غطاء الدخان. TEMED هو واحد من اثنين من عوامل الربط المتقاطعة الحاسمة لبلمرة هيدروجيل PAA ، والآخر هو APS.
    2. أضف 15 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك 1 M لتقليل الرقم الهيدروجيني لمحلول الهيدروجيل وتجنب التحلل المائي لإستر NHS.
      تحذير: حمض الهيدروكلوريك هو مهيج للجلد والعين المسببة للتآكل. استخدام القفازات الواقية والنظارات عند التعامل معها ، والعمل تحت غطاء الدخان.
    3. أضف 10 ميكرولتر من محلول NHS-ester إلى الأنبوب.
      ملاحظة: NHS أمر بالغ الأهمية لعملية النقش. سوف يتفاعل مع مجموعات الأمين في البروتينات الموجودة على الغطاء المزخرف لتشكيل رابطة أميد مستقرة ، مما سيسمح بنقل النمط من الغطاء الزجاجي إلى سطح هلام PAA أثناء بلمرته31.
  5. تنفيذ هذه الخطوات النهائية في خزانة السلامة الأحيائية:
    1. ضع الغطاء مقاس 30 مم بعناية داخل الجزء المعدني من مجموعة أطباق الغطاء (3-APTMS والجانب المعالج بالغلوتارالدهيد لأعلى) وقم بربط الحلقة البلاستيكية في الأعلى. قم بإعداد الغطاء المزخرف بحيث يمكن الوصول إليه بسهولة في الخطوة التالية ، مع الحفاظ على حمايته من الضوء قدر الإمكان.
    2. ماصة 5 ميكرولتر من محلول APS في بقية سلائف PAA في أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، وقلبها للخلط ، ثم ماصة على الفور 35 ميكرولتر من هذا المحلول على غطاء 30 ملم.
    3. قم بإسقاط بروتين الغطاء المزخرف جانبا على المحلول ، مع الحرص على عدم إنشاء فقاعات هواء في الهيدروجيل. حماية الهيدروجيل من الضوء والسماح له بالبلمرة لمدة 90 دقيقة.
    4. بمجرد بلمرة الهيدروجيل ، استخدم شفرة حلاقة أو مشرط لإزالة الغطاء العلوي ، مما يضمن عدم انزلاق الغطاء عن الجل أو سقوطه مرة أخرى على الجل بمجرد إزالته ، لأن هذا سيدمر النمط الموجود على سطح الجل.
      ملاحظة: لا تترك الجل مكشوفا في منطقة ذات تدفق هواء كبير (مثل خزانة السلامة الأحيائية).
    5. لتخميل أي إستر NHS متبقي في الهيدروجيل ، أضف 2 مل من PBS المعقم إلى الجل واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. قم بإعداد المواد الهلامية على الفور للتجارب أو تخزينها بين عشية وضحاها في PBS معقمة عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.

5. التصوير

  1. للتحضير للتجارب على الخلايا ، قم بتشغيل الحرارة (37 درجة مئوية) والرطوبة (70٪) في المجهر بعد ظهر اليوم السابق للتجربة المخطط لها للسماح للمعدات داخل غرفة المجهر بالتوازن مع درجة الحرارة الأعلى.
    ملاحظة: تقلل هذه الخطوة من الانجراف z الناجم عن تقلبات درجة الحرارة.
  2. قبل بدء التجربة مباشرة ، قم بتشغيل مصدر CO2 الخاص بالغرفة.
  3. لمنع الانجراف x-y الناجم عن الحركة المتكررة لمرحلة المجهر أثناء التجربة ، قم بإصلاح مجموعة أطباق الغطاء القابلة للتبديل التي تحمل الهيدروجيل المزروع ببذور الخلية إلى المرحلة بشريط على الوجهين.
  4. انظر إلى الجل للعثور على إطارات ذات أهمية للصورة ، مع حفظ كل موضع مرحلة من الأقسام المراد تصويرها.
  5. في كل من عرض brightfield وعرض الفلورسنت المقابل للبروتين المسمى ، اضبط برنامج المجهر على تصوير كل إطار مرة واحدة كل 5 دقائق لمدة 2 ساعة.

6. تحليل الصور

ملاحظة: تم تطوير نظام يمكنه قياس تشوه المواد الهلامية PAA المنقوشة عن طريق تحديد موقع نقاط الجر ، واستيفاء المواقع الأولية للنقاط المشوهة ، ثم حساب قوى الجر الخلوية في كل موقع. يمكن استخدام أي نظام برمجي قادر على إجراء معالجة الصور والحسابات العددية. يهدف البرنامج إلى تحديد قوى الجر بسرعة ، والقضاء على مدخلات المستخدم وإجراءات المعالجة المسبقة التي من شأنها أن تسهم في الأخطاء المتعلقة بالمستخدم. يتوفر الرمز المستخدم هنا كملفات تكميلية 2-10 ، ويمكن الوصول إلى هذه الملفات ، إلى جانب زوج من صور الممارسة ، في www.bu.edu/mml/downloads.

  1. في برنامج معالجة الصور، افتح جميع الصور الفردية التي تم التقاطها أثناء تجربة الفاصل الزمني من كل عرض مجهري مستخدم بالترتيب، من الصورة الأولى إلى الأخيرة التي تم التقاطها، وقم بتحويلها إلى مكدس صور واحد (النقر فوق الصورة | مكدسات | الصور إلى مكدس). تأكد من وجود مكدسين منفصلين للصور: أحدهما لعرض المجال الساطع للخلايا والآخر لعرض الفلورسنت للنمط الذي يتم إرفاقهما به.
    1. إذا كان هناك انجراف في الصور الفلورية (أي أن جزيرة الاهتمام تتحرك في الاتجاه x و / أو y بين كل إطار بمقدار >1-2 ميكرومتر) ، فقم أولا بمعالجة مكدس الصور باستخدام المكون الإضافي StackReg (P. Thévenaz ، المعهد الفيدرالي السويسري للتكنولوجيا لوزان) لإعادة توسيط كل صورة في المكدس بناء على موضع الأول (النقر فوق المكونات الإضافية | | ستاك ريج | الترجمة حسنا).
      ملاحظة: هذا أمر بالغ الأهمية لأنه حتى الانجراف دون μm يمكن أن يؤثر بشكل كبير على الحساب النهائي لقوى الجر ، خاصة على المواد الهلامية الأكثر صلابة حيث يكون هذا الانجراف x-y خارج نطاق الضوضاء المتوقعة. سيحفظ هذا الرمز الصور بعد إزالة الانجراف ، والتي يمكن بعد ذلك تحويلها إلى مكدس صور جديد لتحليلها.
  2. أدخل مكدسات الصور الساطعة والفلورسنت في CTFTimelapse.m (الملف التكميلي 2).
    1. حدد دليل الملفات حيث توجد مكدسات الصور على السطر 7.
    2. في السطرين 8 و9، حدد اسمي مكدس الصور الفلورية ومكدس الفلورسنت الساطع المقابل على التوالي.
    3. حدد صلابة هلام PAA (Pa):
      1. في الأسطر 11-14 ، والتي تتضمن بعض النماذج المرنة المختلفة من الهلاميات المائية PAA المستخدمة في معظم الأحيان ، قم بالتعليق (اكتب ٪ في بداية الخط) كل شيء باستثناء معامل مرونة الجل في الصور التي يتم تحليلها. بدلا من ذلك ، أضف معامل المرونة إذا لم يكن موجودا بالفعل على الباقي (3658.19 باسكال لصور الاختبار).
    4. حدد نصف قطر النقطة (م) على السطر 15 (1 × 10-6 م لصور الاختبار).
    5. حدد أقصى قطر نقطي ممكن (ميكرومتر) على السطر 16 (2.5 ميكرومتر لصور الاختبار).
    6. حدد نسبة البكسل (ميكرومتر/بكسل):
      1. في الأسطر من 17 إلى 20 ، والتي تتضمن بعض نسب بكسل الصور المختلفة بناء على إعدادات التصوير المستخدمة سابقا ، قم بالتعليق (اكتب ٪ في بداية السطر) كل شيء باستثناء نسبة بكسل الصور التي يتم تحليلها. بدلا من ذلك ، أضف نسبة البكسل المستخدمة إذا لم تكن موجودة بالفعل على الباقي (0.1613 ميكرومتر / بكسل لصور الاختبار).
    7. في السطرين 35 و 87 ، حدد دليل الملفات حيث توجد ملفات معالجة الصور الضرورية.
      ملاحظة: من مكدس الصور الفلورية، تحدد التعليمة البرمجية موقع كل نقطة فلورسنت وتتعقب حركة كل نقطة بين كل صورة في المكدس20. يعرف الموضع الأولي لنقاط الاتصال الدقيقة المطبوعة لأنها لا تتشوه عند نقلها بشكل صحيح إلى الهيدروجيل32.
  3. انتظر حتى يظهر شكلان ومربع حوار واحد بمجرد أن يعثر البرنامج على النقاط. استخدم الشكل 1 للتأكد من أن البرنامج قد وجد النقاط الصحيحة ولم يجد العديد من النقاط حيث لم يكن هناك أي نقاط. استخدم الشكل 2 لاختيار الشبكة المستطيلة التي تساعد البرنامج على تحديد موقع قوى الجر الخلوية وحسابها.
    ملاحظة: الشكل 1 هو صورة الحقل الساطع للخلية مع النقاط التي وجدها البرنامج (والتي ستكون حمراء) متراكبة فوقها (انظر الشكل 3A). الشكل 2 هو صورة تعرض نفس النقاط الموضحة في الشكل 1 ولكن بدون صورة الحقل الساطع في الخلفية.
    1. انتظر حتى يطالب مربع الحوار بالضغط على Enter بعد تحديد النقطة - حيث تكون كل نقطة واحدة من النقاط الحمراء التي وجدها البرنامج - وتحتوي على زر كبير واحد بداخلها يسمى Enter.
    2. اختر أربع نقاط مختلفة في الشكل 2 لإنشاء شبكة مستطيلة حول الخلية/المجموعة على هذا النمط وتضمينها. حدد كل نقطة واحدة تلو الأخرى بنقرة بزر الماوس الأيسر وقم بتأكيدها بالضغط على Enter على الزر الموجود في مربع الحوار المذكور أعلاه. احتفظ بعدد النقاط الموجودة بين النقطة الأولى والثانية بالإضافة إلى النقطة الأولى والثالثة ، حيث سيطلب البرنامج هذه القيم بمجرد تحديد جميع النقاط ذات الزوايا الأربع. أدخل هذه القيم في نافذة الأوامر (اكتب عدد النقاط وانقر فوق الزر Enter على لوحة المفاتيح عند مطالبتك بذلك).
  4. بمجرد اختيار الشبكة المستطيلة ، انتظر حتى يقوم البرنامج النصي بحساب قوى الجر التي يجدها داخل الشبكة بناء على مواقع نقاط الفلورسنت. لاحظ أن البرنامج النصي يجد أولا متجه الإزاحة (u) للمركز الهندسي لكل نقطة ثم يحسب متجه قوة الجر المقابل (F) باستخدام Eq (1):
    Equation 1(1)
    حيث E هو معامل يونغ لركيزة PAA ، a هو نصف قطر علامات نقطة الفلورسنت ، و ν هو نسبة بواسون من الركيزة PAA32. يفترض Eq (1) أن الركيزة هي نصف مساحة مرنة لا نهائية ، وأن قوى الجر يتم تطبيقها في مركز كل علامة نقطية دائرية ، وأن التباعد بين علامات النقاط كبير بما فيه الكفاية بحيث لا تتفاعل إزاحات كل منها مع بعضها البعض23.
    ملاحظة: في التجارب الموضحة هنا، يتم استخدام علامات نقطية نصف قطرها a = 1 ميكرومتر و 6 ميكرومتر من مركز إلى مركز. يجب أن تكون أسهم قوة الجر داخل الخلية / الكتلة التي تشير إلى الداخل نحو مركز الخلية موجودة ، في حين يجب ألا تحتوي المنطقة خارج الخلية / الكتلة على أسهم جر موجودة (انظر الشكل 3C-E). تشير أسهم الجر التي تشير إلى الخارج من داخل الخلية / المجموعة أو العديد من أسهم الجر الكبيرة الموجودة خارج الخلية إلى شبكة مستطيلة سيئة الاختيار.
  5. بمجرد العثور على حقل الجر الصحيح، حدد منطقة اهتمام مناسبة (ROI) تحيط بالخلية/المجموعة، والتي تتضمن جميع أسهم الجر داخل الخلية باستخدام المؤشر.
    1. لرسم عائد الاستثمار، انقر بزر الماوس الأيسر عدة مرات حسب الضرورة لرسم شكل مضلع بأكبر عدد ممكن من الجوانب حسب الرغبة أو ضبط الشكل أو تحريك عائد الاستثمار بعد رسمه بالنقر بزر الماوس الأيسر على الزوايا أو الحواف، على التوالي. بمجرد سحب عائد الاستثمار ، انقر نقرا مزدوجا بزر الماوس الأيسر للانتقال إلى الصورة التالية في المكدس. كرر ذلك لجميع الصور الموجودة في مكدس الحقل الساطع.
      ملاحظة: ستوفر التعليمة البرمجية بيانات قوة الجر والإزاحة لكل نقطة زمنية في نفس المجلد مثل مكدسات الصور الأصلية، والتي يمكن تحليلها بعد ذلك بشكل أكبر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم استخدام الهلاميات المائية PAA مع معامل يونغ E = 3.6 kPa ونسبة Poisson البالغة ν = 0.445 بواسطة طريقة التنميط الدقيق المطروحة هذه. تم تصنيع الهلاميات المائية ليكون سمكها ~ 100 ميكرومتر ، مما يسمح بتصويرها باستخدام إعداد التصوير المستخدم هنا مع منع الخلايا أيضا من استشعار الغطاء الصلب أسفل الجل ، مما قد يسبب مشاكل في الدراسات التي تركز على استشعار الصلابة الخلوية23,33. تم تصنيع المواد الهلامية من العديد من مستويات الصلابة الأخرى (حتى 30 كيلو باسكال) بنجاح وتصويرها باستخدام طريقة التنميط الدقيق غير المباشرة34 ، لذلك لا تقتصر الطريقة على استخدام الهلاميات المائية 3.6 كيلو باسكال فقط. تتم معالجة الأغطية في وقت مبكر باستخدام الجلوتارالدهيد للسماح للهلام بالبقاء ثابتا على الغطاء السفلي عند إزالة الغطاء العلوي المزخرف (الشكل 2C ، D).

لتصور وقياس قوى الجر الخلوي داخل المجموعات، تم نقش الهلاميات المائية 3.6 كيلوباسكال بشكل غير مباشر باستخدام الفيبرونيكتين الفلورسنت (الشكل 2A-D) لإنشاء أنماط جزيرة ذات حجم وشكل محددين مسبقا (الشكل 2E). يمكن أيضا نقش أنواع أخرى من البروتينات على هذه الهلاميات المائية اللينة21،35،36،37،38. ترتبط جودة النمط المنقول مباشرة بدقة القالب الرئيسي الذي يتم من خلاله صب ختم PDMS. ستشهد القوالب التي تحتوي على إزالة SU-8 تدهورا في جودة الأنماط المصنوعة من الطوابع المصبوبة من هذه القوالب الرقائقية. على سبيل المثال ، غالبا ما تخلق القوالب التي تحتوي على SU-8 الرقائقي أنماطا دقيقة تحتوي على أقسام من الفيبرونيكتين غير المنقوش بين الجزر المحددة مسبقا. إذا تم صبها على هلام ، فإن هذه الأنماط تسمح بربط الخلايا بالجل في مناطق خارج النمط المجهري للجزيرة. ولهذا السبب ، كانت مجموعات خلايا التصوير المرتبطة بأنماط الجزر السليمة تماما أو في الغالب هي الأولوية.

تم زرع خلايا العضلات الملساء الوعائية البقرية (BVSMCs) على هذه الهلاميات المائية بكثافة حوالي 60-80 × 103 خلايا / هلام لتعزيز تكوين الكتلة وسمح لها بالالتصاق لمدة 18-24 ساعة قبل التصوير. قبل التجارب مباشرة، كانت الخلايا ملطخة ببقعة نواة الخلية الحية للسماح بتحديد الخلايا الحية وتحديد عدد الخلايا في كل مجموعة. تم تصوير وتحليل الجزر ذات الأنماط الدقيقة مع الخلايا وبدونها. سمحت جزر التصوير بدون خلايا بحساب الضوضاء الموجودة في حسابات قوة الجر للمواد الهلامية 3.6 كيلو باسكال. ويمكن بعد ذلك استخدام قياسات الإزاحة الإيجابية الكاذبة هذه لتحديد قيمة عتبة مناسبة ينبغي استبعاد الإزاحة تحتها.

وقد وجد أن 0.3 ميكرومتر عادة ما تكون كافية للقضاء على خيانة النمط التي تؤدي إلى قياسات إزاحة إيجابية كاذبة. قد يؤدي القيام بذلك إلى فقدان الجر منخفض القوة ولكنه ضروري لإزالة الجر الإيجابي الكاذب. عند التصوير ، تم إعطاء الأولوية لمجموعات الخلايا على أنماط الجزر السليمة في الغالب (أي تلك التي لا تفتقد العديد من النقاط إن وجدت) ومعظمها أنماط سليمة بدون خلايا. تم تصوير كل عائد استثمار مرة واحدة كل 5 دقائق لمدة 2 ساعة. كان المجهر المستخدم لالتقاط صور لكل من الخلايا والمواد الهلامية PAA المنقوشة أثناء تجارب الفاصل الزمني الممتد عبارة عن مجهر فلوري مع مرحلة تلقائية ومصدر ضوء فلوري وكاميرا وبرنامج مجهر قياسي. يحتوي هذا المجهر على مجموعة مخصصة من المرشحات لمراقبة العديد من الألوان المختلفة للتألق. الهدف المستخدم لعرض الخلايا والهيدروجيل المزخرف هو هدف غمر الماء 40x ، NA = 1.15. تم تجهيز هذا المجهر أيضا بدرجة حرارة مخصصة (37 درجة مئوية) - ورطوبة (70٪) - ونظام منظم CO2 (5٪) للحفاظ على الخلايا قابلة للحياة أثناء التجارب الطويلة.

لحساب قوى الجر من صور الجزر ذات الأنماط الدقيقة ، تم استخدام برنامج تحليل الصور لتتبع إزاحة نقاط الفيبرونيكتين الفلورية بمرور الوقت. من خلال معرفة إزاحة نقاط الفلورسنت وصلابة هلام PAA الذي تنقش عليه النقاط ، يمكن للبرنامج تحديد قيم قوى الجر التي تنقلها كل من الخلايا الفردية والمجموعات على ركيزة PAA. ومع ذلك ، هناك طريقتان يصبح البرنامج بهما غير قادر على تحديد قيم الجر. إذا تم تشويه الكثير من النقاط داخل إطار معين من الاهتمام ، فإن البرنامج يكافح لحساب القوى ، حيث يعتمد البرنامج على معظم النقاط في صورة تم تحليلها لتكون غير مشوهة. علاوة على ذلك، إذا كانت نقطتان قريبتان جدا من بعضهما البعض (المسافة من مركز إلى مركز تبلغ ≤2 ميكرومتر20)، فإن إزاحة النقاط الفردية يمكن أن تتداخل مع بعضها البعض، مما يمنع التحديد الدقيق لقيم الإزاحة الفعلية وبالتالي قيم الجر الخاصة بها. طالما تم تصميم الأنماط الدقيقة بنقاط متباعدة بشكل جيد ، يجب ألا تكون الخلايا قادرة على إزاحة النقاط لدرجة أنها تصبح قريبة من بعضها البعض ، حتى على الركائز الأكثر ليونة.

يوضح الشكل 3 قدرات طريقة نمط الإزالة. هنا ، تظهر قدرة هذه الطريقة على تصنيع أنماط جزيرة معزولة ومحددة جيدا ذات شكل محدد مسبقا في الشكل 3B-E ، حيث توجد نقاط التصاق الفيبرونيكتين فقط داخل المنطقة المطلوبة من الجزيرة. وتسمح هذه الجزر المعزولة من نقاط الالتصاق كذلك بالتحكم بشكل أفضل في شكل العنقود، كما هو مبين في الشكل 3 ألف. ولأن شكل الجزر وحجمها متسقان، فإن مجموعات الخلايا التي تلتصق بها وتنمو عليها تميل أيضا إلى أن يكون لها شكل ثابت، لأن أنماط الجزر تحد من منطقة نمو العنقود. وأخيرا، يوضح الشكل 3B-E أيضا قدرة هذه الجزر على استخدامها لحساب قوى الجر الخلوية وميل قوى الجر هذه إلى التغير بمرور الوقت. هنا ، قوى الجر للمجموعة هي الأكبر حول حواف الجزيرة. هذا متوقع لأن الخلايا الموجودة على حواف الكتلة لديها تفاعلات أقل مع الخلايا الأخرى في المجموعة من تلك الموجودة في داخل المجموعة. وبالتالي ، فإن هذه الخلايا عند الحواف تمارس قوى أكبر على الركيزة استجابة لتقلص الهيكل الخلوي من الخلايا الموجودة في الداخل.

Figure 1
الشكل 1: تصميم القناع الضوئي. (أ) تمثيل للنصف الأول من تصميم القناع الضوئي المستخدم هنا ، شبكة منفصلة من نقاط قطرها 2 ميكرومتر متباعدة عند 6 ميكرومتر من مركز إلى مركز. في حين أن الصورة المعروضة هنا ليست سوى جزء صغير من التصميم ، فإن هذه الشبكة تملأ مساحة 1.5 × 1.5 سم على القناع الضوئي. (ب) تمثيل للنصف الثاني من تصميم القناع الضوئي؛ تظهر هنا ست جزر صغيرة من 6 × 6 نقاط. على القناع الضوئي ، هناك العديد من أحجام الجزر المختلفة: 6 × 6 (كما هو موضح هنا) ، 12 × 12 ، 25 × 25 ، و 42 × 42 نقطة. تشغل مجموعة متساوية المسافة (50 ميكرومتر بين الجزر) من كل حجم جزيرة مساحة 1.5 × 0.375 سم ، ويتم فصل صفائف الجزر المختلفة بمقدار 50 ميكرومتر. يبلغ قطر النقاط في كل جزيرة 2 ميكرومتر ومتباعدة 6 ميكرومتر من مركز إلى مركز. يتم فصل قسمي القناع الموصوفين في A و B بمقدار 0.75 سم.

Figure 2
الشكل 2: الطباعة المتناهية الصغر المطروحة. (أ) يتم التعامل مع ختم PDMS مع glutaraldehyde ووضعه في اتصال مع غطاء زجاجي مغلفة بالتساوي بمحلول الفيبرونيكتين الفلورسنت. (ب) عند إزالته من الغطاء ، يقوم ختم PDMS بتجريد معظم الفيبرونيكتين الفلوري على سطح الغطاء ، تاركا نقاطا بحجم ميكرون من البروتين فقط في المواقع المحددة مسبقا بتصميم ختم PDMS. (ج) يتم وضع الغطاء المزخرف على اتصال مع محلول PAA prepolymer و NHS. (D) بمجرد السماح لهلام PAA بالبلمرة بالكامل ، تتم إزالة الغطاء العلوي ، ويتم طباعة نمط من الفيبرونيكتين على سطح هلام PAA. (ه) مثال على نمط جزيرة منفصل يتكون من نقاط متباعدة بالتساوي على هيدروجيل PAA بمعامل يونغ البالغ 3.6 كيلوباسكال. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الاختصارات: PDMS = بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان; PAA = بولي أكريلاميد; NHS = N-هيدروكسي سكسينيميد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحليل الخلايا على الأنماط الدقيقة للجزيرة. (أ) تظهر صورة ساطعة لمجموعة من 3 BVSMCs متراكبة على نمط مجهري لجزيرة الفيبرونيكتين الفلورسنت على هيدروجيل PAA مع معامل يونغ البالغ 3.6 كيلو باسكال. يبلغ قطر النقاط 2 ميكرومتر ويتم فصلها بمقدار 6 ميكرومتر من مركز إلى مركز. (ب) يظهر نمط الفلورسنت أن عددا من نقاط الفيبرونيكتين في الجزيرة قد تم إزاحتها بسبب تطبيق القوى من قبل BVSMCs. (C) قوى الجر المطبقة على نقاط الالتصاق في النقطة الزمنية 1 (بداية تجربة 2 ساعة). يشار إلى اتجاه متجهات القوة هذه باتجاه الأسهم الملونة. يشار إلى حجمها بلون السهم وقيمته المقابلة على شريط اللون (جميع قيم القوة في nN). يعتمد طول المتجه نسبيا على الحد الأدنى والحد الأقصى للقوى المحسوبة بواسطة البرنامج لكل نقطة زمنية. (د) قوى الجر لنفس الكتلة عند النقطة الزمنية 13 (في منتصف الطريق خلال تجربة 2 ساعة) (ه) قوى الجر لنفس الكتلة في النقطة الزمنية 25 (نهاية تجربة 2 ساعة). الاختصارات = BVSMCs = خلايا العضلات الملساء الوعائية البقرية; PAA = بولي أكريلاميد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي 1: آلة حاسبة لوضع العلامات على الفيبرونيكتين هذه أداة لحساب الكمية الصحيحة من صبغة الفلورسنت Alexa488 لاستخدامها عند وضع العلامات على الفيبرونيكتين. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: CTFTimelapse.m هذا هو ملف معالجة الصور ، والذي يسمح بحساب قوى الجر الخلوية كما هو موضح في القسم 5 (تحليل الصور). ويشمل ذلك اختيار شبكة النقاط المطلوبة (الخطوات 6.3-6.3.2) واختيار المنطقة ذات الأهمية لحسابات CTF (الخطوتان 6.5 و6.5.1). يتم استدعاء جميع الملفات التكميلية التالية مباشرة بواسطة هذا البرنامج النصي أو إحدى الوظائف الأخرى المستخدمة فيه. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 3: analyze_initial_image_4.m تسمى هذه الوظيفة بواسطة CTFTimelapse.m ، والغرض منها هو تحديد موقع ومحاذاة نقاط الفلورسنت على شبكة من الإطار الأول من مكدس الصور لنمط الشبكة المشوهة لمطابقة نمط الشبكة الأصلي غير المشوه. يسمح هذا بحسابات قوة الجر للإطار الأول في مكدس الصور. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 4: analyze_subsequent_images.m تسمى هذه الوظيفة بواسطة CTFTimelapse.m ، والغرض منها هو تحديد موقع نقاط الفلورسنت ومحاذاتها على شبكة من جميع إطارات مكدس الصور لنمط الشبكة المشوهة بعد الأول. يسمح هذا بحسابات قوة الجر لجميع الإطارات في مكدس الصور بعد الأول. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 5: bpass.m تسمى هذه الوظيفة بواسطة كل من analyze_initial_image_4.m وتحليل subsequent_images.m ، والغرض منها هو تنفيذ مرشح ممر النطاق الترددي في الفضاء الحقيقي الذي يعالج مكدس الصور لنمط الشبكة المشوه. يمنع هذا المرشح ضوضاء البكسل واختلافات الطول الموجي الطويل للصور مع الاحتفاظ بمعلومات ذات حجم مميز. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 6: CellBoundary.m تسمى هذه الوظيفة بواسطة CTFTimelapse.m ، والغرض منها هو أنها تسمح لمستخدم البرنامج برسم منطقة ذات أهمية حول الخلية / الكتلة التي سيتم حساب قوى الجر لها. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 7: pkfnd.m يتم استدعاء هذه الوظيفة بواسطة كل من analyze_initial_image_4.m و analyze_subsequent_images.m ، والغرض منها هو العثور على الحد الأقصى المحلي في صورة بدقة على مستوى البكسل. يتم استخدام هذه القمم بواسطة cntrd.m لتحديد نمط شبكة الفلورسنت ل CTFTimelapse.m. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 8: cntrd.m تسمى هذه الوظيفة بواسطة كل من analyze_initial_image_4.m و analyze_subsequent_images.m ، والغرض منها هو تحديد موقع مركز النقاط المضيئة في الصورة بدقة بكسل فرعية. يسمح هذا بتحديد موقع نمط شبكة الفلورسنت بواسطة CTFTimelaspe.m ، كما هو موضح في الخطوة 6.3. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 9: FourCorners.m تسمى هذه الدالة بواسطة كل من analyze_initial_image_4.m و analyze_subsequent_images.m ، والغرض منها هو أخذ الشبكة التي اختارها المستخدم (الخطوات 6.3-6.3.2) وحساب المسافة بين كل نقطة زاوية في محورين متعامدين. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 10: track.m تسمى هذه الوظيفة بواسطة كل من analyze_initial_image_4.m و analyze_subsequent_images.m ، والغرض منها هو تتبع حركة النقاط في نمط شبكة الفلورسنت بين الإطارات ، وهو أمر ضروري لحساب قوى الجر المقابلة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يتم وصف طريقة محسنة لنمط المواد الهلامية المائية PAA بشكل غير مباشر في هذه الورقة. يعتمد هذا النهج على الأساليب التي تم استخدامها سابقا 20,35,36,37,38,39,40,41,42. التغيير الأساسي هو أن طوابع PDMS تستخدم الآن لإزالة البروتين وترك النمط المطلوب وراءها على الركيزة الوسيطة بدلا من ختم النمط مباشرة عليه. وهذا يسمح بإنشاء أنماط دقيقة عالية الدقة أكثر اتساقا وإنشاء جزر معزولة ذات أنماط دقيقة استلزمت في السابق خطوتين إنتاجيتين. كما يتم التحكم في شكل وحجم أنماط الجزيرة المصنوعة بهذه الطريقة بسهولة أكبر من تلك المصنوعة باستخدام الطريقة السابقة المكونة من خطوتين. التقنية الجديدة أقل عرضة لكمية الضغط المطبقة أثناء الطباعة الدقيقة من التقنية القديمة. الميزة الثانية هي أن طريقة الإزالة هذه يمكن أن تجعل أنماط الجزيرة ذات شكل وحجم متحكم فيهما في خطوة واحدة فقط. في المقابل ، كانت الطرق السابقة تتطلب خطوتين لصنع الجزر ، بما في ذلك الختم للترسب والختم اللاحق للإزالة ، وأشكال هذه الجزر أقل دقة من تلك التي صنعت بطريقة الإزالة.

العيب الرئيسي لهذه الطريقة هو أن عمر الأساتذة المستخدمين لتشكيل النمط الجديد من طوابع PDMS يبدو أقصر من تلك المستخدمة في طريقة الختم السابقة. من المحتمل أن يعزى ذلك إلى شكل الأساتذة الجدد المستخدمين في طريقة الإزالة. كان المعلمون القدامى يتألفون من مساحة 1.5 × 1.5 سم من SU-8 تتكون من ثقوب دائرية متساوية المسافات بعمق 5 ميكرومتر ، والتي عند صبها في PDMS ، ستخلق طوابع مكونة من أعمدة أسطوانية متباعدة بالتساوي من نفس الارتفاع. على العكس من ذلك ، يتكون المعلمون الجدد من مساحة 1.5 × 1.5 سم من أعمدة أسطوانية SU-8 بطول 5 ميكرومتر ، والتي ، عند صبها في PDMS ، تصنع طوابع تتكون من ثقوب متباعدة بالتساوي.

مع هذا التغيير في بنية الأساتذة ، وجد أن SU-8 يميل إلى أن يصبح مغلفا من السطح بسهولة أكبر بكثير من الطريقة القديمة. تم اتخاذ الاحتياطات اللازمة لمنع ذلك ، مثل معالجة رقائق السيليكون السطحية في آشر البلازما لجعلها أكثر قابلية للارتباط ب SU-8. كما تم تسييل سطح الرقائق قبل الصب الأول في PDMS لمنع SU-8 من الالتصاق ب PDMS عند إزالة الطوابع. على الرغم من ذلك ، فقد لوحظ إزالة SU-8 من رقائق السيليكون بعد الصب المتكرر في PDMS ، ويجب توخي الحذر لضمان صنع رقائق السيليكون الجديدة قبل فقدان السيد الحالي. إحدى الطرق الممكنة لتجنب هذا التفكيك هي استخدام طريقة الصب المزدوج PDMS ، والتي تم وصفها سابقا43 ، على الرغم من أن هذه الطريقة الأخرى لها حدودها.

عيب آخر في هذه الطريقة (وغيرها من الطرق التي تستخدم هيدروجيل قابل للتشوه لقياس قوى الجر44) هو أن مجال الجر ليس في حالة توازن ميكانيكي بسبب الضوضاء التجريبية. وبالتالي ، هناك حاجة إلى تحليل ما بعد المعالجة للحصول على حقل جر متوازن بعد حساب قوى الجر. تتمثل إحدى طرق موازنة قوى الجر في الحصول على القوى الأقرب إلى القياسات التي تلبي التوازن باستخدام طريقة المربعات الصغرى. ونتيجة لذلك، يتغير حجم واتجاه قوى الجر المقاسة45.

هناك قيود على هذه الطريقة لحساب قوى الجر الخلوية. لتحديد قوى الجر الخلوية بدقة باستخدام Eq. (1) (الخطوة 5.4) ، يجب تصميم النمط بحيث لا يؤثر إزاحة نقطة التصاق واحدة بشكل كبير على إزاحة تلك المجاورة مباشرة لها. من الناحية النظرية ، تقل إزاحة منطقة التصاق دائرية على سطح نصف مساحة لا نهائية بسبب قوة عرضية تؤثر في المركز مع زيادة المسافة الشعاعية من مركز الدائرة23. على وجه التحديد ، بالنسبة للركيزة التي تبلغ نسبة بواسون فيها ~ 0.445 (مثل تلك الموضحة هنا) ، فإن الإزاحة على حافة المنطقة الدائرية تبلغ حوالي ثلثي الإزاحة في وسط المنطقة. ومع ذلك ، فإن التنبؤات النظرية لا تمتد إلى ما وراء المنطقة الدائرية. وبالتالي ، من المفترض أن الاتجاه المتناقص في حجم الإزاحة ، المحدد نظريا23 ، يستمر خارج حافة دائرة الالتصاق. في تصميم النمط الدقيق الموضح هنا ، يتم استخدام نقاط دائرية 2 ميكرومتر متباعدة 6 ميكرومتر من مركز إلى مركز. والسبب في هذا التباعد هو أن الإزاحة على مسافة 6 ميكرومتر من مركز النقطة تقدر بحوالي 1/12عشر الإزاحة في مركز النقطة ، والتي يفترض أنها صغيرة بما يكفي للتأثير على قيم الإزاحة للنقاط المجاورة. ومع ذلك ، فمن الممكن أن قوى الجر التي تمارسها الخلايا يمكن أن تحل محل نقاط الالتصاق على الركيزة لدرجة أن المسافة من المركز إلى المركز بينهما تصبح أقل من 2 ميكرومتر. في هذه الحالة ، لا يصمد الافتراض حول إزاحة نقاط الالتصاق المجاورة التي لا تتداخل مع بعضها البعض ، ولا يمكن حساب قوى الجر بدقة باستخدام المعادلة الواردة في الخطوة 6.4 ( Eq (1))).

توفر التقنية المقترحة أداة قوية لقياس قوى الجر الخلوية. تعطي هذه القوى نظرة ثاقبة على البيئة الميكانيكية لكل من الخلايا الفردية والمجموعات ويمكن أن تساعد في فهم ما إذا كانت أنواع مختلفة من الخلايا تحافظ على الاستقرار الميكانيكي وكيف تحافظ عليه. يعد الحفاظ على مستوى استتبابي لتوتر الخلايا أمرا ضروريا للعديد من العمليات الخلوية ، وقد تم ربط فقدان هذا التوازن التوتري بأمراض مختلفة ، مثل تصلب الشرايين والربو والسرطان9،10،12. يعرف التوازن التوتري بأنه قدرة خلية أو مجموعة من الخلايا على الحفاظ على مستوى ثابت من التوتر ، مع تباين زمني منخفض حول نقطة محددة46.

يمكن استخدام طريقة التنميط الدقيق غير المباشرة هذه لتحديد قدرة أنواع الخلايا المختلفة على الحفاظ على التوازن التوتري ، سواء على المستوى الفردي أو متعدد الخلايا. يتم ذلك عن طريق تتبع التغيرات في قيم مجال الجر الخلوي بمرور الوقت ثم تحديد التذبذب الزمني لحقل الجر باستخدام معامل التباين (CV) ، والذي يمثل تلك النسبة من الانحراف المعياري لمقدار حقل الجر إلى قيمته المتوسطة. يستخدم مجموع مقادير قوى الجر ومقدار عزم الانقباض (اللحظة الأولى لقوى الجر) كمقاييس عددية لمقدار حقل الجر46. إذا ظلت السيرة الذاتية لحقل الجر قريبة من الصفر طوال تجربة الفاصل الزمني ، فإنها تظهر أن الخلية / المجموعة حافظت على التوازن التوتري بمرور الوقت46.

باختصار ، توفر هذه الطريقة الجديدة للتنميط الدقيق غير المباشر للهيدروجيل اللينة طريقة أبسط وأكثر كفاءة لإنشاء هيدروجيل منقوش من الطرق السابقة. هناك بعض الخطوات التي يمكن اتخاذها لتحسين هذه الطريقة والتوسع فيها. في المقام الأول ، فإن تحسين عملية تصنيع أسياد السيليكون بطريقة تطيل عمرهم من شأنه أن يزيل العيب الأساسي لطريقة التنميط الدقيق هذه. أما بالنسبة لطرق التوسع في هذه الطريقة ، فإن استكشاف أشكال الجزر المختلفة خارج الجزر المربعة الموصوفة هنا فقط من شأنه أن يحسن من تنوع هذه الطريقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgments

يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور بول باربون من قسم الهندسة الميكانيكية بجامعة بوسطن على المناقشات المفيدة والمساعدة في تحليل البيانات. تم دعم هذه الدراسة من خلال منحة NSF CMMI-1910401.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-aminopropyl)trimethoxysilane Sigma Aldrich #281778
1.5 mL Microcentrifuge tube Fisher Scientific #05-408-129
15 mL conical tube Fisher Scientific #05-539-12
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask Advance Reproductions Corporation N/A Custom-designed mask
6 Well Plates Fisher Scientific #07-200-83
Acetone Fisher Scientific #A18P-4
Acrylamide Solution, 40% Sigma Aldrich #A4058
AlexaFluor 488 Thermo Fisher #A20000
Aminonium Persulfate Fisher Scientific #BP179-25
Bisacrylamide Fisher Scientific #PR-V3141
Ethanol Greenfield Global #111000200C1GL
Glass Coverslips, 25 mm round Fisher Scientifc #12-545-102
Glass Coverslips, 30 mm round Warner #64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 Camera Hamamatsu #C10600-10B
Human Plasma Valley Biomedical #HP1051P Used to isolate fibronectin
Hydrochloric Acid, 1.0 N Millipore Sigma #1.09057
ImageJ Wayne Rasband #1.53n
Interchangeable Coverslip Dish Set Bioptechs #190310-35
Kim Wipes Fisher Scientific #06-666-11C
Mask Alinger Karl Suss #MA6
Matlab 2021 Mathworks #R2021a
MetaMorph Basic Molecular Devices #v7.7.1.0
N-hydroxysuccinimide ester Sigma Aldrich #130672-5G
NucBlue Live Cell Stain Thermo Fisher #R37605
Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope Olympus #IX81
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare #52-1308-00
Photoresist Spinner Hood Headway Research #PWM32
Plasma Cleaner Harrick #PDC-001
Plasma Etcher TePla #M4L
Prior Lumen 200Pro Light Source Prior Scientific #L200
Silicon Wafers, 100 mm University Wafer #809
SU-8 2005 Kayaku Advanced Materials Inc. #NC9463827
SU-8 Developer Kayaku Advanced Materials Inc. #NC9901158
Sylgard 184 Silicone Elastomer Essex Brownell #DC-184-1.1
Tetramethylethylenediamine Fisher Scientific #BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma Aldrich #448931
UAPON-40XW340 Objective Olympus #N2709300
UV Flood Exposure Newport #69910
Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm Ted Pella, Inc. #19395-40

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  2. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  3. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), 55172 (2013).
  4. Bhadriraju, K., et al. Activation of ROCK by RhoA is regulated by cell adhesion, shape, and cytoskeletal tension. Experimental Cell Research. 313 (16), 3616-3623 (2007).
  5. Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
  6. Ganz, A., et al. Traction forces exerted through N-cadherin contacts. Biology of the Cell. 98 (12), 721-730 (2006).
  7. Chopra, A., et al. Reprogramming cardiomyocyte mechanosensing by crosstalk between integrins and hyaluronic acid receptors. Journal of Biomechanics. 45 (5), 824-831 (2012).
  8. Winer, J. P., Chopra, A., Kresh, J. Y., Janmey, P. A. Substrate elasticity as a probe to measure mechanosensing at cell-cell and cell-matrix junctions. Mechanobiology of cell-cell and cell-matrix interactions. , Springer. Boston, MA. 11-22 (2011).
  9. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
  10. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS One. 7 (2), 32572 (2012).
  11. Lavoie, T. L., et al. Disrupting actin-myosin-actin connectivity in airway smooth muscle as a treatment for asthma. Proceedings of the American Thoracic Society. 6 (3), 295-300 (2009).
  12. Kraning-Rush, C. M., et al. Quantifying traction stresses in adherent cells. Methods in Cell Biology. 110, 139-178 (2012).
  13. Halliday, N. L., Tomasek, J. J. Mechanical properties of the extracellular matrix influence fibronectin fibril assembly in vitro. Experimental Cell Research. 217 (1), 109-117 (1995).
  14. Harris, A. K., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
  15. Aratyn-Schaus, Y., et al. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (46), e2173 (2010).
  16. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  17. Sniadecki, N. J., Chen, C. S. Microfabricated silicone elastomeric post arrays for measuring traction forces of adherent cells. Methods in Cell Biology. 83, 313-328 (2007).
  18. Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (4), 1484-1489 (2003).
  19. Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
  20. Polio, S. R., Smith, M. L. Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces. Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).
  21. Polio, S. R., et al. Topographical control of multiple cell adhesion molecules for traction force microscopy. Integrative Biology. 6 (3), 357-365 (2014).
  22. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
  23. Maloney, J. M., et al. Influence of finite thickness and stiffness on cellular adhesion-induced deformation of compliant substrata. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 78 (1), Pt 1 041923 (2008).
  24. Gilles, S. Chemical modification of silicon surfaces for the application in soft lithography. Technical Report Juel-4249. , Available from: https://www.osti.gov/etdeweb/biblio/21084355 (2007).
  25. Lim, K. B., Lee, D. C. Surface modification of glass and glass fibers by plasma surface treatment. Surface and Interface Analysis. 36, 254-258 (2004).
  26. Beal, J. H. L., Bubendorfer, A., Kemmitt, T., Hoek, I., Arnold, W. M. A rapid, inexpensive surface treatment for enhanced functionality of polydimethylsiloxane microfluidic channels. Biomicrifluidics. 6 (3), 36503 (2012).
  27. Goddard, J. M., Erickson, D. Bioconjugation techniques for microfluidic biosensors. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394 (2), 469-479 (2009).
  28. Rajagopalan, P., et al. Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata. Biophysical Journal. 87 (4), 2818-2827 (2004).
  29. Tang, X., Yakut Ali, M., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 3197-3206 (2012).
  30. Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2010).
  31. Rusmini, F., Zhong, Z., Feijen, J. Protein immobilization strategies for protein biochips. Biomacromolecules. 8 (6), 1775-1789 (2007).
  32. Polio, S. R., et al. A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8 (1), 82-88 (2012).
  33. Buxboim, A., et al. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
  34. Xu, H., et al. Focal adhesion displacement magnitude is a unifying feature of tensional homeostasis. Acta Biomaterialia. 113, 327-379 (2020).
  35. Shen, K., et al. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (22), 7791-7796 (2008).
  36. Eichinger, C. D., Hsiao, T. W., Hlady, V. Multiprotein microcontact printing with micrometer resolution. Langmuir. 28 (4), 2238-2243 (2012).
  37. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (22), e1065 (2008).
  38. Zollinger, A. J., et al. Dependence of tensional homeostasis on cell type and on cell-cell interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (3), 175-184 (2018).
  39. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Extending microcontact printing as a microlithographic technique. Langmuir. 13 (7), 2059-2067 (1997).
  40. Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
  41. Rottmar, M., et al. Stem cell plasticity, osteogenic differentiation and the third dimension. Journal of Materials Science-Materials in Medicine. 21 (3), 999-1004 (2010).
  42. Desai, R. A., et al. Subcellular spatial segregation of integrin subtypes by patterned multicomponent surfaces. Integrative Biology. 3 (5), 560-567 (2011).
  43. Kim, S. H., Lee, S., Ahn, D., Park, J. Y. PDMS double casting method enabled by plasma treatment and alcohol passivation. Sensors and Actuators B: Chemical. 293, 115-121 (2019).
  44. Butler, J. P., Tolić-Nǿrrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  45. Canović, E. P., et al. Biomechanical imaging of cell stiffness and prestress with subcellular resolution. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (3), 665-678 (2014).
  46. Stamenović, D., Smith, M. L. Tensional homeostasis at different length scales. Soft Matter. 16 (30), 6946-6963 (2020).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 180،
توليد النمط لمجهر الجر المجهري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bunde, K. A., Stamenović, D.,… More

Bunde, K. A., Stamenović, D., Smith, M. L. Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy. J. Vis. Exp. (180), e63628, doi:10.3791/63628 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter