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Bioengineering

Mustergenerierung für die Mikromuster-Traktionsmikroskopie

Published: February 17, 2022 doi: 10.3791/63628
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Boston University

Summary

Wir beschreiben Verbesserungen an einer Standardmethode zur Messung zellulärer Zugkräfte, die auf dem Mikrokontaktdruck mit einem einzigen subtraktiven Musterungsschritt von Punktarrays extrazellulärer Matrixproteine auf weichen Hydrogelen basiert. Diese Methode ermöglicht eine einfachere und konsistentere Herstellung von Inselmustern, die für die Steuerung der Zellgruppenform unerlässlich sind.

Abstract

Die Mikromuster-Traktionsmikroskopie ermöglicht die Kontrolle der Form einzelner Zellen und Zellcluster. Darüber hinaus ermöglicht die Fähigkeit, auf der Mikrometerlängenskala zu mustern, die Verwendung dieser strukturierten Kontaktzonen für die Messung von Zugkräften, da jeder mikrostrukturierte Punkt die Bildung einer einzigen fokalen Adhäsion ermöglicht, die dann das weiche, darunter liegende Hydrogel verformt. Dieser Ansatz wurde für eine Vielzahl von Zelltypen verwendet, darunter Endothelzellen, glatte Muskelzellen, Fibroblasten, Blutplättchen und Epithelzellen.

Dieser Review beschreibt die Entwicklung von Techniken, die das Drucken von extrazellulären Matrixproteinen auf Polyacrylamid-Hydrogele in einer regelmäßigen Anordnung von Punkten mit vorgegebener Größe und Abstand ermöglichen. Da Muster im Mikrometermaßstab schwer direkt auf weiche Substrate gedruckt werden können, werden Muster zunächst auf starren Glasabdeckungen erzeugt, die dann verwendet werden, um das Muster während der Gelierung auf das Hydrogel zu übertragen. Zunächst wird der ursprüngliche Mikrokontaktdruckansatz zur Erzeugung von Arrays kleiner Punkte auf dem Deckglas beschrieben. Ein zweiter Schritt, der den größten Teil des Musters entfernt, um Inseln aus kleinen Punkten zu hinterlassen, ist erforderlich, um die Formen von Zellen und Zellclustern auf solchen Arrays von gemusterten Punkten zu kontrollieren.

Als nächstes wird eine Weiterentwicklung dieses Ansatzes beschrieben, die die Erzeugung von Punktinseln mit einem einzigen subtraktiven Musterungsschritt ermöglicht. Dieser Ansatz ist für den Benutzer stark vereinfacht, hat aber den Nachteil, dass die Lebensdauer der Masterform, die zur Herstellung der Muster benötigt wird, verringert wird. Schließlich werden die Berechnungsansätze beschrieben, die für die Analyse von Bildern verschobener Punkte und nachfolgender zellgenerierter Traktionsfelder entwickelt wurden, und aktualisierte Versionen dieser Analysepakete werden bereitgestellt.

Introduction

Die meisten Zellphänotypen üben Zugkräfte auf ihre Umgebung aus. Diese Zugkräfte werden durch das kontraktile Zytoskelett einer Zelle erzeugt, das ein Netzwerk aus Aktin und Myosin ist, und anderen filamentösen Biopolymeren und Vernetzungsproteinen 1,2,3,4. Kräfte, die innerhalb der Zelle erzeugt werden, können auf die extrazelluläre Umgebung oder benachbarte Zellen übertragen werden, hauptsächlich über Transmembranproteine wieIntegrine bzw. Cadherine 5,6. Wie sich eine Zelle ausbreitet oder zusammenzieht - und die Größenordnungen der Zugkräfte, die mit diesen Bewegungen verbunden sind - ist das Ergebnis eines intimen Gesprächs mit ihrer Umgebung, das weitgehend von der Art und Menge des in der extrazellulären Matrix (ECM) vorhandenen Proteins abhängt7,8 und der Steifigkeit des ECM. Tatsächlich ist die Zugkraftmikroskopie zu einem unschätzbaren Werkzeug geworden, um die Reaktionsfähigkeit der Zellen auf lokale Reize wie Substratsteifigkeit, auferlegte mechanische Spannungen und Dehnungen oder den Kontakt mit anderen Zellen zu verstehen. Diese Informationen sind direkt relevant für das Verständnis von Krankheiten wie Krebs und Asthma 9,10,11,12.

Zur Berechnung der Zugkräfte ist ein System erforderlich, mit dem die kraftinduzierte Verformung eines Substrats mit bekannten Materialeigenschaften gemessen werden kann. Diese Veränderungen müssen im Laufe der Zeit verfolgt werden, was sowohl bildgebende als auch Bildverarbeitungstechniken erfordert. Eine der ersten Methoden zur Bestimmung der zellulären Zugkräfte war die Beobachtung und Analyse der Kontraktion von Kollagenhydrogelen, die mit Zellen ausgesät waren, obwohl diese Methode nur semiquantitativwar 13. Eine weitere, verfeinerte Methode bestand darin, die von einzelnen Zellen ausgeübten Zugkräfte zu messen, indem die Kräfte bestimmt wurden, die sich aus der Verformung einer dünnen Silikonschicht14 ergaben. Später wurden quantitativere Messtechniken entwickelt, die auch die Verwendung von weichen Hydrogelen wie Polyacrylamid (PAA) 12,15,16 ermöglichten. Bei der Verwendung dieser weichen Materialien konnten Zugkräfte aus der kraftinduzierten Verschiebung von zufällig verschobenen Perlen, die in das Hydrogel eingebettet sind, und den mechanischen Eigenschaften des Gels16,17 bestimmt werden. Ein weiterer Fortschritt kam mit der Entwicklung von Mikropost-Arrays aus weichem Polydimethylsiloxan (PDMS), so dass ihre Auslenkung gemessen und mit Hilfe der Strahltheorie18 in Kraft umgewandelt werden konnte.

Schließlich wurden Methoden zur Mikrostrukturierung weicher Hydrogele entwickelt, da diese Ansätze die Kontrolle der Kontaktbereiche für die Zelladhäsion ermöglichen. Durch die Messung der Verformung des Mikromusters innerhalb der Kontaktfläche einer Zelle könnten Zugkräfte leicht berechnet werden, da kein kraftfreies Referenzbild erforderlichist 19. Diese Methode ist weit verbreitet, da sie die indirekte Strukturierung einer regelmäßigen Anordnung von mikrometergroßen, diskreten fluoreszierenden Proteinadhäsionspunkten auf PAA-Gele zur Messung der zellulären Zugkräfteermöglicht 20. Um diese Kräfte zu berechnen, wurde ein Bildverarbeitungsalgorithmus entwickelt, der die Bewegungen jedes mikrostrukturierten Punktes verfolgen kann, ohne dass Benutzereingaben erforderlich sind,21.

Während diese Methode zum Erstellen ganzer Raster von Punktmustern einfach ist, ist sie komplizierter, wenn Muster von isolierten Flecken (oder Inseln) von Punkten gewünscht werden. Mikrostrukturierte Inseln sind nützlich, wenn die Kontrolle der Form und bis zu einem gewissen Grad der Größe von Zellclustern erforderlich ist. Um diese Inseln zu erstellen, erfordert die oben genannte Methode des Mikrokontaktdrucks zwei verschiedene Schritte: i) Verwendung eines PDMS-Stempels, um ein High-Fidelity-Muster von Punkten auf einem Deckglas zu erstellen, und dann ii) Verwendung eines zweiten anderen PDMS-Stempels, um die meisten dieser Punkte zu entfernen, wobei isolierte Inseln von Punkten21 zurückbleiben. Die Schwierigkeit, Inseln mit dieser ursprünglichen Methode zu erstellen, wird durch die Tatsache verstärkt, dass die Erstellung konsistenter Rastermuster im ersten Schritt des Prozesses für sich genommen eine Herausforderung darstellt. Mikrodruckstempel bestehen aus einer Anordnung von kreisförmigen Mikropfosten, deren Durchmesser der gewünschten Punktgröße entspricht. Diese Stempel werden dann mit einer gleichmäßigen Proteinschicht überzogen und dann mit einer genauen Menge Druck auf behandelte Deckgläser gestanzt, um das gewünschte Muster zu erzeugen. Auf der einen Seite kann zu viel Druck auf den Stempel zu einem ungleichmäßigen Proteintransfer und einer schlechten Mustertreue führen, da die Säule zwischen den Säulen knickt oder durchhängt, was zu einem Kontakt mit dem Glas führt. Auf der anderen Seite führt die Anwendung von zu wenig Druck zu wenig bis gar keinem Proteintransfer und einer schlechten Mustertreue. Aus diesen Gründen ist ein Transferverfahren erwünscht, mit dem sich in nur einem Schritt konsistent hochwertige Mikromuster isolierter Punktinseln erzeugen lassen.

Hierin wird ein Verfahren zur indirekten Mikrostrukturierung von Inseln mikrometergroßer fluoreszierender Proteinadhäsionspunkte auf einem PAA-Gel beschrieben, das konsistenter und vielseitiger ist als zuvor entwickelte Verfahren. Während ältere indirekte Mikrostrukturierungsverfahren auf der Übertragung von Proteinmustern von einem PDMS-Stempel auf ein Zwischensubstrat beruhen, verwendet die hier vorgestellte Methode PDMS-Stempel stattdessen als Gefäß für die Proteinentfernung, nicht für die Addition. Dies geschieht, indem zunächst die Struktur der verwendeten PDMS-Stempel grundlegend geändert wird. Anstatt Stempel herzustellen, die aus einem Muster von gleichmäßig verteilten kreisförmigen Säulen bestehen, bestehen Stempel bei dieser Methode aus einem Muster von gleichmäßig verteilten kreisförmigen Löchern.

Mit dieser neuen Struktur kann die Oberfläche dieser PDMS-Stempel dann mit Glutaraldehyd behandelt werden, wie zuvorbeschrieben 20,29,30, wodurch der Stempel kovalent mit Protein binden kann. Wenn sie auf einem Glasdeckglas verwendet werden, das gleichmäßig mit fluoreszierendem Protein beschichtet ist, werden diese mit Glutaraldehyd behandelten PDMS-Stempel verwendet, um den größten Teil des Proteins auf der Oberfläche des Deckglases zu entfernen, wobei nur das gewünschte Muster von Punkten zurückbleibt, die durch die Position von mikrometergroßen Löchern auf dem Stempel vorgegeben sind. Diese Änderung erhöht die Erfolgsquote für die Erzeugung von Mustern, die aus einem nahezu kontinuierlichen Gitter von Punkten bestehen, und für die Erstellung isolierter Inseln von Punkten durch nur einen Schritt.

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Protocol

1. Erstellung von Silikon-Mastern

HINWEIS: Der größte Teil des Prozesses des Designs, der Erstellung und der Fehlerbehebung von Silizium-Mastern für das wiederholte Formen von PDMS-Stempeln wurde zuvorbehandelt 21, so dass hier nur die wichtigsten Unterschiede in diesem neuen Ansatz beschrieben werden.

  1. Erstellen Sie den Entwurf für die Fotomaske mit AutoCAD oder einer ähnlichen Konstruktionssoftware. Beschichten Sie eine Seite der Fotomaske, ein dünnes Stück Glas, mit einer dünnen Chromschicht, um die UV-Lichtstreuung zu kontrollieren. Entwerfen Sie die Fotomaske so, dass durch das Strahlen von UV-Licht auf den ausgewählten Fotolack ein Silikonmaster mit der Umkehrung der gewünschten Merkmale auf den endgültigen PDMS-Stempeln entsteht. Siehe Abbildung 1 für das Design dieser Maske.
    HINWEIS: Ob die gewünschten Merkmale oder der Bereich außerhalb davon auf der Fotomaske transparent gemacht werden sollen, hängt vom gewählten Fotolack ab. Der hier verwendete Fotolack ist SU-8 2005 (ACHTUNG: brennbar, haut- und augenreizend; halten Sie sich von Hitze / Flammen / Funken fern und verwenden Sie Schutzhandschuhe und Brillen bei der Handhabung), ein negativer Fotolack, der in der Lage ist, 5 μm hohe Merkmale mit fast vertikalen Seitenwänden zu erzeugen.
    1. Härten Sie den negativen Fotolack aus, indem Sie ihn UV-Licht aussetzen und das nicht ausgehärtete SU-8 mit einem chemischen Lösungsmittel entfernen. Entwerfen Sie daher die Hauptmerkmale der Maske so, dass sie transparent sind, während die Umgebung der Maske undurchsichtig ist.
    2. Entwerfen Sie die Fotomaske für diese neue Entfernungsmethode so, dass sie aus zwei Quadraten von 1,5 x 1,5 cm besteht (Abbildung 1A), einem mit einem gleichmäßigen Raster von 2 μm-Kreisen im Abstand von 6 μm von Mitte zu Mitte und einem anderen, das aus vielen quadratischen Inseln besteht, bei denen es sich um kleinere, isolierte Versionen desselben Gittermusters handelt (Abbildung 1B). Erstellen Sie Inseln in den folgenden Größen: 6 x 6 Punkte, 12 x 12 Punkte, 25 x 25 Punkte und 42 x 42 Punkte.
      HINWEIS: Der Durchmesser der Adhäsionspunkte (2 μm) wurde auf der Grundlage früherer Studien gewählt, die zelluläre Zugkräfte22,23 gemessen haben. Die hier verwendete Maske ist 101,6 x 101,6 mm groß und einseitig mit einer 0,06 μm dicken Chromschicht beschichtet, die aufgrund der geringen Merkmale des Masters empfehlenswert ist. Die hier verwendete Fotomaske wurde bei einer externen Fotomaskendruckerei in Auftrag gegeben.
  2. Beschichten Sie in einem Reinraum den ausgewählten Siliziumwafer gleichmäßig mit Fotolack. Als optionalen Schritt behandeln Sie den Wafer in einem Plasmasascher, bevor Sie ihn mit Lack beschichten.
    HINWEIS: Hier kommen Wafer mit 100 mm Durchmesser zum Einsatz. Die Behandlung in einem Plasma-Asher macht den Wafer für die Bindung an SU-8 zugänglicher und hilft, die Delaminierung von SU-8 vom Wafer zu verhindern.
  3. Führen Sie die folgenden Schritte gemäß den Anweisungen des Fotolackherstellers aus:
    1. Drehen Sie den beschichteten Wafer, um die gewünschte Merkmalsdicke zu erzeugen, und variieren Sie die Schleuderzeit basierend auf der gewünschten Dicke und der Art des Lacks. Für eine 5 μm dicke SU-8 2005 unterteilen Sie das empfohlene Spinprogramm in die folgenden drei Schritte:
      1. Beschichten Sie den Wafer mit Fotolack, indem Sie ihn bei 500 U / min für 10 s mit einer Rampe von 100 U / min / s drehen.
      2. Reduzieren Sie die Lackdicke auf etwa 5 μm, indem Sie den Wafer mit 3.000 U / min mit einer Rampe von 300 U / min / s für 30 s drehen.
      3. Verlangsamen Sie den Wafer nach dem Drehen langsam, indem Sie die Geschwindigkeit auf 0 RMP mit einer Rampe von 500 U / min / s für 1 s reduzieren.
    2. Bereiten Sie den Lack für die UV-Belichtung vor, indem Sie ihn kurz auf einer 95 °C heißen Platte backen. Ändern Sie die auf der Heizplatte verbrachte Zeit entsprechend der gewünschten Dicke des Lacks. Die Backzeit beträgt 2 min für eine 5 μm dicke SU-8 2005.
    3. Setzen Sie den Lack UV-Licht aus, um die gewünschten Eigenschaften vollständig auszuhärten. Seien Sie vorsichtig bei Überbelichtung, da dies SU-8 spröde machen und die Gesamtqualität des resultierenden Masters beeinträchtigen kann.
      1. Verwenden Sie eine Expositionsenergie von 105 mJ/cm2 für eine 5 μm dicke SU-8 2005. Berechnen Sie basierend auf der Leistung der verfügbaren UV-Lampe die Belichtungszeit, indem Sie die Belichtungsenergie durch die Leistung der Lampe in mW dividieren.
        HINWEIS: Da die hier verwendete Lampe eine Leistung von 8 mW hat, sollte die Belichtungszeit 13,1 s betragen.
    4. Um die SU-8 Features nach der Entwicklung einzustellen, backen Sie erneut auf einer 95 °C heißen Platte, diesmal für 3 min. Warten Sie, bis die gewünschten Eigenschaften des Masters innerhalb von 1 Minute während dieses Backschritts erscheinen, wenn der Lack richtig freigelegt wurde.
    5. Entfernen Sie den nicht ausgehärteten SU-8 mit SU-8 developer vom Siliziumwafer. Seien Sie gründlich, wenn Sie den nicht ausgehärteten SU-8 entfernen, da er zwischen den mikrometergroßen und den abstandsgroßen Merkmalen des Wafers stecken bleiben kann.
      ACHTUNG: SU-8 Entwickler ist ein brennbares Haut- und Augenreizmittel; Halten Sie es von Hitze / Flammen / Funken fern und verwenden Sie beim Umgang Schutzhandschuhe und Brillen.
    6. Nach der Entwicklung mit Aceton abspülen, um überschüssigen Entwickler auf dem Wafer zu entfernen, und es vollständig mit einer Stickstoffspritzpistole trocknen.
      ACHTUNG: Aceton ist ein entzündliches Haut- und Augenreizmittel; Halten Sie es von Flammen / Funken fern und verwenden Sie beim Umgang Schutzhandschuhe und Brillen.
    7. Optional für SU-8 2005 10 min auf einer 200 °C heißen Platte backen.
      HINWEIS: Diese Hartbacke verleiht dem Fotolack mechanische Festigkeit.
  4. Nachdem Sie das Abkühlen zugelassen haben, legen Sie den Wafer in ein Wafer-Trägerfach und gießen Sie ihn dann in PDMS. Führen Sie zunächst eine Silanisierungsbehandlung auf dem Wafer durch, um die SU-8-Merkmale des Siliziummasters weniger wahrscheinlich an PDMS zu binden und somit weniger wahrscheinlich von der Oberfläche des Wafers entfernt zu werden.
    1. Um die Silanisierungsoberflächenbehandlung abzuschließen, legen Sie den Master und einen kleinen Glasdeckel in einen Exsikkator, der nur für die Verwendung mit Silanen bestimmt ist. Legen Sie 1-2 kleine Tropfen Trichlor (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyl) silan auf das Deckglas, schließen Sie den Exsikkator und lassen Sie ihn 30 Minuten lang bei einem Druck von 4.500 Pa24 unter Vakuum laufen.
      ACHTUNG: Trichlor(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silan ist ein brennbares Haut- und Augenreizmittel; Halten Sie es von Hitze / Flammen / Funken fern, verwenden Sie Schutzhandschuhe und Brillen bei der Handhabung und arbeiten Sie unter einer Abzugshaube.
    2. Schalten Sie das Vakuum aus und lassen Sie den Master und das Deckglas für weitere 30 Minuten im Exsikkator.
      HINWEIS: Der Master ist jetzt bereit für das Gießen in PDMS.

2. Subtraktiver Mikrokontaktdruck

  1. Mischen Sie PDMS im richtigen Verhältnis von Härter zu Basis basierend auf den Anweisungen des Herstellers. Lassen Sie es bei Raumtemperatur und Druck für 15 min sitzen; Dann 15 min unter Vakuum entgasen.
  2. Gießen Sie das PDMS in den Master und legen Sie es über Nacht in einen auf 37 °C eingestellten Inkubator, um es auszuhärten.
  3. Entfernen Sie den Master aus dem Inkubator und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur abkühlen.
  4. Während der Master abkühlt, beschallen Sie 25 mm Deckgläser in Ethanol für 10 min. Verwenden Sie so viele Deckgläser wie die Anzahl der Prägungen, die vorbereitet werden.
  5. 25-mm-Deckgläser gründlich mit deionisiertem (DI) Wasser abspülen und mit einer gefilterten Luftpistole trocknen.
  6. Plasmabehandlung der Deckgläser für 1 min mit einem Plasmareiniger unter Vakuum auf hoher Ebene (Hochfrequenzleistung von 30 W). Achten Sie darauf, das Vakuum nach der Behandlung langsam freizugeben, um zu verhindern, dass sich die Deckgläser in der Kammer bewegen.
    HINWEIS: Die Plasmabehandlung der Glasoberfläche dient zwei Zwecken: Sie reinigt die Oberfläche des Glases, um Verunreinigungen zu entfernen, und erzeugt sauerstoffbasierte polare Gruppen auf der Oberfläche des Glases, um es hydrophobzu machen 25. Diese Hydrophobie macht die Oberfläche des Glases für die Proteinbindung zugänglicher.
  7. Beschichten Sie in einem Raum ohne direkte Sonneneinstrahlung / Deckenbeleuchtung jedes Deckglas mit 100 μL fluoreszierend markierter Proteinlösung in einer Konzentration von mindestens 100 μg / ml, decken Sie zusätzlichen Schutz vor Licht ab und lassen Sie es 20 Minuten ruhen.
    HINWEIS: Hier wird Fibronektin verwendet, das aus menschlichem Plasma isoliert und mit AlexaFluor 488 gefärbt wurde.
    1. Um Fibronektin zu färben, kombinieren Sie unmarkiertes Fibronektin bekannter Konzentration und Volumen mit der entsprechenden Menge an Fluoreszenzfarbstoff in einem 1,5-ml-Röhrchen. Decken Sie die Tube mit Aluminiumfolie ab, um den Farbstoff vor Licht zu schützen, und inkubieren Sie ihn bei Raumtemperatur für 1 Stunde, wobei Sie ihn alle 10 Minuten vorsichtig mischen, indem Sie den Schlauch 5-10 Mal auf den Kopf stellen.
      HINWEIS: Die Menge des benötigten Farbstoffs variiert je nach verwendetem Farbstoff und der Masse des verwendeten Proteins. Siehe Zusatzdatei 1 für den Rechner, der verwendet wird, um die geeignete Menge an Farbstoff für Fibronektin zu bestimmen, die mit Alexa 488 markiert ist. Gemäß den Anweisungen des Herstellers kann überschüssiger Farbstoff durch den Einsatz von Entsalzungssäulen herausgefiltert werden (siehe Materialtabelle).
  8. Spülen Sie jedes Deckglas gründlich mit DI-Wasser ab und entfernen Sie überschüssiges Wasser von der Oberfläche, indem Sie die Seiten jedes Deckglases vorsichtig auf ein Papiertuch oder ähnlich saugfähiges Material klopfen. Lassen Sie die Deckgläser mindestens 30 Minuten im Dunkeln unbedeckt, damit sie vollständig trocknen können.
  9. Während die proteinbeschichteten Deckgläser trocknen, entfernen Sie den PDMS-Stempel vom Master, indem Sie ihn mit einem Skalpell oder einer anderen scharfen Klinge schneiden.
    HINWEIS: Es ist am besten, nicht zu versuchen, das PDMS beim ersten Versuch zu durchschneiden, da das Anlegen von so viel Druck den Siliziumwafer knackt und den Master beschädigt.
  10. Plasmabehandlung der PDMS-Stempel für 2 min unter Vakuum auf hoher Ebene (Hochfrequenzleistung von 30 W).
  11. Legen Sie die Stempel in einen Behälter mit einem Deckel und beschichten Sie jeden Stempel mit einer sehr dünnen Schicht (<100 μL) aus 10% (3-Aminopropyl)trimethoxysilan (3-APTMS), verdünnt in 100% Ethanol.
    ACHTUNG: 3-APTMS ist ein brennbares Haut- und Augenreizmittel; Halten Sie es von Flammen / Funken fern, verwenden Sie beim Handling Schutzhandschuhe und Brillen und arbeiten Sie unter einer Dunstabzugshaube. Eine übermäßige Beschichtung der 3-APTMS-Lösung führt dazu, dass sich später in diesem Prozess ein orangefarbener Film bildet. Diese 3-APTMS-Oberflächenbehandlung integriert die Aminfunktionalität in die Oberfläche des PDMS-Stempels, was eine weitere Ableitung der Oberfläche des Stempels später am26. ermöglicht.
  12. Decken Sie den Behälter mit den Stempeln ab und lassen Sie ihn 5 Minuten bei Raumtemperatur sitzen.
  13. Spülen Sie jeden Stempel mit DI-Wasser auf beiden Seiten gründlich ab.
  14. Legen Sie die Stempel in einen sauberen Behälter und beschichten Sie sie großzügig mit 2,5% Glutaraldehyd in DI-Wasser.
    ACHTUNG: Glutaraldehyd ist giftig; Verwenden Sie Schutzhandschuhe und Brillen bei der Handhabung und Arbeit unter einer Dunstabzugshaube). Diese Glutaraldehydbehandlung bietet neben der vorherigen 3-APTMS-Behandlung Aldehydfunktionalitäten auf der Oberfläche der PDMS-Stempel, die mit den Amingruppen in den Proteinen reagieren können, um eine sekundäre Aminbindung zu erzeugen, die für den Proteinentfernungsprozessentscheidend ist 27.
  15. Decken Sie die Stempel ab, lassen Sie sie 30 min bei Raumtemperatur stehen und spülen Sie sie dann erneut gründlich mit DI-Wasser ab. Entfernen Sie überschüssiges Wasser von der Oberfläche der Stempel auf die gleiche Weise wie die Deckgläser und lassen Sie die Stempel für ~ 30 Minuten unbedeckt trocknen.
  16. Prüfen Sie nach 30 min, ob sowohl die proteinbeschichteten Deckgläser als auch die Stempel trocken sind. Wenn einer von beiden nicht vollständig trocken ist, verwenden Sie eine gefilterte Luftpistole, um sie vollständig zu trocknen, und stellen Sie sicher, dass die Deckgläser über einen längeren Zeitraum nicht dem Licht ausgesetzt sind.
  17. Sobald sowohl die Deckgläser als auch die Stempel trocken sind, drücken Sie das Stempelmuster mit genügend Druck seitlich nach unten auf die Deckgläser, so dass die Stempel in vollen Kontakt mit der Oberfläche des Deckglases kommen. Lassen Sie die Stempel 15 min mit den Deckgläsern in Berührung.
    HINWEIS: Aufgrund der kovalenten Amidbindung zwischen dem Glutaraldehydstempel und der Proteinschicht auf dem Glasdeckglas - die viel stärker ist als die schwachen hydrophoben Wechselwirkungen zwischen der Proteinschicht und dem Glasdeckel - sollten die Proteine das Glas nach dem Muster auf dem PDMS-Stempel abziehen, sobald es entfernt wird.
  18. Nach 15 Minuten die PDMS-Stempel vorsichtig von den Deckgläsern abziehen.
    HINWEIS: Wenn der Entnahmevorgang korrekt funktioniert hat, sollten sich die Stempel nicht widerstandslos von den Deckgläsern lösen, sondern auch nicht so fest an den Deckgläsern haften, dass sie nicht ohne übermäßige Kraft entfernt werden können.
  19. Überprüfen Sie die Echtheit der gemusterten Deckgläser mit dem entsprechenden Filter auf einem Fluoreszenzmikroskop (je nachdem, mit welchem Fluoreszenzfarbstoff die Proteine markiert sind).
  20. Verwenden Sie die gemusterten Deckgläser sofort oder speichern und lagern Sie sie vor direktem Licht geschützt.

3. Aktivierte Deckgläser

HINWEIS: In diesem Schritt werden die unteren Deckgläser für den Einsatz in der Versuchskammer für PAA-Gele hergestellt. Dieser untere Deckglas ist speziell behandelt, damit das PAA-Gel sicher haftet, wenn der obere gemusterte Deckglas während des Musterungsprozesses entfernt wird. Ähnliche Techniken werden auch an anderer Stellebeschrieben 10,12,15,28.

  1. Beschallen Sie 30 mm Deckgläser in 100% Ethanol für 10 min, spülen Sie mit DI-Wasser und trocknen Sie dann gründlich mit einer gefilterten Luftpistole. Bereiten Sie bis zu 6 Deckgläser gleichzeitig pro Charge in einer 6-Well-Platte vor.
  2. Plasma behandeln Sie die Deckgläser für 1 min auf hoher Ebene (Hochfrequenzleistung von 30 W) und legen Sie dann jedes Deckglas in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte.
  3. Beschichten Sie jedes Deckglas mit einer sehr dünnen Schicht von 5% APTMS in Ethanol in einem Abzug.
    HINWEIS: Bei übermäßiger Beschichtung bei diesem Prozess bildet sich ein orangefarbener Rückstand.
  4. Decken Sie die 6-Well-Platte ab und lassen Sie die Deckgläser 5 min ruhen.
  5. Spülen Sie die Deckgläser (beidseitig) und die Innenseite jedes Brunnens gründlich mit DI-Wasser ab und entfernen Sie überschüssiges Wasser in den Brunnen.
  6. Legen Sie die Deckgläser wieder in die 6-Well-Platte und fügen Sie etwa 2 ml 0,5% Glutaraldehyd in DI-Wasser hinzu.
  7. Decken Sie die 6-Well-Platte ab und lassen Sie die Deckgläser 30 min in der Glutaraldehydlösung sitzen; Spülen Sie dann sowohl die Deckgläser als auch die Vertiefungen jeder Platte gründlich mit DI-Wasser ab.
  8. Lagern Sie die behandelten Deckgläser in DI-Wasser innerhalb der 6-Well-Platten für bis zu zwei Wochen oder verwenden Sie sie sofort. Stellen Sie sicher, dass die Deckgläser vor dem Gebrauch vollständig trocken sind.

4. PAA-Gelherstellung und Musterübertragung

HINWEIS: Sobald gemusterte Deckgläser hergestellt sind, müssen sie verwendet werden, um diese Proteinmuster bald darauf (<24 h) 1,29,30 auf das PAA-Hydrogel zu übertragen. Das folgende Rezept ist für ein PAA-Gel mit einem Young-Modul von 3,6 kPa. Die Mengen an Bis-Acrylamid, Acrylamid und DI-Wasser können variiert werden, um die Steifigkeit der PAA-Gele12 einzustellen.

  1. Kurz bevor Sie mit der Herstellung des PAA-Hydrogel-Vorläufers beginnen, entfernen Sie den Acrylsäure-N-Hydroxysuccinimid (NHS)-Ester aus dem Kühlschrank, damit er vor dem Öffnen Raumtemperatur erreichen kann. Bereiten Sie ein austauschbares Deckglasgeschirr vor, indem Sie es mit 70% Ethanol sterilisieren und vor Gebrauch mindestens 30 Minuten unter UV-Licht in einer Biosicherheitskabine stehen lassen.
    ACHTUNG: NHS ist ein giftiges Haut- und Augenreizmittel; Verwenden Sie Schutzhandschuhe und Brillen bei der Handhabung und arbeiten Sie unter einer Dunstabzugshaube.
    1. Fügen Sie 1,25 ml 40% Acrylamid in DI-Wasser zu einem 15 ml konischen Röhrchen hinzu.
      ACHTUNG: Acrylamid ist ein giftiges Haut- und Augenreizmittel; Verwenden Sie Schutzhandschuhe und Brillen bei der Handhabung und arbeiten Sie unter einer Dunstabzugshaube.
    2. 175 μL Bis-Acrylamid-Lösung in DI-Wasser in dieselbe Tube geben (Schritt 4.1.1).
      ACHTUNG: Bis-Acrylamid ist ein giftiges Haut- und Augenreizmittel; Verwenden Sie Schutzhandschuhe und Brillen bei der Handhabung und arbeiten Sie unter einer Dunstabzugshaube.
    3. Fügen Sie 500 μL 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) hinzu.
      ACHTUNG: PBS ist ein Augenreizstoff; Verwenden Sie Schutzhandschuhe und Brillen bei der Handhabung.
    4. Fügen Sie 2,915 ml DI-Wasser hinzu.
  2. Pipette 969 μL dieses Vorläufers in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie den Rest bei 4 °C für bis zu zwei Wochen.
  3. Messen Sie ~ 50-100 mg Ammoniumpersulfat (APS) in einem anderen Mikrozentrifugenröhrchen aus und verdünnen Sie es in DI-Wasser auf 100 mg / ml; Legen Sie es für die spätere Verwendung beiseite. Öffnen Sie den NHS-Ester (jetzt bei Raumtemperatur) in der Haube und messen Sie vorsichtig bis zu 3 mg NHS in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Verdünnen Sie den NHS-Ester auf 1 mg / ml in 1x PBS.
    ACHTUNG: APS ist ein Haut- und Augenreizmittel; Verwenden Sie Schutzhandschuhe und Brillen bei der Handhabung und arbeiten Sie unter einer Dunstabzugshaube. Sowohl APS als auch NHS-Ester hydrolysieren im Laufe der Zeit, wodurch die Aktivität der Chemikalien in der Stammlösung variiert. Daher müssen beide Lösungen jedes Mal frisch zubereitet werden (im Gegensatz zum Rest des Vorläufers).
  4. Führen Sie die nächsten drei Schritte in einem Abzug aus:
    1. 2 μL Tetramethylethylendiamin (TEMED) in das Mikrozentrifugenröhrchen geben, das das 969 μL Aliquot des PAA-Vorläufers enthält.
      ACHTUNG: TEMED ist ein entzündliches Haut- und Augenreizmittel; Halten Sie es von Hitze / Flamme / Funken fern, verwenden Sie Schutzhandschuhe und Brillen bei der Handhabung und arbeiten Sie unter einer Abzugshaube. TEMED ist einer von zwei Vernetzungsmitteln, die für die Polymerisation des PAA-Hydrogels entscheidend sind, das andere ist APS.
    2. Fügen Sie 15 μL 1 M Salzsäure hinzu, um den pH-Wert der Hydrogellösung zu senken und die Hydrolyse des NHS-Esters zu vermeiden.
      ACHTUNG: Salzsäure ist ein ätzendes Haut- und Augenreizmittel; Verwenden Sie Schutzhandschuhe und Brillen bei der Handhabung und arbeiten Sie unter einer Dunstabzugshaube.
    3. 10 μL der NHS-Esterlösung in das Röhrchen geben.
      HINWEIS: Der NHS ist für den Musterungsprozess von entscheidender Bedeutung. Es reagiert mit Amingruppen in den Proteinen auf dem gemusterten Deckglas, um eine stabile Amidbindung zu bilden, die es ermöglicht, das Muster vom Glasdeckglied auf die Oberfläche des PAA-Gels zu übertragen, während es31 polymerisiert.
  5. Führen Sie die folgenden letzten Schritte in einer Biosicherheitskabine durch:
    1. Legen Sie den 30 mm Deckglas vorsichtig in den Metallteil des Deckglasgeschirrsets (3-APTMS und Glutaraldehyd-behandelte Seite nach oben) und schrauben Sie den Kunststoffring obendrauf. Stellen Sie das gemusterte Deckglas so auf, dass es im nächsten Schritt leicht zu erreichen ist, und schützen Sie es dennoch so weit wie möglich vor Licht.
    2. Pippetten Sie 5 μL APS-Lösung in den Rest des PAA-Vorläufers im Mikrozentrifugenröhrchen, invertieren Sie es zum Mischen und pipettieren Sie dann sofort 35 μL dieser Lösung auf das 30-mm-Deckglas.
    3. Lassen Sie das gemusterte Deckglasprotein mit der Seite nach unten auf die Lösung fallen und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen im Hydrogel entstehen. Schützen Sie das Hydrogel vor Licht und lassen Sie es 90 min polymerisieren.
    4. Sobald das Hydrogel polymerisiert ist, verwenden Sie eine Rasierklinge oder ein Skalpell, um das obere Deckglas zu entfernen, um sicherzustellen, dass das Deckglas nicht vom Gel abrutscht oder auf das Gel zurückfällt, sobald es entfernt wurde, da dies das Muster auf der Oberfläche des Gels ruiniert.
      HINWEIS: Lassen Sie das Gel nicht unbedeckt in einem Bereich mit signifikantem Luftstrom (z. B. einer Biosicherheitswerkbank).
    5. Um den verbleibenden NHS-Ester im Hydrogel zu passivieren, fügen Sie dem Gel 2 ml steriles PBS hinzu und inkubieren Sie bei 37 ° C für 45 min. Bereiten Sie die Gele sofort für Experimente vor oder lagern Sie sie über Nacht in sterilem PBS bei 4 °C bis zur Verwendung.

5. Bildgebung

  1. Um sich auf Experimente mit Zellen vorzubereiten, schalten Sie die Wärme (37 ° C) und die Luftfeuchtigkeit (70%) im Mikroskop am Nachmittag vor einem geplanten Experiment ein, damit sich die Geräte in der Mikroskopkammer auf die höhere Temperatur ausgleichen können.
    HINWEIS: Dieser Schritt minimiert die durch Temperaturschwankungen verursachte Z-Drift.
  2. Schalten Sie kurz vor Beginn des Experiments die CO2-Quelle der Kammer ein.
  3. Um eine x-y-Drift zu vermeiden, die durch die wiederholte Bewegung der Mikroskopstufe während des Experiments verursacht wird, befestigen Sie das austauschbare Deckglas-Set, das das zellgesäte Hydrogel hält, mit doppelseitigem Klebeband an der Bühne.
  4. Schauen Sie sich das Gel an, um Bilder zu finden, die für das Bild von Interesse sind, und speichern Sie jede Bühnenposition der abzubildenden Abschnitte.
  5. Stellen Sie sowohl in der Hellfeldansicht als auch in der Fluoreszenzansicht, die dem markierten Protein entspricht, die Mikroskopsoftware so ein, dass jedes Bild einmal alle 5 Minuten für 2 Stunden abgebildet wird.

6. Bildanalyse

HINWEIS: Es wurde ein System entwickelt, das die Verformung der gemusterten PAA-Gele messen kann, indem es die Position der Traktionspunkte bestimmt, die Anfangspositionen der deformierten Punkte interpoliert und dann die zellulären Zugkräfte an jedem Ort berechnet. Es kann jedes Softwaresystem verwendet werden, das in der Lage ist, Bildverarbeitung und numerische Berechnungen durchzuführen. Das Programm zielt darauf ab, die Zugkräfte schnell zu bestimmen und Benutzereingabe- und Vorverarbeitungsverfahren zu eliminieren, die zu benutzerbezogenen Fehlern beitragen würden. Der hier verwendete Code ist hier als Supplemental Files 2-10 verfügbar, und auf diese Dateien kann zusammen mit einem Paar Übungsbilder unter www.bu.edu/mml/downloads zugegriffen werden.

  1. Öffnen Sie in einer Bildverarbeitungssoftware alle einzelnen Bilder, die während eines Zeitrafferexperiments aus jeder verwendeten Mikroskopansicht in der Reihenfolge aufgenommen wurden, vom ersten bis zum letzten aufgenommenen Bild, und verwandeln Sie sie in einen einzigen Bildstapel (klicken Sie auf Bild | Stapel | Bilder zum Stapeln). Stellen Sie sicher, dass es zwei separate Bildstapel gibt: einen der Hellfeldansicht der Zellen und einen der fluoreszierenden Ansicht des Musters, an das sie angehängt sind.
    1. Wenn die fluoreszierenden Bilder driften (d.h. die Insel von Interesse bewegt sich in x- und/oder y-Richtung zwischen jedem Bild um >1-2 μm), verarbeiten Sie zuerst den Bildstapel mit dem StackReg-Plugin (P. Thévenaz, Eidgenössische Technische Hochschule Lausanne), um jedes Bild im Stapel basierend auf der Position des ersten neu zu zentrieren (klicken Sie auf Plugins | StackReg-| Übersetzung | In Ordnung).
      HINWEIS: Dies ist von entscheidender Bedeutung, da selbst eine Drift unter μm die endgültige Berechnung der Zugkräfte erheblich beeinflussen kann, insbesondere bei steiferen Gelen, bei denen diese x-y-Drift außerhalb des Bereichs des erwarteten Geräusches liegt. Dieser Code speichert die Bilder, nachdem die Drift entfernt wurde, die dann zu einem neuen Bildstapel verarbeitet werden kann, der analysiert werden muss.
  2. Geben Sie die Hellfeld- und Fluoreszenzbildstapel in CTFTimelapse.m (Supplemental File 2) ein.
    1. Geben Sie das Dateiverzeichnis an, in dem sich die Image-Stacks in Zeile 7 befinden.
    2. Geben Sie in den Zeilen 8 und 9 die Namen des fluoreszierenden Bildstapels bzw. des entsprechenden Hellfeld-Fluoreszenzstapels an.
    3. PAA-Gelsteifigkeit (Pa) angeben:
      1. Kommentieren Sie in den Zeilen 11-14, die einige verschiedene Elastizitätsmodule von PAA-Hydrogelen enthalten, die am häufigsten verwendet werden, alle außer dem Elastizitätsmodul des Gels in den analysierten Bildern aus (geben Sie % am Anfang der Linie ein). Alternativ können Sie den Elastizitätsmodul hinzufügen, falls noch nicht vorhanden, und den Rest auskommentieren (3658,19 Pa für Testbilder).
    4. Geben Sie den Punktradius (m) in Zeile 15 an (1 × 10-6 m für Testbilder).
    5. Geben Sie den maximal möglichen Punktdurchmesser (μm) in Zeile 16 an (2,5 μm für Testbilder).
    6. Pixelverhältnis (μm/Pixel) angeben:
      1. Kommentieren Sie in den Zeilen 17 bis 20, die einige verschiedene Bild-Pixel-Verhältnisse enthalten, die auf zuvor verwendeten Bildeinstellungen basieren, alle bis auf das Pixelverhältnis der analysierten Bilder aus (geben Sie % am Anfang der Zeile ein). Alternativ können Sie das verwendete Pixelverhältnis hinzufügen, falls noch nicht vorhanden, und den Rest auskommentieren (0,1613 μm/Pixel für Testbilder).
    7. Geben Sie in den Zeilen 35 und 87 das Dateiverzeichnis an, in dem sich die erforderlichen Bildverarbeitungsdateien befinden.
      HINWEIS: Aus dem fluoreszierenden Bildstapel bestimmt der Code die Position jedes fluoreszierenden Punktes und verfolgt die Bewegung jedes Punktes zwischen den einzelnen Bildern im Stapel20. Die Ausgangsposition der Mikrokontakt-Druckpunkte ist bekannt, da sie sich bei richtiger Übertragung auf das Hydrogel32 nicht verformen.
  3. Warten Sie, bis zwei Figuren und ein Dialogfeld angezeigt werden, sobald das Programm die Punkte gefunden hat. Verwenden Sie Abbildung 1 , um sicherzustellen, dass das Programm die richtigen Punkte gefunden hat und nicht viele Punkte gefunden hat, wo es keine gab. Verwenden Sie Abbildung 2, um das rechteckige Gitter auszuwählen, mit dem das Programm zelluläre Zugkräfte lokalisieren und berechnen kann.
    HINWEIS: Abbildung 1 ist das Hellfeldbild der Zelle mit den vom Programm gefundenen Punkten (die rot sein werden) darüber (siehe Abbildung 3A). Abbildung 2 ist ein Bild, das die gleichen Punkte in Abbildung 1 anzeigt, jedoch ohne das Hellfeldbild im Hintergrund.
    1. Warten Sie, bis das Dialogfeld aufgefordert wird, die Eingabetaste zu drücken, nachdem Sie Punkt ausgewählt haben - wobei jeder Punkt einer der roten Punkte ist, die vom Programm gefunden wurden - und eine große Schaltfläche mit der Bezeichnung ENTER darin enthalten ist.
    2. Wählen Sie in Abbildung 2 vier verschiedene Punkte aus, um ein rechteckiges Raster um und einschließlich der Zelle/des Clusters in diesem Muster zu erstellen. Wählen Sie jeden Punkt einzeln mit einem Linksklick der Maus aus und bestätigen Sie ihn, indem Sie die Eingabetaste auf der Schaltfläche im oben genannten Dialogfeld drücken. Zählen Sie, wie viele Punkte zwischen dem ersten und zweiten Punkt sowie dem ersten und dritten Punkt liegen, da das Programm nach diesen Werten fragt, sobald alle Viereckpunkte ausgewählt wurden. Geben Sie diese Werte in das Befehlsfenster ein (geben Sie die Anzahl der Punkte ein und klicken Sie auf die Eingabetaste auf der Tastatur, wenn Sie dazu aufgefordert werden).
  4. Sobald das rechteckige Gitter ausgewählt wurde, warten Sie, bis das Skript die Zugkräfte berechnet, die es innerhalb des Gitters basierend auf den Positionen der fluoreszierenden Punkte findet. Beachten Sie, dass das Skript zuerst den Verschiebungsvektor (u) des geometrischen Mittelpunkts jedes Punktes findet und dann den entsprechenden Zugkraftvektor (F) mit Eq (1) berechnet:
    Equation 1(1)
    Dabei ist E der Elastizitätsmodul des PAA-Substrats, a der Radius der fluoreszierenden Punktmarker und ν ist das Poisson-Verhältnis des PAA-Substrats32. Eq (1) geht davon aus, dass das Substrat ein unendlicher elastischer Halbraum ist, dass Zugkräfte in der Mitte jedes kreisförmigen Punktmarkers aufgebracht werden und dass der Abstand zwischen den Punktmarkierungen ausreichend groß ist, so dass ihre jeweiligen Verschiebungen nicht miteinander interagieren23.
    HINWEIS: In den hier beschriebenen Experimenten werden Punktmarker mit einem Radius von A = 1 μm und 6 μm Mitte-zu-Mitte-Abstand verwendet. Zugkraftpfeile innerhalb der Zelle/des Clusters, die nach innen in Richtung der Mitte der Zelle zeigen, sollten vorhanden sein, während der Bereich außerhalb der Zelle/des Clusters keine Zugpfeile aufweisen sollte (siehe Abbildung 3C-E). Traktionspfeile, die von innerhalb der Zelle/des Clusters nach außen zeigen, oder viele große Traktionspfeile, die außerhalb der Zelle vorhanden sind, weisen auf ein schlecht gewähltes rechteckiges Gitter hin.
  5. Sobald das richtige Traktionsfeld gefunden wurde, wählen Sie einen geeigneten Bereich von Interesse (ROI) aus, der die Zelle/den Cluster umgibt, der alle Traktionspfeile innerhalb der Zelle enthält, indem Sie den Cursor verwenden.
    1. Um den ROI zu zeichnen, klicken Sie mit der linken Maustaste so oft wie nötig, um eine Polygonform mit beliebig vielen Seiten zu zeichnen, passen Sie die Form an oder verschieben Sie den ROI, nachdem sie gezeichnet wurde, indem Sie mit der linken Maustaste auf die Ecken bzw. Kanten klicken. Sobald der ROI gezeichnet ist, doppelklicken Sie mit der linken Maustaste , um mit dem nächsten Bild im Stapel fortzufahren. Wiederholen Sie dies für alle Bilder im Hellfeldstapel.
      HINWEIS: Der Code speichert Zugkraft- und Verschiebungsdaten für jeden Zeitpunkt im selben Ordner wie die ursprünglichen Bildstapel, die dann weiter analysiert werden können.

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Representative Results

PAA-Hydrogele mit dem Young-Modul von E = 3,6 kPa und dem Poisson-Verhältnis von ν = 0,445 wurden für die Verwendung durch diese subtraktive Mikrostrukturierungsmethode hergestellt. Die Hydrogele wurden mit einer Dicke von ~ 100 μm hergestellt, wodurch sie mit dem hier verwendeten Bildgebungsaufbau abgebildet werden können und gleichzeitig verhindern, dass die Zellen das starre Deckglas unter dem Gel erfassen, was in Studien, die sich auf die Erfassung der zellulären Steifigkeit konzentrierten23,33 konzentrierten, Probleme verursachen würde. Gele mit vielen anderen Steifigkeitsstufen (bis zu 30 kPa) wurden erfolgreich mit der indirekten Mikrostrukturierungsmethode34 hergestellt und abgebildet, so dass die Methode nicht auf die Verwendung von nur 3,6 kPa-Hydrogelen beschränkt ist. Die Deckgläser werden vorzeitig mit Glutaraldehyd behandelt, damit das Gel auf dem unteren Deckglas fixiert bleibt, wenn der obere gemusterte Deckglas entfernt wird (Abbildung 2C, D).

Um zelluläre Zugkräfte innerhalb von Clustern zu visualisieren und zu messen, wurden die 3,6 kPa-Hydrogele indirekt mit fluoreszierendem Fibronektin (Abbildung 2A-D) gemustert, um Inselmuster von vorgegebener Größe und Form zu erzeugen (Abbildung 2E). Andere Arten von Proteinen können auch auf diesen weichen Hydrogelen 21,35,36,37,38 gemustert werden. Die Qualität des übertragenen Musters hängt direkt mit der Wiedergabetreue der Masterform zusammen, aus der der PDMS-Stempel gegossen wird. Formen, die SU-8-Delaminierung hatten, werden eine Verschlechterung der Qualität der Muster aus Stempeln sehen, die aus diesen delaminierten Formen gegossen wurden. Zum Beispiel erzeugen Schimmelpilze mit delaminiertem SU-8 oft Mikromuster, die Abschnitte von ungemustertem Fibronektin zwischen den vorbestimmten Inseln enthalten. Wenn sie auf ein Gel gegossen werden, ermöglichen diese Muster die Zellbefestigung am Gel in Bereichen außerhalb des Inselmikromusters. Aus diesem Grund war die Abbildung von Zellclustern, die an vollständig oder größtenteils intakten Inselmustern befestigt waren, die Priorität.

Rindergefäße glatte Muskelzellen (BVSMCs) wurden auf diese Hydrogele mit einer Dichte von etwa 60-80 × 103 Zellen / Gel gesät, um die Clusterbildung zu fördern, und vor der Bildgebung für 18-24 h haften. Kurz vor den Experimenten wurden die Zellen mit einer Lebendzellkernfärbung gefärbt, um lebende Zellen identifizieren und die Anzahl der Zellen in jedem Cluster bestimmen zu können. Mikromusterinseln mit und ohne Zellen wurden abgebildet und analysiert. Bildgebende Inseln ohne Zellen ermöglichten die Berechnung des Geräusches, das in Zugkraftberechnungen für 3,6 kPa-Gele vorhanden ist. Mit diesen Falsch-Positiv-Verschiebungsmessungen kann dann ein geeigneter Schwellenwert ermittelt werden, unterhalb dessen Verschiebungen ausgeschlossen werden sollen.

Es wurde festgestellt, dass 0,3 μm in der Regel ausreichen, um Musteruntreue zu eliminieren, die zu falsch-positiven Wegmessungen führt. Dies kann zum Verlust von Traktionen mit geringer Kraft führen, ist jedoch für die Entfernung falsch-positiver Traktionen unerlässlich. Bei der Bildgebung wurden Zellcluster auf meist intakten Inselmustern priorisiert (d.h. diejenigen, denen nicht viele, wenn überhaupt Punkte fehlen) und meist intakte Muster ohne Zellen. Jeder ROI wurde einmal alle 5 Minuten für 2 Stunden abgebildet. Das Mikroskop, mit dem Bilder beider Zellen und der gemusterten PAA-Gele während längerer Zeitrafferexperimente aufgenommen wurden, war ein Fluoreszenzmikroskop mit einem automatischen Tisch, einer Fluoreszenzlichtquelle, einer Kamera und einer Standard-Mikroskopsoftware. Dieses Mikroskop verfügt über einen benutzerdefinierten Satz von Filtern, um viele verschiedene Farben der Fluoreszenz zu beobachten. Das Objektiv, mit dem die Zellen und das gemusterte Hydrogel betrachtet werden, ist ein 40-faches Wassertauchobjektiv, NA = 1,15. Dieses Mikroskop ist auch mit einem kundenspezifischen Temperatur- (37 ° C) -, Feuchtigkeits- (70%) - und CO2 (5%) - regulierten System ausgestattet, um Zellen während langer Experimente lebensfähig zu halten.

Um die Zugkräfte aus den Bildern der Mikromusterinseln zu berechnen, wurde eine Bildanalysesoftware verwendet, um die Verschiebungen der fluoreszierenden Fibronektinpunkte im Laufe der Zeit zu verfolgen. In Kenntnis der Verschiebungen der fluoreszierenden Punkte und der Steifigkeit des PAA-Gels, auf dem die Punkte gemustert sind, kann das Programm die Werte der Zugkräfte bestimmen, die sowohl von einzelnen Zellen als auch von Clustern auf dem PAA-Substrat übertragen werden. Es gibt jedoch zwei Möglichkeiten, wie das Programm nicht mehr in der Lage ist, Traktionswerte zu bestimmen. Wenn zu viele Punkte innerhalb eines bestimmten Interessenrahmens deformiert werden, hat das Programm Schwierigkeiten, Kräfte zu berechnen, da das Programm darauf angewiesen ist, dass die meisten Punkte in einem analysierten Bild unverformt sind. Wenn zwei Punkte zu nahe beieinander liegen (Mitte-zu-Mitte-Abstand von ≤2 μm20), könnten sich die Verschiebungen der einzelnen Punkte gegenseitig stören, was eine genaue Bestimmung ihrer tatsächlichen Verschiebungswerte und damit ihrer Zugwerte verhindert. Solange die Mikromuster mit Punkten entworfen werden, die gut voneinander entfernt sind, sollten Zellen nicht in der Lage sein, die Punkte so stark zu verdrängen, dass sie selbst auf weicheren Substraten so nahe beieinander liegen.

Abbildung 3 zeigt die Funktionen der Entfernungsmustermethode. Hier ist die Fähigkeit dieser Methode, isolierte, gut definierte Inselmuster von vorgegebener Form herzustellen, in Abbildung 3B-E gezeigt, wo die Fibronektin-Adhäsionspunkte nur innerhalb des gewünschten Bereichs der Insel vorhanden sind. Diese isolierten Inseln von Haftpunkten ermöglichen eine bessere Kontrolle der Clusterform, wie in Abbildung 3A dargestellt. Da die Form und Größe der Inseln konsistent sind, neigen die Zellcluster, die sich an sie anheften und auf ihnen wachsen, auch dazu, eine konsistente Form zu haben, da die Inselmuster den Clusterwachstumsbereich begrenzen. Schließlich zeigt Abbildung 3B-E auch die Fähigkeit dieser Inseln, zelluläre Zugkräfte zu berechnen, und die Tendenz dieser Zugkräfte, sich im Laufe der Zeit zu ändern. Hier sind die Zugkräfte des Clusters die größten an den Rändern der Insel. Dies wird erwartet, da die Zellen an den Rändern eines Clusters weniger Interaktionen mit anderen Zellen im Cluster haben als die im Inneren des Clusters. So üben diese Zellen an den Rändern als Reaktion auf die zytoskelettale Kontraktion größere Kräfte auf das Substrat aus als die Zellen im Inneren.

Figure 1
Abbildung 1: Design der Fotomaske. (A) Eine Darstellung der ersten Hälfte des hier verwendeten Fotomaskendesigns, ein diskretes Raster von Punkten mit einem Durchmesser von 2 μm, die bei 6 μm von Mitte zu Mitte angeordnet sind. Während das hier gezeigte Bild nur ein kleiner Teil des Designs ist, füllt dieses Raster einen Raum von insgesamt 1,5 x 1,5 cm auf der Fotomaske aus. (B) Eine Darstellung der zweiten Hälfte des Fotomaskendesigns; Hier sind sechs kleine Inseln mit 6 x 6 Punkten zu sehen. Auf der Fotomaske gibt es mehrere verschiedene Inselgrößen: 6 x 6 (hier gezeigt), 12 x 12, 25 x 25 und 42 x 42 Punkte. Ein gleichmäßig verteiltes (50 μm zwischen den Inseln) Array jeder Inselgröße nimmt einen Abstand von 1,5 x 0,375 cm ein, und die Arrays verschiedener Inseln sind durch 50 μm getrennt. Die Punkte auf jeder Insel haben einen Durchmesser von 2 μm und einen Abstand von 6 μm von Zentrum zu Mitte. Die beiden Abschnitte der in A und B beschriebenen Maske sind um 0,75 cm getrennt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Subtraktiver Mikrokontaktdruck. (A) Ein PDMS-Stempel wird mit Glutaraldehyd behandelt und mit einem Glasdecker in Kontakt gebracht, der gleichmäßig mit fluoreszierender Fibronektinlösung beschichtet ist. (B) Nach dem Entfernen vom Deckglas entfernt der PDMS-Stempel den größten Teil des fluoreszierenden Fibronektins auf der Oberfläche des Deckglases und hinterlässt mikrometergroße Proteinpunkte nur an Stellen, die durch das Design des PDMS-Stempels vorgegeben sind. (C) Der gemusterte Deckglas wird mit einem PAA-Prepolymer und einer NHS-Lösung in Kontakt gebracht. (D) Sobald das PAA-Gel vollständig polymerisiert wurde, wird das obere Deckglas entfernt und ein Muster aus Fibronektin wird auf die PAA-Geloberfläche gedruckt. (E) Ein Beispiel für ein diskretes Inselmuster, das aus gleichmäßig verteilten Punkten auf einem PAA-Hydrogel mit einem Young-Modul von 3,6 kPa besteht. Maßstabsleiste = 20 μm. Abkürzungen: PDMS = Polydimethylsiloxan; PAA = Polyacrylamid; NHS = N-Hydroxysuccinimid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Analyse von Zellen auf Inselmikromustern. (A) Es wird ein Hellfeldbild eines Clusters von 3 BVSMCs gezeigt, das auf ein fluoreszierendes Fibronektin-Inselmikromuster auf einem PAA-Hydrogel mit einem Young-Modul von 3,6 kPa überlagert ist. Die Punkte haben einen Durchmesser von 2 μm und sind von Mitte zu Mitte durch 6 μm getrennt. (B) Das fluoreszierende Muster zeigt, dass eine Reihe der Fibronektinpunkte auf der Insel aufgrund der Kraftausübung durch die BVSMCs verschoben wurden. (C) Die Zugkräfte, die zum Zeitpunkt 1 (Beginn eines 2-stündigen Experiments) auf die Adhäsionspunkte ausgeübt wurden. Die Richtung dieser Kraftvektoren wird durch die Richtung der farbigen Pfeile angezeigt. Ihre Größe wird durch die Pfeilfarbe und den entsprechenden Wert auf dem Farbbalken angezeigt (alle Kraftwerte sind in nN). Die Vektorlänge ist relativ basierend auf den minimalen und maximalen Kräften, die vom Programm für jeden Zeitpunkt berechnet werden. (D) Zugkräfte desselben Clusters zum Zeitpunkt 13 (nach der Hälfte eines 2-stündigen Experiments) (E) Zugkräfte desselben Clusters zum Zeitpunkt 25 (Ende eines 2-stündigen Experiments). Abkürzungen = BVSMCs = Rindergefäß-glatte Muskelzellen; PAA = Polyacrylamid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzungsdatei 1: Rechner zur Markierung von Fibronektin Dies ist ein Tool zur Berechnung der richtigen Menge an Alexa488-Fluoreszenzfarbstoff, der bei der Markierung von Fibronektin verwendet werden soll. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: CTFTimelapse.m Dies ist die Bildverarbeitungsdatei, die die Berechnung der zellulären Zugkräfte wie in Abschnitt 5 (Bildanalyse) beschrieben ermöglicht. Dazu gehört die Auswahl eines gewünschten Punkterasters (Schritte 6.3-6.3.2) und die Auswahl der interessierenden Region für die CTF-Berechnungen (Schritte 6.5 und 6.5.1). Alle folgenden zusätzlichen Dateien werden direkt von diesem Skript oder einer der anderen darin verwendeten Funktionen aufgerufen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Zusatzdatei 3: analyze_initial_image_4.m Diese Funktion wird von CTFTimelapse.m aufgerufen und dient dazu, die fluoreszierenden Punkte auf einem Gitter aus dem ersten Frame des Bildstapels des deformierten Gittermusters zu lokalisieren und auszurichten, um sie an das ursprüngliche unverformte Gittermuster anzupassen. Dies ermöglicht Zugkraftberechnungen für den ersten Frame im Bildstapel. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 4: analyze_subsequent_images.m Diese Funktion wird von CTFTimelapse.m aufgerufen und dient dazu, die fluoreszierenden Punkte auf einem Raster aus allen Frames des Bildstapels des deformierten Gittermusters nach dem ersten zu lokalisieren und auszurichten. Dies ermöglicht Zugkraftberechnungen für alle Frames im Bildstapel nach dem ersten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 5: bpass.m Diese Funktion wird sowohl von analyze_initial_image_4.m als auch von analyze subsequent_images.m aufgerufen und dient dazu, einen Real-Space-Bandpassfilter zu implementieren, der den Bildstapel des deformierten Gittermusters verarbeitet. Dieser Filter unterdrückt Pixelrauschen und langwellige Bildvariationen, während Informationen einer charakteristischen Größe erhalten bleiben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 6: CellBoundary.m Diese Funktion wird von CTFTimelapse.m aufgerufen und dient dazu, dass sie es dem Programmbenutzer ermöglicht, eine Region von Interesse um die Zelle / den Cluster zu zeichnen, für die Zugkräfte berechnet werden sollen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 7: pkfnd.m Diese Funktion wird sowohl von analyze_initial_image_4.m als auch von analyze_subsequent_images.m aufgerufen und dient dazu, lokale Maxima in einem Bild mit Genauigkeit auf Pixelebene zu finden. Diese Peaks werden von cntrd.m verwendet, um das fluoreszierende Gittermuster für CTFTimelapse.m zu lokalisieren. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 8: cntrd.m Diese Funktion wird sowohl von analyze_initial_image_4.m als auch von analyze_subsequent_images.m aufgerufen und dient dazu, den Schwerpunkt der hellen Flecken in einem Bild mit Subpixelgenauigkeit zu lokalisieren. Dies ermöglicht die Lokalisierung des fluoreszierenden Gittermusters durch CTFTimelaspe.m, wie in Schritt 6.3 beschrieben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 9: FourCorners.m Diese Funktion wird sowohl von analyze_initial_image_4.m als auch von analyze_subsequent_images.m aufgerufen und dient dazu, das vom Benutzer gewählte Raster (Schritte 6.3-6.3.2) zu nehmen und den Abstand zwischen jedem Eckpunkt in zwei orthogonalen Achsen zu berechnen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 10: track.m Diese Funktion wird sowohl von analyze_initial_image_4.m als auch von analyze_subsequent_images.m aufgerufen und dient dazu, die Bewegung der Punkte im fluoreszierenden Gittermuster zwischen den Frames zu verfolgen, was für die Berechnung der entsprechenden Zugkräfte unerlässlich ist. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Eine verbesserte Methode zur indirekten Strukturierung von PAA-Hydrogelen wird in diesem Artikel beschrieben. Dieser Ansatz baut auf Methoden auf, die zuvor verwendet wurden 20,35,36,37,38,39,40,41,42. Die Hauptänderung besteht darin, dass PDMS-Stempel jetzt verwendet werden, um Protein zu entfernen und das gewünschte Muster auf dem Zwischensubstrat zu belassen, anstatt das Muster direkt darauf zu stempeln. Dies ermöglicht eine viel konsistentere Erstellung von High-Fidelity-Mikromustern und die Erstellung isolierter mikrostrukturierter Inseln, die zuvor zwei Produktionsschritte erforderten. Die Form und Größe der mit dieser Methode hergestellten Inselmuster sind ebenfalls leichter zu kontrollieren als die mit der vorherigen zweistufigen Methode. Die neue Technik ist weniger anfällig für den Druck, der beim Mikrodruck ausgeübt wird, als die alte Technik. Ein zweiter Vorteil ist, dass diese Entfernungsmethode Inselmuster von kontrollierter Form und Größe in nur einem Schritt erstellen kann. Im Gegensatz dazu erforderten frühere Methoden zwei Schritte, um Inseln herzustellen, einschließlich des Stempelns für die Abscheidung und des anschließenden Stempelns zum Entfernen, und die Formen dieser Inseln sind weniger präzise als die mit der Entfernungsmethode hergestellten.

Der Hauptnachteil dieser Methode besteht darin, dass die Lebensdauer der Master, die zum Formen des neuen Stils von PDMS-Stempeln verwendet wurden, kürzer zu sein scheint als bei der vorherigen Stanzmethode. Dies kann wahrscheinlich auf die Form der neuen Meister zurückgeführt werden, die in der Entfernungsmethode verwendet werden. Die alten Meister bestanden aus einer 1,5 x 1,5 cm großen Fläche von SU-8, die aus gleichmäßig verteilten 5 μm tiefen kreisförmigen Löchern bestand, die, wenn sie in PDMS gegossen wurden, Stempel aus gleichmäßig verteilten zylindrischen Pfosten gleicher Höhe erzeugten. Umgekehrt bestehen die neuen Master aus einer Fläche von 1,5 x 1,5 cm mit 5 μm hohen zylindrischen SU-8-Pfosten, die, wenn sie in PDMS gegossen werden, Stempel bilden, die aus gleichmäßig verteilten Löchern bestehen.

Mit dieser Veränderung in der Struktur der Meister wurde festgestellt, dass die SU-8 dazu neigt, viel leichter von der Oberfläche delaminiert zu werden als bei der alten Methode. Um dies zu verhindern, wurden Vorkehrungen getroffen, wie z.B. die Oberflächenbehandlung der Siliziumwafer in einem Plasma-Asher, um sie für die Bindung an SU-8 zugänglicher zu machen. Die Oberfläche der Wafer wurde vor dem ersten Guss in PDMS ebenfalls silanisiert, um zu verhindern, dass die SU-8 beim Entfernen der Stempel am PDMS haftet. Trotzdem wurde nach wiederholtem Gießen in PDMS eine SU-8-Delaminierung von den Siliziumwafern beobachtet, und es sollte darauf geachtet werden, dass vor dem Verlust des aktuellen Masters neue Siliziumwafer hergestellt werden. Eine Möglichkeit, diese Delaminierung zu vermeiden, ist die Verwendung der PDMS-Double-Cast-Methode, die zuvor43 beschrieben wurde, obwohl diese andere Methode ihre Grenzen hat.

Ein weiteres Manko dieser Methode (und anderer Methoden, bei denen verformbare Hydrogele zur Messung der Zugkräfteverwendet werden 44) besteht darin, dass sich das Zugfeld aufgrund des experimentellen Lärms nicht im mechanischen Gleichgewicht befindet. Daher ist eine Nachbearbeitungsanalyse erforderlich, um ein ausgeglichenes Zugfeld zu erhalten, nachdem die Zugkräfte berechnet wurden. Eine Möglichkeit, die Zugkräfte auszugleichen, besteht darin, die Kräfte zu erhalten, die den Messungen, die das Gleichgewicht erfüllen, am nächsten kommen, indem man eine Methode der kleinsten Quadrate verwendet. Dadurch werden Größe und Ausrichtung der gemessenen Zugkräfte verändert45.

Es gibt Einschränkungen für diese Methode zur Berechnung zellulärer Zugkräfte. Um die zellulären Zugkräfte unter Verwendung von Gleichung (1) (Schritt 5.4) genau zu bestimmen, muss das Muster so ausgelegt sein, dass die Verschiebung eines Adhäsionspunktes die Verschiebung der direkt angrenzenden Personen nicht wesentlich beeinflusst. Theoretisch nimmt die Verschiebung eines kreisförmigen Adhäsionsbereichs auf der Oberfläche eines unendlichen Halbraums aufgrund einer auf das Zentrum wirkenden Tangentialkraft ab, wenn ein radialer Abstand vom Zentrum des Kreises um23 zunimmt. Insbesondere für ein Substrat, dessen Poisson-Verhältnis ~ 0,445 beträgt (wie die hier beschriebenen), beträgt die Verschiebung am Rand des kreisförmigen Bereichs ungefähr zwei Drittel der Verschiebung in der Mitte der Region. Theoretische Vorhersagen gehen jedoch nicht über den zirkulären Bereich hinaus. Somit wird davon ausgegangen, dass sich der abnehmende Trend in der Verdrängungsgröße, der theoretisch bestimmt wird23, über den Rand des Adhäsionskreises hinaus fortsetzt. In dem hier beschriebenen Mikromusterdesign werden 2 μm kreisförmige Punkte im Abstand von 6 μm Mitte-zu-Mitte verwendet. Der Grund für diesen Abstand ist, dass eine Verschiebung im Abstand von 6 μm vom Zentrum eines Punktes auf etwa 1/12 der Verschiebung inder Mitte des Punktes geschätzt wird, von der angenommen wird, dass sie klein genug ist, um die Verschiebungswerte benachbarter Punkte zu beeinflussen. Es ist jedoch möglich, dass die von Zellen ausgeübten Zugkräfte die Adhäsionspunkte auf einem Substrat so stark verdrängen, dass der Abstand von Mitte zu Zentrum zwischen ihnen weniger als 2 μm beträgt. In diesem Fall trifft die Annahme, dass sich die Verschiebung benachbarter Haftpunkte nicht gegenseitig stört, nicht zu, und die Zugkräfte können mit der in Schritt 6.4 ( Eq (1)) angegebenen Gleichung nicht genau berechnet werden.

Die vorgeschlagene Technik bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur Messung zellulärer Zugkräfte. Diese Kräfte geben Einblick in die mechanische Umgebung sowohl einzelner Zellen als auch von Clustern und können helfen zu verstehen, ob und wie verschiedene Arten von Zellen die mechanische Stabilität aufrechterhalten. Die Aufrechterhaltung eines homöostatischen Zellspannungsniveaus ist für viele zelluläre Prozesse unerlässlich, und der Verlust dieser spannungsgeladenen Homöostase wurde mit verschiedenen Krankheiten wie Atherosklerose, Asthma und Krebs in Verbindung gebracht 9,10,12. Die Spannungshomöostase ist definiert als die Fähigkeit einer Zelle oder eines Zellhaufens, ein konstantes Spannungsniveau mit einer geringen zeitlichen Variabilität um einen Sollwert46 aufrechtzuerhalten.

Diese indirekte Mikrostrukturierungsmethode kann verwendet werden, um die Fähigkeit verschiedener Zelltypen zu bestimmen, die spannungsbehaftete Homöostase sowohl auf individueller als auch auf multizellulärer Ebene aufrechtzuerhalten. Dies geschieht, indem Änderungen der Werte des zellulären Zugfeldes im Laufe der Zeit verfolgt und dann die zeitliche Fluktuation des Zugfeldes unter Verwendung des Variationskoeffizienten (CV) quantifiziert wird, der das Verhältnis der Standardabweichung der Größe des Zugfeldes zu seinem Mittelwert darstellt. Die Summe der Größen der Zugkräfte und die Größe des kontraktilen Moments (das erste Moment der Zugkräfte) werden als skalare Metriken der Größe des Zugfeldes46 verwendet. Wenn der CV des Traktionsfeldes während eines Zeitrafferexperiments nahe Null bleibt, zeigt sich, dass die Zelle / der Cluster die Spannungshomöostase über die Zeitaufrechterhalten hat 46.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese neue Methode zur indirekten Mikrostrukturierung von weichen Hydrogelen eine einfachere und effizientere Methode zur Herstellung von gemusterten Hydrogelen bietet als frühere Methoden. Es gibt bestimmte Schritte, die unternommen werden können, um diese Methode zu verbessern und zu erweitern. In erster Linie würde die Verbesserung des Herstellungsprozesses der Siliziummeister in einer Weise, die ihre Lebensdauer verlängert, den Hauptnachteil dieser Mikrostrukturierungsmethode beseitigen. Was die Möglichkeiten zur Erweiterung dieser Methode betrifft, so würde die Erforschung verschiedener Inselformen, die über die hier beschriebenen quadratischen Inseln hinausgehen, die Vielseitigkeit dieser Methode verbessern.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Die Autoren danken Dr. Paul Barbone vom Boston University Department of Mechanical Engineering für hilfreiche Diskussionen und Unterstützung bei der Datenanalyse. Diese Studie wurde durch den NSF-Zuschuss CMMI-1910401 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-aminopropyl)trimethoxysilane Sigma Aldrich #281778
1.5 mL Microcentrifuge tube Fisher Scientific #05-408-129
15 mL conical tube Fisher Scientific #05-539-12
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask Advance Reproductions Corporation N/A Custom-designed mask
6 Well Plates Fisher Scientific #07-200-83
Acetone Fisher Scientific #A18P-4
Acrylamide Solution, 40% Sigma Aldrich #A4058
AlexaFluor 488 Thermo Fisher #A20000
Aminonium Persulfate Fisher Scientific #BP179-25
Bisacrylamide Fisher Scientific #PR-V3141
Ethanol Greenfield Global #111000200C1GL
Glass Coverslips, 25 mm round Fisher Scientifc #12-545-102
Glass Coverslips, 30 mm round Warner #64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 Camera Hamamatsu #C10600-10B
Human Plasma Valley Biomedical #HP1051P Used to isolate fibronectin
Hydrochloric Acid, 1.0 N Millipore Sigma #1.09057
ImageJ Wayne Rasband #1.53n
Interchangeable Coverslip Dish Set Bioptechs #190310-35
Kim Wipes Fisher Scientific #06-666-11C
Mask Alinger Karl Suss #MA6
Matlab 2021 Mathworks #R2021a
MetaMorph Basic Molecular Devices #v7.7.1.0
N-hydroxysuccinimide ester Sigma Aldrich #130672-5G
NucBlue Live Cell Stain Thermo Fisher #R37605
Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope Olympus #IX81
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare #52-1308-00
Photoresist Spinner Hood Headway Research #PWM32
Plasma Cleaner Harrick #PDC-001
Plasma Etcher TePla #M4L
Prior Lumen 200Pro Light Source Prior Scientific #L200
Silicon Wafers, 100 mm University Wafer #809
SU-8 2005 Kayaku Advanced Materials Inc. #NC9463827
SU-8 Developer Kayaku Advanced Materials Inc. #NC9901158
Sylgard 184 Silicone Elastomer Essex Brownell #DC-184-1.1
Tetramethylethylenediamine Fisher Scientific #BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma Aldrich #448931
UAPON-40XW340 Objective Olympus #N2709300
UV Flood Exposure Newport #69910
Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm Ted Pella, Inc. #19395-40

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References

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Bioengineering Ausgabe 180
Mustergenerierung für die Mikromuster-Traktionsmikroskopie
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Bunde, K. A., Stamenović, D., Smith, M. L. Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy. J. Vis. Exp. (180), e63628, doi:10.3791/63628 (2022).

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