Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

نموذج لصرع المسببات المعدية باستخدام فيروس التهاب الدماغ والنخاع الفئران ثيلر

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/63673
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1,2, 3
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Utah, 2Interdepartmental Program in Neuroscience, University of Utah, 3Faculty of Veterinary Medicine, Institute of Pharmacology and Toxicology, Freie Universität Berlin

Summary

تكرر العدوى داخل المخ بفيروس التهاب الدماغ والنخاع في الثيلين (TMEV) في الفئران C57BL / 6 العديد من الأعراض السريرية المبكرة والمزمنة لالتهاب الدماغ الفيروسي والصرع اللاحق في المرضى من البشر. تصف هذه الورقة عدوى الفيروس والأعراض وعلم أمراض الأنسجة لنموذج TMEV.

Abstract

أحد الأسباب الرئيسية للصرع هو عدوى الجهاز العصبي المركزي (CNS). ما يقرب من 8 ٪ من المرضى الذين نجوا من مثل هذه العدوى يصابون بالصرع نتيجة لذلك ، مع ارتفاع المعدلات بشكل ملحوظ في البلدان الأقل تقدما من الناحية الاقتصادية. يقدم هذا العمل لمحة عامة عن نمذجة الصرع من المسببات المعدية واستخدامه كمنصة لاختبار مركب مضاد للتشنج الجديد. يتم تقديم بروتوكول لتحريض الصرع عن طريق الحقن داخل المخ غير التجسيمي لفيروس التهاب الدماغ والنخاع في الفئران (TMEV) في الفئران C57BL / 6 ، والذي يكرر العديد من الأعراض السريرية المبكرة والمزمنة لالتهاب الدماغ الفيروسي والصرع اللاحق في المرضى من البشر. تم وصف التقييم السريري للفئران أثناء التهاب الدماغ لمراقبة نشاط النوبات والكشف عن الآثار المحتملة المضادة للنوبات للمركبات الجديدة. علاوة على ذلك ، تظهر العواقب النسيجية المرضية لالتهاب الدماغ الفيروسي والنوبات مثل تلف الحصين والتهاب الأعصاب ، وكذلك العواقب طويلة المدى مثل نوبات الصرع التلقائية. يعد نموذج TMEV أحد المنصات التجريبية الأولى التي تعتمد على العدوى للسماح بالتحقيق في آليات تطور الصرع نتيجة لعدوى الجهاز العصبي المركزي. وبالتالي ، فإنه يعمل أيضا على تحديد الأهداف والمركبات العلاجية المحتملة للمرضى المعرضين لخطر الإصابة بالصرع بعد عدوى الجهاز العصبي المركزي.

Introduction

واحدة من العواقب المتكررة لالتهاب الدماغ الفيروسي هي نوبات الصرع. تؤدي العديد من الالتهابات الفيروسية إلى نوبات أعراض خلال المرحلة الحادة من العدوى. يزداد خطر حدوث مثل هذه النوبات بأكثر من 20٪ بين عامة الناس1،2،3. المرضى الذين نجوا من العدوى لديهم أيضا خطر متزايد بنسبة 4٪ -20٪ من الإصابة بالصرع المزمن في الأشهر إلى السنوات التالية للعدوى 1,4. تم تحديد فيروس التهاب الدماغ والنخاع الفأر في ثيلر (TMEV) كفيروس مناسب لدراسة النوبات الحادة والمزمنة في نموذج فأر من التهاب الدماغ الفيروسي5،6،7. TMEV هو فيروس RNA غير مغلف ، ذو إحساس إيجابي ، أحادي الشريط من عائلة Picornaviridae وقد استخدم تقليديا لدراسة إزالة الميالين في الحبل الشوكي لفئران SJL ، والتي تحمي الفئران C57BL / 6 (B6) لأن لديها القدرة على إزالة الفيروس بسرعة بعد الإصابة. ومع ذلك ، فإن TMEV يحفز نوبات حادة في 50٪ -75٪ من ذكور وإناث الفئران B6 خلال الأسبوع الأول بعد الإصابة (pi) ، بينما يصاب حوالي 25٪ -40٪ بالصرع المزمن من أسابيع إلى أشهرpi 2،5،6،8،9. بصرف النظر عن النوبات ، تظهر الفئران أيضا التشريح المرضي الشائع لقرن آمون الصرع مع التنكس العصبي والتسمم5،6،8،10،11،12. علاوة على ذلك ، فإن أداء الفئران B6 المصابة ب TMEV أسوأ بكثير في الاختبارات السلوكية للتعلم والذاكرة ولديها اعتلال مشترك معرفي ، والذي يظهر أيضا في المرضى السريريين المصابين بالصرع13،14،15.

تقليديا ، تستخدم نماذج الصرع والنوبات إما تطبيق المواد الكيميائية المتشنجة أو التحفيز الكهربائي للحث على النوبات. ومع ذلك ، تفتقر هذه النماذج إلى صلاحية البناء وغالبا ما تظهر نوبات شديدة وتلف في الدماغ أكثر مما يظهر في المرضى السريريين16. لا يوجد نموذج مناسب لكل سؤال بحثي17. يعد استخدام نموذج TMEV مثيرا للاهتمام بشكل خاص إذا تم البحث عن العوامل المؤهبة لتطور النوبات بعد الإصابة بالجهاز العصبي المركزي أو إذا تم فحص المركبات للتأكد من كفاءتها المضادة للتشنج.

منذ أن تم إنشاء نموذج TMEV واستخدامه عبر العديد من المختبرات المختلفة على المستوى الدولي ، حدد المؤلفون العديد من التفاصيل التي تسمح بالتنفيذ الناجح للنموذج ، على سبيل المثال ، خصوصية سلالات الفيروسات والفئران المختلفة. تم إنشاء تحريض النوبات الأكثر موثوقية مع سلالة دانيال من الفئران TMEV و B6J2،5،6،8،9. يستخدم النموذج حاليا من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NINDS) كمنصة لتحديد الأدوية الجديدة ضد الصرع والنوبات18,19. تتضمن هذه الورقة البروتوكول التفصيلي لتحريض الفيروس والمراقبة السريرية للسماح للباحثين الآخرين باستخدام هذا النموذج من التهاب الدماغ الفيروسي لتعزيز فهم آليات المرض ، وكذلك لاختبار الأدوية.

يعكس البروتوكول التالي دراسة مصممة لاختبار المركب في هذا النموذج ، على الرغم من أنه يمكن إجراء العديد من أنواع الدراسات الأخرى. يتم تخدير الفئران لفترة وجيزة قبل الحقن بسلالة دانيال من TMEV في المنطقة الزمنية لنصف الكرة الأيمن (الخلفي والإنسي للعين اليمنى). اعتمادا على سؤال البحث ، إذا كانت هناك حاجة إلى مراقبة غير مصابة ، تتلقى الفئران محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS ، الرقم الهيدروجيني 7.4 ، بما في ذلك KH 2 PO 4 [1.06 mM] ، NaCl [155.17 mM] ، و Na 2 HPO4 · 7H 2 O [2.97mM]) بدلا من TMEV. أشارت التجربة السابقة في الفئران المصابة ب TMEV إلى أن النوبات التي يسببها التعامل تحدث بين اليوم 3 واليوم 7 بعد الإصابة. يختلف تواتر الحقن ومسار ووقت اختبار المركبات التجريبية وفقا لخصائصها. يوصى بإجراء التطعيم ضد الفيروس يوم الجمعة ، مما يسمح بمراقبة النوبات في اليوم 3-7 في الأسبوع التالي ، من الاثنين إلى الجمعة. خلال أسبوع مراقبة النوبات ، يمكن إعطاء المركبات التجريبية (i.p.) مرتين يوميا (على الأقل 4 ساعات) ما لم تقترح حركية المركب أو آلية العمل خلاف ذلك. يمكن إجراء مراقبة النوبات أثناء العلاج في نقطة زمنية محددة مسبقا. تختلف أوقات الحقن والمراقبة اعتمادا على المركبات الفردية. يتم حقن الحيوانات بمركب الاختبار أو بمركبة بدلا من مركب الدواء. يمكن التعامل مع هاتين المجموعتين وملاحظتهما بشكل مشابه للمجموعة التجريبية. أثناء التجربة ، يجب أن يعمى الشخص الوحيد الذي يتعامل مع الفئران ويسجل النوبات عن العلاج.

Protocol

تم تفويض جميع الإجراءات الموصوفة من قبل السلطات المعنية. يتم الحفاظ على الحيوانات وفقا للتوصيات الواردة في "دليل رعاية واستخدام المختبر" (المجلس القومي للبحوث) ووفقا لسياسة خدمة الصحة العامة واللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات في جامعة يوتا ، بروتوكول الحيوان (رقم: 21-11009 ، قسم علم الأدوية والسموم) وفي Freie Universität Berlin (البروتوكول: G0015/21 ، LAGeSo برلين ، معهد علم الأدوية والسموم) ، على التوالي. تمت الموافقة على النتائج الموضحة في الشكل 3 والشكل 5 تحت 33.9-42502-04-11 / 0516 و 33.9-42502-04-15 / 1892 (LAVES Oldenburg ، قسم علم الأدوية والسموم والصيدلة ، جامعة الطب البيطري هانوفر).

1. اعتبارات واستعدادات لتصميم الدراسة

  1. فيروس
    1. تم توفير سلالة دانيال من TMEV من قبل روبرت فوجينامي من جامعة يوتا. في الأصل ، تم عزله من فأر في مستعمرة هارفارد20. ابحث عن التصنيف واللوائح المحددة للعوامل البيولوجية في البلدان المعنية قبل التعامل مع TMEV ، وناقش مع موظفي السلامة البيولوجية المؤسسيين لضمان الامتثال للوائح. عادة ، يتم تصنيف TMEV على أنه BSL 2 ، اعتمادا على السلالة والتعديلات الجينية. الجرعة القياسية اللازمة للحث على النوبات في غالبية الحيوانات هي 3 × 105 وحدات تشكيل البلاك (PFU).
      ملاحظة: قد يتعين تكييف الجرعة ، على سبيل المثال ، إذا تم استخدام الفئران المعدلة وراثيا. بشكل عام ، تم استخدام التتر بين 2 × 104 PFU و 2.44 × 107 PFU للحث على النوبات بنجاح. تتلقى التحكم برنامج تلفزيوني معقم ولا تعاني من نوبات. الفيروس لا يصيب البشر. ومع ذلك ، يجب ارتداء معدات الوقاية الشخصية (معطف المختبر والقفازات ونظارات السلامة) من قبل المجربين في جميع الأوقات ، ويجب تعقيم جثث الفئران والفراش قبل التخلص منها.
  2. الحيوانات
    1. لإحداث النوبات والتحقيق فيها ، استخدم الفئران B6J ، لأن سلالات الفئران الأخرى لا تظهر بالضرورة نوبات ، على سبيل المثال ، SJL / J ، FVB / N ، أو Balb / cالفئران 5. لا يوجد فرق بين الفئران الإناث والذكور في تردد النوبات الحادة5. إجراء التجارب على الفئران المراهقة إلى البالغين (بدءا من 5-6 أسابيع من العمر).
  3. النظام الغذائي
    1. تم تحديد النظام الغذائي كمصدر واحد للتباين من مختبر إلى مختبر في شدة المرض. ومن ثم ، ضع في اعتبارك النظام الغذائي كعامل محتمل للاختلاف22.
  4. حجم المجموعة
    1. نظرا لعدم إصابة جميع الحيوانات بنوبات حادة أو مزمنة في هذا النموذج ، استخدم حوالي 20 فأرا / مجموعة للاختبار المركب.
  5. الرفق بالحيوان
    1. إذا أظهر أي فأر آثارا ضارة كبيرة من العدوى أو إعطاء المركب البحثي (على سبيل المثال ، الخمول ، وسوء الاستمالة ، والاحمرار المفرط ، والإفرازات القيحية من الجرح) بعد وقت مراقبة تحدده إرشادات IACUC المحلية (على سبيل المثال ، 48 ساعة) ، القتل الرحيم للفأر إنسانيا.
    2. القتل الرحيم لأي فأر يظهر فقدانا شديدا في وزن الجسم (>20٪) خلال فترة العدوى بشكل إنساني.
    3. إذا كانت الحيوانات لا تأكل بشكل صحيح ، فامنحها إمكانية الوصول إلى الكريات التكميلية المبللة بمحلول إلكتروليت للأطفال أو ما شابه ذلك.

2. تلقيح الفيروس

  1. تعقيم حقنة الحقن
    1. قم بإزالة غطاء حقنة الأنسولين. أضف أنابيب البولي إيثيلين كطوق حول الإبرة لضمان عمق حقن مناسب يبلغ 2.5 مم. اغمر المحقنة في الإيثانول لمدة 30 دقيقة. ضع المحقنة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة.
    2. ضع الغطاء مرة أخرى على الإبرة. لف المحقنة في كيس معقم وأغلقها. تسمية مع تاريخ التحضير.
  2. حقن الفيروسات
    1. احصل على حصص من سلالة دانيال من TMEV من الفريزر -80 درجة مئوية. قم بإذابة الفيروس واحتفظ به على الجليد. تجنب ذوبان وإعادة تجميد الفيروس. قم بتحميل المحقنة بتعليق الفيروس (3 × 105 PFU مخفف في 20 ميكرولتر من وسط زراعة PBS أو DMEM).
      تحذير: الفيروس معدي للفئران ولكن ليس للبشر.
    2. نظف المقعد بمطهر واعمل تحت ممتص الدخان. التلقيح ضد الفيروس ليس معقما ولكنه نظيف قدر الإمكان.
    3. انقل الماوس إلى غرفة تحريض التخدير ، واستخدم 2٪ إيزوفلوران في الأكسجين للحث على التخدير. يستغرق الوصول إلى التسامح الجراحي بضع دقائق. اضبط التركيز بناء على تنفس الحيوان وعمق التخدير.
    4. انقل الماوس المخدر من صندوق التخدير تحت الغطاء. تحقق من التحمل الجراحي ، على سبيل المثال ، عن طريق قرصة إصبع القدم. يتم تنفيذ الإجراء بأكمله في أقل من 30 ثانية ، لذلك لا يحتاج الحيوان إلى استنشاق الأيزوفلوران أثناء الحقن. أضف مرهم العين لمنع جفاف القرنية.
    5. تنظيف رأس الحيوان مع وسادة الكحول. قم بإمالة رأس الماوس قليلا إلى اليسار بحيث يشير موقع الحقن لأعلى.
    6. اسحب الجلد للخلف قليلا ، وأدخل الإبرة في الرأس ، وحقن 20 ميكرولتر داخل القشرة على عمق 2.5 مم في المنطقة الزمنية لنصف الكرة الأيمن (الخلفي والإنسي للعين اليمنى).
    7. إجراء الحقن من جانب واحد في نفس نصف الكرة الأرضية في جميع الحيوانات. استخدم العين والأذن كمعالم لموقع القشرة الجدارية. تم التحقق من الموضع مسبقا من الناحية النسيجية ؛ انظر الشكل 1. إحداثيات الحقن وفقا للحقن التجسيمي فيما يتعلق بالبريغما هي -2.0 (AP) ؛ +3.0 (مل) ؛ −1.5 (دف).
    8. اترك المحقنة في مكانها لمدة 5-15 ثانية. اكتب ما إذا كان هناك أي تسرب من الحقن أو إذا شوهدت فقاعات هواء - في هذه الحالة ، قم بإعداد حقنة جديدة. عند سحب المحقنة بعناية ، قم بتدويرها قليلا. ضع مرهم العين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
    9. اختياري: قم بترميز الحيوان على الذيل أو الأذن اعتمادا على الإجراءات المحلية (اختياري ولكنه سهل لأن الحيوان فاقد الوعي).
    10. نقل الحيوان إلى قفص جديد ، والذي يتم وضعه نصف على / نصف قبالة وسادة التدفئة (35-40 درجة مئوية) أثناء الشفاء من التخدير. لا تترك الحيوانات دون مراقبة حتى تستعيد وعيها الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي.
      ملاحظة: يمكن إيواء الحيوانات مرة أخرى بعد الشفاء (لا يتم خلط الحيوانات المصابة مع الحيوانات المصابة وهمية). لا ينبغي إيواء الفئران المصابة في نفس الغرفة مثل الفئران غير المصابة.
    11. تتبع وزن الفئران لأول 7 أيام pi لأنها تفقد الوزن بعد الإصابة وقد تتطلب تغذية إضافية.

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي لإجراء حقن TMEV. من اليسار إلى اليمين: بالنسبة لحقن القشرة الجدارية اليمنى ، يتم حقن الإبرة بشكل جانبي قليلا من خط وهمي بين العين والأذن المقابلة. يشار إلى طوق التحكم في العمق باللون الأصفر. يمكن رؤية قناة الحقن في قسم الدماغ الإكليلي ، الذي يتميز بالسهم. يتوافق موقع الحقن مع الإحداثيات الواردة أعلى السهم. تظهر الصورة اليمنى توزيع فيروس Theiler (البنفسجي) داخل CA1 لتشكيل الحصين. تم إعداد الرقم باستخدام biorender.com. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. اختبار مركب

  1. إعداد مركب
    1. راجع تعليمات الصياغة. قم بإعداد حل السيارة وفقا للتوصيات أو التعليمات المقدمة. على سبيل المثال ، يتم تقديم الإجراء الخاص بعقار ليفيتيراسيتام المضاد للصرع (LEV). يقلل LEV من عبء النوبات إلى 30٪ -40٪ من مستويات السيارة بجرعة 350 مجم / كجم. السيارة المستخدمة في هذه الدراسة هي 0.5٪ ميثيل سلولوز.
    2. حساب الجرعات اعتمادا على المركب. وزن الدواء وفقا للحساب. لعلاج 1 كجم من الفئران ، تزن 350 ملغ من LEV.
    3. قم بإعداد محلول مخزون بالحجم المناسب لمحلول السيارة ، وفقا لتوجيهات تعليمات الصياغة (على سبيل المثال ، صوتنة ، سواغ السيارة ، إلخ). بالنظر إلى حجم حقن 0.01 مل / جم من الفأر ، فإن حجم الحقن ل 1 كجم سيكون 10 مل مع 350 مجم من LEV ، مما ينتج عنه محلول 35 مجم / مل19. أبلغ عن الحساب والجرعة في ملغم / كغم والحجم في مل.
      ملاحظة: يمكن الاطلاع على بروتوكول نموذجي في الصفحة 2 من المادة التكميلية 1.
  2. إدارة المجمع
    1. عشوائية أقفاص للمركبة أو المجموعة المركبة. استخدم الفئران المصابة بوهمية لإجراء دراسات حول آليات تطور الصرع أو لأغراض التحقق من الصحة ولكن ليس لفحص الأدوية الروتيني.
    2. الإبلاغ عن ظروف البيئة مثل درجة الحرارة والرطوبة والوقت من اليوم وما إلى ذلك.
    3. دوامة الحل مع المركب وكذلك حل السيارة. نضح السيارة أو المركب في حقنة وقم بترميز المحاقن بالألوان لمنع الاختلاط.
    4. وزن الحيوانات. تأكد من أن الفئران B6J >18 جم في اليوم 3 pi (غير مدورة). الإبلاغ عن الوزن.
    5. إدارة المركب (على سبيل المثال ، عن طريق الحقن داخل الصفاق أو الطرق المناسبة الأخرى). اكتب وقت وطريق الإدارة.
    6. مراقبة الحيوانات بحثا عن أي تغيرات سلوكية بعد إعطاء المركب ، خاصة بعد الحقن الأولى. في حالة حدوث نوبات ، أبلغ عن شدة النوبة وفقا لمقياس راسين23 ؛ راجع الخطوة 3.2.
      ملاحظة: يمكن العثور على بروتوكول نموذجي للإدارة المركبة في المادة التكميلية 1، الصفحة 3، في حين أن المضبوطات التي لوحظت أثناء الإعطاء ستسجل في المادة التكميلية 1، الصفحات 4-5.
  3. رصد النوبات الناجمة عن المناولة
    1. نفذ هذا الإجراء من قبل مجرب أعمى عن العلاج. إحضار جميع الأقفاص إلى مقاعد البدلاء. مراقبة الحيوانات للنوبات 2x يوميا خلال مرحلة الضوء.
    2. سجل نشاط النوبة بمقياس راسين المعدل23: 0 = لا تغيير في السلوك ، 1 = حركات الفم والوجه ، 2 = إيماء الرأس ، 3 = رمعان الأطراف الأمامية من جانب واحد ، 4 = رمعية طرفية أمامية ثنائية مع تربية ، 5 = نشاط منشط رمجي معمم مع فقدان نغمة الوضع ، وأحيانا القفز ، 6 = القفز المطول والمفرط وفرط النشاط. الإبلاغ عن عدد وشدة النوبات.
    3. حرك قلما عبر القفص لإحداث بعض الضوضاء.
    4. نقل كل إلى صندوق آخر والعودة.
    5. هز القفص برفق باستخدام حركة ذهابا وإيابا ، مع الحرص على عدم هز القفص بقوة بحيث تصطدم الحيوانات بجوانب أو أعلى القفص وتكون معرضة لخطر الإصابة الجسدية.
    6. مراقبة جميع الحيوانات في القفص للمضبوطات. في أي وقت ، إذا كان الفأر يعاني من نوبة ، فقم بنقله مرة أخرى إلى القفص المنزلي واكتب مستوى النوبة دون مزيد من تحفيز النوبة عن طريق الضوضاء أو المناولة.
    7. بالنسبة للحيوانات التي لم يتم الاستيلاء عليها بشكل عفوي أو بعد اهتزاز القفص اللطيف ، قم بإثارة النوبات عن طريق التعامل الأكثر كثافة: اقلب الماوس بعناية عن طريق قلبه على ذيله من اليسار إلى اليمين.
      ملاحظة: الحيوانات المصابة بالنوبات شديدة الانفعال ، ويمكن أن تكون قافية.
    8. مراقبة كل لسلوك النوبة مرة أخرى. كرر العملية للأقفاص اللاحقة.
      ملاحظة: يمكن العثور على بروتوكول نموذجي لرصد النوبات في المواد التكميلية 1، الصفحات 6-7.
  4. تقرير بيانات عن التأثيرات المركبة
    1. تحليل أوزان الجسم اليومية باستخدام المقاييس المتكررة (RM) ANOVA.
    2. استخدم قيم عبء النوبات التراكمية اليومية للحصول على تمثيل رسومي للبيانات. قدم بيانات الفعالية (عدد الحيوانات التي لم تتعرض لنوبات راسين في المرحلة 3-5) كعدد محمي / العدد الذي تم اختباره في كل مجموعة (عادة N = 20). لذلك ، قارن البيانات بين المجموعات المعالجة بالمركبات والمخدرات للاستجابات (الاستيلاء أو عدم الاستيلاء) باستخدام اختبار فيشر الدقيق.
      ملاحظة: يعتبر الحيوان "محميا" من النوبات إذا كان لديه نوبة من المرحلة 2 أو أقل والحيوانات غير المحمية لديها نوبات من المراحل 3-5.
    3. تحليل بيانات التحمل بالمثل ، مثل عدد الحيوانات ذات الإعاقات السلوكية أو التأثيرات السامة / العدد الذي تم اختباره في كل مجموعة. لاحظ أي آثار ضارة ، بما في ذلك الوفيات.
    4. إذا كان أقل من 50٪ من الفئران التي تم حقنها بالسيارة تضبط بشكل حاد ، فلا تفكر في البيانات.

Representative Results

الآثار المركبة على النوبات الحادة
يتم تسجيل النوبات السلوكية إذا حدثت أثناء حقن المخدرات (DI) أو أثناء جلسات معالجة / مراقبة نوبات AM / PM اللاحقة. ويمكن عرض المضبوطات التي لوحظت أثناء مناولة المضبوطات كخريطة حرارية، كما هو مبين في الشكل 2 ل LEV (350 مغ/كغ). ولتحليل عبء المضبوطات، يؤخذ متوسط قيم عبء النوبات التراكمية النهائية (اليوم 7) للمجموعة المعالجة بالمركبات ويقارن باختبار مان-ويتني يو بالمجموعة المعالجة المركبة (تشمل قيم عبء النوبات تلك التي تجمع عند ملاحظة ما بعد الحقن). بالنسبة لفعالية المركب ، يحدد اختبار فيشر الدقيق ما إذا كان هناك اختلاف إحصائي في الفعالية بين المجموعات المعالجة بالمركبات والأدوية. وبالمثل ، يتم تحليل بيانات التحمل باستخدام اختبار فيشر الدقيق. يتم إجراء تحليل وزن الجسم عن طريق قياسات متكررة ANOVA لتحديد التغييرات على مدار التجربة ، وكذلك الاختلافات بين الفئران المعالجة بالمركبات والمركبات.

Figure 2
الشكل 2: خريطة حرارية للنوبات السلوكية بعد الاختبار باستخدام السيارة (0.5٪ ميثيل سلولوز) أو LEV (350 مجم / كجم). حدثت الحقن مرتين يوميا قبل 1 ساعة من ملاحظات المناولة والنوبات. تم تسجيل النوبات السلوكية إذا حدثت أثناء حقن المخدرات (DI) أو أثناء جلسات معالجة / مراقبة نوبات AM / PM اللاحقة. يقلل LEV (350 مجم / كجم) بشكل كبير من النوبات التي لوحظت أثناء جلسات المناولة (35.9٪ من عبء ضبط المركبات) خلال فترة المراقبة التي تبلغ 5 أيام. يتم إنشاء خريطة الحرارة عن طريق تصوير مرحلة النوبات 1-3 باللون الأخضر و 4 باللون الأصفر و 5 باللون البرتقالي. تم إنشاء هذا الرقم الجديد من مجموعة بيانات منشورة19. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الصرع المزمن
بصرف النظر عن عبء النوبات المبلغ عنه في الأسبوع الأول pi ، هناك العديد من القراءات التي يمكن أن تكون مفيدة اعتمادا على الدراسة والفرضية. إذا تم الاحتفاظ بالحيوانات على المدى الطويل ، فإن مجموعة فرعية من الحيوانات المصابة ستطور نوبات صرع عفوية في عدة أسابيع pi ، والتي تحدث بشكل أقل تواترا من النوبات الحادة ، وبالتالي تتطلب تسجيل EEG. من أجل تسجيل EEG من الفئران ، يجب زرع الأقطاب الكهربائية في جراحة تجسيمية24. يوضح الشكل 3 أحداث الصرع المختلفة في المرحلة المزمنة عن طريق تسجيل EEG في الفئران المصابة ب TMEV8.

Figure 3
الشكل 3: آثار EEG النموذجية في المرحلة المزمنة (14 أسبوعا pi) بعد عدوى فيروس DA في الفئران. (A-C) أحداث EEG التمثيلية التي لم يلاحظ فيها أي ارتباط حركي سلوكي ، أي (A) طفرات مفردة ، (B) مجموعات سبايك ، (C) بالإضافة إلى نوبة كهربية يفترض أنها بؤرية. (مد-واو) أحداث EEG التمثيلية مع الارتباطات السلوكية. كان للفأر الموضح في D أحداث شبيهة بالنوبات مع تشنجات رمعية عضلية (يشار إليها ب "M" ، مصحوبة بقطع أثرية للحركة) ، أو حركات نمطية (يشار إليها ب "ضغط الرأس" ، عندما يضغط الفأر على الرأس بشكل مسطح على الأرض) ، أو توقف سلوكي ؛ يصف "Scr" قطعة أثرية للحركة للخدش ، ويظهر (E) و (F) تغيرات نموذجية في مخطط كهربية الدماغ أثناء النوبات المتشنجة المعممة: (E) نوبة راسين من المرحلة 3 لمدة 22 ثانية و 1 هرتز ، و (F) نوبة من المرحلة 5 لمدة 34 ثانية و 5.4 هرتز. تم نشر هذا الرقم قبل8 وأعيد طبعه بإذن من Elsevier. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

علم الأنسجة
نظرا لأن الصرع والنوبات عادة ما تكون مصحوبة بأمراض الحصين في المرضى ، والتي يتم تلخيصها في النماذج التجريبية ، فإن معظم المختبرات تحلل أيضا تغيرات الحصين أو تأثير العلاج المضاد للتشنجات المحتمل على علم الأمراض. تشمل المعلمات التي يتم تحليلها بشكل شائع التنكس العصبي الحصين والانكماش ، بالإضافة إلى الالتهاب عن طريق وضع العلامات على مجموعات معينة من الخلايا المناعية. لمثل هذه التحليلات ، في نهاية التجربة ، يتم تخدير الفئران بعمق حتى يحدث توقف التنفس ويتباطأ معدل ضربات القلب بشكل كبير أو يظهر عدم انتظام ضربات القلب. تتم إزالة الدم عن طريق التروية داخل القلب من PBS تليها 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) 25 لتثبيت الأنسجة. ثم تتم معالجة الأنسجة عن طريق التشريح بالتبريد وتلطيخ (المناعة)26 ، تليها التحليلات المجهرية.

Figure 4
الشكل 4: تنكس الحصين في الفئران المصابة بالصرع TMEV. (أ ، ب) تظهر المقاطع الإكليلية الملطخة بالكريسيل البنفسجي بنية خلوية طبيعية في فأر تحكم (أ) (PBS) وتنكس الحصين في فأر TMEV (B) عند 2 أشهر pi. ملاحظة: تضخم البطينين الجانبيين ، انهيار الحويصلات الهوائية ، وترقق طبقة الخلايا الهرمية. (ج) يظهر القياس الكمي لهذا الضرر انخفاضا كبيرا في منطقة الحصين وزيادة مقابلة في منطقة البطين لفئران TMEV (N = 7) مقابل فئران PBS (N = 6 ؛ البيانات هي متوسط ± SEM ؛ p < 0.001 ؛ اختبار t للطالب). (د، ه) يوضح وضع العلامات على NeuN أيضا حجم فقدان الخلايا العصبية في الأقسام المأخوذة في 6 أشهر pi. تشير الأسهم إلى المناطق ذات الفقدان الهرمي الكامل للخلايا. (ه) يبدو أن التلفيف المسنن سليم نسبيا حتى في الفئران المصابة بالصرع. شريط المقياس = (أ ، ب) 2 مم ؛ (D ، E) 0.5 مم. تم نشر هذا الرقم قبل6 وأعيد طبعه بإذن من مطبعة جامعة أكسفورد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: صور مجهرية تمثيلية لشدة مختلفة لتسلل الخلايا التائية بسبب التهاب الدماغ الحاد بعد 7 أيام من الإصابة. تم تلطيخ المقاطع التسلسلية التي تحتوي على الحصين الظهري المماثل بالأجسام المضادة ضد CD3 من أجل تسمية الخلايا اللمفاوية التائية. (أ، د) قرن آمون طبيعي بدون تسلل الخلايا التائية كما ظهر في الحيوانات المصابة وهمية. (ب، ه) تسلل الخلايا التائية المعتدلة كما هو موضح في غالبية الفئران المصابة ب TMEV. (ج، و) تسلل شديد للخلايا الليمفاوية التائية ، والذي شوهد فقط في بعض الفئران المصابة. تم نشر هذا الرقم قبل8 وأعيد طبعه بإذن من Elsevier. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي 1: يتكون الملف التكميلي من النموذج المستخدم للاختبار المركب في نموذج TMEV. تقدم الصفحة 1 نظرة عامة على الإعداد التجريبي. يتم تسجيل المعلومات المتعلقة بإعداد المركب والمركبة والمحلول المركب في الصفحات 1-2. يتم تسجيل التطبيق المركب في الصفحة 3. تستخدم أوراق التسجيل في الصفحات 4-5 لتسجيل النوبات التي لوحظت وحددت كميا من قبل المجرب الذي يقوم بالحقن المركب. في الصفحة 4 ، يمكن جمع البيانات عن الأقفاص 1-4 من 5 فئران لكل منها ، وفي الصفحة 5 ، يمكن تسجيل الأقفاص 5-8 ، وهو العدد القياسي للحيوانات للاختبار المركب في أيدينا. يتم استخدام أوراق التسجيل في الصفحات 6-7 من قبل المراقب الأعمى الذي يقوم بالملاحظة والتعامل والقفص اللطيف الذي يهز 1 ساعة بعد كل حقنة مركبة. مرة أخرى ، يمكن ملاحظة درجات المضبوطات لثمانية أقفاص في المجموع في أوراق النتائج النموذجية هذه. يمكن استخدام الصفحة الأخيرة 8 لتسجيل أي ملاحظات أو ملاحظات أخرى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

هذا هو أول نموذج للقوارض القائم على العدوى للصرع الذي يسمح بالتحقيق في تطور النوبات الحادة والمزمنة. وسوف يساعد على تحديد أهداف الأدوية والمركبات الجديدة للوقاية من الأمراض أو تعديلها لأحد مسببات الصرع الأكثر شيوعا.

كما هو موضح أعلاه ، قد يكون من الضروري النظر بعناية في الدفعة والعيار الفيروسي لضمان أن تظهر نسبة كافية من الفئران المعالجة TMEV نوبات ناجمة عن المناولة. إذا كانت الحيوانات تعاني من نوبات أقل من المعتاد ، فاستخدم مجموعة من N = 20 حيوانا للتحقق من كفاءة الفيروس. إذا انخفض نشاطها (أقل من 50٪) ، فقد حان الوقت لعمل حصص جديدة واختبارها باستخدام N = 20 حيوانا. إذا لم تكن الحصص الجديدة أكثر كفاءة ، فيجب تنقية دفعة جديدة من الفيروس. بالنسبة لبعض خطوط الماوس المعدلة وراثيا ، قد يكون من الضروري استخدام عيار فيروسي أقل ؛ لذلك ، يجب تخفيف العيار الفيروسي حسب الحاجة بعد التجارب الأولية. معظم البيانات المتاحة عن الفئران B6 نشأت من مختبرات جاكسون (بار هاربور ، الشرق الأوسط ، الولايات المتحدة الأمريكية أو تشارلز ريفر ، سولزفيلد ، ألمانيا). ومع ذلك ، تم تأكيد معدلات نوبات مماثلة في الفئران B6 التي تم الحصول عليها من Harlan (Eystrup ، ألمانيا)8. معدلات المضبوطات للحيوانات المعدلة وراثيا ذات الخلفية B6 قابلة للمقارنة مع الفئران B6 من النوع البري ولكن يمكن أن تختلف إذا كان للتغيرات الجينية تأثير على غزو الفيروس أو الاستجابة الالتهابية أو التنكس العصبي21. يتم ملاحظة النوبات الحادة تلقائيا ولكن يتم تشغيلها عن طريق المناولة والضوضاء ، لذلك من الأهمية بمكان التعامل مع جميع الحيوانات بطريقة مماثلة عند مقارنة معدلات النوبات. قدمت جلسات المناولة مرتين يوميا في السابق عبئا كبيرا من النوبات ونسبة أكبر من الفئران التي تظهر نوبات خلال الأيام 3-7 بعد الإصابة6،8،19. يمكن أيضا استخدام جلسات مناولة إضافية (اليوم 1 واليوم 2) لزيادة عبء النوبات. علاوة على ذلك ، يمكن ملاحظة الحيوانات قبل كل جلسة مناولة لضمان عدم حدوث نوبات عفوية. على سبيل المثال ، قد تنتج بيئة المختبر الصاخبة نوبات ، والتي بدورها قد تجعل الحيوانات مقاومة للنوبات التي يسببها التعامل معها خلال أوقات الاختبار.

في حين أن عدوى TMEV تنتج نوبات ناجمة عن المناولة في غالبية الفئران ، فمن غير المعروف سبب مقاومة بعض الحيوانات لهذا العلاج. كما هو موضح أعلاه ، قد تحدث نوبات كهربية (مع الحد الأدنى من السلوكيات المرتبطة بها أو بدونها) ولا يتم قياسها عادة دون تسجيل EEG المصاحب. قد يكون أيضا أن الاختلافات الصغيرة في موقع الحقن تسهل تقليل التأثير الفيروسي في الدماغ. ومع ذلك ، تم الإبلاغ عن النوبات بعد العدوى القشرية والمخططة5،6،8،9 بسبب انتحاء الفيروس إلى الحصين. بالنسبة لدراسات فحص المخدرات في هذا النموذج ، لتحديد انخفاض في النوبات (على سبيل المثال ، انخفاض بنسبة 50٪ في عبء النوبات) ، يلزم وجود عدد أكبر من الحيوانات لكل مجموعة (على سبيل المثال ، N = 20). علاوة على ذلك ، فإن التباين في سلوكيات النوبات في هذا النموذج يستلزم اختلافات أكبر في تأثيرات المخدرات مقابل المركبات لتحديد انخفاض كبير في النوبات. لذلك ، فإن أحد قيود هذا النموذج هو متطلبات أحجام المجموعات الأكبر. ومع ذلك ، فإن أحجام المجموعات الكافية تسمح أيضا بتحديد التأثيرات المضادة للنوبات والمضادة للالتهابات في هذا النموذج19.

تحدث الغالبية العظمى من النوبات التي يمكن ملاحظتها في هذا النموذج خلال فترة العدوى الحادة. على الرغم من حدوث تنكس الحصين ، وتنشيط الخلايا المناعية ، والعجز المعرفي الذي لوحظ في الفئران التي عولجت ب TMEV ، فإن جزءا صغيرا فقط من الحيوانات التي عولجت تتطور في النهاية إلى نوبات مزمنة وعفوية. سيتطلب عبء النوبات الإجمالي المنخفض هذا عددا كبيرا من الفئران المصابة من أجل دراسة النوبات التلقائية بشكل صحيح في هذا النموذج ، وهو ما يتجاوز نطاق وقدرة العديد من المشاريع. كما أن زرع قطب العمق ومراقبة EEG من شأنه أيضا زيادة العبء على التجارب. في حين أن أقطاب العمق قد تساعد في تحديد نشاط النوبة التلقائية ، فإن التغييرات في تشريح الحصين بعد العدوى قد تجعل وضع القطب الكهربائي المتسق تحديا.

تتطلب الحاجة الملحة لتحديد علاجات جديدة للصرع تطوير نماذج يمكن استخدامها كطريقة فحص سريعة لفعالية مضادات النوبات. يوفر هذا النموذج ميزات لمعالجة هذا الطلب العاجل. علاوة على ذلك ، فإن حقيقة أنه لا يتطلب أي جراحة تجسيمية يجعله نموذجا مناسبا وسهل الأداء للتحقيق في المركبات المضادة للتشنج.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

يتم دعم SB من خلال منحة أولية من FU Berlin. يتم دعم KSW من قبل R37 NS065434 ومؤسسة ALSAM. يتم دعم LAB بجائزة D-SPAN 1F99NS125773-01. نشكر روبرت فوجينامي ، دكتوراه لتزويدنا بفيروس ثيلر والمرفق الأساسي للتصوير الخلوي بجامعة يوتا لدعم الفحص المجهري.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbent paper - - any
Analytical balance Mettler Toledo (Columbus, OH, U.S.A.) 30216542 0. 1 mg–220 g 
Animal balance Ohaus (Parsippany, NJ, U.S.A.) STX2202 0.01 g–2200 g 
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes BD (Mississauga, ON, Canada)  BD329461 Lo-Dose sterile syringes with permanent BD Micro-Fine IV needle - 1 mL
Daniel's strain of TMEV kindly provided by Robert Fujinami (University of Utah) - 3 x 105 plaque-forming units aliquot(s)
Disinfectant, e.g. VennoVet 1 super Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Germany - Recommended by campus veterinarians with less than or equal to 5% alcohol
Fisherbrand medium sterile Alcohol prep pad C7  Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) 22-363-750
Fluriso VETone (Boise, ID, U.S.A) 502017 Isoflurane 250 mL, 2%–5%
Fume absorber  Labconco (Kansas City, MO, U.S.A.) - -
General Protection Disposable SMS White Lab Coats   Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) 17-100-810A
GraphPad Prism version 9  (La Jolla, CA, U.S.A.)
Ice bucket - - any
Microsoft Excel Microsoft  (Redmond, WA, U.S.A.)
Microsoft Word Microsoft  (Redmond, WA, U.S.A.)
Mouse cage - - any mouse cage holding at least 5 mice
PrecisionGlide needles  BD (Mississauga, ON, Canada) 329652 BD Slip Tip with PrecisionGlide Needle Insulin Syringes - 26 G x 3/8 - 0.45 mm x 10 mm
Self-Sealing Sterilizing Pouch  Fisher Scientific (Hampton, NY, U.S.A.) NC9241087  12.6 x 25.5 cm
Small glass flask - - any, volume 25 mL
sterile PBS Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) 10010056
Stir bar Carl Roth GmbH & CO. KG X171.1 size according to volume of solution
Stir plate Carl Roth GmbH & CO. KG AAN2.1
Syringe Luer-Lok BD (Mississauga, ON, Canada) 309628 1 mL syringe only
Ultrasonic Cleaner, Heater/Mechanical Timer Cole-Parmer (Vernon Hills, IL, U.S.A.) EW-08895-23 Bath sonicator - 0.5 gal, 115 V
Vehicle solution - - depending on compound vehicle
Vortex REAX  Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Germany 541-10000-00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Getts, D. R., Balcar, V. J., Matsumoto, I., Müller, M., King, N. J. Viruses and the immune system: their roles in seizure cascade development. Journal of Neurochemistry. 104 (5), 1167-1176 (2008).
  2. Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Neurotropic viral infections leading to epilepsy: Focus on Theiler's murine encephalomyelitis virus. Future Virology. 6 (11), 1339-1350 (2011).
  3. Vezzani, A., et al. Infections, inflammation and epilepsy. Acta Neuropathologica. 131 (2), 211-234 (2016).
  4. Misra, U. K., Tan, C. T., Kalita, J. Viral encephalitis and epilepsy. Epilepsia. 49, Suppl 6 13-18 (2008).
  5. Libbey, J. E., et al. Seizures following picornavirus infection). Epilepsia. 49 (6), 1066-1074 (2008).
  6. Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. Development of postinfection epilepsy after Theiler's virus infection of C57BL/6 mice. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (12), 1210-1219 (2010).
  7. Stewart, A. M., et al. Perspectives of zebrafish models of epilepsy: What, how and where next. Brain Research Bulletin. 87 (2-3), 135-143 (2012).
  8. Bröer, S., et al. Brain inflammation, neurodegeneration and seizure development following picornavirus infection markedly differ among virus and mouse strains and substrains. Experimental Neurology. 279, 57-74 (2016).
  9. Bröer, S., et al. Viral mouse models of multiple sclerosis and epilepsy: Marked differences in neuropathogenesis following infection with two naturally occurring variants of Theiler's virus BeAn strain. Neurobiology of Disease. 99, 121-132 (2017).
  10. Loewen, J. L., Barker-Haliski, M. L., Dahle, E. J., White, H. S., Wilcox, K. S. Neuronal Injury, gliosis, and glial proliferation in two models of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 75 (4), 366-378 (2016).
  11. Bell, L. A., Wallis, G. J., Wilcox, K. S. Reactivity and increased proliferation of NG2 cells following central nervous system infection with Theiler's murine encephalomyelitis virus. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 369 (2020).
  12. Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. Theiler's virus infection chronically alters seizure susceptibility. Epilepsia. 51 (8), 1418-1428 (2010).
  13. Buenz, E. J., Rodriguez, M., Howe, C. L. Disrupted spatial memory is a consequence of picornavirus infection. Neurobiology of Disease. 24 (2), 266-273 (2006).
  14. Tramoni-Negre, E., Lambert, I., Bartolomei, F., Felician, O. Long-term memory deficits in temporal lobe epilepsy. Revue Neurologique. 173 (7-8), 490-497 (2017).
  15. Ponds, R. W., Hendriks, M. Cognitive rehabilitation of memory problems in patients with epilepsy. Seizure. 15 (4), 267-273 (2006).
  16. Sloviter, R. S. Experimental status epilepticus in animals: What are we modeling. Epilepsia. 12, 11-13 (2009).
  17. Löscher, W. Animal models of seizures and epilepsy: Past, present, and future role for the discovery of antiseizure drugs. Neurochemical Research. 42 (7), 1873-1888 (2017).
  18. Kehne, J. H., Klein, B. D., Raeissi, S., Sharma, S. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP). Neurochemical Research. 42 (7), 1894-1903 (2017).
  19. Metcalf, C. S., et al. Screening of prototype antiseizure and anti-inflammatory compounds in the Theiler's murine encephalomyelitis virus model of epilepsy. Epilepsia Open. 7 (1), 46-58 (2021).
  20. Daniels, J. B., Pappenheimer, A. M., Richardson, S. Observations on encephalomyelitis of mice (DA strain). Journal of Experimental Medicine. 96 (6), 517-530 (1952).
  21. Käufer, C., et al. Chemokine receptors CCR2 and CX3CR1 regulate viral encephalitis-induced hippocampal damage but not seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (38), 8929-8938 (2018).
  22. Libbey, J. E., et al. The effects of diet on the severity of central nervous system disease: One part of lab-to-lab variability. Nutrition. 32 (7-8), 877-883 (2016).
  23. Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 32 (3), 281-294 (1972).
  24. Kim, J. E., Cho, K. O. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy and EEG monitoring using radiotelemetry system in mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831 (2018).
  25. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  26. Tu, L., et al. Free-floating immunostaining of mouse brains. Journal of Visualized Experiments. (176), e62876 (2021).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 184 ،
نموذج لصرع المسببات المعدية باستخدام فيروس التهاب الدماغ والنخاع الفئران ثيلر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Batot, G., Metcalf, C. S., Bell, L.… More

Batot, G., Metcalf, C. S., Bell, L. A., Pauletti, A., Wilcox, K. S., Bröer, S. A Model for Epilepsy of Infectious Etiology using Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus. J. Vis. Exp. (184), e63673, doi:10.3791/63673 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter