Summary
Die intrazerebrale Infektion mit dem Theiler-murinen Enzephalomyelitis-Virus (TMEV) in C57BL/6-Mäusen repliziert viele der frühen und chronischen klinischen Symptome der viralen Enzephalitis und der anschließenden Epilepsie bei menschlichen Patienten. Dieser Artikel beschreibt die Virusinfektion, die Symptome und die Histopathologie des TMEV-Modells.
Abstract
Eine der Hauptursachen für Epilepsie ist eine Infektion des zentralen Nervensystems (ZNS); Etwa 8 % der Patienten, die eine solche Infektion überleben, entwickeln in der Folge eine Epilepsie, wobei die Raten in wirtschaftlich weniger entwickelten Ländern deutlich höher sind. Diese Arbeit gibt einen Überblick über die Modellierung von Epilepsie infektiöser Ätiologie und deren Verwendung als Plattform für neuartige Antiepilepsie-Substanztests. Es wird ein Protokoll der Epilepsie-Induktion durch nicht-stereotaktische intrazerebrale Injektion des Theiler-murinen Enzephalomyelitis-Virus (TMEV) in C57BL/6-Mäusen vorgestellt, das viele der frühen und chronischen klinischen Symptome der viralen Enzephalitis und der anschließenden Epilepsie bei menschlichen Patienten repliziert. Die klinische Bewertung von Mäusen während einer Enzephalitis zur Überwachung der Anfallsaktivität und zur Detektion der potentiellen Antiepileptik-Effekte neuartiger Wirkstoffe wird beschrieben. Des Weiteren werden histopathologische Folgen einer viralen Enzephalitis und Krampfanfälle wie Hippocampusschäden und Neuroinflammation sowie Langzeitfolgen wie spontane epileptische Anfälle aufgezeigt. Das TMEV-Modell ist eine der ersten translationalen, infektionsgetriebenen, experimentellen Plattformen, die es ermöglicht, die Mechanismen der Epilepsieentstehung als Folge einer ZNS-Infektion zu untersuchen. Damit dient es auch dazu, potenzielle therapeutische Ziele und Wirkstoffe für Patienten zu identifizieren, bei denen das Risiko besteht, nach einer ZNS-Infektion an Epilepsie zu erkranken.
Introduction
Eine der häufigsten Folgen einer viralen Enzephalitis sind epileptische Anfälle. Viele Virusinfektionen lösen in der akuten Phase der Infektion symptomatische Anfälle aus; Das Risiko für solche Anfälle ist in der Bevölkerung um über 20 % erhöht 1,2,3. Patienten, die die Infektion überleben, haben auch ein um 4%-20% erhöhtes Risiko, in den Monaten bis Jahren nach der Infektion an einer chronischen Epilepsie zu erkranken 1,4. Das Theiler-murine Enzephalomyelitis-Virus (TMEV) wurde als geeignetes Virus identifiziert, um akute und chronische Anfälle in einem Mausmodell der viralen Enzephalitis zu untersuchen 5,6,7. TMEV ist ein unbehülltes, einzelsträngiges RNA-Virus aus der Familie der Picornaviridae und wird traditionell zur Untersuchung der Demyelinisierung im Rückenmark von SJL-Mäusen verwendet, vor der C57BL/6 (B6)-Mäuse geschützt sind, da sie die Fähigkeit haben, das Virus nach der Infektion schnell zu beseitigen. TMEV induziert jedoch bei 50%-75% der männlichen und weiblichen B6-Mäuse akute Anfälle innerhalb der ersten Woche nach der Infektion (pi), während etwa 25%-40% Wochen bis Monate pi 2,5,6,8,9 eine chronische Epilepsie entwickeln. Neben Anfällen zeigen die Mäuse auch die übliche Histopathologie eines epileptischen Hippocampus mit Neurodegeneration und Gliose 5,6,8,10,11,12. Darüber hinaus schneiden TMEV-infizierte B6-Mäuse in Verhaltenstests für Lernen und Gedächtnis signifikant schlechter ab und weisen eine kognitive Komorbidität auf, die auch bei klinischen Patienten mit Epilepsie beobachtet wird13,14,15.
Traditionell verwenden Modelle von Epilepsie und Krampfanfällen entweder die Anwendung von chemokonvulsiven Substanzen oder elektrische Stimulation, um Anfälle auszulösen. Diese Modelle haben jedoch keine Konstruktvalidität und zeigen oft schwerere Anfälle und Hirnschäden als bei klinischen Patienten16. Es gibt kein Modell, das für jede Forschungsfrage geeignet ist17. Die Verwendung des TMEV-Modells ist besonders interessant, wenn die prädisponierenden Faktoren der Anfallsentwicklung nach einer Infektion des ZNS erforscht werden oder wenn Verbindungen auf ihre antiepileptische Wirksamkeit untersucht werden.
Da das TMEV-Modell in mehreren verschiedenen Laboren international etabliert und eingesetzt wurde, haben die Autoren viele Details identifiziert, die eine erfolgreiche Implementierung des Modells ermöglichen, z. B. die Spezifität verschiedener Virus- und Mausstämme. Die zuverlässigste Anfallsinduktion wurde mit dem Daniel-Stamm von TMEV- und B6J-Mäusen erzeugt 2,5,6,8,9. Das Modell wird derzeit vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) als Plattform zur Identifizierung neuer Medikamente gegen Epilepsie und Krampfanfälle verwendet18,19. Diese Arbeit enthält ein detailliertes Protokoll der Virusinduktion und der klinischen Überwachung, damit andere Forscher dieses Modell der viralen Enzephalitis nutzen können, um das Verständnis der Krankheitsmechanismen zu verbessern und Medikamente zu testen.
Das folgende Protokoll spiegelt eine Studie wider, die für die Prüfung von Verbindungen in diesem Modell konzipiert wurde, obwohl zahlreiche andere Arten von Studien durchgeführt werden können. Die Mäuse werden kurz vor der Injektion mit dem Daniel-Stamm von TMEV in der temporalen Region der rechten Hemisphäre (posterior und medial des rechten Auges) betäubt. Abhängig von der Fragestellung erhalten Mäuse, wenn nicht-infizierte Kontrolltiere benötigt werden, sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4, einschließlich KH 2 PO 4 [1,06 mM], NaCl [155,17 mM] und Na2 HPO4·7H2O [2,97mM]) anstelle von TMEV. Frühere Erfahrungen mit TMEV-infizierten Mäusen haben gezeigt, dass Handling-induzierte Anfälle zwischen Tag 3 und Tag 7 nach der Infektion auftreten. Die Häufigkeit der Injektion, der Weg und der Zeitpunkt der Prüfung von experimentellen Verbindungen variieren je nach ihren Eigenschaften. Es wird empfohlen, die Virusimpfung an einem Freitag durchzuführen, so dass die Überwachung der Anfälle von Tag 3 bis 7 in der folgenden Woche, von Montag bis Freitag, erfolgen kann. Während der Anfallsüberwachungswoche können experimentelle Verbindungen zweimal täglich (im Abstand von mindestens 4 Stunden) verabreicht (i.p.) werden, sofern die Kinetik oder der Wirkmechanismus der Verbindung nichts anderes vorschlagen. Die Überwachung der Anfälle während der Behandlung kann zu einem vorher festgelegten Zeitpunkt durchgeführt werden. Die Injektions- und Beobachtungszeiten variieren je nach Verbindung. Den Tieren wird die Testsubstanz oder ein Vehikel anstelle der Wirkstoffverbindung injiziert. Diese beiden Gruppen können analog zur Experimentalgruppe behandelt und beobachtet werden. Während des Experiments sollte die eine Person, die mit den Mäusen umgeht und die Anfälle bewertet, für die Behandlung blind sein.
Protocol
Alle beschriebenen Verfahren wurden von den jeweiligen Behörden genehmigt. Die Tiere werden gemäß den Empfehlungen des "Guide for Care and Use of Laboratory Animals" (National Research Council) und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Public Health Service und dem Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Utah, Tierprotokoll (Nummer: 21-11009, Abt. Pharmakologie und Toxikologie) und an der Freien Universität Berlin (Protokoll: G0015/21, LAGeSo Berlin, Institut für Pharmakologie bzw. Toxikologie. Die in Abbildung 3 und Abbildung 5 dargestellten Ergebnisse wurden unter 33.9-42502-04-11/0516 und 33.9-42502-04-15/1892 (LAVES Oldenburg, Abt. Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie, Tierärztliche Hochschule Hannover) genehmigt.
1. Überlegungen und Vorbereitungen für die Konzeption der Studie
- Virus
- Der Daniel's-Stamm von TMEV wurde freundlicherweise von Robert Fujinami von der University of Utah zur Verfügung gestellt. Ursprünglich wurde es aus einer Maus in der Harvard-Kolonie20 isoliert. Informieren Sie sich vor dem Umgang mit TMEV über die spezifische Einstufung und Vorschriften für biologische Arbeitsstoffe in den jeweiligen Ländern und besprechen Sie dies mit dem institutionellen Biosicherheitspersonal, um die Einhaltung der Vorschriften sicherzustellen. Typischerweise wird TMEV als BSL 2 klassifiziert, abhängig vom Stamm und den genetischen Veränderungen. Die Standarddosis, die erforderlich ist, um bei der Mehrzahl der Tiere Krampfanfälle auszulösen, beträgt 3 x 105 plaquebildende Einheiten (PFU).
HINWEIS: Die Dosis muss möglicherweise angepasst werden, z. B. wenn transgene Mäuse verwendet werden. Insgesamt wurden Titer zwischen 2 x 104 PFU und 2,44 x 107 PFU verwendet, um erfolgreich Anfälle zu induzieren. Kontrolltiere erhalten steriles PBS und erleiden keine Krampfanfälle. Das Virus infiziert den Menschen nicht; PSA (Laborkittel, Handschuhe, Schutzbrille) sollte jedoch von den Experimentatoren jederzeit getragen werden, und Mäusekadaver und Einstreu sollten vor der Entsorgung autoklaviert werden.
- Der Daniel's-Stamm von TMEV wurde freundlicherweise von Robert Fujinami von der University of Utah zur Verfügung gestellt. Ursprünglich wurde es aus einer Maus in der Harvard-Kolonie20 isoliert. Informieren Sie sich vor dem Umgang mit TMEV über die spezifische Einstufung und Vorschriften für biologische Arbeitsstoffe in den jeweiligen Ländern und besprechen Sie dies mit dem institutionellen Biosicherheitspersonal, um die Einhaltung der Vorschriften sicherzustellen. Typischerweise wird TMEV als BSL 2 klassifiziert, abhängig vom Stamm und den genetischen Veränderungen. Die Standarddosis, die erforderlich ist, um bei der Mehrzahl der Tiere Krampfanfälle auszulösen, beträgt 3 x 105 plaquebildende Einheiten (PFU).
- Tiere
- Um Anfälle zu induzieren und zu untersuchen, verwenden Sie B6J-Mäuse, da andere Mausstämme nicht unbedingt Anfälle aufweisen, z. B. SJL/J-, FVB/N- oder Balb/c-Mäuse5. Es gibt keinen Unterschied zwischen weiblichen und männlichen Mäusen in der akuten Anfallshäufigkeit5. Führen Sie die Experimente an jugendlichen bis erwachsenen Mäusen durch (ab einem Alter von 5-6 Wochen).
- Diät
- Die Ernährung wurde als eine der Ursachen für die Variabilität der Krankheitsschwere von Labor zu Labor identifiziert. Betrachten Sie daher die Ernährung als einen potenziellen Faktor für die Variation22.
- Gruppengröße
- Da in diesem Modell nicht alle Tiere akute oder chronische Anfälle entwickeln, sollten Sie etwa 20 Mäuse pro Gruppe für Präparationstests verwenden.
- Tierschutz
- Wenn eine Maus nach einer in den lokalen IACUC-Richtlinien festgelegten Beobachtungszeit (z. B. 48 Stunden) signifikante unerwünschte Wirkungen durch die Infektion oder Verabreichung des Prüfpräparats zeigt (z. B. Lethargie, schlechte Pflege, übermäßige Rötung und eitriger Ausfluss aus der Wunde), wird die Maus auf humane Weise eingeschläfert.
- Euthanasieren Sie jede Maus, die während der Infektionsphase einen extremen Körpergewichtsverlust (>20%) zeigt, auf humane Weise.
- Wenn Tiere nicht richtig fressen, geben Sie ihnen Zugang zu zusätzlichen Pellets, die mit pädiatrischer Elektrolytlösung oder ähnlichem angefeuchtet sind.
2. Virus-Inokulation
- Sterilisation der Injektionsspritze
- Entfernen Sie die Kappe der Insulinspritze. Fügen Sie einen Polyethylenschlauch als Kragen um die Nadel hinzu, um eine ausreichende Injektionstiefe von 2,5 mm zu gewährleisten. Tauchen Sie die Spritze 30 Minuten lang in Ethanol. Setzen Sie die Spritze für 30 Minuten unter UV-Licht.
- Setzen Sie die Kappe wieder auf die Nadel. Wickeln Sie die Spritze in einen Sterilisationsbeutel und kleben Sie ihn mit Klebeband zu. Etikett mit dem Zubereitungsdatum.
- Virus-Injektion
- Holen Sie sich Aliquots von Daniels TMEV-Stamm aus dem −80 °C Gefrierschrank. Tauen Sie das Virus auf und bewahren Sie es auf Eis auf. Vermeiden Sie das Auftauen und erneute Einfrieren des Virus. Füllen Sie die Spritze mit der Virussuspension (3 x 105 PFU, verdünnt in 20 μl PBS- oder DMEM-Nährmedium).
ACHTUNG: Das Virus ist für Mäuse infektiös, aber nicht für Menschen. - Reinigen Sie die Bank mit Desinfektionsmittel und arbeiten Sie unter einem Rauchabsorber. Die Virusinokulation ist nicht steril, sondern so sauber wie möglich.
- Übertragen Sie die Maus in die Anästhesie-Induktionskammer und verwenden Sie 2 % Isofluran in Sauerstoff, um die Anästhesie einzuleiten. Das Erreichen der chirurgischen Toleranz dauert einige Minuten; Passen Sie die Konzentration an die Atmung des Tieres und die Narkosetiefe an.
- Übertragen Sie die betäubte Maus aus der Anästhesiebox unter die Haube. Chirurgische Verträglichkeit prüfen, z.B. durch Zehenkneifen. Der gesamte Eingriff wird in weniger als 30 Sekunden durchgeführt, so dass das Tier während der Injektion kein Isofluran einatmen muss. Fügen Sie Augensalbe hinzu, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
- Reinigen Sie den Kopf des Tieres mit einem Alkoholpad. Neigen Sie den Kopf der Maus leicht nach links, so dass die Injektionsstelle nach oben zeigt.
- Ziehen Sie die Haut etwas nach hinten, führen Sie die Nadel in den Kopf ein und injizieren Sie 20 μL intrakortikal bis zu einer Tiefe von 2,5 mm in den Schläfenbereich der rechten Hemisphäre (posterior und medial des rechten Auges).
- Führen Sie die Injektion bei allen Tieren einseitig in derselben Hemisphäre durch. Verwenden Sie das Auge und das Ohr als Orientierungspunkte für die Position des parietalen Kortex. Die Platzierung wurde zuvor histologisch verifiziert; siehe Abbildung 1. Die Injektionskoordinaten nach stereotaktischer Injektion in Bezug auf bregma sind −2,0 (AP); +3,0 (ML); −1,5 (DV).
- Lassen Sie die Spritze 5-15 Sekunden lang an Ort und Stelle. Notieren Sie, ob bei der Injektion etwas austritt oder ob Luftblasen zu sehen sind - bereiten Sie in diesem Fall eine neue Spritze vor. Wenn Sie die Spritze vorsichtig herausziehen, drehen Sie sie leicht. Tragen Sie Augensalbe auf, um Trockenheit unter Narkose zu vermeiden.
- OPTIONAL: Kodieren Sie das Tier auf dem Schwanz oder dem Ohr, abhängig von den örtlichen Verfahren (optional, aber einfach, da das Tier bewusstlos ist).
- Bringen Sie das Tier in einen neuen Käfig, der während der Genesung von der Narkose halb auf/halb von einem Heizkissen (35-40 °C) platziert wird. Lassen Sie die Tiere nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt haben, um das Brustbein zu halten.
HINWEIS: Die Tiere können nach der Genesung wieder in einer Gruppe untergebracht werden (infizierte Tiere werden nicht mit Scheintieren vermischt). Infizierte Mäuse sollten nicht im selben Raum wie nicht infizierte Mäuse untergebracht werden. - Behalten Sie das Gewicht der Mäuse in den ersten 7 Tagen pi im Auge, da sie nach der Infektion an Gewicht verlieren und möglicherweise zusätzliche Fütterung benötigen.
- Holen Sie sich Aliquots von Daniels TMEV-Stamm aus dem −80 °C Gefrierschrank. Tauen Sie das Virus auf und bewahren Sie es auf Eis auf. Vermeiden Sie das Auftauen und erneute Einfrieren des Virus. Füllen Sie die Spritze mit der Virussuspension (3 x 105 PFU, verdünnt in 20 μl PBS- oder DMEM-Nährmedium).
Abbildung 1: Schematische Darstellung des TMEV-Injektionsverfahrens. Von links nach rechts: Bei einer Injektion des rechten parietalen Kortex wird die Nadel leicht seitlich einer gedachten Linie zwischen dem Auge und dem gegenüberliegenden Ohr injiziert. Der Kragen zur Tiefenkontrolle ist gelb markiert. Der Injektionstrakt ist im koronalen Hirnabschnitt zu sehen, der durch den Pfeil markiert ist. Die Injektionsstelle entspricht den Koordinaten, die über dem Pfeil angegeben sind. Das rechte Bild zeigt die Verteilung des Theiler-Virus (violett) innerhalb des CA1 der Hippocampus-Formation. Die Figur wurde mit biorender.com präpariert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
3. Compound-Prüfung
- Compound-Präparation
- Lesen Sie die Formulierungsanweisungen. Bereiten Sie die Fahrzeuglösung gemäß den Empfehlungen oder den bereitgestellten Anweisungen vor. Als Beispiel wird das Verfahren für das Antiepileptikum Levetiracetam (LEV) vorgestellt. LEV reduziert die Anfallslast bei einer Dosis von 350 mg/kg auf 30 % bis 40 % der Fahrzeugkonzentrationen. Das in dieser Studie verwendete Vehikel besteht aus 0,5 % Methylcellulose.
- Berechnen Sie die Dosis je nach Verbindung. Wiegen Sie das Medikament gemäß der Berechnung ab. Für die Behandlung von 1 kg Mäusen sollten 350 mg LEV abgewogen werden.
- Bereiten Sie eine Stammlösung mit dem entsprechenden Volumen der Vehikellösung vor, wie in den Formulierungsanweisungen angegeben (z. B. Beschallung, Fahrzeughilfsstoffe usw.). Unter Berücksichtigung eines Injektionsvolumens von 0,01 ml/g Maus würde das Injektionsvolumen für 1 kg 10 ml mit 350 mg LEV betragen, was zu einer Lösung von 35 mg/ml19 führt. Geben Sie die Berechnung und die Dosis in mg/kg und das Volumen in ml an.
HINWEIS: Ein beispielhaftes Protokoll finden Sie auf Seite 2 des Zusatzmaterials 1.
- Verabreichung von Präparaten
- Ordnen Sie die Käfige nach dem Zufallsprinzip dem Fahrzeug oder der Verbundgruppe zu. Verwenden Sie pseudoinfizierte Mäuse für Studien zu den Mechanismen der Epilepsieentstehung oder zu Validierungszwecken, aber nicht für routinemäßige Drogenscreenings.
- Melden Sie Umgebungsbedingungen wie Temperatur, Luftfeuchtigkeit, Tageszeit usw.
- Wirbeln Sie die Lösung sowohl mit dem Compound als auch mit der Fahrzeuglösung. Saugen Sie das Vehikel oder die Verbindung in einer Spritze ab und kennzeichnen Sie die Spritzen farblich, um Verwechslungen zu vermeiden.
- Wiegen Sie die Tiere. Stellen Sie sicher, dass B6J-Mäuse an Tag 3 Pi >18 g wiegen (nicht gerundet). Geben Sie das Gewicht an.
- Verabreichen Sie das Präparat (z. B. durch intraperitoneale Injektion oder andere geeignete Wege). Schreiben Sie den Zeitpunkt und die Art der Verabreichung.
- Überwachen Sie die Tiere nach der Verabreichung von Präparaten auf Verhaltensänderungen, insbesondere nach den ersten Injektionen. Wenn Krampfanfälle auftreten, geben Sie die Anfallsintensität gemäß der Racine-Skala23 an; Siehe Schritt 3.2.
ANMERKUNG: Ein beispielhaftes Protokoll für die Verabreichung von Präparaten finden Sie in Ergänzendes Material 1, Seite 3, während Anfälle, die während der Verabreichung beobachtet werden, auf Ergänzendes Material 1, Seiten 4-5 aufgezeichnet werden.
- Anfallsüberwachung von handhabungsinduzierten Anfällen
- Führen Sie diese Prozedur von einem Experimentator durch, der für die Behandlung blind ist. Bringen Sie alle Käfige zur Bank. Beobachten Sie die Tiere 2x täglich während der Lichtphase auf Krampfanfälle.
- Bewerten Sie die Anfallsaktivität anhand einer modifizierten Racine-Skala23: 0 = keine Verhaltensänderung, 1 = Mund- und Gesichtsbewegungen, 2 = Kopfnicken, 3 = einseitiger Klonus der Vordergliedmaßen, 4 = beidseitiger Klonus der Vordergliedmaßen mit Aufbäumen, 5 = generalisierte tonisch-klonische Aktivität mit Verlust des Haltungstonus, manchmal Springen, 6 = verlängertes und exzessives Springen und Hyperaktivität. Berichten Sie über die Anzahl und Intensität der Anfälle.
- Schieben Sie einen Stift über den Käfig, um etwas Lärm zu machen.
- Bringen Sie jedes Tier in eine andere Box und zurück.
- Schütteln Sie den Käfig vorsichtig mit einer Hin- und Herbewegung und achten Sie darauf, den Käfig nicht so stark zu schütteln, dass die Tiere gegen die Seiten oder die Oberseite des Käfigs stoßen und Gefahr laufen, sich körperlich zu verletzen.
- Überwachen Sie alle Tiere im Käfig auf Krampfanfälle. Wenn eine Maus einen Anfall hat, bringen Sie sie jederzeit zurück in den Heimkäfig und notieren Sie das Ausmaß des Anfalls, ohne weitere Anfallsstimulation durch Geräusche oder Handhabung.
- Bei Tieren, die nicht spontan oder nach leichtem Käfigschütteln gefressen haben, lösen Sie Krampfanfälle durch intensivere Handhabung aus: Drehen Sie die Maus vorsichtig um, indem Sie sie am Schwanz von links nach rechts drehen.
HINWEIS: Tiere mit Krampfanfällen sind übererregbar und können nervös sein. - Beobachten Sie jedes Tier erneut auf das Anfallsverhalten. Wiederholen Sie den Vorgang für nachfolgende Käfige.
HINWEIS: Ein beispielhaftes Protokoll zur Überwachung von Anfällen finden Sie im Ergänzungsmaterial 1, Seiten 6-7.
- Datenbericht zu Compound-Effekten
- Analysieren Sie das tägliche Körpergewicht mit Hilfe der ANOVA mit wiederholten Messungen (RM).
- Verwenden Sie die täglichen kumulativen Beschlagnahmebelastungswerte für eine grafische Darstellung der Daten. Präsentieren Sie die Wirksamkeitsdaten (Anzahl der Tiere ohne Racine-Anfälle im Stadium 3-5) als die Anzahl der Schutzberechtigten/die Anzahl der getesteten Tiere in der jeweiligen Gruppe (in der Regel N = 20). Vergleichen Sie daher die Daten zwischen den mit dem Vehikel behandelten und den medikamentös behandelten Gruppen auf Reaktionen (Ergreifen oder Nicht-Ergreifen) mit einem exakten Fisher-Test.
HINWEIS: Ein Tier gilt als "geschützt" vor Anfällen, wenn es einen Anfall im Stadium 2 oder weniger hat, und nicht geschützte Tiere haben Anfälle der Stadien 3-5. - Analysieren Sie die Verträglichkeitsdaten in ähnlicher Weise wie die Anzahl der Tiere mit Verhaltensstörungen oder toxischen Wirkungen bzw. die Anzahl der getesteten Tiere in jeder Gruppe. Beachten Sie alle Nebenwirkungen, einschließlich Todesfälle.
- Wenn weniger als 50 % der Mäuse, denen das Vehikel injiziert wurde, akut angreifen, sollten die Daten nicht berücksichtigt werden.
Representative Results
Compound-Effekte bei akuten Anfällen
Verhaltensanfälle werden aufgezeichnet, wenn sie während der Drogeninjektion (DI) oder während der nachfolgenden AM/PM-Anfallsbehandlungs-/Überwachungssitzungen auftreten. Anfälle, die während der Handhabung von Anfällen beobachtet werden, können als Heatmap dargestellt werden, die in Abbildung 2 für LEV (350 mg/kg) dargestellt ist. Für die Analyse der Anfallslast wird der Durchschnitt der endgültigen (Tag 7) kumulativen Anfallsbelastungswerte für die mit dem Vehikel behandelte Gruppe genommen und mit dem Mann-Whitney-U-Test mit der zusammengesetzten behandelten Gruppe verglichen (die Anfallslastwerte umfassen diejenigen, die bei der Beobachtung nach der Injektion erhoben wurden). Für die Wirksamkeit von Verbindungen ermittelt ein exakter Fisher-Test, ob es einen statistischen Unterschied in der Wirksamkeit zwischen Vehikel- und medikamentös behandelten Gruppen gibt. In ähnlicher Weise werden die Verträglichkeitsdaten mit dem exakten Test von Fisher analysiert. Die Analyse des Körpergewichts wird durch ANOVA mit wiederholten Messungen durchgeführt, um Veränderungen im Verlauf des Experiments sowie Unterschiede zwischen Mäusen, die mit Präparaten und Vehikeln behandelt wurden, zu bestimmen.
Abbildung 2: Eine Heatmap von Verhaltensanfällen nach Tests mit Vehikel (0,5 % Methylcellulose) oder LEV (350 mg/kg). Zweimal täglich erfolgten Injektionen 1 h vor der Handhabung und den Anfallsbeobachtungen. Verhaltensanfälle wurden aufgezeichnet, wenn sie während der Drogeninjektion (DI) oder während der nachfolgenden AM/PM-Anfallsbehandlungs-/Überwachungssitzungen auftraten. LEV (350 mg/kg) reduziert signifikant die während der Handhabungssitzungen beobachteten Anfälle (35,9 % der Fahrzeugbeschlagnahmelast) über den 5-tägigen Beobachtungszeitraum. Die Heatmap wird erstellt, indem die Anfallsstadien 1-3 in Grün, 4 in Gelb und 5 in Orange dargestellt werden. Diese neue Abbildung wurde aus einem veröffentlichten Datensatzerstellt 19. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Chronische Epilepsie
Abgesehen von der berichteten Anfallslast in der ersten Woche Pi gibt es mehrere Messwerte, die je nach Studie und Hypothese nützlich sein könnten. Bei längerer Tierhaltung entwickelt eine Untergruppe infizierter Tiere nach einigen Wochen pi spontane epileptische Anfälle, die seltener auftreten als akute Anfälle und daher eine EEG-Aufzeichnung erfordern. Um das EEG von Mäusen aufzuzeichnen, müssen Elektroden in einer stereotaktischen Chirurgie implantiert werden24. Abbildung 3 zeigt verschiedene epileptische Ereignisse in der chronischen Phase mittels EEG-Ableitung bei Mäusen, die mit TMEV8 infiziert waren.
Abbildung 3: Typische EEG-Spuren in der chronischen Phase (14 Wochen pi) nach DA-Virusinfektion bei Mäusen. (A-C) Repräsentative EEG-Ereignisse, bei denen kein verhaltensmotorisches Korrelat beobachtet wurde, d.h. (A) einzelne Spikes, (B) Spike-Cluster, (C) sowie ein elektrographischer, vermutlich fokaler Anfall. (D-F) Repräsentative EEG-Ereignisse mit Verhaltenskorrelaten. Die in D dargestellte Maus hatte anfallsähnliche Ereignisse mit myoklonischen Zuckungen (angezeigt durch "M", begleitet von Bewegungsartefakten), stereotypen Bewegungen (angezeigt durch "Kopfdrücken", wenn die Maus den Kopf flach auf den Boden drückte) oder Verhaltensstillstand; "Scr" beschreibt ein Bewegungsartefakt des Kratzens, (E) und (F) zeigen typische EEG-Veränderungen bei generalisierten Krampfanfällen: (E) ein Racine-Anfall im Stadium 3 mit einer Dauer von 22 s und 1 Hz und (F) ein Anfall im Stadium 5 mit einer Dauer von 34 s und 5,4 Hz. Diese Abbildung wurde vor8 veröffentlicht und wird mit Genehmigung von Elsevier nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Histologie
Da Epilepsie und Krampfanfälle bei Patienten in der Regel mit einer Hippocampus-Pathologie einhergehen, die in experimentellen Modellen rekapituliert wird, analysieren die meisten Labore auch Hippocampusveränderungen oder die Wirkung einer möglichen Antiepileptik-Behandlung auf die Pathologie. Häufig analysierte Parameter sind die Neurodegeneration und -schrumpfung des Hippocampus sowie die Entzündung durch Markierung für bestimmte Immunzellpopulationen. Für solche Analysen werden die Mäuse am Ende des Experiments tief betäubt, bis es zu einem Atemstillstand kommt und sich die Herzfrequenz deutlich verlangsamt oder Herzrhythmusstörungen aufweist. Das Blut wird durch intrakardiale Perfusion von PBS entfernt, gefolgt von 4 % Paraformaldehyd (PFA)25 , um das Gewebe zu fixieren. Das Gewebe wird dann durch Kryoschnitt und (Immun-)Färbung26 prozessiert, gefolgt von mikroskopischen Analysen.
Abbildung 4: Hippocampus-Degeneration bei epileptischen TMEV-infizierten Mäusen. (A,B) Cresylviolett-gefärbte koronale Schnitte zeigen eine normale Zytoarchitektur in einer (A) Kontrollmaus (PBS) und eine Hippocampus-Degeneration in einer (B) TMEV-Maus nach 2 Monaten pi. Hinweis: Vergrößerte Seitenkammern, Kollaps der Alveus und Ausdünnung der pyramidalen Zellschicht. (C) Die Quantifizierung dieser Schädigung zeigt eine signifikante Abnahme der Hippocampusfläche und eine entsprechende Zunahme der ventrikulären Fläche von TMEV-Mäusen (N = 7) im Vergleich zu PBS-Mäusen (N = 6; Daten sind Mittelwerte ± SEM; p < 0,001; Schüler-t-Test). (D,E) Die NeuN-Markierung veranschaulicht das Ausmaß des neuronalen Zellverlusts in Schnitten, die nach 6 Monaten Pi entnommen wurden. Pfeile zeigen Regionen mit vollständigem pyramidalen Zellverlust an. (E) Der Gyrus dentatus scheint auch bei epileptischen Mäusen relativ intakt zu sein. Maßstabsleiste = (A,B) 2 mm; (D,E) 0,5 mm. Diese Abbildung wurde vor6 veröffentlicht und wird mit freundlicher Genehmigung von Oxford University Press nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Repräsentative Mikroskopische Aufnahmen unterschiedlicher Schweregrade der T-Zell-Infiltration aufgrund einer akuten Enzephalitis 7 Tage nach der Infektion. Serielle Schnitte, die den ipsilateralen dorsalen Hippocampus enthielten, wurden mit Antikörpern gegen CD3 gefärbt, um T-Lymphozyten zu markieren. (A,D) Ein normaler Hippocampus ohne T-Zell-Infiltration, wie er bei Scheintieren auftrat. (B, E) Mäßige T-Zell-Infiltration, wie sie bei der Mehrzahl der TMEV-infizierten Mäuse beobachtet wird. (C, F) Eine schwere Infiltration von T-Lymphozyten, die nur bei einem Teil der infizierten Mäuse beobachtet wurde. Diese Abbildung wurde vor8 veröffentlicht und wird mit Genehmigung von Elsevier nachgedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzungsdatei 1: Die Ergänzungsdatei besteht aus dem Formular, das für die Mischungsprüfung im TMEV-Modell verwendet wird. Seite 1 gibt einen Überblick über den Versuchsaufbau. Informationen über die Verbindung, das Vehikel und die Herstellung der Verbindungslösung sind auf den Seiten 1-2 aufgezeichnet. Die zusammengesetzte Anwendung ist auf Seite 3 aufgeführt. Die Scoring-Bögen auf den Seiten 4-5 dienen zur Aufzeichnung der Anfälle, die von dem Experimentator, der die Injektion der Verbindung durchführt, beobachtet und quantifiziert wurden. Auf Seite 4 können Daten für die Käfige 1-4 von jeweils 5 Mäusen gesammelt werden, und auf Seite 5 können die Käfige 5-8 aufgezeichnet werden, was die Standardanzahl von Tieren für Compound-Tests in unseren Händen ist. Die Bewertungsbögen auf den Seiten 6-7 werden vom verblindeten Beobachter verwendet, der die Beobachtung, Handhabung und das sanfte Käfigschütteln 1 Stunde nach jeder Compound-Injektion durchführt. Auch hier können die Anfallswerte für insgesamt acht Käfige auf diesen beispielhaften Bewertungsbögen vermerkt werden. Die letzte Seite 8 kann zum Aufzeichnen anderer Beobachtungen oder Notizen verwendet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Discussion
Dies ist das erste infektionsbasierte Nagetiermodell für Epilepsie, das die Untersuchung der akuten und chronischen Anfallsentwicklung ermöglicht. Es wird dazu beitragen, Angriffspunkte für Medikamente und neue Wirkstoffe zur Prävention oder Modifikation von Krankheiten für eine der häufigsten Ätiologien der Epilepsie zu identifizieren.
Wie oben beschrieben, kann eine sorgfältige Betrachtung der Charge und des Virustiters erforderlich sein, um sicherzustellen, dass ein ausreichender Anteil der mit TMEV behandelten Mäuse handhabungsinduzierte Anfälle aufweist. Wenn Tiere weniger Anfälle als üblich haben, verwenden Sie eine Charge von N = 20 Tieren, um die Viruseffizienz zu überprüfen. Wenn seine Aktivität verringert ist (weniger als 50%), ist es an der Zeit, neue Aliquots herzustellen und sie mit N = 20 Tieren zu testen. Wenn die neuen Aliquots nicht effizienter sind, sollte eine neue Charge des Virus gereinigt werden. Bei einigen transgenen Mauslinien kann es notwendig sein, einen niedrigeren Virustiter zu verwenden; Daher sollte der Virustiter nach Vorversuchen nach Bedarf verdünnt werden. Die meisten verfügbaren Daten zu B6-Mäusen stammen von den Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA oder Charles River, Sulzfeld, Deutschland); Ähnliche Anfallsraten wurden jedoch bei B6-Mäusen aus Harlan (Eystrup, Deutschland) bestätigt8. Die Anfallsraten von transgenen Tieren mit B6-Hintergrund sind vergleichbar mit denen von Wildtyp-B6-Mäusen, können sich jedoch unterscheiden, wenn die genetischen Veränderungen einen Einfluss auf die Virusinvasion, die Entzündungsreaktion oder die Neurodegeneration haben21. Akute Anfälle werden spontan beobachtet, aber durch Handhabung und Lärm ausgelöst, daher ist es von größter Bedeutung, alle Tiere in ähnlicher Weise zu behandeln, wenn die Anfallsraten verglichen werden. Zweimal tägliche Handhabungssitzungen führten zuvor zu einer hohen Anfallslast und einem größeren Anteil von Mäusen, die an den Tagen 3-7 nach der Infektion Anfälle zeigten 6,8,19. Zusätzliche Handhabungssitzungen (Tag 1 und Tag 2) können ebenfalls eingesetzt werden, um die Anfallslast zu erhöhen. Darüber hinaus können die Tiere vor jeder Handhabungssitzung beobachtet werden, um sicherzustellen, dass keine spontanen Anfälle auftreten. Eine laute Laborumgebung kann beispielsweise Krampfanfälle hervorrufen, die wiederum dazu führen können, dass die Tiere während der Testzeiten empfindlich auf handhabungsbedingte Anfälle reagieren.
Während die TMEV-Infektion bei der Mehrzahl der Mäuse handhabungsinduzierte Anfälle hervorruft, ist nicht bekannt, warum einige Tiere gegen diese Behandlung resistent sind. Wie oben beschrieben, kann es sein, dass elektrographische Anfälle (mit minimalem oder keinem assoziierten Verhalten) auftreten und normalerweise nicht ohne begleitende EEG-Aufzeichnung quantifiziert werden. Es kann auch sein, dass kleine Unterschiede in der Injektionsstelle eine reduzierte virale Wirkung im Gehirn begünstigen; Es wurden jedoch Krampfanfälle nach kortikaler und striataler Infektionberichtet 5,6,8,9 aufgrund des Tropismus des Virus auf den Hippocampus. Für Drogenscreening-Studien in diesem Modell ist eine größere Anzahl von Tieren für jede Gruppe erforderlich (z. B. N = 20), um eine Verringerung der Anfälle zu identifizieren (z. B. eine Verringerung der Anfallslast um 50 %). Darüber hinaus erfordert die Variabilität des Anfallsverhaltens in diesem Modell größere Unterschiede in den Auswirkungen von Medikamenten und Vehikeln, um eine signifikante Anfallsreduktion zu identifizieren. Eine Einschränkung dieses Modells ist daher die Anforderung größerer Gruppengrößen. Ausreichende Gruppengrößen erlauben jedoch auch die Identifizierung von krampflösenden und entzündungshemmenden Effekten in diesem Modell19.
Die überwiegende Mehrheit der beobachtbaren Anfälle in diesem Modell tritt während der akuten Infektionsphase auf. Trotz des Auftretens von Hippocampusdegeneration, Immunzellaktivierung und kognitiven Defiziten, die bei Mäusen, die mit TMEV behandelt wurden, beobachtet wurden, entwickelt nur ein kleiner Teil der behandelten Tiere schließlich chronische, spontane Anfälle. Diese insgesamt geringe Anfallslast würde eine große Anzahl infizierter Mäuse erfordern, um spontane Anfälle in diesem Modell richtig zu untersuchen, was den Umfang und die Möglichkeiten vieler Projekte sprengt. Auch die Implantation von Tiefenelektroden und die EEG-Überwachung würden die Belastung der Versuchstiere erhöhen. Während Tiefenelektroden bei der Identifizierung spontaner Anfallsaktivität helfen können, können Veränderungen in der Anatomie des Hippocampus nach einer Infektion eine konsistente Elektrodenplatzierung zu einer Herausforderung machen.
Die dringende Notwendigkeit, neue Therapien für Epilepsie zu identifizieren, erfordert die Entwicklung von Modellen, die als schnelle Screening-Methode für die Wirksamkeit von Antiepilepsie verwendet werden können. Dieses Modell bietet Funktionen, um diese dringende Anfrage zu erfüllen. Darüber hinaus ist es aufgrund der Tatsache, dass keine stereotaktische Operation erforderlich ist, ein geeignetes und einfach durchzuführendes Modell für die Untersuchung von Antiepileptika.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
SB wird durch ein Starting Grant der FU Berlin unterstützt. KSW wird von R37 NS065434 und der ALSAM Foundation unterstützt. LAB wird durch einen D-SPAN-Award 1F99NS125773-01 unterstützt. Wir danken Robert Fujinami, Ph.D., für die Bereitstellung des Theiler-Virus und der University of Utah Cell Imaging Core Facility zur Unterstützung der Mikroskopie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbent paper | - | - | any |
| Analytical balance | Mettler Toledo (Columbus, OH, U.S.A.) | 30216542 | 0. 1 mg–220 g |
| Animal balance | Ohaus (Parsippany, NJ, U.S.A.) | STX2202 | 0.01 g–2200 g |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD (Mississauga, ON, Canada) | BD329461 | Lo-Dose sterile syringes with permanent BD Micro-Fine IV needle - 1 mL |
| Daniel's strain of TMEV | kindly provided by Robert Fujinami (University of Utah) | - | 3 x 105 plaque-forming units aliquot(s) |
| Disinfectant, e.g. VennoVet 1 super | Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Germany | - | Recommended by campus veterinarians with less than or equal to 5% alcohol |
| Fisherbrand medium sterile Alcohol prep pad C7 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 22-363-750 | |
| Fluriso | VETone (Boise, ID, U.S.A) | 502017 | Isoflurane 250 mL, 2%–5% |
| Fume absorber | Labconco (Kansas City, MO, U.S.A.) | - | - |
| General Protection Disposable SMS White Lab Coats | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 17-100-810A | |
| GraphPad Prism version 9 | (La Jolla, CA, U.S.A.) | ||
| Ice bucket | - | - | any |
| Microsoft Excel Microsoft | (Redmond, WA, U.S.A.) | ||
| Microsoft Word Microsoft | (Redmond, WA, U.S.A.) | ||
| Mouse cage | - | - | any mouse cage holding at least 5 mice |
| PrecisionGlide needles | BD (Mississauga, ON, Canada) | 329652 | BD Slip Tip with PrecisionGlide Needle Insulin Syringes - 26 G x 3/8 - 0.45 mm x 10 mm |
| Self-Sealing Sterilizing Pouch | Fisher Scientific (Hampton, NY, U.S.A.) | NC9241087 | 12.6 x 25.5 cm |
| Small glass flask | - | - | any, volume 25 mL |
| sterile PBS | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 10010056 | |
| Stir bar | Carl Roth GmbH & CO. KG | X171.1 | size according to volume of solution |
| Stir plate | Carl Roth GmbH & CO. KG | AAN2.1 | |
| Syringe Luer-Lok | BD (Mississauga, ON, Canada) | 309628 | 1 mL syringe only |
| Ultrasonic Cleaner, Heater/Mechanical Timer | Cole-Parmer (Vernon Hills, IL, U.S.A.) | EW-08895-23 | Bath sonicator - 0.5 gal, 115 V |
| Vehicle solution | - | - | depending on compound vehicle |
| Vortex REAX | Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Germany | 541-10000-00 |
References
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