Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En model for epilepsi af infektiøs ætiologi ved hjælp af Theilers murin encephalomyelitis virus

Published: June 23, 2022 doi: 10.3791/63673
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 3, 1,2, 3
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Utah, 2Interdepartmental Program in Neuroscience, University of Utah, 3Faculty of Veterinary Medicine, Institute of Pharmacology and Toxicology, Freie Universität Berlin

Summary

Intracerebral infektion med Theilers murine encephalomyelitis virus (TMEV) i C57BL/6 mus replikerer mange af de tidlige og kroniske kliniske symptomer på viral encephalitis og efterfølgende epilepsi hos humane patienter. Dette papir beskriver virusinfektion, symptomer og histopatologi af TMEV-modellen.

Abstract

En af hovedårsagerne til epilepsi er en infektion i centralnervesystemet (CNS); Ca. 8% af patienterne, der overlever en sådan infektion, udvikler epilepsi som følge heraf, idet satserne er signifikant højere i mindre økonomisk udviklede lande. Dette arbejde giver et overblik over modellering af epilepsi af infektiøs ætiologi og brug af det som en platform for ny antibeslaglæggelsesforbindelse. En protokol for epilepsiinduktion ved ikke-stereotaktisk intracerebral injektion af Theilers murine encephalomyelitis virus (TMEV) i C57BL/6-mus præsenteres, som replikerer mange af de tidlige og kroniske kliniske symptomer på viral encefalitis og efterfølgende epilepsi hos humane patienter. Den kliniske evaluering af mus under encephalitis for at overvåge anfaldsaktivitet og detektere de potentielle antibeslaglæggelsesvirkninger af nye forbindelser beskrives. Desuden vises histopatologiske konsekvenser af viral encephalitis og anfald såsom hippocampal skade og neuroinflammation såvel som langsigtede konsekvenser såsom spontane epileptiske anfald. TMEV-modellen er en af de første translationelle, infektionsdrevne, eksperimentelle platforme, der gør det muligt at undersøge mekanismerne for epilepsiudvikling som følge af CNS-infektion. Det tjener således også til at identificere potentielle terapeutiske mål og forbindelser til patienter med risiko for at udvikle epilepsi efter en CNS-infektion.

Introduction

En af de hyppige konsekvenser af viral encephalitis er epileptiske anfald. Mange virusinfektioner udløser symptomatiske anfald i den akutte fase af infektionen; Risikoen for sådanne beslaglæggelser øges med over 20% blandt befolkningen 1,2,3. Patienter, der overlever infektionen, har også en øget risiko på 4%-20% for at udvikle kronisk epilepsi i månederne til årene efter infektion 1,4. Theilers murin encephalomyelitis virus (TMEV) er blevet identificeret som en egnet virus til at studere akutte og kroniske anfald i en musemodel af viral encephalitis 5,6,7. TMEV er en ikke-indhyllet, positiv-sense, enkeltstrenget RNA-virus af Picornaviridae-familien og er traditionelt blevet brugt til at studere demyelinering i rygmarven hos SJL-mus, som C57BL/6 (B6) mus er beskyttet mod, fordi de har evnen til at rydde virussen hurtigt efter infektion. TMEV inducerer imidlertid akutte anfald hos 50%-75% af mandlige og kvindelige B6-mus inden for den første uge efter infektion (pi), mens ca. 25%-40% udvikler kronisk epilepsi uger til måneder pi 2,5,6,8,9. Bortset fra anfald viser musene også den fælles histopatologi af en epileptisk hippocampus med neurodegeneration og gliose 5,6,8,10,11,12. Desuden klarer TMEV-inficerede B6-mus sig signifikant dårligere i adfærdstest for læring og hukommelse og har kognitiv komorbiditet, hvilket også ses hos kliniske patienter med epilepsi13,14,15.

Traditionelt bruger modeller af epilepsi og anfald enten anvendelse af kemokonvulsive stoffer eller elektrisk stimulering til at fremkalde anfald; Disse modeller mangler imidlertid konstruktionsvaliditet og viser ofte mere alvorlige anfald og hjerneskade, end det ses hos kliniske patienter16. Der er ingen model, der passer til ethvert forskningsspørgsmål17. Brug af TMEV-modellen er især interessant, hvis de disponerende faktorer for anfaldsudvikling efter en infektion i CNS undersøges, eller hvis forbindelser screenes for deres antibeslaglæggelseseffektivitet.

Siden TMEV-modellen er blevet etableret og brugt på tværs af flere forskellige laboratorier internationalt, har forfatterne identificeret mange detaljer, der muliggør en vellykket implementering af modellen, f.eks. specificiteten af forskellige virus- og musestammer. Den mest pålidelige anfaldsinduktion blev genereret med Daniels stamme af TMEV- og B6J-mus 2,5,6,8,9. Modellen bruges i øjeblikket af National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) som en platform til at identificere nye lægemidler mod epilepsi og anfald18,19. Dette papir indeholder den detaljerede protokol for virusinduktion og klinisk overvågning for at give andre forskere mulighed for at udnytte denne model af viral encephalitis til at fremme forståelsen af sygdomsmekanismerne såvel som til lægemiddeltestning.

Følgende protokol afspejler en undersøgelse designet til sammensat test i denne model, selvom mange andre typer undersøgelser kan udføres. Mus bedøves kort før injektion med Daniels stamme af TMEV i den tidsmæssige region af højre halvkugle (bageste og mediale til højre øje). Afhængigt af forskningsspørgsmålet, hvis ikke-inficerede kontroldyr er påkrævet, modtager mus sterilt fosfatbufret saltvand (PBS, pH 7,4, inklusive KH 2 PO 4 [1,06 mM], NaCl [155,17 mM] og Na 2 HPO4 · 7H 2 O [2,97mM]) i stedetfor TMEV. Tidligere erfaringer med TMEV-inficerede mus har indikeret, at håndteringsinducerede anfald forekommer mellem dag 3 og dag 7 efter infektion. Hyppigheden af injektionen, ruten og tidspunktet for testning af eksperimentelle forbindelser varierer alt efter deres egenskaber. Det anbefales at udføre viruspodningen på en fredag, hvilket gør det muligt for dag 3-7 anfaldsovervågning at ske den følgende uge, mandag-fredag. I løbet af anfaldsovervågningsugen kan eksperimentelle forbindelser administreres (i.p.) to gange dagligt (mindst 4 timer fra hinanden), medmindre andet er foreslået af forbindelsens kinetik eller virkningsmekanisme. Anfaldsovervågning under behandlingen kan udføres på et tidligere bestemt tidspunkt. Injektions- og observationstider varierer afhængigt af individuelle forbindelser. Dyr injiceres med testforbindelsen eller med et køretøj i stedet for lægemiddelforbindelsen. Disse to grupper kan håndteres og observeres analogt med den eksperimentelle gruppe. Under forsøget skal den ene person, der håndterer musene og scorer anfaldene, blindes for behandlingen.

Protocol

Alle beskrevne procedurer blev godkendt af de respektive myndigheder. Dyr holdes efter anbefalingerne i "Guide for Care and Use of Laboratory Animals" (National Research Council) og i overensstemmelse med Public Health Service-politikken og Institutional Animal Care and Use Committee ved University of Utah, dyreprotokol (nummer: 21-11009, Institut for Farmakologi og Toksikologi) og ved Freie Universität Berlin (protokol: G0015/21, LAGeSo Berlin, Institut for Farmakologi og Toksikologi), henholdsvis. Resultaterne vist i figur 3 og figur 5 blev godkendt under 33.9-42502-04-11/0516 og 33.9-42502-04-15/1892 (LAVES Oldenburg, Institut for Farmakologi, Toksikologi og Farmaci, University of Veterinary Medicine Hannover).

1. Overvejelser og forberedelser til udformningen af undersøgelsen

  1. Virus
    1. Daniels stamme af TMEV blev venligst leveret af Robert Fujinami fra University of Utah. Oprindeligt blev den isoleret fra en mus i Harvard-kolonien20. Se den specifikke klassificering og regler for biologiske agenser i de respektive lande, før du håndterer TMEV, og diskuter med det institutionelle biosikkerhedspersonale for at sikre overholdelse af reglerne. TMEV klassificeres typisk som BSL 2, afhængigt af stammen og genetiske modifikationer. Standarddosis, der er nødvendig for at fremkalde anfald hos et flertal af dyrene, er 3 x 105 plakdannende enheder (PFU).
      BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at tilpasse dosis, f.eks. hvis der anvendes transgene mus. Samlet set er titere mellem 2 x 104 PFU og 2,44 x 107 PFU blevet brugt til med succes at fremkalde anfald. Kontroldyr modtager steril PBS og oplever ikke anfald. Virussen inficerer ikke mennesker; PPE (laboratoriefrakke, handsker, sikkerhedsbriller) bør dog altid bæres af eksperimenter, og musekroppe og strøelse bør autoklaveres inden bortskaffelse.
  2. Dyr
    1. Til at fremkalde og undersøge anfald skal du bruge B6J-mus, da andre musestammer ikke nødvendigvis viser anfald, f.eks. SJL / J, FVB / N eller Balb / c-mus5. Der er ingen forskel mellem hun- og hanmus i akut anfaldsfrekvens5. Udfør forsøgene på unge til voksne mus (startende ved 5-6 uger).
  3. Diæt
    1. Kost er blevet bestemt som en kilde til lab-til-lab variabilitet i sygdommens sværhedsgrad; Overvej derfor kosten som en potentiel faktor for variation22.
  4. Gruppens størrelse
    1. Da ikke alle dyr udvikler akutte eller kroniske anfald i denne model, skal du bruge ca. 20 mus / gruppe til sammensat testning.
  5. Dyrevelfærd
    1. Hvis en mus viser signifikante bivirkninger fra infektion eller administration af forsøgsstoffet (f.eks. sløvhed, dårlig pleje, overdreven rødme og purulent udflåd fra såret) efter en observationstid bestemt af de lokale IACUC-retningslinjer (f.eks. 48 timer), skal musen aflives humant.
    2. Aflive enhver mus, der demonstrerer ekstremt vægttab (>20%) i infektionsperioden humant.
    3. Hvis dyr ikke spiser ordentligt, skal du give dem adgang til supplerende pellets fugtet med pædiatrisk elektrolytopløsning eller lignende.

2. Virus podning

  1. Sterilisering af injektionssprøjten
    1. Fjern hætten på insulinsprøjten. Tilføj polyethylenslange som krave rundt om nålen for at sikre en tilstrækkelig injektionsdybde på 2,5 mm. Nedsænk sprøjten i ethanol i 30 min. Anbring sprøjten under UV-lys i 30 min.
    2. Sæt hætten tilbage på nålen. Pak sprøjten ind i en steriliserende pose og tape den lukket. Etiket med fremstillingsdato.
  2. Virus injektion
    1. Få alikvoter af Daniels stamme af TMEV fra -80 °C fryseren. Optø virussen og hold den på is. Undgå optøning og genfrysning af virussen. Fyld sprøjten med virussuspensionen (3 x 105 PFU fortyndet i 20 μL PBS eller DMEM dyrkningsmedium).
      FORSIGTIG: Virussen er smitsom for mus, men ikke for mennesker.
    2. Rengør bænken med desinfektionsmiddel og arbejd under en røgabsorber. Viruspodning er ikke steril, men er så ren som muligt.
    3. Overfør musen til anæstesiinduktionskammeret, og brug 2% isofluran i ilt til at inducere anæstesi. At nå kirurgisk tolerance tager et par minutter; Juster koncentrationen baseret på dyrets vejrtrækning og dybde af anæstesi.
    4. Overfør den bedøvede mus fra anæstesiboksen under emhætten. Kontroller kirurgisk tolerance, f.eks. ved tåklemme. Hele proceduren udføres på mindre end 30 s, så dyret behøver ikke at indånde isofluran under injektionen. Tilsæt øjensalve for at forhindre tørring af hornhinden.
    5. Rengør dyrets hoved med en alkoholpude. Vip musens hoved lidt til venstre, så injektionsstedet peger opad.
    6. Træk huden lidt bagud, indsæt nålen i hovedet, og injicer 20 μL intrakortisk til en dybde på 2,5 mm i det tidsmæssige område på højre halvkugle (bageste og mediale til højre øje).
    7. Udfør injektionen ensidigt på samme halvkugle hos alle dyr. Brug øjet og øret som landemærker for placeringen af parietal cortex. Placeringen er tidligere verificeret histologisk; se figur 1. Injektionskoordinater i henhold til stereotaksisk injektion i forhold til bregma er -2,0 (AP); +3,0 (ML); -1,5 (DV).
    8. Lad sprøjten sidde i 5-15 s. Skriv ned, hvis der er lækage fra injektion, eller hvis der ses luftbobler - i så fald skal du forberede en ny sprøjte. Når du forsigtigt trækker sprøjten ud, skal du dreje den lidt. Påfør øjensalve for at forhindre tørhed under anæstesi.
    9. VALGFRIT: Kod dyret på halen eller øret afhængigt af lokale procedurer (valgfrit, men let, da dyret er bevidstløst).
    10. Overfør dyret til et nyt bur, som placeres halvt på/halvt af en varmepude (35-40 °C) under genopretning fra anæstesi. Efterlad ikke dyrene uden opsyn, før de har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystliggende.
      BEMÆRK: Dyr kan gruppehuses igen efter genopretning (inficerede dyr blandes ikke med mock-inficerede dyr). Inficerede mus bør ikke anbringes i samme rum som ikke-inficerede mus.
    11. Hold styr på musenes vægt i de første 7 dage pi, da de taber sig efter infektion og kan kræve yderligere fodring.

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over TMEV-injektionsproceduren. Fra venstre mod højre: For en højre parietal cortex injektion injiceres nålen lidt lateralt af en imaginær linje mellem øjet og det modsatte øre. Kraven til dybdekontrol er angivet med gult. Injektionskanalen kan ses i koronal hjernesektion, markeret med pilen. Injektionsstedet svarer til koordinaterne over pilen. Det højre billede viser fordelingen af Theiler-viruset (violet) inden for CA1 af hippocampalformationen. Figuren blev udarbejdet ved hjælp af biorender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Test af sammensatte

  1. Sammensat præparat
    1. Gennemgå formuleringsvejledningen. Forbered køretøjsløsning i henhold til anbefalinger eller medfølgende instruktioner. Som et eksempel præsenteres proceduren for det antiepileptiske lægemiddel levetiracetam (LEV). LEV reducerer beslaglæggelsesbyrden til 30% -40% af køretøjets niveauer ved en dosis på 350 mg / kg. Det køretøj, der anvendes i denne undersøgelse, er 0,5% methylcellulose.
    2. Beregn doser afhængigt af forbindelsen. Væg lægemidlet ud i henhold til beregningen. Til behandling af 1 kg mus vejes 350 mg LEV.
    3. Forbered en stamopløsning med det passende volumen køretøjsopløsning som anvist i formuleringsinstruktionerne (f.eks. Sonikering, køretøjshjælpestoffer osv.). I betragtning af et injektionsvolumen på 0,01 ml / g mus ville injektionsvolumenet for 1 kg være 10 ml med 350 mg LEV, hvilket resulterer i en opløsning på 35 mg / ml19. Angiv beregningen og dosis i mg/kg og volumen i ml.
      BEMÆRK: En eksemplarisk protokol findes på side 2 i supplerende materiale 1.
  2. Administration af forbindelse
    1. Randomiser bure til køretøjet eller sammensat gruppe. Brug mock-inficerede mus til undersøgelser af mekanismerne for epilepsiudvikling eller til valideringsformål, men ikke til rutinemæssig lægemiddelscreening.
    2. Rapporter miljøforhold såsom temperatur, fugtighed, tidspunkt på dagen osv.
    3. Vortex opløsningen med forbindelsen såvel som køretøjsopløsningen. Opsug køretøjet eller forbindelsen i en sprøjte og farvekode sprøjterne for at forhindre forveksling.
    4. Vej dyrene. Sørg for, at B6J-mus er >18 g på dag 3 pi (ikke afrundet). Rapportér vægten.
    5. Administrer forbindelsen (f.eks. ved intraperitoneal injektion eller andre passende veje). Skriv tid og rute for administration.
    6. Overvåg dyrene for eventuelle adfærdsændringer efter sammensat administration, især efter de første injektioner. Hvis der forekommer anfald, skal anfaldsintensiteten indberettes på Racineskalaen23. Se trin 3.2.
      BEMÆRK: En eksemplarisk protokol for administration af forbindelser findes i Supplerende materiale 1, side 3, mens anfald observeret under administration vil blive registreret på Supplerende materiale 1, side 4-5.
  3. Overvågning af anfald forårsaget af håndtering
    1. Udfør denne procedure af en eksperimentator, der er blindet for behandlingen. Bring alle burene til bænken. Overhold dyrene for anfald 2x dagligt i lysfasen.
    2. Scor anfaldsaktiviteten ved en modificeret Racine-skala23: 0 = ingen ændring i adfærd, 1 = mund- og ansigtsbevægelser, 2 = hovednikkende, 3 = ensidig forbenklonus, 4 = bilateral forbenklonus med opdræt, 5 = generaliseret tonisk-klonisk aktivitet med tab af postural tone, undertiden spring, 6 = langvarig og overdreven spring og hyperaktivitet. Indberet antallet og intensiteten af anfald.
    3. Skub en pen hen over buret for at lave noget støj.
    4. Overfør hvert dyr til en anden kasse og tilbage.
    5. Ryst forsigtigt buret med en bevægelse frem og tilbage, og pas på ikke at ryste buret så kraftigt, at dyrene rammer siderne eller toppen af buret og er i fare for at lide fysisk skade.
    6. Overvåg alle dyr i buret for anfald. Hvis en mus har et anfald, skal du til enhver tid overføre det tilbage til hjemmeburet og notere niveauet af anfaldet uden yderligere anfaldsstimulering ved støj eller håndtering.
    7. For dyr, der ikke har grebet spontant eller efter blid burrystelse, udløser anfald ved mere intens håndtering: Vend forsigtigt musen ved at vende den ved halen fra venstre mod højre.
      BEMÆRK: Dyr med anfald er hyperexcitable og kan være hoppende.
    8. Overhold hvert dyr for anfaldsadfærd igen. Gentag processen for efterfølgende bur.
      BEMÆRK: En eksemplarisk protokol for overvågning af anfald findes i supplerende materiale 1, side 6-7.
  4. Datarapport om sammensatte virkninger
    1. Analyser de daglige kropsvægte ved hjælp af gentagne målinger (RM) ANOVA.
    2. Brug værdierne for den daglige kumulative beslaglæggelsesbyrde til en grafisk repræsentation af dataene. Angiv effektdata (antal dyr uden anfald i fase 3-5 af racin) som antallet af beskyttede/antallet undersøgt i hver enkelt gruppe (normalt N = 20). Sammenlign derfor dataene mellem køretøjs- og narkotikabehandlede grupper for svar (beslaglæggelse eller ikke-beslaglæggelse) ved hjælp af en Fishers nøjagtige test.
      BEMÆRK: Et dyr betragtes som "beskyttet" mod anfald, hvis det har en beslaglæggelse i fase 2 eller mindre, og ikke-beskyttede dyr har anfald i trin 3-5.
    3. Analyser tolerabilitetsdataene på samme måde som antallet af dyr med adfærdsmæssige svækkelser eller toksiske virkninger / antallet testet i hver gruppe. Bemærk eventuelle bivirkninger, herunder dødsfald.
    4. Hvis mindre end 50% af de mus, der injiceres med køretøjet, griber akut, skal du ikke overveje dataene.

Representative Results

Sammensatte virkninger på akutte anfald
Adfærdsmæssige anfald registreres, hvis de opstår under lægemiddelinjektion (DI) eller under de efterfølgende AM / PM beslaglæggelseshåndterings- / overvågningssessioner. Krampeanfald observeret under håndtering af anfald kan præsenteres som et varmekort, som er vist i figur 2 for LEV (350 mg/kg). Til analyse af beslaglæggelsesbyrden tages gennemsnittet af de endelige (dag 7) kumulative anfaldsbyrdeværdier for den vehikelbehandlede gruppe og sammenlignes ved Mann-Whitney U-testen med den sammensatte behandlede gruppe (værdier for anfaldsbyrden omfatter dem, der indsamles ved observationen efter injektion). For sammensat effektivitet bestemmer en Fishers nøjagtige test, om der er en statistisk forskel i effektivitet mellem køretøjs- og lægemiddelbehandlede grupper. På samme måde analyseres tolerabilitetsdata med Fishers nøjagtige test. Kropsvægtanalyse udføres ved hjælp af gentagne målinger ANOVA for at bestemme ændringer i løbet af eksperimentet samt forskelle mellem blandings- og køretøjsbehandlede mus.

Figure 2
Figur 2: Et varmekort over adfærdsmæssige anfald efter test med køretøj (0,5% methylcellulose) eller LEV (350 mg / kg). To gange dagligt injektioner forekom 1 time før håndtering og anfaldsobservationer. Adfærdsmæssige anfald blev registreret, hvis de opstod under lægemiddelinjektion (DI) eller under de efterfølgende AM / PM beslaglæggelseshåndterings- / overvågningssessioner. LEV (350 mg/kg) reducerer signifikant anfald observeret under håndteringssessioner (35,9 % af køretøjsbeslaglæggelsesbyrden) i løbet af observationsperioden på 5 dage. Varmekortet er skabt ved at afbilde anfald trin 1-3 i grønt, 4 i gult og 5 i orange. Denne nye figur blev oprettet ud fra et offentliggjort datasæt19. Klik her for at se en større version af denne figur.

Kronisk epilepsi
Bortset fra den rapporterede anfaldsbyrde i den første uge pi, er der flere aflæsninger, der kan være nyttige afhængigt af undersøgelsen og hypotesen. Hvis dyr holdes på lang sigt, vil en delmængde af inficerede dyr udvikle spontane epileptiske anfald efter flere uger pi, som forekommer sjældnere end akutte anfald og derfor kræver EEG-registrering. For at registrere EEG fra mus skal elektroder implanteres i en stereotaksisk kirurgi24. Figur 3 viser forskellige epileptiske hændelser i den kroniske fase ved EEG-registrering hos mus inficeret med TMEV8.

Figure 3
Figur 3: Typiske EEG-spor i den kroniske fase (14 uger pi) efter DA-virusinfektion hos mus. (A-C) Repræsentative EEG-hændelser, hvor der ikke blev set nogen adfærdsmotorisk korrelat, dvs. (A) enkelte pigge, (B) spikeklynger, (C) samt et elektromagnetisk, formodentlig fokal anfald. (D-F) Repræsentative EEG-begivenheder med adfærdsmæssige korrelater. Musen illustreret i D havde anfaldslignende begivenheder med myokloniske trækninger (angivet med "M", ledsaget af bevægelsesartefakter), stereotype bevægelser (angivet med "hovedtryk", når musen pressede hovedet fladt på jorden) eller adfærdsmæssig anholdelse; "Scr" beskriver en bevægelsesartefakt af ridser, (E) og (F) viser typiske EEG-ændringer under generaliserede konvulsive anfald: (E) et Racine stadium 3-anfald med en varighed på 22 s og 1 Hz og (F) et trin 5-anfald med en varighed på 34 s og 5,4 Hz. Denne figur er offentliggjort før8 og er genoptrykt med tilladelse fra Elsevier. Klik her for at se en større version af denne figur.

Histologi
Da epilepsi og anfald normalt ledsages af hippocampus patologi hos patienter, som rekapituleres i eksperimentelle modeller, analyserer de fleste laboratorier også hippocampale ændringer eller effekten af en potentiel antibeslaglæggelsesbehandling på patologi. Almindeligt analyserede parametre omfatter hippocampus neurodegeneration og krympning samt betændelse ved mærkning for specifikke immuncellepopulationer. Til sådanne analyser bedøves mus i slutningen af eksperimentet dybt, indtil vejrtrækningsstop opstår, og hjertefrekvensen sænkes signifikant eller viser arytmi. Blod fjernes ved intrakardieperfusion af PBS efterfulgt af 4% paraformaldehyd (PFA)25 for at fiksere vævet. Vævet behandles derefter ved kryosektion og (immun-)farvning26 efterfulgt af mikroskopiske analyser.

Figure 4
Figur 4: Hippocampus degeneration i epileptiske TMEV-inficerede mus. (A,B) Cresylvioletfarvede koronale sektioner viser normal cytoarkitektur i en (A) kontrol (PBS) mus og hippocampus degeneration i en (B) TMEV-mus ved 2 måneder pi. Bemærk: Forstørrede laterale ventrikler, sammenbrud af alveus og udtynding af det pyramidale cellelag. (C) Kvantificering af denne skade viser et signifikant fald i hippocampus og en tilsvarende stigning i ventrikelområdet hos TMEV-mus (N = 7) vs. PBS-mus (N = 6; data er gennemsnitlige ± SEM; p < 0,001; Elevens t-test). (D,E) NeuN-mærkning illustrerer yderligere størrelsen af neuronalt celletab i sektioner taget ved 6 måneders pi. Pile angiver regioner med fuldstændigt pyramidalcelletab. (E) Dentate gyrus synes at være relativt intakt selv hos epileptiske mus. Skalastang = (A, B) 2 mm; (D,E) 0,5 mm. Denne figur er offentliggjort før6 og er genoptrykt med tilladelse fra Oxford University Press. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Repræsentative fotomikrografier af forskellig sværhedsgrad af T-celleinfiltration på grund af akut encefalitis 7 dage efter infektion. Serielle sektioner indeholdende den ipsilaterale dorsale hippocampus blev farvet med antistoffer mod CD3 for at mærke T-lymfocytter. (A,D) En normal hippocampus uden T-celleinfiltration, som det så ud hos mock-inficerede dyr. (B, E) Moderat T-celleinfiltration, som det ses hos de fleste TMEV-inficerede mus. (C, F) En alvorlig infiltration af T-lymfocytter, som kun blev set hos nogle af de inficerede mus. Denne figur er offentliggjort før8 og er genoptrykt med tilladelse fra Elsevier. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1: Den supplerende fil består af den formular, der anvendes til sammensatte test i TMEV-modellen. Side 1 giver et overblik over den eksperimentelle opsætning. Oplysninger om præparatet af forbindelsen, køretøjet og den sammensatte opløsning er registreret på side 1-2. Sammensat applikation registreres på side 3. Scoringsarkene på side 4-5 bruges til at registrere de anfald, der observeres og kvantificeres af eksperimentatoren, der udfører den sammensatte injektion. På side 4 kan der indsamles data for bur 1-4 med 5 mus hver, og på side 5 kan bur 5-8 registreres, hvilket er standardantallet af dyr til blandingstest i vores hænder. Scoringsarkene på side 6-7 bruges af den blindede observatør, der udfører observationen, håndteringen og den blide burrystning 1 time efter hver sammensat injektion. Igen kan beslaglæggelsesscorer noteres for otte bure i alt på disse eksemplariske scoreark. Den sidste side 8 kan bruges til at registrere eventuelle andre observationer eller noter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Dette er den første infektionsbaserede gnavermodel for epilepsi, der muliggør undersøgelse af akut og kronisk anfaldsudvikling. Det vil hjælpe med at identificere lægemiddelmål og nye forbindelser til sygdomsforebyggelse eller modifikation for en af de mest almindelige ætiologier af epilepsi.

Som beskrevet ovenfor kan det være nødvendigt nøje at overveje batchen og virustiteren for at sikre, at en tilstrækkelig andel af TMEV-behandlede mus udviser håndteringsinducerede anfald. Hvis dyr har færre anfald end normalt, skal du bruge et parti N = 20 dyr for at kontrollere viruseffektiviteten. Hvis aktiviteten er nedsat (mindre end 50%), er det tid til at lave nye alikvoter og teste dem med N = 20 dyr. Hvis de nye delprøver ikke er mere effektive, bør et nyt parti af virusset renses. For nogle transgene muselinjer kan det være nødvendigt at bruge en lavere viral titer; Derfor bør den virale titer fortyndes efter behov efter indledende forsøg. De fleste tilgængelige data om B6-mus stammer fra Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, USA eller Charles River, Sulzfeld, Tyskland); lignende anfaldsrater hos B6-mus fra Harlan (Eystrup, Tyskland) er imidlertid blevet bekræftet8. Beslaglæggelsesrater for transgene dyr med B6-baggrund kan sammenlignes med vildtype B6-mus, men kan variere, hvis de genetiske ændringer har indflydelse på virusinvasion, inflammatorisk respons eller neurodegeneration21. Akutte anfald observeres spontant, men udløses af håndtering og støj, så det er yderst vigtigt at håndtere alle dyr på samme måde, når beslaglæggelsesraterne sammenlignes. To gange daglig håndtering har tidligere givet en høj anfaldsbyrde og en større andel af mus, der udviser anfald på dag 3-7 efter infektion 6,8,19. Yderligere håndteringssessioner (dag 1 og dag 2) kan også anvendes til at øge anfaldsbyrden. Desuden kan dyr observeres før hver håndteringssession for at sikre, at spontane anfald ikke forekommer. Et højt laboratoriemiljø kan for eksempel producere anfald, hvilket igen kan gøre dyr ildfaste over for håndteringsinducerede anfald under testtider.

Mens TMEV-infektion producerer håndteringsinducerede anfald hos de fleste mus, er det ukendt, hvorfor nogle dyr er resistente over for denne behandling. Som beskrevet ovenfor kan det være, at elektrografiske anfald (med minimal eller ingen tilknyttet adfærd) forekommer og normalt ikke kvantificeres uden samtidig EEG-optagelse. Det kan også være, at små forskelle i injektionssted letter reduceret viral effekt i hjernen; Imidlertid er anfald blevet rapporteret efter kortikal og striatal infektion 5,6,8,9 på grund af virusets tropisme til hippocampus. For lægemiddelscreeningsundersøgelser i denne model kræves der et større antal dyr for hver gruppe (f.eks. N = 20) for at identificere en reduktion i anfald (f.eks. N = 20). Desuden nødvendiggør variabiliteten i anfaldsadfærd i denne model større forskelle i narkotika vs. køretøjseffekter for at identificere en signifikant anfaldsreduktion. Derfor er en begrænsning ved denne model kravet om større gruppestørrelser. Ikke desto mindre giver tilstrækkelige gruppestørrelser også mulighed for identifikation af anti-beslaglæggelse og antiinflammatoriske virkninger i denne model19.

Langt de fleste observerbare anfald i denne model forekommer i den akutte infektionsperiode. På trods af forekomsten af hippocampus degeneration, immuncelleaktivering og kognitive underskud observeret hos mus behandlet med TMEV, udvikler kun en lille del af de behandlede dyr til sidst kroniske, spontane anfald. Denne lave samlede anfaldsbyrde ville kræve et stort antal inficerede mus for korrekt at studere spontane anfald i denne model, hvilket ligger uden for mange projekters omfang og kapacitet. Dybdeelektrodeimplantation og EEG-overvågning vil også øge byrden for forsøgsdyrene. Mens dybdeelektroder kan hjælpe med at identificere spontan anfaldsaktivitet, kan ændringer i hippocampus anatomi efter infektion gøre konsekvent elektrodeplacering til en udfordring.

Det presserende behov for at identificere nye behandlinger for epilepsi kræver udvikling af modeller, der kan bruges som en hurtig screeningsmetode for antibeslaglæggelseseffekt. Denne model indeholder funktioner til at imødekomme denne presserende anmodning. Desuden gør det faktum, at det ikke kræver nogen stereotaktisk kirurgi, det til en passende og nem at udføre model til undersøgelse af antibeslaglæggelsesforbindelser.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

SB støttes af et starttilskud fra FU Berlin. KSW er støttet af R37 NS065434 og ALSAM Foundation. LAB er støttet af en D-SPAN pris 1F99NS125773-01. Vi takker Robert Fujinami, Ph.D. for at give os Theiler-virussen og University of Utah Cell Imaging Core Facility til mikroskopistøtte.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absorbent paper - - any
Analytical balance Mettler Toledo (Columbus, OH, U.S.A.) 30216542 0. 1 mg–220 g 
Animal balance Ohaus (Parsippany, NJ, U.S.A.) STX2202 0.01 g–2200 g 
BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes BD (Mississauga, ON, Canada)  BD329461 Lo-Dose sterile syringes with permanent BD Micro-Fine IV needle - 1 mL
Daniel's strain of TMEV kindly provided by Robert Fujinami (University of Utah) - 3 x 105 plaque-forming units aliquot(s)
Disinfectant, e.g. VennoVet 1 super Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Germany - Recommended by campus veterinarians with less than or equal to 5% alcohol
Fisherbrand medium sterile Alcohol prep pad C7  Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) 22-363-750
Fluriso VETone (Boise, ID, U.S.A) 502017 Isoflurane 250 mL, 2%–5%
Fume absorber  Labconco (Kansas City, MO, U.S.A.) - -
General Protection Disposable SMS White Lab Coats   Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) 17-100-810A
GraphPad Prism version 9  (La Jolla, CA, U.S.A.)
Ice bucket - - any
Microsoft Excel Microsoft  (Redmond, WA, U.S.A.)
Microsoft Word Microsoft  (Redmond, WA, U.S.A.)
Mouse cage - - any mouse cage holding at least 5 mice
PrecisionGlide needles  BD (Mississauga, ON, Canada) 329652 BD Slip Tip with PrecisionGlide Needle Insulin Syringes - 26 G x 3/8 - 0.45 mm x 10 mm
Self-Sealing Sterilizing Pouch  Fisher Scientific (Hampton, NY, U.S.A.) NC9241087  12.6 x 25.5 cm
Small glass flask - - any, volume 25 mL
sterile PBS Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) 10010056
Stir bar Carl Roth GmbH & CO. KG X171.1 size according to volume of solution
Stir plate Carl Roth GmbH & CO. KG AAN2.1
Syringe Luer-Lok BD (Mississauga, ON, Canada) 309628 1 mL syringe only
Ultrasonic Cleaner, Heater/Mechanical Timer Cole-Parmer (Vernon Hills, IL, U.S.A.) EW-08895-23 Bath sonicator - 0.5 gal, 115 V
Vehicle solution - - depending on compound vehicle
Vortex REAX  Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Germany 541-10000-00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Getts, D. R., Balcar, V. J., Matsumoto, I., Müller, M., King, N. J. Viruses and the immune system: their roles in seizure cascade development. Journal of Neurochemistry. 104 (5), 1167-1176 (2008).
  2. Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Neurotropic viral infections leading to epilepsy: Focus on Theiler's murine encephalomyelitis virus. Future Virology. 6 (11), 1339-1350 (2011).
  3. Vezzani, A., et al. Infections, inflammation and epilepsy. Acta Neuropathologica. 131 (2), 211-234 (2016).
  4. Misra, U. K., Tan, C. T., Kalita, J. Viral encephalitis and epilepsy. Epilepsia. 49, Suppl 6 13-18 (2008).
  5. Libbey, J. E., et al. Seizures following picornavirus infection). Epilepsia. 49 (6), 1066-1074 (2008).
  6. Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. Development of postinfection epilepsy after Theiler's virus infection of C57BL/6 mice. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (12), 1210-1219 (2010).
  7. Stewart, A. M., et al. Perspectives of zebrafish models of epilepsy: What, how and where next. Brain Research Bulletin. 87 (2-3), 135-143 (2012).
  8. Bröer, S., et al. Brain inflammation, neurodegeneration and seizure development following picornavirus infection markedly differ among virus and mouse strains and substrains. Experimental Neurology. 279, 57-74 (2016).
  9. Bröer, S., et al. Viral mouse models of multiple sclerosis and epilepsy: Marked differences in neuropathogenesis following infection with two naturally occurring variants of Theiler's virus BeAn strain. Neurobiology of Disease. 99, 121-132 (2017).
  10. Loewen, J. L., Barker-Haliski, M. L., Dahle, E. J., White, H. S., Wilcox, K. S. Neuronal Injury, gliosis, and glial proliferation in two models of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 75 (4), 366-378 (2016).
  11. Bell, L. A., Wallis, G. J., Wilcox, K. S. Reactivity and increased proliferation of NG2 cells following central nervous system infection with Theiler's murine encephalomyelitis virus. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 369 (2020).
  12. Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. Theiler's virus infection chronically alters seizure susceptibility. Epilepsia. 51 (8), 1418-1428 (2010).
  13. Buenz, E. J., Rodriguez, M., Howe, C. L. Disrupted spatial memory is a consequence of picornavirus infection. Neurobiology of Disease. 24 (2), 266-273 (2006).
  14. Tramoni-Negre, E., Lambert, I., Bartolomei, F., Felician, O. Long-term memory deficits in temporal lobe epilepsy. Revue Neurologique. 173 (7-8), 490-497 (2017).
  15. Ponds, R. W., Hendriks, M. Cognitive rehabilitation of memory problems in patients with epilepsy. Seizure. 15 (4), 267-273 (2006).
  16. Sloviter, R. S. Experimental status epilepticus in animals: What are we modeling. Epilepsia. 12, 11-13 (2009).
  17. Löscher, W. Animal models of seizures and epilepsy: Past, present, and future role for the discovery of antiseizure drugs. Neurochemical Research. 42 (7), 1873-1888 (2017).
  18. Kehne, J. H., Klein, B. D., Raeissi, S., Sharma, S. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP). Neurochemical Research. 42 (7), 1894-1903 (2017).
  19. Metcalf, C. S., et al. Screening of prototype antiseizure and anti-inflammatory compounds in the Theiler's murine encephalomyelitis virus model of epilepsy. Epilepsia Open. 7 (1), 46-58 (2021).
  20. Daniels, J. B., Pappenheimer, A. M., Richardson, S. Observations on encephalomyelitis of mice (DA strain). Journal of Experimental Medicine. 96 (6), 517-530 (1952).
  21. Käufer, C., et al. Chemokine receptors CCR2 and CX3CR1 regulate viral encephalitis-induced hippocampal damage but not seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (38), 8929-8938 (2018).
  22. Libbey, J. E., et al. The effects of diet on the severity of central nervous system disease: One part of lab-to-lab variability. Nutrition. 32 (7-8), 877-883 (2016).
  23. Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 32 (3), 281-294 (1972).
  24. Kim, J. E., Cho, K. O. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy and EEG monitoring using radiotelemetry system in mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831 (2018).
  25. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  26. Tu, L., et al. Free-floating immunostaining of mouse brains. Journal of Visualized Experiments. (176), e62876 (2021).

Tags

Neurovidenskab udgave 184
En model for epilepsi af infektiøs ætiologi ved hjælp af Theilers murin encephalomyelitis virus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Batot, G., Metcalf, C. S., Bell, L.… More

Batot, G., Metcalf, C. S., Bell, L. A., Pauletti, A., Wilcox, K. S., Bröer, S. A Model for Epilepsy of Infectious Etiology using Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus. J. Vis. Exp. (184), e63673, doi:10.3791/63673 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter