Summary
C57BL / 6 farelerde Theiler'in murin ensefalomiyelit virüsü (TMEV) ile intraserebral enfeksiyon, insan hastalarda viral ensefalitin ve müteakip epilepsinin erken ve kronik klinik semptomlarının çoğunu çoğaltır. Bu yazıda TMEV modelinin virüs enfeksiyonu, semptomları ve histopatolojisi anlatılmaktadır.
Abstract
Epilepsinin ana nedenlerinden biri, merkezi sinir sisteminin (CNS) bir enfeksiyonudur; Böyle bir enfeksiyondan kurtulan hastaların yaklaşık% 8'i sonuç olarak epilepsi geliştirir ve oranlar ekonomik olarak daha az gelişmiş ülkelerde önemli ölçüde daha yüksektir. Bu çalışma, enfeksiyöz etiyolojinin epilepsisinin modellenmesine ve yeni antinöbet bileşik testleri için bir platform olarak kullanılmasına genel bir bakış sunmaktadır. C57BL/6 farelerde Theiler's murine encephalomyelit virüsünün (TMEV) stereotaktik olmayan intraserebral enjeksiyonu ile epilepsi indüksiyonu protokolü sunulmuştur ve bu protokol, insan hastalarda viral ensefalitin ve müteakip epilepsinin erken ve kronik klinik semptomlarının çoğunu çoğaltmaktadır. Ensefalit sırasında nöbet aktivitesini izlemek ve yeni bileşiklerin potansiyel antinöbet etkilerini tespit etmek için farelerin klinik değerlendirmesi açıklanmaktadır. Ayrıca, viral ensefalit ve hipokampal hasar ve nöroinflamasyon gibi nöbetlerin histopatolojik sonuçlarının yanı sıra spontan epileptik nöbetler gibi uzun vadeli sonuçlar da gösterilmiştir. TMEV modeli, SSS enfeksiyonunun bir sonucu olarak epilepsi gelişim mekanizmalarının araştırılmasına izin veren ilk translasyonel, enfeksiyon odaklı, deneysel platformlardan biridir. Bu nedenle, bir CNS enfeksiyonunu takiben epilepsi gelişme riski taşıyan hastalar için potansiyel terapötik hedefleri ve bileşikleri tanımlamaya da hizmet eder.
Introduction
Viral ensefalitin sık görülen sonuçlarından biri epileptik nöbetlerdir. Birçok viral enfeksiyon, enfeksiyonun akut fazı sırasında semptomatik nöbetleri tetikler; Bu tür nöbetler için risk halk arasında %20'nin üzerinde artmıştır 1,2,3. Enfeksiyondan kurtulan hastalar da enfeksiyondan sonraki aylar ila yıllar içinde kronik epilepsi gelişme riskinin% 4-20'sinde artmıştır 1,4. Theiler'in murin ensefalomiyelit virüsü (TMEV), viral ensefalit 5,6,7'nin bir fare modelinde akut ve kronik nöbetleri incelemek için uygun bir virüs olarak tanımlanmıştır. TMEV, Picornaviridae ailesinin zarfsız, pozitif anlamlı, tek sarmallı bir RNA virüsüdür ve geleneksel olarak C57BL / 6 (B6) farelerinin korunduğu SJL farelerinin omuriliğindeki demiyelinizasyonu incelemek için kullanılmıştır, çünkü enfeksiyondan sonra virüsü hızla temizleme yeteneğine sahiptirler. Bununla birlikte, TMEV, enfeksiyon sonrası ilk hafta (pi) içinde erkek ve dişi B6 farelerinin% 50-75'inde akut nöbetlere neden olurken, yaklaşık% 25-40'ında kronik epilepsi haftaları ila aylar pi 2,5,6,8,9 gelişir. Nöbetlerin yanı sıra, fareler ayrıca nörodejenerasyon ve gliyoz 5,6,8,10,11,12 ile epileptik hipokampüsün ortak histopatolojisini gösterir. Ayrıca, TMEV ile enfekte B6 fareleri, öğrenme ve hafıza için davranışsal testlerde önemli ölçüde daha kötü performans gösterir ve epilepsili klinik hastalarda da görülen bilişsel komorbiditeye sahiptir13,14,15.
Geleneksel olarak, epilepsi ve nöbet modelleri, nöbetleri indüklemek için kemokonvülsan maddelerin veya elektriksel stimülasyonun uygulanmasını kullanır; Bununla birlikte, bu modeller yapı geçerliliğinden yoksundur ve sıklıkla klinik hastalarda görülenden daha ciddi nöbetler ve beyin hasarı gösterir16. Her araştırma sorusuna uygun bir model yoktur17. TMEV modelinin kullanılması, MSS'nin bir enfeksiyonundan sonra nöbet gelişiminin predispozan faktörleri araştırıldığında veya bileşiklerin antinöbet etkinlikleri açısından tarandığında özellikle ilginçtir.
TMEV modeli uluslararası olarak birkaç farklı laboratuvarda kurulduğundan ve kullanıldığından, yazarlar modelin başarılı bir şekilde uygulanmasına izin veren birçok ayrıntıyı, örneğin farklı virüs ve fare suşlarının özgüllüğünü tanımlamışlardır. En güvenilir nöbet indüksiyonu, Daniel'in TMEV ve B6J farelerinin 2,5,6,8,9 suşu ile üretildi. Model şu anda Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (NINDS) tarafından epilepsi ve nöbetlere karşı yeni ilaçları tanımlamak için bir platform olarak kullanılmaktadır18,19. Bu makale, diğer araştırmacıların hastalık mekanizmalarının daha iyi anlaşılması ve ilaç testi için bu viral ensefalit modelini kullanmalarına izin vermek için virüs indüksiyonu ve klinik izlemenin ayrıntılı protokolünü içermektedir.
Aşağıdaki protokol, bu modelde bileşik test için tasarlanmış bir çalışmayı yansıtmaktadır, ancak çok sayıda başka çalışma türü gerçekleştirilebilir. Fareler, sağ yarımkürenin temporal bölgesinde (sağ göze posterior ve medial) Daniel'in TMEV suşu ile enjeksiyondan kısa bir süre önce uyuşturulur. Araştırma sorusuna bağlı olarak, enfekte olmayan kontrol hayvanlarına ihtiyaç duyulursa, fareler TMEV yerine steril fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4, KH 2 PO 4 [1.06 mM], NaCl [155.17 mM] ve Na 2 HPO4 · 7H 2 O [2.97mM]dahil) alırlar. TMEV ile enfekte olmuş farelerde önceki deneyimler, elleçlemeye bağlı nöbetlerin enfeksiyon sonrası 3. gün ile 7. gün arasında meydana geldiğini göstermiştir. Deneysel bileşiklerin enjeksiyon sıklığı, yolu ve test zamanı, özelliklerine göre değişir. Virüs aşılamasının bir Cuma günü yapılması önerilir, bu da 3-7. gün nöbet izlemenin ertesi hafta, Pazartesi-Cuma günleri gerçekleşmesine izin verir. Nöbet izleme haftası boyunca, deneysel bileşikler, bileşiğin kinetiği veya etki mekanizması tarafından aksi önerilmedikçe, günde iki kez (en az 4 saat arayla) uygulanabilir (i.p.). Tedavi sırasında nöbet izleme, önceden belirlenmiş bir zaman noktasında gerçekleştirilebilir. Enjeksiyon ve gözlem süreleri bireysel bileşiklere bağlı olarak değişir. Hayvanlara test bileşiği veya ilaç bileşiği yerine bir araç enjekte edilir. Bu iki grup, deney grubuna benzer şekilde ele alınabilir ve gözlemlenebilir. Deney sırasında, fareleri ele alan ve nöbetleri puanlayan bir kişi tedaviye kör edilmelidir.
Protocol
Açıklanan tüm prosedürler ilgili makamlar tarafından yetkilendirilmiştir. Hayvanlar, "Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu" ndaki (Ulusal Araştırma Konseyi) tavsiyelere uygun olarak ve Utah Üniversitesi Halk Sağlığı Hizmeti politikası ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi, hayvan protokolü (numara: 21-11009, Farmakoloji ve Toksikoloji Bölümü) ve Freie Universität Berlin'de (protokol: G0015/21, LAGeSo Berlin, Farmakoloji ve Toksikoloji Enstitüsü), sırasıyla. Şekil 3 ve Şekil 5'te gösterilen sonuçlar 33.9-42502-04-11/0516 ve 33.9-42502-04-15/1892 (LAVES Oldenburg, Farmakoloji, Toksikoloji ve Eczacılık Bölümü, Hannover Üniversitesi Veterinerlik Bölümü) kapsamında onaylanmıştır.
1. Çalışmanın tasarlanmasında dikkat edilmesi gereken noktalar ve hazırlıklar
- Virüs
- Daniel'in TMEV suşu Utah Üniversitesi'nden Robert Fujinami tarafından nazikçe sağlandı. Başlangıçta, Harvard kolonisi20'deki bir fareden izole edildi. TMEV'yi ele almadan önce ilgili ülkelerdeki biyolojik ajanlar için özel sınıflandırma ve yönetmeliklere bakın ve yönetmeliklere uyumu sağlamak için kurumsal biyogüvenlik personeli ile görüşün. Tipik olarak, TMEV, suşa ve genetik modifikasyonlara bağlı olarak BSL 2 olarak sınıflandırılır. Hayvanların çoğunda nöbetleri indüklemek için gerekli standart doz 3 x 105 plak oluşturan birimdir (PFU).
NOT: Dozun, örneğin transgenik fareler kullanılıyorsa, uyarlanması gerekebilir. Genel olarak, nöbetleri başarılı bir şekilde indüklemek için 2 x 104 PFU ile 2.44 x 107 PFU arasındaki titreler kullanılmıştır. Kontrol hayvanları steril PBS alırlar ve nöbet geçirmezler. Virüs insanlara bulaşmaz; Bununla birlikte, KKD (laboratuvar önlüğü, eldiven, güvenlik gözlükleri) deneyciler tarafından her zaman giyilmeli ve fare karkasları ve yatakları bertaraf edilmeden önce otoklavlanmalıdır.
- Daniel'in TMEV suşu Utah Üniversitesi'nden Robert Fujinami tarafından nazikçe sağlandı. Başlangıçta, Harvard kolonisi20'deki bir fareden izole edildi. TMEV'yi ele almadan önce ilgili ülkelerdeki biyolojik ajanlar için özel sınıflandırma ve yönetmeliklere bakın ve yönetmeliklere uyumu sağlamak için kurumsal biyogüvenlik personeli ile görüşün. Tipik olarak, TMEV, suşa ve genetik modifikasyonlara bağlı olarak BSL 2 olarak sınıflandırılır. Hayvanların çoğunda nöbetleri indüklemek için gerekli standart doz 3 x 105 plak oluşturan birimdir (PFU).
- Hayvan
- Nöbetleri indüklemek ve araştırmak için B6J fareleri kullanın, çünkü diğer fare suşları mutlaka nöbetleri göstermez, örneğin SJL / J, FVB / N veya Balb / c fareleri5. Akut nöbet sıklığında dişi ve erkek fareler arasında fark yoktur5. Deneyleri ergenden yetişkin farelere kadar yapın (5-6 haftalıktan itibaren).
- Perhiz
- Diyet, hastalık şiddetinde laboratuvardan laboratuvara değişkenliğin bir kaynağı olarak belirlenmiştir; Bu nedenle, diyeti varyasyon22 için potansiyel bir faktör olarak düşünün.
- Grup büyüklüğü
- Bu modelde tüm hayvanlar akut veya kronik nöbetler geliştirmediğinden, bileşik testi için yaklaşık 20 fare / grup kullanın.
- Hayvan refahı
- Herhangi bir fare, yerel IACUC kılavuzları tarafından belirlenen bir gözlem süresinden sonra (örneğin, 48 saat) enfeksiyondan veya araştırma bileşiğinin uygulanmasından (örneğin, uyuşukluk, zayıf tımar, aşırı kızarıklık ve yaradan pürülan akıntı) önemli olumsuz etkiler gösterirse, fareyi insancıl bir şekilde ötenazi yapın.
- Enfeksiyon döneminde aşırı vücut ağırlığı kaybı (% >% 20) gösteren herhangi bir fareyi insanca ötenazi yapın.
- Hayvanlar düzgün beslenmezse, pediatrik elektrolit çözeltisi veya benzeri ile nemlendirilmiş ek peletlere erişmelerini sağlayın.
2. Virüs aşılama
- Enjeksiyon şırıngasının sterilizasyonu
- İnsülin şırıngasının kapağını çıkarın. 2,5 mm'lik yeterli enjeksiyon derinliği sağlamak için iğnenin etrafına yaka olarak polietilen boru ekleyin. Şırıngayı 30 dakika boyunca etanol içine batırın. Şırıngayı 30 dakika boyunca UV ışığı altında tutun.
- Kapağı tekrar iğnenin üzerine koyun. Şırıngayı sterilize edici bir torbaya sarın ve bantlayın. Hazırlık tarihi ile etiketleyin.
- Virüs enjeksiyonu
- Daniel'in TMEV suşunun alikotlarını -80 ° C dondurucudan alın. Virüsü çözün ve buzda tutun. Virüsün çözülmesinden ve yeniden dondurulmasından kaçının. Şırıngayı virüs süspansiyonu ile yükleyin (20 μL PBS veya DMEM kültür ortamında seyreltilmiş 3 x 105 PFU).
DİKKAT: Virüs farelere bulaşıcıdır, ancak insanlara bulaşamaz. - Tezgahı dezenfektanla temizleyin ve bir duman emici altında çalışın. Virüs aşılaması steril değildir, ancak mümkün olduğunca temizdir.
- Fareyi anestezi indüksiyon odasına aktarın ve anesteziyi indüklemek için oksijende% 2 izofluran kullanın. Cerrahi toleransa ulaşmak birkaç dakika sürer; Konsantrasyonu, hayvanın nefes almasına ve anestezi derinliğine göre ayarlayın.
- Anestezi uygulanan fareyi kaputun altındaki anestezi kutusundan aktarın. Cerrahi toleransı kontrol edin, örneğin ayak parmağı tutamağıyla. Tüm prosedür 30 saniyeden daha kısa sürede gerçekleştirilir, bu nedenle hayvanın enjeksiyon sırasında izofluran solumasına gerek yoktur. Korneanın kurumasını önlemek için göz merhemi ekleyin.
- Hayvanın kafasını bir alkol pedi ile temizleyin. Enjeksiyon bölgesi yukarı bakacak şekilde farenin kafasını hafifçe sola doğru eğin.
- Cildi biraz geriye doğru çekin, iğneyi kafaya yerleştirin ve sağ yarımkürenin temporal bölgesinde (sağ göze posterior ve medial) 20 μL intrakorterek 2,5 mm derinliğe kadar enjekte edin.
- Enjeksiyonu tüm hayvanlarda aynı yarımkürede tek taraflı olarak gerçekleştirin. Gözü ve kulağı, parietal korteksin yeri için işaretler olarak kullanın. Yerleştirme daha önce histolojik olarak doğrulanmıştır; bkz. Şekil 1. Bregma ile ilişkili stereotaksik enjeksiyona göre enjeksiyon koordinatları -2.0 (AP); +3,0 (ML); −1,5 (DV).
- Şırıngayı 5-15 saniye boyunca yerinde bırakın. Enjeksiyondan herhangi bir sızıntı olup olmadığını veya hava kabarcıkları görülüp görülmediğini yazın - bu durumda yeni bir şırınga hazırlayın. Şırıngayı dikkatlice dışarı çekerken, hafifçe döndürün. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için göz merhemi uygulayın.
- İSTEĞE BAĞLI: Yerel prosedürlere bağlı olarak hayvanı kuyrukta veya kulakta kodlayın (isteğe bağlı ancak hayvan bilinçsiz olduğu için kolaydır).
- Hayvanı, anesteziden iyileşme sırasında bir ısıtma yastığının (35-40 ° C) yarısına / yarısına yerleştirilen yeni bir kafese aktarın. Sternal yatmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanları gözetimsiz bırakmayın.
NOT: Hayvanlar iyileştikten sonra tekrar grup halinde barındırılabilir (enfekte hayvanlar sahte enfekte hayvanlarla karıştırılmaz). Enfekte olmuş fareler, enfekte olmayan farelerle aynı odada barındırılmamalıdır. - Enfeksiyondan sonra kilo verdikleri ve ek beslenme gerektirebilecekleri için farelerin ağırlığını ilk 7 gün pi boyunca takip edin.
- Daniel'in TMEV suşunun alikotlarını -80 ° C dondurucudan alın. Virüsü çözün ve buzda tutun. Virüsün çözülmesinden ve yeniden dondurulmasından kaçının. Şırıngayı virüs süspansiyonu ile yükleyin (20 μL PBS veya DMEM kültür ortamında seyreltilmiş 3 x 105 PFU).
Şekil 1: TMEV enjeksiyon prosedürünün şeması. Soldan sağa: Sağ parietal korteks enjeksiyonu için, iğneye göz ile karşı kulak arasındaki hayali bir çizginin hafifçe yanal enjekte edilir. Derinlik kontrolü için yaka sarı ile gösterilir. Enjeksiyon yolu, okla işaretlenmiş koronal beyin bölümünde görülebilir. Enjeksiyon bölgesi, okun üzerinde verilen koordinatlara karşılık gelir. Doğru görüntü, Theiler virüsünün (menekşe) hipokampal oluşumun CA1'i içindeki dağılımını göstermektedir. Şekil biorender.com kullanılarak hazırlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
3. Bileşik testi
- Bileşik hazırlama
- Formülasyon talimatlarını gözden geçirin. Araç çözümünü önerilere veya verilen talimatlara göre hazırlayın. Örnek olarak, antiepileptik ilaç levetirasetam (LEV) için prosedür sunulmuştur. LEV, nöbet yükünü 350 mg / kg'lık bir dozda araç seviyelerinin% 30-40'ına düşürür. Bu çalışmada kullanılan araç %0.5 metilselülozdur.
- Bileşiğe bağlı olarak dozları hesaplayın. İlacı hesaplamaya göre tartın. 1 kg fareyi tedavi etmek için 350 mg LEV ağırlığındadır.
- Formülasyon talimatlarının (örneğin, sonikasyon, araç yardımcı maddeleri, vb.) 0.01 mL / g farenin enjeksiyon hacmi göz önüne alındığında, 1 kg için enjeksiyon hacmi 350 mg LEV ile 10 mL olacaktır ve bu da 35 mg / mL19'luk bir çözelti ile sonuçlanacaktır. Hesaplamayı ve dozu mg / kg cinsinden ve hacmi mL cinsinden bildirin.
NOT: Örnek bir protokol, Ek Materyal 1'in 2. sayfasında bulunabilir.
- Bileşik uygulama
- Kafesleri araca veya bileşik gruba rastgele yerleştirin. Epilepsi gelişim mekanizmaları üzerine çalışmalar için veya doğrulama amacıyla alay ile enfekte olmuş fareleri kullanın, ancak rutin ilaç taraması için kullanmayın.
- Sıcaklık, nem, günün saati gibi ortam koşullarını raporlayın.
- Çözeltiyi, bileşiğin yanı sıra araç çözümü ile de vorteks. Aracı veya bileşiği bir şırıngada aspire edin ve karışmayı önlemek için şırıngaları renk koduyla kodlayın.
- Hayvanları tartın. B6J farelerin 3 pi gününde >18 g olduğundan emin olun (yuvarlanmamış). Ağırlığı bildirin.
- Bileşiği uygulayın (örneğin, intraperitoneal enjeksiyon veya diğer uygun yollarla). Yönetimin zamanını ve yolunu yazın.
- Bileşik uygulamasından sonra, özellikle ilk enjeksiyonlardan sonra hayvanları herhangi bir davranış değişikliği açısından izleyin. Nöbetler meydana gelirse, nöbet yoğunluğunu Racine ölçeği23'e göre bildirin; Bkz. Adım 3.2.
NOT: Bileşik uygulama için örnek bir protokol Ek Materyal 1, sayfa 3'te bulunabilirken, uygulama sırasında gözlenen nöbetler Ek Materyal 1, sayfa 4-5'e kaydedilecektir.
- Elleçlemeye bağlı nöbetlerin nöbet izlemesi
- Bu prosedürü tedaviye kör olmuş bir deneyci tarafından uygulayın. Tüm kafesleri tezgaha getirin. Işık fazı sırasında hayvanları günde 2 kez nöbet için gözlemleyin.
- Nöbet aktivitesini modifiye edilmiş bir Racine ölçeği ile puanlayın23: 0 = davranışta değişiklik yok, 1 = ağız ve yüz hareketleri, 2 = baş sallama, 3 = tek taraflı ön ayak klonusu, 4 = yetiştirme ile bilateral ön ayak klonu, 5 = postüral ton kaybı ile genelleştirilmiş tonik-klonik aktivite, bazen atlama, 6 = uzun süreli ve aşırı atlama ve hiperaktivite. Nöbetlerin sayısını ve yoğunluğunu bildirin.
- Biraz ses çıkarmak için bir kalemi kafes boyunca kaydırın.
- Her hayvanı başka bir kutuya aktarın ve geri alın.
- İleri geri bir hareket kullanarak kafesi hafifçe sallayın, kafesi o kadar kuvvetli bir şekilde sallamamaya dikkat edin, böylece hayvanlar kafesin yanlarına veya tepesine çarpacak ve fiziksel yaralanmaya maruz kalma tehlikesi altındadır.
- Nöbetler için kafesteki tüm hayvanları izleyin. Herhangi bir zamanda, bir farenin nöbeti varsa, onu ev kafesine geri aktarın ve gürültü veya kullanım yoluyla daha fazla nöbet stimülasyonu olmadan nöbet seviyesini yazın.
- Kendiliğinden veya hafif kafes sallantısından sonra ele geçirmemiş hayvanlar için, daha yoğun kullanımla nöbetleri tetikleyin: Fareyi kuyruğunda soldan sağa çevirerek dikkatlice çevirin.
NOT: Nöbet geçiren hayvanlar aşırı uyarılabilir ve ürkek olabilirler. - Her hayvanı nöbet davranışı için tekrar gözlemleyin. Sonraki kafesler için işlemi tekrarlayın.
NOT: Nöbet izleme için örnek bir protokol Ek Materyal 1, sayfa 6-7'de bulunabilir.
- Bileşik etkilerle ilgili veri raporu
- Tekrarlanan ölçümler (RM) ANOVA kullanarak günlük vücut ağırlıklarını analiz edin.
- Verilerin grafiksel gösterimi için günlük kümülatif nöbet yükü değerlerini kullanın. Etkinlik verilerini (Racine evre 3-5 nöbeti olmayan hayvan sayısı) korunan sayı / her bir ilgili grupta test edilen sayı (genellikle N = 20) olarak sunun. Bu nedenle, bir Fisher'ın kesin testini kullanarak araç ve uyuşturucu ile tedavi edilen gruplar arasındaki verileri yanıtlar (ele geçirme veya ele geçirmeme) açısından karşılaştırın.
NOT: Bir hayvan, evre 2 veya daha az nöbet geçirmişse ve korunmayan hayvanların evre 3-5 nöbetleri varsa, nöbetlerden "korunmuş" olarak kabul edilir. - Tolere edilebilirlik verilerini, davranış bozuklukları veya toksik etkileri olan hayvanların sayısı / her grupta test edilen sayı olarak benzer şekilde analiz edin. Ölümler de dahil olmak üzere tüm olumsuz etkilere dikkat edin.
- Araca enjekte edilen farelerin% 50'sinden azı akut olarak ele geçirilirse, verileri dikkate almayın.
Representative Results
Akut nöbetler üzerindeki bileşik etkiler
Davranışsal nöbetler, ilaç enjeksiyonu (DI) sırasında veya sonraki / PM nöbet işleme / izleme oturumları sırasında ortaya çıkarsa kaydedilir. Elleçleme nöbetleri sırasında gözlenen nöbetler, LEV (350 mg / kg) için Şekil 2'de gösterilen bir ısı haritası olarak sunulabilir. Nöbet yükünün analizi için, araçla tedavi edilen grup için nihai (7. gün) kümülatif nöbet yükü değerlerinin ortalaması alınır ve Mann-Whitney U testi ile bileşik tedavi edilen grupla karşılaştırılır (nöbet yükü değerleri, enjeksiyon sonrası gözlemde toplananları içerir). Bileşik etkinlik için, bir Fisher'ın kesin testi, araç ve ilaçla tedavi edilen gruplar arasında etkinlikte istatistiksel bir fark olup olmadığını belirler. Benzer şekilde, tolere edilebilirlik verileri Fisher'ın kesin testi ile analiz edilir. Vücut ağırlığı analizi, deney boyunca meydana gelen değişiklikleri ve ayrıca bileşik ve araçla tedavi edilen fareler arasındaki farklılıkları belirlemek için tekrarlanan ölçümler ANOVA tarafından gerçekleştirilir.
Şekil 2: Araç (% 0.5 metilselüloz) veya LEV (350 mg / kg) ile yapılan testlerden sonra davranışsal nöbetlerin ısı haritası. Günde iki kez enjeksiyon, elleçleme ve nöbet gözlemlerinden 1 saat önce gerçekleşti. Davranışsal nöbetler, ilaç enjeksiyonu (DI) sırasında veya sonraki / PM nöbet işleme / izleme oturumları sırasında meydana geldiyse kaydedildi. LEV (350 mg / kg), 5 günlük gözlem süresi boyunca kullanım seansları sırasında gözlenen nöbetleri (araç ele geçirme yükünün% 35.9'u) önemli ölçüde azaltır. Isı haritası, nöbet evresi 1-3'ü yeşil, 4'ü sarı ve 5'i turuncu renkte resmedilerek oluşturulur. Bu yeni rakam, yayımlanmış bir veri kümesi19'dan oluşturulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Kronik epilepsi
İlk hafta pi'de bildirilen nöbet yükünün yanı sıra, çalışmaya ve hipoteze bağlı olarak yararlı olabilecek birkaç okuma vardır. Hayvanlar uzun süreli tutulursa, enfekte hayvanların bir alt kümesi, akut nöbetlerden daha az sıklıkta ortaya çıkan ve bu nedenle EEG kaydı gerektiren birkaç hafta pi'de spontan epileptik nöbetler geliştirecektir. Farelerden EEG'yi kaydetmek için, elektrotların stereotaksik bir cerrahiye implante edilmesi gerekir24. Şekil 3 , TMEV8 ile enfekte olmuş farelerde EEG kaydı ile kronik fazdaki çeşitli epileptik olayları göstermektedir.
Şekil 3: Farelerde DA virüsü enfeksiyonunu takiben kronik fazda (14 hafta pi) tipik EEG izleri. (A-C) Davranışsal motor korelasyonun görülmediği temsili EEG olayları, yani (A) tek sivri uçlar, (B) başak kümeleri, (C) ve elektrografik, muhtemelen fokal nöbet. (D-F) Davranışsal korelasyonlu temsili EEG olayları. D'de gösterilen fare, miyoklonik seğirmeler (hareket eserleri eşliğinde "M" ile gösterilir), kalıplaşmış hareketler (fare başını yere düz bir şekilde bastırdığında "kafa presi" ile gösterilir) veya davranışsal arrest ile nöbet benzeri olaylara sahipti; "Scr", çizilmenin bir hareket artefaktını tanımlar, (E) ve (F) jeneralize konvülsif nöbetler sırasında tipik EEG değişikliklerini gösterir: (E) 22 s ve 1 Hz süreli bir Racine evre 3 nöbeti ve (F) 34 s ve 5.4 Hz süreli bir evre 5 nöbeti. Bu şekil8'den önce yayınlanmıştır ve Elsevier'in izniyle yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Histoloji
Epilepsi ve nöbetlere genellikle deneysel modellerde özetlenen hipokampal patoloji eşlik ettiğinden, çoğu laboratuvar hipokampal değişiklikleri veya potansiyel bir antinöbet tedavisinin patoloji üzerindeki etkisini de analiz eder. Yaygın olarak analiz edilen parametreler, hipokampal nörodejenerasyon ve küçülmenin yanı sıra spesifik bağışıklık hücresi popülasyonları için etiketleme yoluyla inflamasyonu içerir. Bu tür analizler için, deneyin sonunda, solunum durması meydana gelene kadar fareler derinlemesine uyuşturulur ve kalp atış hızı önemli ölçüde yavaşlar veya aritmi gösterir. PBS'nin intrakardiyal perfüzyonu ile kan çıkarılır ve ardından dokuyu sabitlemek için% 4 paraformaldehit (PFA)25 alınır. Doku daha sonra kriyoseksiyon ve (bağışıklık) boyama26 ile işlenir, ardından mikroskobik analizler yapılır.
Şekil 4: Epileptik TMEV ile enfekte farelerde hipokampal dejenerasyon. (A,B) Kresil menekşe boyalı koronal kesitler, (A) kontrol (PBS) faresinde normal sitomimariyi ve (B) TMEV faresinde hipokampal dejenerasyonu 2 aylık pi'de gösterir. Not: Genişlemiş lateral ventriküller, alveusun çökmesi ve piramidal hücre tabakasının incelmesi. (C) Bu hasarın ölçülmesi, hipokampal alanda önemli bir azalma ve TMEV farelerinin (N = 7) PBS farelerine (N = 6; veriler SEM; p < 0.001 ± ortalamadır; Öğrencinin t-testi). (D,E) NeuN etiketlemesi, 6 aylık pi'de alınan kesitlerde nöronal hücre kaybının büyüklüğünü daha da göstermektedir. Oklar, tam piramidal hücre kaybı olan bölgeleri gösterir. (E) Dentat girus, epileptik farelerde bile nispeten sağlam görünmektedir. Ölçek çubuğu = (A,B) 2 mm; (D,E) 0,5 mm. Bu rakam6'dan önce yayınlanmıştır ve Oxford University Press'in izniyle yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Enfeksiyondan 7 gün sonra akut ensefalite bağlı farklı şiddette T hücre infiltrasyonunun temsili fotomikrografları. İpsilateral dorsal hipokampusu içeren seri kesitler, T-lenfositleri etiketlemek için CD3'e karşı antikorlarla boyandı. (A,D) Sahte enfekte hayvanlarda göründüğü gibi T hücresi infiltrasyonu olmayan normal bir hipokampus. (B, E) TMEV ile enfekte farelerin çoğunda görüldüğü gibi orta derecede T hücre infiltrasyonu. (C, F) Sadece enfekte farelerin bazılarında görülen T lenfositlerin ciddi bir infiltrasyonu. Bu şekil8'den önce yayınlanmıştır ve Elsevier'in izniyle yeniden basılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Ek dosya, TMEV modelinde bileşik test için kullanılan formdan oluşur. Sayfa 1, deneme kurulumuna genel bir bakış sunar. Bileşik, araç ve bileşik çözelti hazırlığı ile ilgili bilgiler sayfa 1-2'ye kaydedilir. Bileşik uygulama sayfa 3'e kaydedilir. Sayfa 4-5'teki puanlama sayfaları, bileşik enjeksiyonu gerçekleştiren deneyci tarafından gözlemlenen ve ölçülen nöbetleri kaydetmek için kullanılır. Sayfa 4'te, her biri 5 fareden 1-4 kafesi için veri toplanabilir ve sayfa 5'te, elimizde bileşik testi için standart hayvan sayısı olan 5-8 kafesleri kaydedilebilir. Sayfa 6-7'deki puanlama sayfaları, her bileşik enjeksiyondan 1 saat sonra gözlem, kullanım ve nazik kafes sallamayı gerçekleştiren kör gözlemci tarafından kullanılır. Yine, bu örnek puan tablolarında toplam sekiz kafes için nöbet skorları not edilebilir. Son sayfa 8, diğer gözlemleri veya notları kaydetmek için kullanılabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Bu, epilepsi için akut ve kronik nöbet gelişiminin araştırılmasına izin veren ilk enfeksiyon bazlı kemirgen modelidir. Epilepsinin en yaygın etiyolojilerinden biri için hastalığın önlenmesi veya modifikasyonu için ilaç hedeflerinin ve yeni bileşiklerin belirlenmesine yardımcı olacaktır.
Yukarıda tarif edildiği gibi, TMEV ile tedavi edilen farelerin yeterli bir oranının elleçlemeye bağlı nöbetler göstermesini sağlamak için parti ve viral titrenin dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi gerekebilir. Hayvanların normalden daha az nöbeti varsa, virüs verimliliğini doğrulamak için bir grup N = 20 hayvan kullanın. Aktivitesi azalırsa (% 50'den az), yeni alikotlar yapmanın ve bunları N = 20 hayvanlarla test etmenin zamanı gelmiştir. Yeni alikotlar daha verimli değilse, virüsün yeni bir partisi saflaştırılmalıdır. Bazı transgenik fare çizgileri için, daha düşük bir viral titre kullanmak gerekebilir; Bu nedenle, viral titre ön deneylerden sonra gerektiği gibi seyreltilmelidir. B6 fareler üzerinde mevcut verilerin çoğu Jackson Laboratuvarlarından (Bar Harbor, ME, ABD veya Charles River, Sulzfeld, Almanya) kaynaklanmaktadır; Bununla birlikte, Harlan'dan (Eystrup, Almanya) elde edilen B6 farelerinde benzer nöbet oranları doğrulanmıştır8. B6 arka plana sahip transgenik hayvanların nöbet oranları vahşi tip B6 farelerle karşılaştırılabilir, ancak genetik değişikliklerin virüs istilası, enflamatuar yanıt veya nörodejenerasyon üzerinde bir etkisi varsa farklılık gösterebilir21. Akut nöbetler kendiliğinden gözlenir, ancak kullanım ve gürültü ile tetiklenir, bu nedenle nöbet oranları karşılaştırılırken tüm hayvanların benzer şekilde ele alınması son derece önemlidir. Günde iki kez yapılan elleçleme seansları daha önce yüksek bir nöbet yükü ve enfeksiyondan sonraki 3-7. günlerde nöbet gösteren farelerin daha büyük bir oranını sağlamıştır 6,8,19. Nöbet yükünü artırmak için ek elleçleme seansları (gün 1 ve gün 2) de kullanılabilir. Ayrıca, spontan nöbetlerin meydana gelmediğinden emin olmak için her kullanım seansından önce hayvanlar gözlemlenebilir. Örneğin, yüksek sesli bir laboratuar ortamı, nöbetler üretebilir ve bu da hayvanları test zamanlarında elleçlemeye bağlı nöbetlere karşı dirençli hale getirebilir.
TMEV enfeksiyonu farelerin çoğunda elleçlemeye bağlı nöbetler üretirken, bazı hayvanların neden bu tedaviye dirençli olduğu bilinmemektedir. Yukarıda tarif edildiği gibi, elektrografik nöbetler (minimal veya hiç ilişkili davranışla) meydana gelebilir ve eşzamanlı EEG kaydı olmadan normal olarak ölçülemez. Ayrıca, enjeksiyon yerindeki küçük farklılıkların beyindeki viral etkinin azalmasını kolaylaştırması da olabilir; Bununla birlikte, virüsün hipokampusa tropizmi nedeniyle kortikal ve striatal enfeksiyon 5,6,8,9 sonrası nöbetler bildirilmiştir. Bu modeldeki uyuşturucu tarama çalışmaları için, nöbetlerde bir azalma (örneğin, nöbet yükünde% 50'lik bir azalma) tanımlamak için, her grup için daha fazla sayıda hayvan gereklidir (örneğin, N = 20). Ayrıca, bu modeldeki nöbet davranışlarındaki değişkenlik, önemli bir nöbet azalmasını tanımlamak için ilaç ve araç etkilerinde daha büyük farklılıklar gerektirmektedir. Bu nedenle, bu modelin bir sınırlaması, daha büyük grup boyutları için gerekliliktir. Bununla birlikte, yeterli grup büyüklükleri, bu model19'da anti-nöbet ve anti-enflamatuar etkilerin tanımlanmasına da izin vermektedir.
Bu modeldeki gözlemlenebilir nöbetlerin büyük çoğunluğu akut enfeksiyon döneminde ortaya çıkar. TMEV ile tedavi edilen farelerde hipokampal dejenerasyon, bağışıklık hücresi aktivasyonu ve bilişsel eksikliklerin ortaya çıkmasına rağmen, tedavi edilen hayvanların sadece küçük bir kısmı sonunda kronik, spontan nöbetler geliştirir. Bu düşük genel nöbet yükü, birçok projenin kapsamı ve kapasitesinin ötesinde olan bu modelde spontan nöbetleri düzgün bir şekilde incelemek için çok sayıda enfekte fare gerektirecektir. Derinlik elektrodu implantasyonu ve EEG izlemesi de deney hayvanları üzerindeki yükü artıracaktır. Derinlik elektrotları spontan nöbet aktivitesinin tanımlanmasına yardımcı olabilirken, enfeksiyonu takiben hipokampal anatomideki değişiklikler tutarlı elektrot yerleşimini zorlaştırabilir.
Epilepsi için yeni tedavilerin belirlenmesinin acil ihtiyacı, antinöbet etkinliği için hızlı bir tarama yöntemi olarak kullanılabilecek modellerin geliştirilmesini gerektirmektedir. Bu model, bu acil isteği karşılamak için özellikler sağlar. Ayrıca, herhangi bir stereotaktik cerrahi gerektirmemesi, onu antinöbet bileşiklerinin araştırılması için uygun ve uygulaması kolay bir model haline getirmektedir.
Disclosures
Yazarlar, rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
SB, FU Berlin'in başlangıç hibesi ile desteklenmektedir. KSW, R37 NS065434 ve ALSAM Vakfı tarafından desteklenmektedir. LAB, 1F99NS125773-01 D-SPAN ödülü ile desteklenmektedir. Robert Fujinami, Ph.D.'ye Theiler virüsünü bize sağladığı için ve mikroskopi desteği için Utah Üniversitesi Hücre Görüntüleme Çekirdek Tesisi'ne teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbent paper | - | - | any |
| Analytical balance | Mettler Toledo (Columbus, OH, U.S.A.) | 30216542 | 0. 1 mg–220 g |
| Animal balance | Ohaus (Parsippany, NJ, U.S.A.) | STX2202 | 0.01 g–2200 g |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD (Mississauga, ON, Canada) | BD329461 | Lo-Dose sterile syringes with permanent BD Micro-Fine IV needle - 1 mL |
| Daniel's strain of TMEV | kindly provided by Robert Fujinami (University of Utah) | - | 3 x 105 plaque-forming units aliquot(s) |
| Disinfectant, e.g. VennoVet 1 super | Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Germany | - | Recommended by campus veterinarians with less than or equal to 5% alcohol |
| Fisherbrand medium sterile Alcohol prep pad C7 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 22-363-750 | |
| Fluriso | VETone (Boise, ID, U.S.A) | 502017 | Isoflurane 250 mL, 2%–5% |
| Fume absorber | Labconco (Kansas City, MO, U.S.A.) | - | - |
| General Protection Disposable SMS White Lab Coats | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 17-100-810A | |
| GraphPad Prism version 9 | (La Jolla, CA, U.S.A.) | ||
| Ice bucket | - | - | any |
| Microsoft Excel Microsoft | (Redmond, WA, U.S.A.) | ||
| Microsoft Word Microsoft | (Redmond, WA, U.S.A.) | ||
| Mouse cage | - | - | any mouse cage holding at least 5 mice |
| PrecisionGlide needles | BD (Mississauga, ON, Canada) | 329652 | BD Slip Tip with PrecisionGlide Needle Insulin Syringes - 26 G x 3/8 - 0.45 mm x 10 mm |
| Self-Sealing Sterilizing Pouch | Fisher Scientific (Hampton, NY, U.S.A.) | NC9241087 | 12.6 x 25.5 cm |
| Small glass flask | - | - | any, volume 25 mL |
| sterile PBS | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, U.S.A.) | 10010056 | |
| Stir bar | Carl Roth GmbH & CO. KG | X171.1 | size according to volume of solution |
| Stir plate | Carl Roth GmbH & CO. KG | AAN2.1 | |
| Syringe Luer-Lok | BD (Mississauga, ON, Canada) | 309628 | 1 mL syringe only |
| Ultrasonic Cleaner, Heater/Mechanical Timer | Cole-Parmer (Vernon Hills, IL, U.S.A.) | EW-08895-23 | Bath sonicator - 0.5 gal, 115 V |
| Vehicle solution | - | - | depending on compound vehicle |
| Vortex REAX | Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Germany | 541-10000-00 |
References
- Getts, D. R., Balcar, V. J., Matsumoto, I., Müller, M., King, N. J. Viruses and the immune system: their roles in seizure cascade development. Journal of Neurochemistry. 104 (5), 1167-1176 (2008).
- Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Neurotropic viral infections leading to epilepsy: Focus on Theiler's murine encephalomyelitis virus. Future Virology. 6 (11), 1339-1350 (2011).
- Vezzani, A., et al.
- Misra, U. K., Tan, C. T., Kalita, J.
- Libbey, J. E., et al.
- Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. Development of postinfection epilepsy after Theiler's virus infection of C57BL/6 mice. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (12), 1210-1219 (2010).
- Stewart, A. M., et al. Perspectives of zebrafish models of epilepsy: What, how and where next. Brain Research Bulletin. 87 (2-3), 135-143 (2012).
- Bröer, S., et al. Brain inflammation, neurodegeneration and seizure development following picornavirus infection markedly differ among virus and mouse strains and substrains. Experimental Neurology. 279, 57-74 (2016).
- Bröer, S., et al. Viral mouse models of multiple sclerosis and epilepsy: Marked differences in neuropathogenesis following infection with two naturally occurring variants of Theiler's virus BeAn strain. Neurobiology of Disease. 99, 121-132 (2017).
- Loewen, J. L., Barker-Haliski, M. L., Dahle, E. J., White, H. S., Wilcox, K. S. Neuronal Injury, gliosis, and glial proliferation in two models of temporal lobe epilepsy. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 75 (4), 366-378 (2016).
- Bell, L. A., Wallis, G. J., Wilcox, K. S. Reactivity and increased proliferation of NG2 cells following central nervous system infection with Theiler's murine encephalomyelitis virus. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 369 (2020).
- Stewart, K. A., Wilcox, K. S., Fujinami, R. S., White, H. S. Theiler's virus infection chronically alters seizure susceptibility. Epilepsia. 51 (8), 1418-1428 (2010).
- Buenz, E. J., Rodriguez, M., Howe, C. L. Disrupted spatial memory is a consequence of picornavirus infection. Neurobiology of Disease. 24 (2), 266-273 (2006).
- Tramoni-Negre, E., Lambert, I., Bartolomei, F., Felician, O. Long-term memory deficits in temporal lobe epilepsy. Revue Neurologique. 173 (7-8), 490-497 (2017).
- Ponds, R. W., Hendriks, M. Cognitive rehabilitation of memory problems in patients with epilepsy. Seizure. 15 (4), 267-273 (2006).
- Sloviter, R. S. Experimental status epilepticus in animals: What are we modeling. Epilepsia. 12, 11-13 (2009).
- Löscher, W. Animal models of seizures and epilepsy: Past, present, and future role for the discovery of antiseizure drugs. Neurochemical Research. 42 (7), 1873-1888 (2017).
- Kehne, J. H., Klein, B. D., Raeissi, S., Sharma, S. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Epilepsy Therapy Screening Program (ETSP). Neurochemical Research. 42 (7), 1894-1903 (2017).
- Metcalf, C. S., et al. Screening of prototype antiseizure and anti-inflammatory compounds in the Theiler's murine encephalomyelitis virus model of epilepsy. Epilepsia Open. 7 (1), 46-58 (2021).
- Daniels, J. B., Pappenheimer, A. M., Richardson, S. Observations on encephalomyelitis of mice (DA strain). Journal of Experimental Medicine. 96 (6), 517-530 (1952).
- Käufer, C., et al. Chemokine receptors CCR2 and CX3CR1 regulate viral encephalitis-induced hippocampal damage but not seizures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (38), 8929-8938 (2018).
- Libbey, J. E., et al. The effects of diet on the severity of central nervous system disease: One part of lab-to-lab variability. Nutrition. 32 (7-8), 877-883 (2016).
- Racine, R. J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology. 32 (3), 281-294 (1972).
- Kim, J. E., Cho, K. O. The pilocarpine model of temporal lobe epilepsy and EEG monitoring using radiotelemetry system in mice. Journal of Visualized Experiments. (132), e56831 (2018).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Tu, L., et al.
