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Neuroscience

एक उत्परिवर्ती मेथिओनिन टीआरएनए सिंथेटेस माउस लाइन का उपयोग करके जटिल ऊतकों से सेल-प्रकार विशिष्ट प्रोटीन शुद्धिकरण और पहचान

Published: April 13, 2022 doi: 10.3791/63713
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 1, 2
1Max-Planck-Institute for Brain Research, Synaptic Plasticity Department, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Veterinary School, Complutense University of Madrid

Summary

यह प्रोटोकॉल बताता है कि उत्परिवर्ती एल 274 जी-मेथिओनिन टीआरएनए सिंथेटेस (मेटआरएस *) को व्यक्त करने वाली माउस लाइन का उपयोग करके एज़िडोनोरल्यूसीन (एएनएल) के साथ सेल-टाइप-विशिष्ट प्रोटीन लेबलिंग कैसे करें और लेबल सेल-प्रकार-विशिष्ट प्रोटीन अलगाव के लिए आवश्यक कदम उठाएं। हम (1) पीने के पानी और (2) इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा जीवित चूहों में दो संभावित एएनएल प्रशासन मार्गों को रेखांकित करते हैं।

Abstract

विवो में प्रोटीन होमियोस्टेसिस को समझना यह जानने के लिए महत्वपूर्ण है कि कोशिकाएं शारीरिक और रोग दोनों स्थितियों में कैसे काम करती हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल विवो लेबलिंग और बाद में विशिष्ट सेलुलर आबादी के लिए प्रोटीन लेबलिंग को निर्देशित करने के लिए एक इंजीनियर माउस लाइन का उपयोग करके नए संश्लेषित प्रोटीन के शुद्धिकरण का वर्णन करता है। यह एल 274 जी-मेथिओनिन टीआरएनए सिंथेटेस (मेटआरएस *) की क्रे रिकोम्बिनेस अभिव्यक्ति द्वारा एक इंड्यूसेबल लाइन है, जो प्रोटीन में एज़िडोनोरल्यूसीन (एएनएल) को शामिल करने में सक्षम बनाता है, जो अन्यथा नहीं होगा। यहां वर्णित विधि का उपयोग करके, विवो में लेबल किए गए सेल-प्रकार-विशिष्ट प्रोटिओम को शुद्ध करना और नमूना जटिलता में कमी के कारण प्रोटीन सामग्री में सूक्ष्म परिवर्तनों का पता लगाना संभव है।

Introduction

असामान्य प्रोटीन होमियोस्टेसिस प्रोटीन संश्लेषण और गिरावट में असंतुलन के कारण होता है। कई बीमारियां प्रोटीन होमियोस्टैसिस में परिवर्तन से संबंधित हैं। कुछ रोगों की पहचान विभिन्न उपकोशिकीय स्थानों और मस्तिष्क क्षेत्रों में समुच्चय की उपस्थिति है। प्रोटीन होमियोस्टेसिस न केवल बीमारी में महत्वपूर्ण है, बल्कि सामान्य अंग और सेलुलर फ़ंक्शन 1 में भी महत्वपूर्ण भूमिकानिभाता है। उदाहरण के लिए, प्रोटीन संश्लेषण न्यूरोनल प्लास्टिसिटी 2,3 के कई रूपों के लिए आवश्यक है, जैसा कि प्रोटीन संश्लेषणको अवरुद्ध करने वाले रासायनिक अवरोधकों के उपयोग से निर्धारित होता है। हालांकि, यह न तो स्पष्ट है कि सीखने और स्मृति का समर्थन करने के लिए किस सेल-प्रकार में प्रोटिओम को बदल दिया जाता है, न ही यह समझा जाता है कि प्रत्येक सेल-प्रकार में कौन से विशिष्ट प्रोटीन उनके संश्लेषण या गिरावट में वृद्धि या कमी करते हैं। इस प्रकार, प्रोटीन होमियोस्टेसिस के एक व्यापक अध्ययन के लिए विशिष्ट सेल-प्रकारों से आने वाले प्रोटिओम को अलग करने की क्षमता की आवश्यकता होती है। दरअसल, एक बहुकोशिकीय वातावरण में होने वाली सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए सेल-प्रकार-विशिष्ट प्रोटिओम की पहचान प्रोटिओमिक्स में एक महत्वपूर्ण बाधा रही है। इस कारण से, हमने बायो-ऑर्थोगोनल विधियों के साथ संयुक्त मेटआरएस * अभिव्यक्ति का उपयोग करके एक तकनीक विकसित की है जो सेल-प्रकार के विशिष्ट प्रोटिओम की पहचान और शुद्धिकरण करने का एक प्रभावी तरीका साबित हुई है, इस अंतरको 5,6,7 से भर दिया है।

एक उत्परिवर्ती मेटआरएस * (मेटआरएस एल 274 जी) की अभिव्यक्ति गैर-कैननिकल मेथिओनिन एनालॉग एएनएल को संबंधित टीआरएनए 8,9 मेंलोड करने और बाद में प्रोटीन में शामिल करने की अनुमति देती है। जब मेटआरएस * अभिव्यक्ति को सेल-प्रकार-विशिष्ट प्रमोटर द्वारा विनियमित किया जाता है, तो गैर-कैननिकल अमीनो एसिड को सेल-चयनात्मक तरीके से प्रोटीन में शामिल किया जाएगा। एक बार प्रोटीन में एएनएल को शामिल करने के बाद, इसे चुनिंदा रूप से क्लिक-रसायन विज्ञान द्वारा कार्यात्मक किया जा सकता है और बाद में या तो इमेजिंग (FUNCAT) या वेस्टर्न इम्यूनोब्लॉट (BONCAT) द्वारा कल्पना की जा सकती है। वैकल्पिक रूप से, प्रोटीन को मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) द्वारा चुनिंदा रूप से शुद्ध और पहचाना जा सकता है। इस तकनीक का उपयोग करते हुए, हमने क्रे रिकोम्बिनेस के नियंत्रण में मेटआरएस * प्रोटीन को व्यक्त करने वाली एक माउस लाइन बनाई। उपलब्ध क्रे-माउस लाइनों की बढ़ती संख्या को ध्यान में रखते हुए, मेटआरएस * प्रणाली का उपयोग किसी भी क्षेत्र में किसी भी ऊतक से किसी भी सेल-प्रकार का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है जिसके लिए एक मौजूदा क्रे-लाइन है। एएनएल के साथ प्रोटीन लेबलिंग विट्रो या विवो में संभव है, और माउस व्यवहार या प्रोटीन अखंडता6 को नहीं बदलता है। लेबलिंग टाइमस्पैन को प्रत्येक शोधकर्ता के वैज्ञानिक प्रश्न के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, नए संश्लेषित प्रोटीन (छोटे लेबलिंग समय) या पूरे प्रोटिओम (लंबे लेबलिंग समय) को लेबल किया जा सकता है। इस तकनीक का उपयोग उस प्रकार की कोशिकाओं की संख्या से सीमित है जो शोधकर्ता अध्ययन करने के लिए तैयार है; इसलिए कम संख्या या कम चयापचय दर वाले सेल-प्रकारों से प्रोटीन अलगाव इस विधि द्वारा संभव नहीं है। प्रस्तुत विधि का लक्ष्य विवो में लेबल किए गए सेल-प्रकार-विशिष्ट प्रोटीन / प्रोटिओम की पहचान करना है। इस प्रोटोकॉल में, हम वर्णन करते हैं कि जीवित चूहों में एएनएल के साथ सेल-प्रकार-विशिष्ट प्रोटिओम को कैसे लेबल किया जाए और लेबल किए गए प्रोटीन को शुद्ध किया जाए। शुद्धिकरण के बाद, प्रोटीन को नियमित मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटोकॉल 5,10 द्वारा पहचाना जा सकता है। विशिष्ट सेलुलर आबादी से प्रोटीन के चयनात्मक शुद्धिकरण द्वारा इस विधि में प्राप्त नमूना जटिलता की कमी प्रयोगकर्ता को प्रोटिओम में सूक्ष्म परिवर्तनों का पता लगाने की अनुमति देती है, उदाहरण के लिए, पर्यावरणीय परिवर्तनों के जवाब में। लेबल किए गए प्रोटीन का शुद्धिकरण ~ 10 दिनों में प्राप्त किया जा सकता है, जिसमें एमएस विश्लेषण या लेबलिंग अवधि शामिल नहीं है। यहां, हम चूहों को व्यक्त करने वाले मेटआरएस * के लिए एएनएल प्रशासन के लिए दो तरीकों का वर्णन करते हैं, अर्थात् (1) पीने के पानी में अमीनो एसिड जोड़ना, और (2) इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा एएनएल पेश करना। एएनएल प्रशासन के लिए चुनी गई विधि के बावजूद, अलगाव और शुद्धिकरण चरण समान हैं (चरण 2 से)।

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Protocol

जानवरों के साथ सभी प्रयोग जर्मनी में स्थानीय सरकारी कार्यालयों (आरपी डार्मस्टेड; प्रोटोकॉल: वी 54-19 सी 20/15-एफ 122/14, वी 54-19 सी 20/15-एफ 126/1012) या स्पेन (यूसीएम में पशु प्रयोगों की समिति और कोमुनिडाड डी मैड्रिड के पर्यावरण परामर्श, प्रोटोकॉल संख्या: प्रोईएक्स 005.0/21) की अनुमति के साथ किए गए थे।

1. एएनएल के साथ विवो मेटाबोलिक लेबलिंग में

  1. पीने का पानी:
    1. चूहों के नियमित पीने के पानी में एएनएल और माल्टोज घोलें। अनुशंसित माल्टोज एकाग्रता 0.7% (डब्ल्यूटी / वॉल्यूम) है। पीने के पानी में मिलाए गए एएनएल की अधिकतम मात्रा 1% (डब्ल्यूटी / वॉल्यूम) है। एक बार मिश्रण तैयार हो जाने के बाद, इसे निस्पंदन द्वारा निष्फल करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. चूहों को चरण 1.1 में तैयार मिश्रण प्रदान करें। संदूषण से बचने के लिए बोतलों को बार-बार बदलें (उदाहरण के लिए, हर 3 दिन), और संभावित संदूषण या क्लॉगिंग की तलाश के लिए हर दिन उनकी जांच करें। चूहों के एएनएल सेवन को जानने के लिए, रोजाना वजन करके नशे में पानी की मात्रा की निगरानी करें।
      नोट: यहां मूल्यांकन की गई अधिकतम लेबलिंग अवधि पीने के पानी में 1% की एएनएल एकाग्रता का उपयोग करके 3 सप्ताह है, जिसके परिणामस्वरूप मस्तिष्क में अच्छी तरह से पता लगाने योग्य लेबलिंग हुई। अच्छी लेबलिंग भी 2 सप्ताह में हासिल की जा सकती है। इस प्रशासन विधि का उपयोग करके हमारे द्वारा न तो कम लेबलिंग समय, न ही लंबे समय बिंदु, और न ही अन्य एएनएल राशियों का अध्ययन किया गया है, जिसका अर्थ यह नहीं है कि पूर्वगामी काम नहीं करेगा। एएनएल निगमन दर अध्ययन किए गए ऊतक या सेल-प्रकार के आधार पर भिन्न हो सकती है। वैज्ञानिक प्रश्न के आधार पर लेबलिंग का समय भिन्न हो सकता है; उदाहरण के लिए, यदि प्रोटिओम को लेबल किया जाना था, तो लेबलिंग समय की गणना अध्ययन किए गए ऊतक में प्रोटीन के औसत आधे जीवन के कार्य में की जानी चाहिए। यदि रुचि केवल नए संश्लेषित प्रोटीन की पहचान करने के लिए है, तो समय को छोटा किया जा सकता है। लेबलिंग अवधि और एएनएल खुराक को प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति और सेल-प्रकार की रुचि के लिए अनुभवजन्य रूप से परीक्षण किया जाना चाहिए।
  2. इंट्रापरिटोनियल प्रशासन:
    1. शारीरिक एनएसीएल समाधान में एएनएल को 400 एमएम, फॉस्फेट खारा बफर (पीबीएस), या पानी में भंग करें।
    2. सुनिश्चित करें कि समाधान की परासरणता शारीरिक सीमा के भीतर है। यहां, चूहों को एएनएल समाधान के शरीर का 10 एमएल / किग्रा वजन दिया जाता है।
      नोट: मस्तिष्क के उत्तेजक न्यूरॉन्स में अच्छी लेबलिंग 1 सप्ताह के लिए 400 एमएम एएनएल के साथ एक दैनिक इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन (आईपी) द्वारा सफलतापूर्वक प्राप्त की जाती है। इस अध्ययन में न तो कम एएनएल सांद्रता और न ही आईपी इंजेक्शन द्वारा अन्य लेबलिंग अवधि का परीक्षण किया गया है, जिसका अर्थ यह नहीं है कि वे काम नहीं करेंगे। एएनएल को कुछ कंपनियों द्वारा हाइड्रोक्लोराइड के रूप में आपूर्ति की जाती है। इस मामले में, समाधान के पीएच को पर्याप्त पीएच (प्रशासन मार्ग के आधार पर) में समायोजित किया जाना चाहिए। एएनएल को कुछ संशोधनों के साथ लिंक एट अल .11 द्वारा प्रकाशित विधि का पालन करके भी संश्लेषित किया जासकता है। एएनएल लेबलिंग को अन्य एएनएल सांद्रता, टाइमस्पैन और प्रशासन मार्गों का उपयोग करके किया जा सकता है। कम चयापचय दर वाले ऊतकों / सेल-प्रकारों के लिए, कम सामग्री मेथिओनिन आहार का उपयोग किया जा सकता है, जो हमेशा एएनएल प्रशासन से 1 सप्ताह पहले शुरू होता है। जब 400 एमएम एएनएल का उपयोग किया जाता है, तो यह 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने पर अवक्षेपित हो सकता है; 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने से एएनएल समाधान में वापस आ जाता है। इंजेक्शन से पहले इसे कमरे के तापमान तक पहुंचने दें। अधिकांश विश्व क्षेत्रों में, चूहों के लिए एएनएल प्रशासन एक पशु प्रयोग है और इसे प्रासंगिक अधिकारियों द्वारा अनुमोदित करने की आवश्यकता है।

2. ऊतक कटाई, लाइसिस, और प्रोटीन निष्कर्षण

  1. ऊतक विच्छेदन: कोशिका-प्रकार के हित वाले ऊतक के क्षेत्र को विच्छेदित करें और ऊतक के एकत्रित टुकड़े के वजन को नोट करें।
    नोट: नमूने कई महीनों (स्टॉप पॉइंट) के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, चूहों प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस को विच्छेदित किया गया था।
  2. ऊतक लाइसिस: लाइसिस बफर (पीबीएस पीएच 7.4, 1% डब्ल्यूटी / वॉल्यूम एसडीएस, 1% (वॉल्यूम / वॉल्यूम) ट्राइटन एक्स -100, बेंजोनेस (1: 1000 वॉल्यूम / वॉल्यूम), एक प्रोटीज अवरोधक (पीआई) (ईडीटीए मुक्त 1: 4000)) के ऊतक के गीले वजन का 12-15 गुना मात्रा जोड़कर कमरे के तापमान पर ऊतक को समरूप करें। उदाहरण के लिए, 20 मिलीग्राम ऊतक टुकड़े के लिए, लाइसिस बफर के 240-300 μL जोड़ें। ऊतक को तब तक ट्राइट्यूरेट करें जब तक कि यह समरूप न हो जाए।
    नोट: नमूने कई महीनों (स्टॉप पॉइंट) के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। 1.5 एमएल ट्यूबों में प्रत्यक्ष समरूपीकरण के लिए, एक हैंडहेल्ड, बैटरी संचालित होमोजेनाइज़र के उपयोग की सिफारिश की जाती है, खासकर जब ऊतक के छोटे टुकड़े संसाधित होते हैं। बड़े टुकड़ों के लिए, एक डौंस होमोजेनाइज़र का उपयोग किया जा सकता है। प्रत्येक बफर में जहां प्रोटीज इनहिबिटर (पीआई) शामिल हैं, उन्हें उपयोग से तुरंत पहले जोड़ा जाना चाहिए और पहले नहीं।
  3. प्रोटीन विकृतीकरण: होमोजेनेट को 15 मिनट के लिए 75 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और सेंट्रीफ्यूज को 10 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 17,000 x g पर गर्म करें। सुपरनैटेंट को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. प्रोटीन सामग्री माप: प्रत्येक नमूने की प्रोटीन एकाग्रता को मापें, और सभी नमूनों को एक ही प्रोटीन एकाग्रता की तुलना में समायोजित करें; लाइसिस बफर जोड़कर एकाग्रता को समायोजित करें। एक इष्टतम एकाग्रता सीमा 2-4 μg / μL के बीच है।
    नोट: नमूने कई महीनों (स्टॉप पॉइंट) के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  5. अल्काइलेशन
    1. पीबीएस (पीएच 7.8) + पीआई (ईडीटीए मुक्त 1: 4000) में 2-3 बार होमोजिनाइज्ड नमूनों को पतला करें।
    2. 20 mM (स्टॉक समाधान 500 mM) की अंतिम एकाग्रता में आयोडोसेटामाइड (IAA) जोड़ें।
    3. नमूने को अंधेरे में 20 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 घंटे के लिए छोड़ दें। चरण 2.5.2-2.5.3 दो बार करें।
      नोट: कुछ ऊतकों के लिए, यदि नकारात्मक नियंत्रण में गैर-विशिष्ट क्लिक अधिक रहता है, तो अल्काइलेशन12 से पहले कमी चरण करना आवश्यक हो सकता है। नमूने में जोड़ने से ठीक पहले आईएए स्टॉक को ताजा तैयार करें। नमूने कई महीनों (स्टॉप पॉइंट) के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं।
  6. बफर एक्सचेंज: क्लिक रसायन विज्ञान विनिमय बफर (पीबीएस पीएच 7.8, 0.04% (डब्ल्यूटी / वॉल्यूम) एसडीएस, 0.08% (वॉल्यूम / वॉल्यूम) ट्राइटन एक्स -100 और पीआई (1: 4000)) का उपयोग करके बफर एक्सचेंज कॉलम को बराबर करें। निर्माता के निर्देशों का पालन करें। सभी अल्काइलेटेड नमूने का आदान-प्रदान करें।
    नोट: एल्यूटेड नमूने कई महीनों (स्टॉप पॉइंट) के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं। इस चरण में, आईएए को समाप्त कर दिया जाता है, और बफर को क्लिक रसायन विज्ञान बफर द्वारा आदान-प्रदान किया जाता है। बफर एक्सचेंज चरण के बाद प्रोटीन को फिर से मापा जा सकता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि बफर एक्सचेंज प्रक्रिया के दौरान प्रोटीन खो नहीं गया था। बफर एक्सचेंज के लिए उपयोग किए जाने वाले स्तंभों के प्रकार के आधार पर, प्रोटीन बड़े पैमाने पर खो सकता है। प्रोटीन हानि से बचने के लिए अनुशंसित कॉलम का उपयोग करें। नमूना भंडारण के लिए, एलिकोट की तैयारी की सिफारिश की जाती है।
  7. प्रयोग में एएनएल निगमन का मूल्यांकन करने के लिए प्रतिक्रिया पर क्लिक करें
    1. चरण 2.6 में इल्यूटेड नमूनों का 40 μL लें और 120 μL की अंतिम मात्रा में PBS (pH 7.8) जोड़ें।
    2. क्लिक रसायन विज्ञान प्रतिक्रिया को सेट करने के लिए, दिए गए क्रम में निम्न अभिकर्मकों को जोड़ें और प्रत्येक जोड़ के बाद 20 सेकंड के लिए भंवर: ट्राइज़ोल लिगैंड (स्टॉक 40 एमएम) का 1.5 μL, बायोटिन एल्काइन (स्टॉक 5 mM) का 1.5 μL और Cu (I) ब्रोमाइड का 1 μL (स्टॉक 10 mg / mL, सावधानीपूर्वक ऊपर और नीचे करके DMSO में घुल जाता है, भंवर मत करो)। अभिकर्मकों को जितनी जल्दी हो सके जोड़ें।
    3. निरंतर रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में रात भर नमूनों को इनक्यूबेट करें।
    4. 17,000 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें। थोड़ा फ़िरोज़ा पेलेट दिखाई देगा। सुपरनैटेंट को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: तांबे के ऑक्सीकरण से बचने के लिए उपयोग करने से तुरंत पहले क्यू (आई) ब्रोमाइड स्टॉक तैयार करें। प्रत्येक ट्यूब में समान अंतिम डिटर्जेंट एकाग्रता सुनिश्चित करने के लिए नमूनों के बीच लाइस्ड नमूने और पीबीएस स्थिर के बीच मात्रा का अनुपात रखना आवश्यक है। क्लिक रसायन विज्ञान प्रतिक्रिया की असेंबली को तेज करने के लिए, ट्यूबों के लिए रैक के साथ एक टेबल भंवर की सिफारिश की जाती है। क्लिक किए गए नमूनों को कई महीनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, या आगे की प्रक्रिया (स्टॉप पॉइंट) तक कुछ हफ्तों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर।
  8. प्रयोग में एएनएल निगमन का मूल्यांकन करने के लिए पश्चिमी धब्बा विश्लेषण
    1. क्लिक रसायन प्रतिक्रिया (चरण 2.7) से सतह पर तैरने वाले के 20-40 μL के साथ एक SDS-PAGE चलाएँ। 12% एक्रिलामाइड जैल का उपयोग करें, 1% एसडीएस, 250 एमएम ट्रिस-एचसीएल, 2 एमएम ग्लाइसिन में चलाएं। तब तक चलाएं जब तक कि सामने वाला जेल से बाहर न निकल जाए।
    2. प्रोटीन को नाइट्रोसेल्यूलोज या पीवीडीएफ झिल्ली13 में स्थानांतरित करें।
    3. जीएफपी एंटीबॉडी (1: 500, जीएफपी प्रोटीन मेटआरएस * 5 के साथ सह-अनुवादित है), और बायोटिन एंटीबॉडी (1: 1000) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर झिल्ली को इनक्यूबेट करें, जो बायोटिन से संयुग्मित है।
    4. प्राथमिक एंटीबॉडी को 10 मिनट के लिए 2 बार धोएं और 1.5 घंटे के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ें।
    5. द्वितीयक एंटीबॉडी को 10 मिनट के लिए 2 बार धोएं और स्कैन करें (यदि फ्लोरोफोरे-संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग कर रहे हैं) या फिल्मों के संपर्क में आएं (यदि हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज-संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग कर रहे हैं)।
    6. इमेजजे या इसी तरह के सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके बायोटिन सिग्नल की मात्रा निर्धारित करें, प्रयोग के प्रत्येक नमूने के सामान्य लेबलिंग का मूल्यांकन करें, और संभावित आउटलायर्स का पता लगाएं। प्रयोग के सिग्नल-टू-शोर अनुपात (नकारात्मक नियंत्रण से पृष्ठभूमि के लिए एएनएल नमूना लेबलिंग) का मूल्यांकन करें और उन संभावित जानवरों का पता लगाएं जो एएनएल लेने / शामिल करने में विफल रहे।
      नोट: उच्च एएनएल निगमन वाले नमूनों के लिए, प्रोटीन शुद्धिकरण सैद्धांतिक रूप से गैर-क्लीवर एल्केनीज का उपयोग करके संभव है जैसे कि एएनएल निगमन के मूल्यांकन के लिए इस खंड में उपयोग किया जाता है। मस्तिष्क के नमूनों का उपयोग करते हुए, गैर-क्लीवर एल्केनीज का उपयोग करके प्रोटीन शुद्धिकरण के बाद एमएस द्वारा नकारात्मक नियंत्रणमें प्राप्त पृष्ठभूमि बहुत अधिक है। इसलिए, पहले सामान्य नमूने और प्रयोग मूल्यांकन के लिए केवल आसान-से-हैंडल, गैर-क्लीवर एल्केनेस का उपयोग किया गया था। प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए एल्केन के प्रकार के बावजूद, निम्नलिखित अनुभाग (चरण 2.9) में वर्णित एल्काइन खुराक अनुकूलन के लिए चरणों का प्रदर्शन करना उचित है।
  9. क्लीवर अल्काइन खुराक अनुकूलन के लिए प्रतिक्रिया पर क्लिक करें
    1. एक प्रतिनिधि नमूने के 40 μL के साथ चार ट्यूब तैयार करें (चरण 2.6 में प्राप्त और चरण 2.8 में मूल्यांकन किया गया) और 120 μL की अंतिम मात्रा में PBS (pH 7.8) जोड़ें।
    2. चरण 2.7 में बताए अनुसार क्लिक रसायन विज्ञान प्रतिक्रिया सेट करें लेकिन इस बार, डीएसटी-एल्केन की चार अलग-अलग मात्रा जोड़ें। उक्त एल्केन के लिए, परीक्षण 5 μM, 15 μM, 30 μM, और 60 μM की सिफारिश की जाती है।
    3. सबसे कम पृष्ठभूमि संकेत के साथ उच्चतम लेबलिंग दक्षता के आधार पर, अध्ययन के तहत विशिष्ट प्रयोगात्मक प्रश्न के लिए सबसे उपयुक्त एल्काइन खुराक कौन सा है, यह तय करने के लिए चरण 2.8 दोहराएं।
      नोट: शेष नमूनों को एक क्लिक प्रतिक्रिया के अधीन करने से पहले, किसी भी एल्केन की इष्टतम मात्रा निर्धारित करने की आवश्यकता है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एल्केनीज के कई विकल्प हैं जिनका उपयोग किया जा सकता है। वे दरार के तरीके में भिन्न होते हैं (उदाहरण के लिए, प्रकाश या कम करने वाले एजेंट)। तनाव-प्रचारित अभिकर्मकों (जैसे, डीबीसीओ अभिकर्मकों) का उपयोग करके कॉपर-मुक्त क्लिक रसायन विज्ञान भी संभव है। या तो एल्केनीज या डीबीसीओ अभिकर्मकों की मात्रा में छोटे परिवर्तन अक्सर नकारात्मक नियंत्रण (पृष्ठभूमि) में संकेत को काफी बढ़ाते हैं। यहां, एजेंटों (डाइसल्फ़ाइड बायोटिन एल्केन या डीएसटी-एल्केन15) को कम करके एक डाइसल्फ़ाइड पुल के साथ एक एल्काइन का उपयोग करके प्रोटीन शुद्धिकरण का वर्णन किया गया है। एसडीएस-पेज (चरण 8.1) चलाने के लिए, डीएसटी-एल्केन का उपयोग करते समय, एल्काइन दरार को रोकने के लिए डीटीटी या β-मर्काप्टोथेनॉल जैसे मजबूत कम करने वाले एजेंटों के साथ बफर लोड करने से बचें। इस अध्ययन में, लोडिंग बफर में एन-एथिलमेलीमाइड (एनईएम) के 5 एमएम का उपयोग करके 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करना डीएसटी-एल्केन स्थिरता को प्रभावित नहीं करता है। चरण 2.9.2 को दोहराया जा सकता है, जो सबसे अच्छे की सीमा में अधिक बारीक खुराक का परीक्षण करता है।
  10. प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए प्रारंभिक क्लिक प्रतिक्रिया
    1. चरण 2.9 में निर्धारित इष्टतम एल्काइन खुराक के साथ चरण 2.6 में प्राप्त सभी नमूनों पर क्लिक करें और एसडीएस-पेज और वेस्टर्न ब्लॉट (चरण 2.8) द्वारा एक अंश का विश्लेषण करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि नमूना अपस्केलिंग सटीकता सुनिश्चित करने के लिए पिपेट को ठीक से कैलिब्रेट किया गया है। क्लिक किए गए नमूने कई महीनों (स्टॉप पॉइंट) के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं।

3. प्रोटीन शुद्धिकरण

  1. बफर एक्सचेंज
    1. चरण 2.6 में वर्णित बफर एक्सचेंज प्रक्रिया के लिए सभी क्लिक किए गए नमूनों के अधीन, लेकिन न्यूट्रैविडिन बाइंडिंग बफर का उपयोग संतुलन बफर (पीबीएस पीएच 7.4, 0.15% (डब्ल्यूटी / वॉल्यूम) एसडीएस, 1% (वॉल्यूम / वॉल्यूम) ट्राइटन एक्स -100 और पीआई (1: 2000)) के रूप में करें।
      नोट: एल्यूटेड नमूने कई महीनों (स्टॉप पॉइंट) के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं। इस चरण में, गैर-क्लिक किए गए मुक्त एल्केन को समाप्त कर दिया जाता है, और बफर को न्यूट्राविडिन बाइंडिंग बफर द्वारा आदान-प्रदान किया जाता है।
  2. न्यूट्राविडिन मोतियों के लिए बंधन
    1. न्यूट्राविडिन बाइंडिंग बफर के साथ न्यूट्राविडिन उच्च क्षमता वाले मोतियों को धोएं (चरण 3.1 देखें); बफर के साथ मोतियों को मिलाएं और मिश्रण को 3000 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें, और सुपरनैटेंट को छोड़ दें। तीन बार दोहराएं।
    2. सूखे मोतियों और न्यूट्राविडिन बाइंडिंग बफर की समान मात्रा जोड़कर न्यूट्राविडिन मोतियों का 1: 1 घोल तैयार करें।
    3. प्रत्येक नमूने के 20-40 μL को पूर्व-शुद्ध लाइसेट के रूप में अलग रखें और इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. प्रोटीन सांद्रता को मापें (चरण 2.4 देखें), और चरण 3.2.2 में प्राप्त मोती घोल के 4 μL के साथ 100 μg प्रोटीन मिलाएं।
    5. मिश्रण को निरंतर रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें, जिससे लेबल किए गए प्रोटीन मोतियों से जुड़ सकें।
      नोट: क्लिक रसायन विज्ञान प्रतिक्रिया के लिए, चरण 3.2.4 में वर्णित मूल आत्मीयता शुद्धिकरण प्रतिक्रिया को बढ़ाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हिप्पोकैम्पस के उत्तेजक न्यूरॉन्स से प्रोटीन के शुद्धिकरण के लिए, 1 मिलीग्राम प्रोटीन लाइसेट को न्यूट्राविडिन मोतियों के 40 μL (1: 1 घोल) के साथ मिलाया जाता है। न्यूट्राविडिन मोतियों की मात्रा को कुल प्रोटीन के प्रति मिलीग्राम लेबल प्रोटीन की मात्रा के अनुसार बढ़ाया या घटाया जा सकता है, जो चुने हुए सेल-प्रकार और लेबलिंग अवधि पर निर्भर करेगा और इसे अनुभवजन्य रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता है।
  3. न्यूट्राविडिन मोती धोते हैं और प्रोटीन क्षालन
    1. सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा सुपरनैटेंट एकत्र करें (चरण 3.2.1 देखें)। बाद के विश्लेषण के लिए प्रत्येक सतह पर तैरने वाले के 20-40 μl एलिकोट को अलग रखें और बाकी को -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
    2. बिंदर को ठंडा न्यूट्राविडिन वाशिंग बफर 1 (पीबीएस पीएच 7.4, 0.2% (डब्ल्यूटी /वॉल्यूम) एसडीएस, 1% (वॉल्यूम /वॉल्यूम) ट्राइटन एक्स -100 और पीआई (1: 2000)) के साथ बफर जोड़कर, मोतियों को तलछट करके और सतह पर तैरने वाले को त्यागकर धोएं। इस चरण को तीन बार दोहराएं।
    3. फिर, एक ही बफर जोड़ें और सतह पर तैरने वाले को छोड़ने से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर निरंतर रोटेशन के तहत 10 मिनट के लिए मोतियों को इनक्यूबेट करें। इस चरण को तीन बार दोहराएं।
    4. चरण 3.3.2-3.3.3 में बताए गए अनुसार मोतियों को धोएं, लेकिन न्यूट्राविडिन वाशिंग बफर 2 (1x PBS, pH 7.4, और PI 1: 2000) का उपयोग करें।
    5. चरण 3.3.2-3.3.3 के रूप में बताए गए मोतियों को धोएं, लेकिन न्यूट्राविडिन वॉशिंग बफर 3 (50 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट और पीआई 1: 2000) का उपयोग करें।
    6. उपयोग किए गए सूखे मोतियों की एक मात्रा के अनुरूप न्यूट्राविडिन क्षालन बफर (5% (वॉल्यूम /वॉल्यूम) β-मर्काप्टोएथेनॉल और 0.03% (डब्ल्यूटी / वॉल्यूम) एसडीएस) की मात्रा के साथ 20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मोतियों को इनक्यूबेट करके क्लिक किए गए प्रोटीन को अलग करें।
    7. थर्मोब्लॉक शेकर में निरंतर आंदोलन (1000 आरपीएम) द्वारा क्षालन के दौरान मोतियों को निलंबन में बनाए रखें। दो बार मिलाएं और दोनों एलुएट्स को मिलाएं।
      नोट: घोल (मोतियों) और जलीय चरण (सुपरनैटेंट) के ठोस अंश को अलग करने के लिए स्थापित सेंट्रीफ्यूजेशन, जैसा कि चरण 3.2.1 में समझाया गया है, चरण 3.3.1-3.3.7 पर लागू होता है। यदि प्रोटीन क्षालन पूरा नहीं होता है तो एसडीएस की मात्रा बढ़ाई जा सकती है। हालांकि, एसडीएस के 0.08% -0.1% से अधिक मात्रा के साथ, प्रोटीन विशेष रूप से मोतियों से बंधे नहीं होते हैं। β-मर्काप्टोएथेनॉल अस्थिर और विषाक्त है; चरण 3.3.6-3.3.7 के लिए हुड का उपयोग उचित है। चरण 3.2.3 और 3.3.1 में एकत्र किए गए नमूने एसडीएस-पेज द्वारा चलाए जाने चाहिए और आत्मीयता शुद्धिकरण (चरण 3.3) की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए वेस्टर्न ब्लॉट (चरण 2.8 देखें) द्वारा मूल्यांकन किया जाना चाहिए।
  4. एल्यूटेड प्रोटीन का मूल्यांकन
    1. 1/3 नमूने को एसडीएस-पेज पर लोड करें (चरण 2.8.1 देखें)।
    2. उच्च संवेदनशीलता विधि का उपयोग करके प्रोटीन की कल्पना करने के लिए जेल को दाग दें, जैसे कि चांदी का धुंधलापन या फ्लोरोसेंट विधि।
    3. यदि नमूनों में अपेक्षित गुणवत्ता है, जिसका अर्थ है कि नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में एएनएल लेबल वाले नमूनों में 3-4 गुना अधिक प्रोटीन है, तो एल्यूटेड प्रोटीन को नियमित मास स्पेक्ट्रोमेट्री विधियों द्वारा पहचाना जा सकता है जैसे कि संदर्भ5 में समझाया गया है।

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Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल (चित्रा 1 में संक्षेप में) के बाद, एएनएल को चूहों को 7 दिनों के लिए दैनिक इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन (400 एमएम एएनएल 10 एमएल / किग्रा, नेक्स-क्रे:: मेटआरएस *) द्वारा या पीने के पानी (0.7% माल्टोस, 1% एएनएल, कैमकी-क्रे:: मेटआरएस *) के माध्यम से 21 दिनों के लिए प्रशासित किया गया था। लेबलिंग के बाद, संबंधित मस्तिष्क क्षेत्रों को विच्छेदित, लाइस, एल्काइलेटेड और क्लिक किया गया था। एसडीएस-पेज और वेस्टर्न इम्यूनोब्लॉट द्वारा क्लिक प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण किया गया था। प्रयोगों की प्रतिनिधि छवियों को आईपी इंजेक्शन द्वारा एएनएल प्रशासन के लिए चित्रा 2 में और पीने के पानी के माध्यम से एएनएल प्रशासन के लिए चित्रा 3 में दिखाया गया है। ध्यान दें कि आंकड़ों का उद्देश्य यह दिखाना है कि दोनों लेबलिंग प्रोटोकॉल काम करते हैं, न कि उनकी तुलना करने के लिए। तुलना संभव नहीं है क्योंकि दिखाए गए दो प्रयोगों में विभिन्न न्यूरोनल आबादी को लेबल किया गया है (हिप्पोकैम्पस और कॉर्टेक्स के उत्तेजक न्यूरॉन्स, और सेरिबैलम के पर्किन्जे न्यूरॉन्स)।

एक और प्रयोग इष्टतम डीएसटी-क्लीवर एल्केन एकाग्रता (चित्रा 4) के निर्धारण के लिए एक उदाहरण प्रदान करता है। इस उदाहरण में, लेबल किए गए नमूने और नियंत्रण के बीच गुना परिवर्तन 14 μM की एल्काइन एकाग्रता पर उच्चतम है। यह एल्केन एकाग्रता तब सभी नमूनों पर लागू होती है। चुने हुए एल्काइन राशि के साथ प्रयोग में प्रत्येक नमूने के लेबलिंग के सत्यापन के बाद, सभी नमूनों को न्यूट्रैविडिन मोतियों (चित्रा 5) का उपयोग करके आत्मीयता बंधन द्वारा एएनएल-लेबल / बायोटिन-क्लिक किए गए प्रोटीन के शुद्धिकरण के अधीन किया गया था। इस चरण में, प्रोटीन मोतियों से बंधे होते हैं, धोए जाते हैं, और बाद में डीएसटी-एल्केन में मौजूद डाइसल्फ़ाइड पुल को कम करके अलग हो जाते हैं। इस अंतिम चरण के बाद, बायोटिन और एल्केन का हिस्सा मोतियों से बंधा रहता है। एएनएल युक्त प्रोटीन (बाकी एल्केन से बंधे) क्षालन बफर में बरामद किए जाते हैं। क्षालन चरण की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए, एक तिहाई एलुएट वॉल्यूम को एसडीएस-पेज जेल पर लोड किया जाता है और एक संवेदनशील कुल प्रोटीन दाग विधि का उपयोग करके कल्पना की जाती है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ व्याख्या योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए नकारात्मक नियंत्रण और एएनएल-लेबल नमूनों के बीच कुल प्रोटीन दाग का कम से कम 3 गुना तीव्रता अंतर देखा जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी चरणों के पूरा होने के बाद एमएस नमूना तैयार करना, अधिग्रहण और विश्लेषण5 होगा। यद्यपि एमएस के लिए कोई विशेष आवश्यकताएं नहीं हैं (प्रत्येक प्रयोगशाला अपने नियमित एमएस प्रोटोकॉल 5,10 का उपयोग कर सकती है), यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि शुद्ध प्रोटीन की मात्रा आम तौर पर कम होगी (नैनोग्राम के क्रम में)। चित्रा 6 नियंत्रण (चित्रा 6 ए) की तुलना में एएनएल-लेबल नमूने में स्पष्ट संवर्धन के साथ एमएस परिणामों का एक उदाहरण प्रदान करता है। यह अंतर पहले से ही चित्रा 5 में दिखाए गए कुल प्रोटीन दाग में दिखाई दे रहा था। पेप्टाइड तीव्रता में परिवर्तन के अलावा, दोनों नमूनों में अद्वितीय प्रोटीन भी पाए जाते हैं (चित्रा 6 बी)।

Figure 1
चित्रा 1: बोनकैट द्वारा सेल-प्रकार-विशिष्ट प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए कार्य पाइपलाइन। एएनएल के साथ प्रोटीन लेबलिंग के बाद, रुचि के ऊतक को विच्छेदित और लाइस किया जाता है, क्लिक रसायन विज्ञान द्वारा बायोटिन के साथ टैग किया जाता है, और प्रत्येक नमूने के लिए लेबलिंग की मात्रा का मूल्यांकन बोनकैट द्वारा किया जाता है। आउटलायर्स (जो एएनएल को शामिल करने में विफल रहे) और प्रतिनिधि नमूने इस चरण में विभेदित किए जा सकते हैं। प्रतिनिधि नमूनों में से एक को बाद में प्रोटीन शुद्धिकरण के लिए अनुकूलित क्लीवर एल्केन खुराक खोजने के लिए फिर से क्लिक किया जाता है। सबसे अच्छा सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्राप्त करने वाली एल्काइन खुराक हर जैविक प्रतिकृति पर लागू होती है। सेल-प्रकार-विशिष्ट प्रोटीन आत्मीयता शुद्धिकरण द्वारा प्राप्त किए जाते हैं। शुद्ध नमूने मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा अध्ययन किए जाते हैं, और प्रोटीन की पहचान की जाती है। इस आंकड़े को अल्वारेज़-कैस्टेलाओ एट अल (2017)6 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन (आईपी) द्वारा एएनएल प्रशासन। बोनकैट हिप्पोकैम्पस (एचपी) और कॉर्टेक्स (सीएक्स) में प्रोटीन लेबलिंग का मूल्यांकन करने के लिए 7 दिनों के लिए दैनिक आईपी इंजेक्शन द्वारा एएनएल के साथ प्रोटीन के चयापचय लेबलिंग के बाद किया गया था। नकारात्मक नियंत्रण (डब्ल्यूटी) के रूप में जंगली प्रकार के चूहों के नमूने लेबल किए गए नमूनों (मेटआरएस *) के समानांतर क्लिक किए गए थे। लेबल किए गए प्रोटीन नेक्स-क्रे का उपयोग करके उत्तेजक न्यूरॉन्स से होते हैं: मेटआरएस * लाइन16। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: पीने के पानी द्वारा एएनएल प्रशासन। बोनकैट को 21 दिनों के लिए पीने के पानी के माध्यम से एएनएल के प्रशासन के बाद सेरिबैलम के पर्किन्जे न्यूरॉन्स में प्रोटीन लेबलिंग का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था: एमईटीआरएस * चूहों को 21 दिनों के लिए पीने के पानी के माध्यम से । आंकड़ा एक नकारात्मक नियंत्रण (डब्ल्यूटी) और एक लेबल नमूना (मेटआरएस *) को समानांतर में चित्रित और क्लिक करता है। इस आंकड़े को अल्वारेज़-कैस्टेलाओ एट अल (2017)6 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: डीएसटी-एल्केन खुराक अनुमापन। इष्टतम एल्काइन एकाग्रता को टाइट करने के लिए प्रति प्रयोग एक जैविक प्रतिकृति को प्रतिनिधि नमूने के रूप में चुना जाता है। बोनकैट के लिए क्लिक प्रतिक्रिया में यहां एल्केन की तीन सांद्रता (14, 28, और 56 μM) का परीक्षण किया गया था। एएनएल-लेबल नमूना (मेटआरएस *) और नकारात्मक नियंत्रण (डब्ल्यूटी) के बीच लेबलिंग अनुपात सिग्नल-टू-शोर अनुपात (ग्राफ में दिखाया गया है) निर्धारित करता है। 14 μM इस प्रयोग में प्राप्त सबसे अच्छा अल्किन एकाग्रता है। एएनएल-लेबल नेक्स से कॉर्टेक्स ऊतक:: मेटआरएस * माउस लाइन का उपयोग इस प्रयोग के लिए किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: शुद्ध प्रोटीन। पुरकिंजे न्यूरॉन्स से लेबल किए गए प्रोटीन को एसवाईपीआरओ रूबी का उपयोग करके शुद्ध और दाग दिया गया था। इस आंकड़े को अल्वारेज़-कैस्टेलाओ एट अल (2017)6 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: प्रोटीन की पहचान और परिमाणीकरण। पर्किन्जे सेल प्रोटिओम को जीएडी-क्रे से सेरिबैलम का उपयोग करके मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा प्राप्त किया गया था: मेटआरएस * माउस लाइन शुरुआती सामग्री के रूप में। (ए) जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) चूहों की तुलना में एएनएल लेबल नमूनों में पहचाने गए प्रोटीन की प्रचुरता (पेप्टाइड तीव्रता) में वृद्धि दर्शाता है। (बी) पर्किन्जे प्रोटिओम को ए में एएनएल-लेबल नमूनों में समृद्ध प्रोटीन (डब्ल्यूटी की तुलना में मेटआरएस * चूहों में >3 गुना तीव्रता द्वारा परिभाषित) और मेटआरएस * -व्यक्त चूहों में पाए जाने वाले अद्वितीय प्रोटीन द्वारा प्राप्त किया गया था। इस आंकड़े को अल्वारेज़-कैस्टेलाओ एट अल (2017)6 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण पहलू हैं; डीएसटी-एल्केन का उपयोग करते समय नकारात्मक नियंत्रणों को शामिल करना, पर्याप्त जैविक प्रतिकृतियां, एएनएल प्रशासन मार्ग, मात्रा और अवधि, नमूनों का अल्काइलेशन, एल्केन एकाग्रता और β-मर्कैप्टोएथेनॉल उन्मूलन।

सीआरई ड्राइवर के बिना एएनएल-लेबल वाले जानवरों से आगे बढ़ने वाले नकारात्मक नियंत्रण नमूनों को शामिल करना महत्वपूर्ण है और इसलिए कोई मेटआरएस * अभिव्यक्ति नहीं है। इन नमूनों को एएनएल-लेबल सीआरई-प्रेरित मेटआरएस * चूहों के नमूनों के समानांतर प्रोटोकॉल में वर्णित हर चरण के अधीन किया जाना चाहिए। गैर-क्लिक किए गए नमूने मान्य नियंत्रण नहीं हैं, क्योंकि केवल इस नियंत्रण का उपयोग करके प्राप्त कोई भी परिणाम गैर-विशिष्ट क्लिक के कारण हो सकता है। हमने उन कोशिकाओं में एएनएल का समावेश नहीं देखा है जो मेटआरएस * जीन को व्यक्त नहीं करते हैं, और न ही बिना सीआरई वाली कोशिकाओं में मेटआरएस * अभिव्यक्ति; इस प्रकार, एएनएल के साथ लेबल किए गए डब्ल्यूटी जानवरों को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

यह देखते हुए कि इसके द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल में कई चरण शामिल हैं जहां नमूने खो सकते हैं, तकनीकी विफलता को ध्यान में रखते हुए जैविक प्रतिकृति की गणना करने की सिफारिश की जाती है। मस्तिष्क के नमूनों के लिए, लगभग 30% प्रतिकृति हानि होती है।

हम यहां दो एएनएल प्रशासन मार्गों और अवधियों का वर्णन करते हैं। यह इस बात को बाहर नहीं करता है कि अन्य प्रशासनिक मार्ग (जैसे, भोजन में एएनएल जोड़ना), समान रूप से अच्छी तरह से काम करते हैं। प्रशासित एएनएल राशि के संबंध में, यहां दिखाए गए प्रयोगों को अपेक्षाकृत उच्च मात्रा में एएनएल का उपयोग करके किया गया था। प्रयोगात्मक सेट-अप के आधार पर कम मात्रा के साथ लेबलिंग भी संभव है। इस प्रोटोकॉल में रिपोर्ट की गई एएनएल लेबलिंग का सबसे छोटा समय अवधि 1 सप्ताह है, और सबसे लंबा 21 दिन है। छोटी या लंबी लेबलिंग अवधि लागू की जा सकती है, लेकिन हमने इसे निर्धारित नहीं किया है। शोधकर्ताओं को ऊतक के चयापचय गुणों, सेल-प्रकार की रुचि और अध्ययन के तहत प्रयोगात्मक प्रश्न पर विचार करके अध्ययन के तहत विशिष्ट प्रयोगात्मक प्रश्न के लिए पर्याप्त एएनएल प्रशासन मार्ग, एएनएल खुराक और एएनएल लेबलिंग अवधि निर्धारित करनी चाहिए।

नमूना क्षारीकरण, जिसे कैपिंग के रूप में भी जाना जाता है, पृष्ठभूमि क्लिक17 से बचने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। जब अल्काइलेशन ठीक से किया जाता है, तो नियंत्रण नमूनों द्वारा निगरानी के अनुसार गैर-विशिष्ट क्लिक कम हो जाता है, और नकारात्मक नियंत्रण और एएनएल-लेबल वाले नमूनों के बीच का अंतर बड़ा होता है। अल्काइलेशन के बाद मुफ्त आईएए का उन्मूलन भी एक महत्वपूर्ण कदम है। क्लिक प्रतिक्रिया के दौरान आईएए की छोटी मात्रा की उपस्थिति इसकी दक्षता को सीमित करेगी। कभी-कभी, डीसाल्टिंग चरण जो आईएए (चरण 2.6) को भी समाप्त करता है, को आईएए के उचित निष्कासन को सुनिश्चित करने के लिए दोहराया जाना चाहिए।

विभिन्न कंपनियों से व्यावसायिक रूप से कई बायोटिन-एल्केनेस और -डीबीसीओ अभिकर्मक उपलब्ध हैं। उनके बीच मुख्य अंतर पॉलीथाइलेनग्लाइकोल (पीईजी) लिंकर श्रृंखला की लंबाई और क्लीवर समूहों की अनुपस्थिति, उपस्थिति और प्रकार को मानते हैं। उपयोग किए गए प्रकार के बावजूद, एल्केन की अतिरिक्त मात्रा केवल प्राकृतिक अमीनो एसिड वाले प्रोटीन के लिए गैर-विशिष्ट क्लिक का कारण बनती है। यह आसानी से एल्केन राशि के सटीक और सावधानीपूर्वक अनुमापन द्वारा रोका जा सकता है। जैसा कि वर्णित है, इसे प्राप्त करने का सबसे अच्छा तरीका वास्तविक लाइस्ड और एल्काइलेटेड नमूनों का उपयोग करना है, जिसका उपयोग बाद के प्रोटीन शुद्धिकरण चरणों (चरण 2.6) और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण में किया जा सकता है।

जब क्लिक प्रतिक्रिया में डीएसटी-एल्केनीज का उपयोग किया जाता है, तो β-मर्काप्टोएथेनॉल डाइसल्फ़ाइड पुल को कम करता है और क्षालन चरण (चरण 3.3) में मोतियों से लेबल प्रोटीन को अलग करता है। एमएस के लिए आवश्यक एंजाइमेटिक पाचन की अनुमति देने के लिए नमूनों से β-मर्काप्टोएथेनॉल को हटा दिया जाना चाहिए। ऐसा करने के कई तरीके हैं (उदाहरण के लिए, लियोफिलाइजेशन18, जेल19 से छांटना, या एस-ट्रैप कॉलम20 का उपयोग करके सफाई), और विकल्प एमएस प्रयोगशाला द्वारा नमूनों को संसाधित करना चाहिए।

प्रोटोकॉल में उल्लिखित महत्वपूर्ण चरणों को अनुकूलित करने के लिए विधि के संशोधन और समस्या निवारण को निर्देशित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, यदि बहुत अधिक परिवर्तनशीलता है, तो अधिक जैविक प्रतिकृति जोड़ें; यदि लेबलिंग बहुत कम है, तो एएनएल एकाग्रता बढ़ाएं, लंबे लेबलिंग समय अवधि का उपयोग करें, या अन्य एएनएल प्रशासन मार्गों का परीक्षण करें जो अध्ययन किए गए ऊतक के लिए अधिक कुशल हो सकते हैं। प्रोटीन अल्काइलेशन के लिए, आईएए को जोड़ने के लिए एक पिछला कम करने वाला कदम लागू किया जा सकता है।

विधि की मुख्य सीमा छोटी कोशिका आबादी से उत्पन्न होने वाले प्रोटिओम का शुद्धिकरण है, भले ही एक छोटे ऊतक क्षेत्र को विच्छेदित किया गया हो। अधिक संख्या में सेल आबादी के प्रोटिओम, हालांकि, बड़े ऊतक क्षेत्रों में फैले हुए हैं, उन तक पहुंचना भी मुश्किल है। फिर भी, यहां वर्णित विवो लेबलिंग तकनीक को अभी भी इमेजिंग द्वारा संदर्भित सेल-प्रकारों का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, FUNCAT या FUNCAT-PLA21 के साथ)।

यह विधि वर्तमान में पूर्ण लंबाई वाले प्रोटीन के आधार पर सेल-प्रकार-विशिष्ट प्रोटिओम के विवो अध्ययन और सेल-प्रकार-विशिष्ट पूर्ण प्रोटीन के सीटू विज़ुअलाइज़ेशन के लिए उपलब्ध एकमात्र विधि है। अन्य गैर-कैननिकल अमीनो एसिड जैसे कि एज़िडोहोमोअलेनिन (एएचए) का उपयोग विवो प्रोटीन लेबलिंग और प्रोटिओम के शुद्धिकरण के लिए भी किया जा सकता है, लेकिन सेल सेल-प्रकार विशिष्टता22,23 की कमी है। अन्य दृष्टिकोण जैसे कि प्यूरोमाइसिन प्रोटीन संश्लेषण24,25 की एक निश्चित तस्वीर प्रदान करने के लिए उपयुक्त हैं। फिर भी, लेबलिंग की लंबी अवधि के लिए गैर-कैननिकल अमीनो एसिड का उपयोग करना संभव है, प्रोटीन क्षरण को भी दर्शाता है और अधिक सटीक सेलुलर प्रोटिओम दिखाता है। बायोआईडी आधारित विधियों का उपयोग विशिष्ट उपकोशिकीय क्षेत्रों में प्रोटीन की पहचान करने के लिए किया जाता है, भले ही उनके क्षण / संश्लेषण के स्थानकी परवाह किए बिना।

माउस लाइन में जिसे हमने स्थापित किया है (जैक्सन लैब, स्टॉक नंबर 028071 से उपलब्ध है), उत्परिवर्ती मेथिओनिन टीआरएनए सिंथेटेस (मेटआरएस *) जो कोशिकाओं में एएनएल को शामिल करने की अनुमति देता है, को क्रे निर्भर तरीके से व्यक्त किया जाता है। एक उपकरण के रूप में इस माउस लाइन के साथ, सेल-प्रकारों में विशेष रूप से मेटआरएस * को व्यक्त करना संभव है जिसके लिए क्रे-ड्राइवर लाइनें उपलब्ध हैं। यह व्यवस्था विधि को काफी बहुमुखी प्रतिभा के साथ संपन्न करती है, जिससे यह जैव चिकित्सा अनुसंधान के लगभग हर क्षेत्र में उपयोगी हो जाती है।

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Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

बीए-सी को स्पेनिश विज्ञान और नवाचार मंत्रालय (रामोन वाई कैजल-आरवाईसी 2018-024435-आई), मैड्रिड के स्वायत्त समुदाय (एट्राकिओन डी टैलेंटो -2019 टी 1 / बीएमडी -14057), और एमआईसीआईएनएन (पीआईडी 2020-113270आरए-आई00) अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। आर ए-पी मैड्रिड के स्वायत्त समुदाय (एट्राकिओन डी टैलेंटो -2019 टी 1 / बीएमडी -14057) द्वारा वित्त पोषित है। ईएमएस को मैक्स प्लैंक सोसाइटी द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, यूरोपीय अनुसंधान परिषद (अनुदान 743216), डीएफजी सीआरसी 1080: न्यूरल होमियोस्टेसिस के आणविक और सेलुलर तंत्र, और डीएफजी सीआरसी 902: आरएनए-आधारित विनियमन के आणविक सिद्धांत। हम अपनी तकनीकी सलाह और डीएसटी-एल्केन के संश्लेषण के लिए डीसी डाइटरिच और पी लैंडग्राफ को धन्यवाद देते हैं। हम ई नॉर्थरूप, एस ज़ीस्लर, एस गिल मास्ट, और मस्तिष्क अनुसंधान के लिए एमपीआई की पशु सुविधा को उनके उत्कृष्ट समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं। हम नेक्स-क्रे माउस लाइन साझा करने के लिए सैंड्रा गोएबल्स को धन्यवाद देते हैं। हम अंग्रेजी संपादन के साथ उनकी मदद के लिए एंटोनियो जी कारोगियो को धन्यवाद देते हैं। बी.ए.सी. प्रयोगों को डिजाइन, आयोजित और विश्लेषण किया। बी.एन.ए., डी.ओ.सी., आर.ए.-पी. डी ने प्रयोगों का आयोजन और विश्लेषण किया। बीए-सी और ईएमएस ने प्रयोगों को डिजाइन किया, और परियोजना की देखरेख की, बीए-सी ने पेपर लिखा। सभी लेखकों ने पेपर संपादित किया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Acrylamide gels GenScript SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%
β-Mercaptoethanol Sigma M6250 Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.
Ammonium bicarbonate Sigma 9830 Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood
ANL Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11)
ANL-HCl IrishBotech HAA1625.0500
Benzonase Sigma E1014
Biotin alkyne Thermo, B10185
Chicken antibody anti-GFP Aves 1020
Complete EDTA-free protease inhibitor Roche 4693132001 Toxic; use a lab coat and gloves.
Copper (I) bromide Sigma 254185 99.999% (wt/wt)
Disulfide tag (DST)-alkyne Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20
DMSO Sigma 276855
Filters Merk SCGP00525
Iodo acetamide (IAA) Sigma I1149
IR anti chicken 800 LI-COR IRDye 800CW Donkey anti-Chicken Secondary Antibody
IR anti rabit 680 LI-COR IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody
Maltose Sigma M9171
Manual Mixer BioSpec Products 1083
NaCl Sigma S9888
N-ethylmaleimide Sigma 4259 Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.
NeutrAvidin beads Pierce 29200
Nitrocellulose membrane Bio-rad 1620112
PBS 1X Thermo J62036.K2
PBS 1X pH 7.8 Preparation described in reference number 5
PD SpinTrap G-25 columns GE Healthcare Buffer exchange
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo, 23225 Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life.
Polyclonal rabbit anti-biotin antibody Cell Signaling 5597
PVDF membrane Millipore IPVH00010
SDS 10% Sigma 71736
SDS-PAGE  Running buffer MOPS GenScript M00138
SYPRO Ruby stain Sigma S4942
Table automatic Vortexer Eppendorf Mixmate
Triazole ligand Sigma 678937
Triton X-100 Sigma T9284
Water Sigma W4502 Molecular biology grade

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 182
एक उत्परिवर्ती मेथिओनिन टीआरएनए सिंथेटेस माउस लाइन का उपयोग करके जटिल ऊतकों से सेल-प्रकार विशिष्ट प्रोटीन शुद्धिकरण और पहचान
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Nassim-Assir, B., Ouro Corredera, D., Alvarez-Pardo, R., tom Dieck, S., Ciirdaeva, E., Schuman, E. M., Alvarez-Castelao, B. Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line. J. Vis. Exp. (182), e63713, doi:10.3791/63713 (2022).

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