Summary
该协议描述了如何使用表达突变L274G-蛋氨酸tRNA合成酶(MetRS *)的小鼠系使用叠氮金亮氨酸(ANL)进行细胞类型特异性蛋白质标记,以及标记细胞类型特异性蛋白质分离的必要步骤。我们通过(1)饮用水和(2)腹膜内注射概述了活小鼠中两种可能的ANL给药途径。
Abstract
了解 体内 蛋白质稳态是了解细胞在生理和疾病条件下如何工作的关键。本协议描述了使用工程小鼠系对新合成的蛋白质进行 体内 标记和随后的纯化,以将蛋白质标记定向到特定的细胞群。它是L274G-蛋氨酸tRNA合成酶(MetRS*)的Cre重组酶表达的诱导系,使叠氮白氨酸(ANL)掺入蛋白质中,否则不会发生。使用此处描述的方法,可以纯化 体内 标记的细胞类型特异性蛋白质组,并检测由于样品复杂性降低而导致的蛋白质含量的细微变化。
Introduction
异常蛋白质稳态是由蛋白质合成和降解的不平衡引起的。几种疾病与蛋白质稳态的改变有关。某些疾病的标志是聚集体存在于不同的亚细胞位置和大脑区域。蛋白质稳态不仅在疾病中很重要,而且在正常器官和细胞功能中也起着至关重要的作用1。例如,蛋白质合成对于许多形式的神经元可塑性2,3是必需的,这是通过使用阻断蛋白质合成的化学抑制剂4来确定的。然而,既不清楚蛋白质组在哪种细胞类型中被改变以支持学习和记忆,也不清楚每种细胞类型中的哪些特定蛋白质在其合成或降解中增加或减少。因此,蛋白质稳态的综合研究需要能够区分来自特定细胞类型的蛋白质组。事实上,鉴定细胞类型特异性蛋白质组以研究多细胞环境中发生的细胞过程一直是蛋白质组学的一个重要障碍。出于这个原因,我们开发了一种使用MetRS*表达结合生物正交方法的技术,该技术已被证明是鉴定和纯化细胞类型特异性蛋白质组的有效方法,填补了这一空白5,6,7。
突变体MetRS*(MetRS L274G)的表达允许将非规范蛋氨酸类似物ANL加载到相应的tRNA8,9中,并随后将其掺入蛋白质中。当MetRS*表达被细胞类型特异性启动子调节时,非规范氨基酸将以细胞选择性方式掺入蛋白质中。一旦ANL掺入蛋白质中,就可以通过点击化学选择性地进行功能化,随后通过成像(FUNCAT)或蛋白质免疫印迹(BONCAT)进行可视化。或者,蛋白质可以通过质谱(MS)选择性纯化和鉴定。使用这项技术,我们在Cre重组酶的控制下创建了一个表达MetRS*蛋白的小鼠系。考虑到可用的Cre-mouse系数量不断增加,MetRS*系统可用于任何领域,以研究来自存在Cre系的任何组织的任何细胞类型。ANL的蛋白质标记可以在体外或体内进行,并且不会改变小鼠的行为或蛋白质完整性6。标记时间跨度可以适应每个研究人员的科学问题,标记新合成的蛋白质(较短的标记时间)或整个蛋白质组(较长的标记时间)。该技术的使用受到研究人员愿意研究的类型细胞数量的限制;因此,这种方法无法从低数量或低代谢率的细胞类型中分离蛋白质。所提出的方法的目标是鉴定体内标记的细胞类型特异性蛋白质/蛋白质组。在该协议中,我们描述了如何在活小鼠中用ANL标记细胞类型特异性蛋白质组并纯化标记的蛋白质。纯化后,蛋白质可以通过常规质谱方案5,10进行鉴定。通过从特定细胞群中选择性纯化蛋白质,该方法降低了样品复杂性,使实验者能够检测蛋白质组的细微变化,例如响应环境变化。标记蛋白的纯化可以在~10天内实现,不包括MS分析或标记期。在这里,我们描述了两种向表达MetRS*的小鼠施用ANL的方法,即(1)在饮用水中添加氨基酸,和(2)通过腹膜内注射引入ANL。无论选择哪种方法进行ANL给药,分离和纯化步骤都是相同的(从步骤2开始)。
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Protocol
所有动物实验均在德国(RP Darmstadt;协议:V54-19c20/15-F122/14、V54-19c20/15-F126/1012)或西班牙(UCM动物实验委员会和马德里市环境咨询委员会,协议号:PROEX 005.0/21)的许可下进行,并符合马克斯普朗克学会规则和西班牙法规,并遵循欧盟动物福利准则。
1 . ANL体内代谢标记
- 饮用水:
- 将ANL和麦芽糖溶解在小鼠的常规饮用水中。推荐的麦芽糖浓度为0.7%(重量/体积)。添加到饮用水中的最大ANL量为1%(重量/体积)。混合物准备好后,通过过滤对其进行灭菌并将其储存在4°C。
- 将步骤1.1中制备的混合物提供给小鼠。经常更换瓶子(例如,每3天一次)以避免污染,并每天检查它们以寻找可能的污染或堵塞。通过称重来监测每天喝水量,以了解小鼠的ANL摄入量。
注意:这里评估的最长标记期是 3 周,使用 ANL 在饮用水中的 1% 浓度,这导致大脑中可很好地检测到标记。良好的标签也可以在 2 周内实现。我们使用这种管理方法既没有研究较短的标记时间,也没有较长的时间点或其他ANL量,这并不意味着上述方法不起作用。ANL掺入率可能因研究的组织或细胞类型而异。标记的时间可能因科学问题而异;例如,如果要标记蛋白质组,则应根据所研究组织中蛋白质的平均半衰期来计算标记时间。如果兴趣只是识别新合成的蛋白质,则可以缩短时间。标记周期和ANL剂量必须针对每个实验条件和感兴趣的细胞类型进行经验测试。
- 腹膜内给药:
- 将ANL溶解在生理NaCl溶液中至400 mM,磷酸盐缓冲液(PBS)或水中。
- 确保溶液的渗透压在生理范围内。在这里,向小鼠施用10mL / kg体重的ANL溶液。
注意:通过每天腹膜内注射(IP)和400mM ANL成功获得大脑兴奋性神经元中的良好标记,持续1周。在本研究中,较低的ANL浓度或其他IP注入标记期均未进行测试,这并不意味着它们不起作用。ANL由一些公司以盐酸盐形式供应。在这种情况下,必须将溶液的pH调节到足够的pH值(取决于给药途径)。ANL也可以按照Link等人发表的方法合成11 ,并进行一些修改5。可以使用其他 ANL 浓度、时间跨度和管理途径进行 ANL 标记。对于代谢率低的组织/细胞类型,可以使用低含量蛋氨酸饮食,始终在 ANL 给药前 1 周开始。当使用400mM ANL时,它在4°C储存时会沉淀;加热至37°C将ANL带回溶液中。注射前让它达到室温。在世界上大多数地区,对小鼠的ANL给药是一项动物实验,需要得到有关当局的批准。
2. 组织收获、裂解和蛋白质提取
- 组织解剖:解剖含有感兴趣细胞类型的组织区域,并注意收集的组织块的重量。
注意:样品可以在-80°C下储存数月(停止点)。在本协议中,解剖小鼠皮层和海马体。 - 组织裂解:在室温下通过添加12-15倍于裂解缓冲液组织湿重的体积(PBS pH 7.4,1%重量/体积SDS,1%(体积/体积)Triton X-100,苯佐酶(1:1000体积/体积),蛋白酶抑制剂(PI)(EDTA游离1:4000))在室温下匀浆组织。例如,对于 20 mg 组织片,加入 240-300 μL 裂解缓冲液。研磨组织直至其均质化。
注意:样品可以在-80°C下储存数月(停止点)。对于在 1.5 mL 管中直接匀浆,建议使用手持式电池供电均质器,尤其是在处理小块组织时。对于较大的工件,可以使用 Dounce 均质机。对于包含蛋白酶抑制剂(PI)的每种缓冲液,应在使用前立即添加,而不是更早添加。 - 蛋白质变性:将匀浆加热至75°C15分钟,并在10°C下以17,000× g 离心15分钟。 将上清液转移到新管中。
- 蛋白质含量测量:测量每个样品的蛋白质浓度,并将所有要比较的样品调整为相同的蛋白质浓度;通过添加裂解缓冲液来调节浓度。最佳浓度范围在 2-4 μg/μL 之间。
注意:样品可以在-80°C下储存数月(停止点)。 - 烷基化
- 将均质样品在PBS(pH 7.8)+ PI(不含EDTA的1:4000)中稀释2-3倍。
- 加入碘乙酰胺(IAA)至终浓度为20mM(储备溶液500mM)。
- 将样品在20°C下在黑暗中放置1-2小时。执行步骤 2.5.2-2.5.3 两次。
注意:对于某些组织,如果阴性对照中的非特异性点击仍然很高,则可能需要在烷基化12之前执行还原步骤。在将IAA原液添加到样品中之前,请新鲜制备IAA原液。样品可在-80°C下储存数月(停止点)。
- 缓冲液置换:使用点击化学交换缓冲液(PBS pH 7.8、0.04%(重量/体积)SDS、0.08%(体积/体积)Triton X-100和PI(1:4000))平衡缓冲液交换柱。按照制造商的说明进行操作。更换所有烷基化样品。
注意:洗脱的样品可在-80°C下储存数月(停止点)。在此步骤中,消除了IAA,并通过点击化学缓冲液交换缓冲液。在缓冲液交换步骤后可以再次测量蛋白质,以确保蛋白质在缓冲液交换过程中不会丢失。根据用于缓冲液交换的色谱柱类型,蛋白质可能会大量丢失。使用推荐的色谱柱以避免蛋白质损失。对于样品储存,建议制备等分试样。 - 单击反应以评估实验中的ANL掺入
- 在步骤 2.6 中取 40 μL 洗脱样品,并加入 PBS (pH 7.8) 至最终体积为 120 μL。
- 要设置点击化学反应,请按给定顺序添加以下试剂,并在每次加入后涡旋20秒:1.5 μL 三唑配体(库存 40 mM)、1.5 μL 生物素炔烃(库存 5 mM)和 1 μL 溴化铜(I)(库存 10 mg/mL,通过小心上下移液溶解在 DMSO 中, 不要涡旋)。尽快添加试剂。
- 将样品在4°C的黑暗中连续旋转孵育过夜。
- 将样品在4°C下以17,000× g离心5分钟。可以看到略带绿松石色的颗粒。将上清液转移到新管中。
注意:使用前立即准备溴化铜(I)原料,以避免铜氧化。保持裂解样品与样品之间PBS之间的体积比恒定对于确保每个试管中的最终洗涤剂浓度相同至关重要。为了加快点击化学反应的组装,建议使用带有管架的工作台式涡旋器。将点击的样品在-80°C下储存数月,或在-20°C下储存数周,直到进一步处理(停止点)。
- 蛋白质印迹分析以评估实验中的ANL掺入
- 使用来自点击化学反应的 20-40 μL 上清液运行 SDS-PAGE(步骤 2.7)。使用12%丙烯酰胺凝胶,在1%SDS,250 mM Tris-HCl,2 mM甘氨酸中运行。运行直到前面从凝胶中取出。
- 将蛋白质转移到硝酸纤维素或PVDF膜13上。
- 将膜在4°C下与GFP抗体(1:500,GFP蛋白与MetRS * 5共翻译)和生物素抗体(1:1000)孵育过夜,用于点击炔烃检测,其与生物素偶联。
- 洗涤一抗2次10分钟,加入二抗1.5小时。
- 洗涤二抗2次10分钟并扫描(如果使用荧光团偶联抗体)或暴露于薄膜(如果使用辣根过氧化物酶偶联抗体)。
- 使用 ImageJ 或类似软件量化生物素信号,评估实验每个样品的一般标记,并检测可能的异常值。评估实验的信噪比(ANL样品标记与阴性对照的背景),并检测未能吸收/合并ANL的可能动物。
注意:对于ANL掺入率高的样品,理论上可以使用不可裂解的炔烃进行蛋白质纯化,例如本节中用于评估ANL掺入的炔烃。使用脑样品,使用不可裂解炔烃纯化蛋白质后MS在阴性对照中获得的背景过高14。因此,只有更易于处理、不可裂解的炔烃用于首次一般样品和实验评估。无论用于蛋白质纯化的炔烃类型如何,建议执行下一节(步骤2.9)中描述的炔烃剂量优化步骤。
- 点击反应优化可裂解炔烃剂量
- 用 40 μL 一个代表性样品(在步骤 2.6 中获得并在步骤 2.8 中评估)制备四个试管,并将 PBS (pH 7.8) 加入到 120 μL 的最终体积中。
- 按照步骤2.7中的说明设置点击化学反应,但这次,添加四种不同量的DST-炔烃。对于所述炔烃,建议测试5μM,15μM,30μM和60μM。
- 重复步骤2.8,根据背景信号最高的标记效率和最低的背景信号,确定哪种炔烃剂量最适合正在研究的特定实验问题。
注意:在对剩余样品进行点击反应之前,需要确定任何炔烃的最佳量。可以使用几种市售炔烃。它们在裂解方式上有所不同(例如,轻剂或还原剂)。使用菌株促进试剂(例如DBCO试剂)进行无铜点击化学也是可能的。炔烃或DBCO试剂量的微小变化通常会显着增加阴性对照(背景)中的信号。这里描述了使用具有可通过还原剂裂解的二硫键炔烃(二硫生物素炔烃或DST-炔烃15)的蛋白质纯化。使用DST炔烃运行时,为了运行SDS-PAGE(步骤8.1),请避免用强还原剂(如DTT或β-巯基乙醇)加载缓冲液,以防止炔烃裂解。在本研究中,在72°C下加热5分钟,在上样缓冲液中使用5mM的N-乙基马来酰亚胺(NEM)不影响DST-炔烃稳定性。步骤2.9.2可以重复,在观察到的最佳剂量范围内测试更细粒度的剂量。
- 用于蛋白质纯化的制备型点击反应
- 使用步骤2.9中确定的最佳炔烃剂量单击步骤2.6中获得的所有样品,并通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析馏分(步骤2.8)。
注意:确保移液器已正确校准,以确保样品升标精度。点击的样品可以在-80°C下储存数月(停止点)。
- 使用步骤2.9中确定的最佳炔烃剂量单击步骤2.6中获得的所有样品,并通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析馏分(步骤2.8)。
3. 蛋白质纯化
- 缓冲液交换
- 如步骤2.6所述,将所有点击的样品置于缓冲液交换程序,但使用Neutravidin结合缓冲液作为平衡缓冲液(PBS pH 7.4,0.15%(重量/体积)SDS,1%(体积/体积)Triton X-100和PI(1:2000))。
注意:洗脱的样品可在-80°C下储存数月(停止点)。在此步骤中,去除未点击的游离炔烃,并通过中性粒细胞素结合缓冲液交换缓冲液。
- 如步骤2.6所述,将所有点击的样品置于缓冲液交换程序,但使用Neutravidin结合缓冲液作为平衡缓冲液(PBS pH 7.4,0.15%(重量/体积)SDS,1%(体积/体积)Triton X-100和PI(1:2000))。
- 与中性粒细胞蛋白珠结合
- 用中性粒细胞素结合缓冲液洗涤中性粒细胞素高容量珠子(参见步骤3.1);将珠子与缓冲液混合,并以3000× g离心混合物5分钟,弃去上清液。重复三次。
- 通过加入相同体积的干珠和中性粒素结合缓冲液来制备 1:1 的中性粒细胞素珠浆液。
- 留出20-40μL的每个样品作为预纯化的裂解物,并将其储存在-20°C。
- 测量蛋白质浓度(参见步骤2.4),并将100μg蛋白质与步骤3.2.2中获得的4μL珠浆混合。
- 将混合物在4°C下连续旋转孵育过夜,使标记的蛋白质能够与磁珠结合。
注意:对于点击化学反应,可以升级步骤3.2.4中描述的基本亲和纯化反应。例如,为了从海马体的兴奋性神经元中纯化蛋白质,将1mg蛋白质裂解物与40μL中性粒细胞素珠(1:1浆液)混合。Neutravidin 珠子的量可以根据每毫克总蛋白质的标记蛋白量放大或缩小,这将取决于所选的细胞类型和标记期,需要根据经验确定。
- 中性粒蛋白珠洗涤和蛋白质洗脱
- 通过离心收集上清液(参见步骤3.2.1)。将每种上清液的20-40μl等分试样放在一边以供以后分析,并将其余液在-80°C冷冻。
- 通过添加缓冲液、沉淀珠子并丢弃上清液,用冷却的 Neutravidin 洗涤缓冲液 1(PBS pH 7.4、0.2%(重量/体积)SDS、1%(体积/体积)Triton X-100 和 PI (1:2000))洗涤珠子。重复此步骤三次。
- 然后,加入相同的缓冲液,并将珠子在4°C下连续旋转孵育10分钟,然后弃去上清液。重复此步骤三次。
- 按照步骤3.3.2-3.3.3中的说明洗涤珠子,但使用中性粒细胞素洗涤缓冲液2(1x PBS,pH 7.4和PI 1:2000)。
- 按照步骤3.3.2-3.3.3的解释洗涤珠子,但使用中性粒细胞素洗涤缓冲液3(50mM碳酸氢铵和PI 1:2000)。
- 通过将磁珠在20°C下孵育30分钟与对应于所用干珠体积的体积的Neutravidin洗脱缓冲液(5%(体积/体积)β-巯基乙醇和0.03%(wt/vol)SDS))洗脱点击的蛋白质。
- 在洗脱过程中通过在热块振荡器中连续搅拌(1000rpm)保持珠子悬浮。洗脱两次并合并两种洗脱液。
注:如步骤3.2.1所述,用于分离浆料(珠子)和水相(上清液)的固体部分的离心装置适用于步骤3.3.1-3.3.7。如果蛋白质洗脱不完全,可以增加SDS量。然而,当量高于SDS的0.08%-0.1%时,与磁珠非特异性结合的蛋白质开始洗脱。β-巯基乙醇具有挥发性和毒性;建议在步骤3.3.6-3.3.7中使用罩。在步骤3.2.3和3.3.1中收集的样品应通过SDS-PAGE运行,并通过蛋白质印迹(参见步骤2.8)进行评估,以评估亲和纯化的效率(步骤3.3)。
- 洗脱蛋白的评估
- 将1/3的洗脱样品加载到SDS-PAGE中(参见步骤2.8.1)。
- 使用高灵敏度方法(例如银染或荧光方法)对凝胶进行染色以可视化蛋白质。
- 如果样品具有预期的质量,这意味着ANL标记样品中的蛋白质比阴性对照多3-4倍,则可以通过常规质谱方法鉴定洗脱的蛋白质,如参考文献5中解释的方法。
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Representative Results
按照所描述的方案(总结在图1中),通过每日腹膜内注射(400mM ANL 10mL / kg,Nex-Cre::MetRS*)7天或通过饮用水(0.7%麦芽糖,1%ANL,CamkII-Cre::MetRS*)给予小鼠ANL21天。标记后,对相应的脑区域进行解剖、裂解、烷基化和点击。点击反应通过SDS-PAGE和蛋白质免疫印迹进行分析。实验的代表性图像如图2所示,用于通过IP注入进行ANL给药,图3显示了通过饮用水进行ANL给药的图像。请注意,这些数字的目的是表明两种标记协议都有效,而不是比较它们。比较是不可能的,因为在所示的两个实验中标记了不同的神经元群(海马体和皮层的兴奋性神经元,以及小脑的浦肯野神经元)。
进一步的实验为确定最佳DST可裂解炔烃浓度提供了示例(图4)。在本例中,当炔烃浓度为14μM时,标记样品和对照之间的倍数变化最高。然后将该炔烃浓度应用于所有样品。在用所选的炔烃量验证实验中每个样品的标记后,通过使用Neutravidin珠的亲和结合对所有样品进行ANL标记/生物素点击蛋白的纯化(图5)。在此步骤中,蛋白质与磁珠结合,洗涤,随后通过还原DST-炔烃中存在的二硫键洗脱。在最后一步之后,生物素和部分炔烃仍然与珠子结合。含ANL的蛋白质(与其余炔烃结合)在洗脱缓冲液中回收。为了评估洗脱步骤的效率,将洗脱液体积的三分之一上样到SDS-PAGE凝胶上,并使用灵敏的总蛋白染色法进行可视化。必须观察阴性对照和ANL标记样品之间总蛋白染色的至少3倍强度差异,才能通过质谱获得可解释的结果。完成本协议中描述的所有步骤后,将进行MS样品制备,采集和分析5。虽然对MS没有特殊要求(每个实验室都可以使用其常规MS方案5,10),但应该记住,纯化蛋白质的量通常较低(以纳克为单位)。图6提供了MS结果的示例,与对照相比,ANL标记的样品中有明显的富集(图6A)。这种差异在图5所示的总蛋白染色中已经可见。除了肽强度的变化外,在两个样品中还发现了独特的蛋白质(图6B)。
图 1:BONCAT 细胞类型特异性蛋白质纯化的工作流程。 用ANL标记蛋白质后,对感兴趣的组织进行解剖和裂解,通过点击化学用生物素标记,并通过BONCAT评估每个样品的标记量。在此步骤中,可以区分异常值(未能纳入ANL)和代表性样本。再次点击其中一个代表性样品,找到优化的可裂解炔烃剂量,用于后续的蛋白质纯化。达到最佳信噪比的炔烃剂量适用于每个生物重复。通过亲和纯化获得细胞类型特异性蛋白质。通过质谱法研究纯化的样品,并鉴定蛋白质。该数字已从Alvarez-Castelao等人(2017)6修改。 请点击此处查看此图的大图。
图2:通过腹膜内注射(IP)给予ANL。 进行BONCAT以评估通过每日IP注射7天用ANL对蛋白质进行代谢标记后海马(HP)和皮层(CX)中的蛋白质标记。将野生型小鼠样品作为阴性对照(wt)与标记样品(MetRS*)平行点击。标记的蛋白质来自使用Nex-Cre::MetRS*线16的兴奋性神经元。 请点击此处查看此图的大图。
图3:通过饮用水给予ANL。 进行BONCAT以评估通过饮用水 将 ANL施用GAD-Cre::MetRS*小鼠21天后小脑浦肯野神经元中的蛋白质标记。该图显示了阴性对照(wt)和标记样品(MetRS*)并行裂解和点击。该数字已从Alvarez-Castelao等人(2017)6修改。 请点击此处查看此图的大图。
图 4:DST-炔烃剂量滴定。 每个实验选择一个生物学重复作为代表性样品,以滴定最佳炔烃浓度。在BONCAT的点击反应中测试了三种浓度(14,28和56μM)的炔烃。ANL标记样品(MetRS*)和阴性对照(wt)之间的标记比决定了信噪比(如图所示)。14μM是本实验中获得最佳炔烃浓度。来自ANL标记的Nex::MetRS*小鼠系的皮层组织用于本实验。 请点击此处查看此图的大图。
图 5:纯化的蛋白质。 来自浦肯野神经元的标记蛋白使用SYPRO Ruby纯化和染色。该数字已从Alvarez-Castelao等人(2017)6修改。 请点击此处查看此图的大图。
图 6:蛋白质鉴定和定量。 浦肯野细胞蛋白质组是使用来自GAD-Cre::MetRS*小鼠系的小脑作为起始材料的质谱法获得的。(A)显示与野生型(wt)小鼠相比,ANL标记样品中鉴定的蛋白质的丰度(肽强度)增加。(B)浦肯野蛋白质组是通过将富含ANL标记样品中的蛋白质混合在A中(定义为MetRS*小鼠的强度是>wt的3倍)和在表达MetRS*的小鼠中发现的独特蛋白质而获得的。该数字已从Alvarez-Castelao等人(2017)6修改。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
该协议的关键方面是;包括阴性对照,具有足够的生物学重复,ANL给药途径,数量和持续时间,样品的烷基化,炔烃浓度以及使用DST-炔烃时的β-巯基乙醇消除。
关键是要包括来自ANL标记动物的阴性对照样品,没有Cre驱动程序,因此没有MetRS*表达。这些样品必须与来自ANL标记的Cre诱导的MetRS*小鼠的样品并行进行协议中描述的每个步骤。未单击的样本不是有效的控件,因为仅使用此控件获得的任何结果都可能是由于非特定单击造成的。我们没有观察到ANL在不表达MetRS*基因的细胞中掺入,也没有观察到MetRS*在没有Cre的细胞中表达;因此,用ANL标记的WT动物可用作阴性对照。
鉴于此处描述的方案包括许多可能丢失样品的步骤,建议在计算生物学重复时牢记技术故障。对于脑样本,大约有30%的重复损失。
我们在这里描述两种 ANL 管理途径和持续时间。这并不排除其他给药途径(例如,在食物中添加ANL)同样有效。关于施用的ANL量,这里显示的实验是使用相对大量的ANL进行的。根据实验设置,也可以使用较低量的标记。该协议中报告的ANL标记的最短时间跨度为1周,最长为21天。可以应用更短或更长的标记期,但我们尚未确定。研究人员应通过考虑组织的代谢特性、感兴趣的细胞类型和正在研究的实验问题,确定适合所研究特定实验问题的 ANL 给药途径、ANL 剂量和 ANL 标记期。
样品烷基化,也称为封端,是避免背景点击的重要步骤17。当正确进行烷基化时,对照样品监测的非特异性点击减少,阴性对照和ANL标记样品之间的差异更大。烷基化后消除游离IAA也是关键步骤。点击反应期间少量IAA的存在将限制其效率。有时,必须重复也消除IAA的脱盐步骤(步骤2.6),以确保正确去除IAA。
有几种生物素-炔烃和-DBCO试剂可从各种公司获得。它们之间的主要区别在于聚乙二醇(PEG)接头链长度以及可裂解基团的缺失、存在和类型。无论使用哪种类型,过量的炔烃都会导致仅携带天然氨基酸的蛋白质的非特异性点击。通过精确和仔细地滴定炔烃量可以很容易地防止这种情况。如上所述,实现这一目标的最佳方法是使用实际裂解和烷基化的样品,用于随后的蛋白质纯化步骤(步骤2.6)和质谱分析。
当在点击反应中使用DST-炔烃时,β-巯基乙醇在洗脱步骤中还原二硫键并将标记的蛋白质从珠子中解离(步骤3.3)。必须从样品中除去β-巯基乙醇,以允许MS所需的酶消化。有几种方法可以做到这一点(例如,冻干18,从凝胶中切除19或使用S-Trap色谱柱20进行清洁),应由处理样品的MS实验室进行选择。
应指导对方法进行修改和故障排除,以优化协议中提到的关键步骤。例如,如果变异性太大,请添加更多的生物学重复;如果标记太低,增加ANL浓度,使用更长的标记时间跨度,或测试其他可能对研究组织更有效的ANL给药途径。对于蛋白质烷基化,可以实施先前添加IAA的还原步骤。
该方法的主要局限性是即使解剖了很小的组织区域,也能纯化来自小细胞群的蛋白质组。然而,分布在较大组织区域的更多细胞群的蛋白质组也难以获得。尽管如此,这里描述的 体内 标记技术仍然可以用于通过成像(例如,使用FUNCAT或FUNCAT-PLA21)评估所指的细胞类型。
该方法是目前唯一可用于基于全长蛋白质的细胞类型特异性蛋白质组的 体内 研究和细胞类型特异性完整蛋白质原 位 可视化的方法。其他非规范氨基酸如叠氮高丙氨酸(AHA)也可用于蛋白质组的 体内蛋白质 标记和纯化,但缺乏细胞类型特异性22,23。其它方法如嘌呤霉素适用于提供蛋白质合成的固定图像24,25。然而,使用非规范氨基酸进行更长时间的标记是可能的,这也反映了蛋白质降解并显示出更准确的细胞蛋白质组。基于BioID的方法用于鉴定特定亚细胞区域中的蛋白质,无论其合成的时刻/位置如何26。
在我们建立的小鼠系(可从杰克逊实验室获得,库存号028071)中,允许将ANL掺入细胞中的突变蛋氨酸tRNA合成酶(MetRS*)以Cre依赖性方式表达。使用该鼠标系作为工具,可以在可用的Cre-driver系的细胞类型中专门表达MetRS*。这种安排赋予了该方法相当大的多功能性,使其在生物医学研究的几乎每个领域都很有用。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
B.A-C由西班牙科学与创新部(Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I)、马德里自治区(Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057)和MICINN(PID2020-113270RA-I00)资助。R. A-P由马德里自治区(Atracción de Talento-2019T1 / BMD-14057)资助。E.M.S.由马克斯·普朗克学会资助,该学会是欧洲研究理事会的高级研究者奖(赠款743216),DFG CRC 1080:神经稳态的分子和细胞机制,以及DFG CRC 902:基于RNA的调控的分子原理。我们感谢D.C Dieterich和P. Landgraf的技术建议和DST-炔烃的合成。我们感谢E. Northrup,S. Zeissler,S. Gil Mast和MPI脑研究动物设施的出色支持。我们感谢Sandra Goebbels分享Nex-Cre鼠标系列。我们感谢Antonio G. Carroggio在英文编辑方面的帮助。B.A-C.设计、进行和分析实验。B.N-A、D.O.C、R.A-P、C.E.和S.T.D.进行和分析实验。B.A-C和E.M.S.设计实验,并监督该项目,B.A-C撰写了这篇论文。所有作者都编辑了这篇论文。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
12% Acrylamide gels | GenScript | SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12% | |
β-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood |
ANL | Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11) | ||
ANL-HCl | IrishBotech | HAA1625.0500 | |
Benzonase | Sigma | E1014 | |
Biotin alkyne | Thermo, | B10185 | |
Chicken antibody anti-GFP | Aves | 1020 | |
Complete EDTA-free protease inhibitor | Roche | 4693132001 | Toxic; use a lab coat and gloves. |
Copper (I) bromide | Sigma | 254185 | 99.999% (wt/wt) |
Disulfide tag (DST)-alkyne | Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20 | ||
DMSO | Sigma | 276855 | |
Filters | Merk | SCGP00525 | |
Iodo acetamide (IAA) | Sigma | I1149 | |
IR anti chicken 800 | LI-COR | IRDye 800CW | Donkey anti-Chicken Secondary Antibody |
IR anti rabit 680 | LI-COR | IRDye 680RD | Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody |
Maltose | Sigma | M9171 | |
Manual Mixer | BioSpec Products | 1083 | |
NaCl | Sigma | S9888 | |
N-ethylmaleimide | Sigma | 4259 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
NeutrAvidin beads | Pierce | 29200 | |
Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 1620112 | |
PBS 1X | Thermo | J62036.K2 | |
PBS 1X pH 7.8 | Preparation described in reference number 5 | ||
PD SpinTrap G-25 columns | GE Healthcare | Buffer exchange | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo, | 23225 | Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life. |
Polyclonal rabbit anti-biotin antibody | Cell Signaling | 5597 | |
PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
SDS 10% | Sigma | 71736 | |
SDS-PAGE Running buffer MOPS | GenScript | M00138 | |
SYPRO Ruby stain | Sigma | S4942 | |
Table automatic Vortexer | Eppendorf | Mixmate | |
Triazole ligand | Sigma | 678937 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Water | Sigma | W4502 | Molecular biology grade |
References
- Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M.
The regulation of synaptic protein turnover. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015). - Sutton, M. A., Schuman, E. M. Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory. Cell. 127 (1), 49-58 (2006).
- Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons. Elife. 9, 52939 (2020).
- Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. Memory in mice as affected by intracerebral puromycin. Science. 141 (3575), 57-59 (1963).
- Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo. Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).
- Alvarez-Castelao, B., et al. Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo. Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).
- Ngo, J. T., et al.
Cell-selective metabolic labeling of proteins. Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009). - Mahdavi, A., et al. Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis. Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).
- Yuet, K. P., et al. Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).
- Patel, V. J., et al. A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).
- Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer. Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).
- Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes. Methods in Molecular Biology. 1266, Clifton, N.J. 199-215 (2015).
- Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L.
Analysis of proteins by immunoblotting. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021). - Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).
- Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
- Goebbels, S., et al. Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice. Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).
- van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).
- O'Fagain, C.
Lyophilization of proteins. Methods in Molecular Biology. 244, Clifton, N.J. 309-321 (2004). - Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).
- tom Dieck, S., et al. Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ. Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).
- McShane, E., et al. Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation. Cell. 167 (3), 803-815 (2016).
- Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome. Scientific Reports. 6, 32377 (2016).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. BioID: A screen for protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).