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Neuroscience

Purificazione e identificazione di proteine specifiche per tipo cellulare da tessuti complessi utilizzando una linea murina di topo di metionina tRNA sintetasi mutante

Published: April 13, 2022 doi: 10.3791/63713
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 1, 2
1Max-Planck-Institute for Brain Research, Synaptic Plasticity Department, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Veterinary School, Complutense University of Madrid

Summary

Questo protocollo descrive come eseguire la marcatura proteica specifica del tipo di cellula con azidonorleucina (ANL) utilizzando una linea murina che esprime una sintetasi tRNA mutante L274G-Metionina (MetRS*) e i passaggi necessari per l'isolamento delle proteine marcate specifiche del tipo di cellula. Descriviamo due possibili vie di somministrazione di ANL in topi vivi mediante (1) acqua potabile e (2) iniezioni intraperitoneali.

Abstract

Comprendere l'omeostasi proteica in vivo è la chiave per sapere come funzionano le cellule sia in condizioni fisiologiche che di malattia. Il presente protocollo descrive la marcatura in vivo e la successiva purificazione di proteine di nuova sintesi utilizzando una linea di topi ingegnerizzata per indirizzare l'etichettatura delle proteine a specifiche popolazioni cellulari. È una linea inducibile dall'espressione di Cre ricombinasi della L274G-Metionina tRNA sintetasi (MetRS*), che consente l'incorporazione dell'azidonorleucina (ANL) nelle proteine, che altrimenti non si verificherebbe. Utilizzando il metodo qui descritto, è possibile purificare proteomi specifici del tipo di cellula marcati in vivo e rilevare sottili cambiamenti nel contenuto proteico dovuti alla riduzione della complessità del campione.

Introduction

L'omeostasi delle proteine aberranti è causata da uno squilibrio nella sintesi e nella degradazione delle proteine. Diverse malattie sono correlate ad alterazioni nell'omeostasi proteica. Il segno distintivo di alcune malattie è la presenza di aggregati in diverse posizioni subcellulari e aree cerebrali. L'omeostasi proteica non è importante solo nella malattia, ma svolge anche un ruolo cruciale nella normale funzione degli organi e delle cellule1. Ad esempio, la sintesi proteica è necessaria per molte forme di plasticità neuronale2,3, come determinato dall'uso di inibitori chimici che bloccano la sintesi proteica4. Tuttavia, non è chiaro in quali tipi cellulari il proteoma sia alterato per supportare l'apprendimento e la memoria, né si capisce quali proteine specifiche in ciascun tipo di cellula aumentano o diminuiscono nella loro sintesi o degradazione. Pertanto, uno studio completo dell'omeostasi proteica richiede la capacità di differenziare i proteomi provenienti da specifici tipi di cellule. In effetti, l'identificazione di proteomi specifici del tipo di cellula per studiare i processi cellulari che si verificano in un ambiente multicellulare è stato un ostacolo importante nella proteomica. Per questo motivo, abbiamo sviluppato una tecnica che utilizza l'espressione di MetRS* combinata con metodi bio-ortogonali che si è dimostrata un modo efficace per identificare e purificare proteomi specifici del tipo cellulare, colmando questa lacuna 5,6,7.

L'espressione di un mutante MetRS* (MetRS L274G) permette il caricamento dell'analogo non canonico della metionina ANL nel corrispondente tRNA 8,9 e la sua successiva incorporazione nelle proteine. Quando l'espressione di MetRS* è regolata da un promotore specifico del tipo di cellula, l'amminoacido non canonico sarà incorporato nelle proteine in modo selettivo cellulare. Una volta che l'ANL è incorporato nelle proteine, può essere funzionalizzato selettivamente mediante click-chemistry e successivamente visualizzato mediante imaging (FUNCAT) o Western Immunoblot (BONCAT). In alternativa, le proteine possono essere purificate selettivamente e identificate mediante spettrometria di massa (MS). Utilizzando questa tecnologia, abbiamo creato una linea di topi che esprime la proteina MetRS* sotto il controllo della Cre ricombinasi. Considerando il crescente numero di linee Cre-mouse disponibili, il sistema MetRS* può essere utilizzato in qualsiasi campo per studiare qualsiasi tipo di cellula da qualsiasi tessuto per il quale esiste una linea Cre esistente. La marcatura delle proteine con ANL è possibile in vitro o in vivo e non altera il comportamento del topo o l'integrità delle proteine6. Il periodo di marcatura può essere adattato alla domanda scientifica di ciascun ricercatore, etichettando proteine di nuova sintesi (tempi di etichettatura più brevi) o interi proteomi (tempi di etichettatura più lunghi). L'uso di questa tecnica è limitato dal numero di cellule del tipo che il ricercatore è disposto a studiare; Quindi l'isolamento delle proteine da tipi cellulari con basso numero o bassi tassi metabolici non è possibile con questo metodo. L'obiettivo del metodo presentato è quello di identificare proteine/proteomi specifici del tipo di cellula marcati in vivo. In questo protocollo, descriviamo come etichettare i proteomi specifici del tipo di cellula con ANL nei topi vivi e purificare le proteine marcate. Dopo la purificazione, le proteine possono essere identificate mediante protocolli di spettrometria di massa di routine 5,10. La riduzione della complessità del campione ottenuta in questo metodo mediante la purificazione selettiva di proteine da specifiche popolazioni cellulari consente allo sperimentatore di rilevare sottili cambiamenti nei proteomi, ad esempio, in risposta a cambiamenti ambientali. La purificazione delle proteine marcate può essere ottenuta in ~ 10 giorni, esclusa l'analisi della SM o il periodo di etichettatura. Qui, descriviamo due metodi per la somministrazione di ANL ai topi che esprimono MetRS*, vale a dire (1) aggiunta dell'amminoacido nell'acqua potabile e (2) introduzione di ANL mediante iniezioni intraperitoneali. Indipendentemente dal metodo scelto per la somministrazione di ANL, le fasi di isolamento e purificazione sono le stesse (dalla fase 2 in poi).

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Protocol

Tutti gli esperimenti con gli animali sono stati eseguiti con il permesso degli uffici governativi locali in Germania (RP Darmstadt; protocolli: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) o Spagna (Comitato di esperimenti sugli animali presso l'UCM e consulenza ambientale della Comunidad de Madrid, numero di protocollo: PROEX 005.0/21) e sono conformi alle regole della Max Planck Society e ai regolamenti spagnoli e seguono le linee guida dell'UE per il benessere degli animali.

1. Marcatura metabolica in vivo con ANL

  1. Acqua potabile:
    1. Sciogliere ANL e maltosio nella normale acqua potabile dei topi. La concentrazione di maltosio raccomandata è dello 0,7% (wt/vol). La quantità massima di ANL aggiunta all'acqua potabile è dell'1% (wt/vol). Una volta che la miscela è pronta, sterilizzarla mediante filtrazione e conservarla a 4 °C.
    2. Fornire la miscela preparata nel passaggio 1.1 ai topi. Cambiare frequentemente le bottiglie (ad esempio, ogni 3 giorni) per evitare contaminazioni e controllarle ogni giorno per cercare possibili contaminazioni o intasamenti. Monitorare la quantità di acqua bevuta ogni giorno pesandola, per conoscere l'assunzione di ANL dei topi.
      NOTA: Il periodo massimo di etichettatura valutato qui è di 3 settimane utilizzando una concentrazione di ANL dell'1% nell'acqua potabile, che ha portato a un'etichettatura ben rilevabile nel cervello. Una buona etichettatura può anche essere raggiunta in 2 settimane. Né tempi di etichettatura più brevi, né punti temporali più lunghi, né altre quantità di ANL sono stati studiati da noi utilizzando questo metodo di somministrazione, il che non implica che quanto sopra non funzionerebbe. I tassi di incorporazione di ANL possono variare a seconda del tessuto studiato o del tipo di cellula. Il tempo di etichettatura può variare a seconda della domanda scientifica; Ad esempio, se i proteomi dovessero essere etichettati, il tempo di marcatura dovrebbe essere calcolato in funzione dell'emivita media delle proteine nel tessuto studiato. Se l'interesse è solo quello di identificare le proteine appena sintetizzate, i tempi possono essere abbreviati. I periodi di etichettatura e i dosaggi di ANL devono essere testati empiricamente per ogni condizione sperimentale e tipo di cellula di interesse.
  2. Somministrazione intraperitoneale:
    1. Sciogliere l'ANL in soluzione fisiologica di NaCl a 400 mM, tampone salino fosfato (PBS) o acqua.
    2. Assicurarsi che l'osmolarità della soluzione rientri nell'intervallo fisiologico. Qui, 10 ml / kg di peso corporeo di soluzione ANL vengono somministrati ai topi.
      NOTA: Una buona etichettatura nei neuroni eccitatori del cervello è ottenuta con successo da un'iniezione intraperitoneale giornaliera (IP) con 400 mM ANL per 1 settimana. Né concentrazioni di ANL più basse né altri periodi di etichettatura mediante iniezioni IP sono stati testati in questo studio, il che non implica che non funzionerebbero. ANL è fornito come cloridrato da alcune aziende. In questo caso, il pH delle soluzioni deve essere regolato al pH adeguato (a seconda della via di somministrazione). L'ANL può anche essere sintetizzato seguendo il metodo pubblicato da Link et al.11 con alcune modifiche5. L'etichettatura ANL può essere eseguita utilizzando altre concentrazioni ANL, intervalli di tempo e vie di somministrazione. Per i tessuti/tipi cellulari con bassi tassi metabolici, può essere utilizzata una dieta a basso contenuto di metionina, iniziando sempre 1 settimana prima della somministrazione di ANL. Quando si utilizza 400 mM ANL, può precipitare mentre è conservato a 4 °C; il riscaldamento fino a 37 °C riporta ANL nella soluzione. Lasciare raggiungere la temperatura ambiente prima dell'iniezione. Nella maggior parte delle regioni del mondo, la somministrazione di ANL ai topi è un esperimento animale e deve essere approvata dalle autorità competenti.

2. Raccolta dei tessuti, lisi ed estrazione di proteine

  1. Dissezione tissutale: sezionare l'area di tessuto contenente il tipo di cellula di interesse e annotare il peso del pezzo di tessuto raccolto.
    NOTA: I campioni possono essere conservati a -80 °C per diversi mesi (punto di arresto). Nel presente protocollo, la corteccia dei topi e l'ippocampo sono stati sezionati.
  2. Lisi tissutale: omogeneizzare il tessuto a temperatura ambiente aggiungendo un volume 12-15 volte il peso umido del tessuto del tampone di lisi (PBS pH 7,4, 1% wt/vol SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100, Benzonase (1:1000 vol/vol), un inibitore della proteasi (PI) (EDTA free 1:4000)). Ad esempio, per un pezzo di tessuto da 20 mg, aggiungere 240-300 μL di tampone di lisi. Triturare il tessuto fino a quando non è omogeneizzato.
    NOTA: I campioni possono essere conservati a -80 °C per diversi mesi (punto di arresto). Per l'omogeneizzazione diretta in provette da 1,5 ml, si consiglia l'uso di un omogeneizzatore portatile a batteria, soprattutto quando vengono lavorati piccoli pezzi di tessuto. Per pezzi più grandi, è possibile utilizzare un omogeneizzatore Dounce. Ad ogni tampone in cui sono inclusi inibitori della proteasi (PI), questi devono essere aggiunti immediatamente prima dell'uso e non prima.
  3. Denaturazione delle proteine: riscaldare l'omogenato a 75 °C per 15 minuti e centrifugare a 17.000 x g per 15 minuti a 10 °C. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo.
  4. Misurazione del contenuto proteico: misurare la concentrazione proteica di ciascun campione e regolare tutti i campioni per essere confrontati con la stessa concentrazione proteica; Regolare la concentrazione aggiungendo tampone di lisi. Un intervallo di concentrazione ottimale è compreso tra 2-4 μg/μL.
    NOTA: I campioni possono essere conservati a -80 °C per diversi mesi (punto di arresto).
  5. Alchilazione
    1. Diluire i campioni omogeneizzati di 2-3 volte in PBS (pH 7,8) + PI (EDTA free 1:4000).
    2. Aggiungere iodoacetamide (IAA) ad una concentrazione finale di 20 mM (soluzione madre 500 mM).
    3. Lasciare i campioni per 1-2 ore a 20 °C al buio. Eseguire due volte i passaggi 2.5.2-2.5.3.
      NOTA: Per alcuni tessuti, se il clic non specifico nel controllo negativo rimane elevato, potrebbe essere necessario eseguire una fase di riduzione prima dell'alchilazione12. Preparare il brodo IAA appena prima di aggiungerlo ai campioni. I campioni possono essere conservati a -80 °C per diversi mesi (punto di arresto).
  6. Scambio buffer: equilibrare le colonne di scambio del buffer utilizzando il buffer di scambio della chimica a clic (PBS pH 7,8, 0,04% (wt/vol) SDS, 0,08% (vol/vol) Triton X-100 e PI (1:4000)). Seguire le istruzioni del produttore. Sostituire tutti i campioni alchilati.
    NOTA: I campioni eluiti possono essere conservati a -80 °C per diversi mesi (punto di arresto). In questo passaggio, l'IAA viene eliminato e il buffer viene scambiato dal buffer chimico click. Le proteine possono essere nuovamente misurate dopo la fase di scambio tampone per assicurarsi che le proteine non siano state perse durante il processo di scambio tampone. A seconda del tipo di colonne utilizzate per lo scambio tampone, le proteine possono essere perse in modo massiccio. Utilizzare le colonne consigliate per evitare la perdita di proteine. Per la conservazione dei campioni si raccomanda la preparazione di aliquote.
  7. Fare clic sulla reazione per valutare l'incorporazione di ANL nell'esperimento
    1. Prelevare 40 μL dei campioni eluiti nella fase 2.6 e aggiungere PBS (pH 7,8) a un volume finale di 120 μL.
    2. Per impostare la reazione chimica a clic, aggiungere i seguenti reagenti nell'ordine e nel vortice dati per 20 s dopo ogni aggiunta: 1,5 μL di ligando triazolico (stock 40 mM), 1,5 μL di biotina alchina (stock 5 mM) e 1 μL di Cu(I) bromuro (stock 10 mg/ml, sciolto in DMSO mediante un attento pipettaggio su e giù, non vortice). Aggiungere i reagenti il più velocemente possibile.
    3. Incubare i campioni durante la notte al buio a 4 °C con rotazione continua.
    4. Centrifugare i campioni a 4 °C per 5 minuti a 17.000 x g. Sarà visibile un pellet leggermente turchese. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo.
      NOTA: Preparare il bromuro di Cu (I) immediatamente prima dell'uso per evitare l'ossidazione del rame. Mantenere costante il rapporto di volumi tra il campione lisato e PBS tra i campioni è essenziale per garantire la stessa concentrazione finale di detergente in ciascuna provetta. Per accelerare l'assemblaggio della reazione chimica del clic, si consiglia un vortice da tavolo con rack per tubi. Conservare i campioni cliccati a -80 °C per diversi mesi o a -20 °C per un paio di settimane fino a ulteriore elaborazione (punto di arresto).
  8. Analisi Western blot per valutare l'incorporazione di ANL nell'esperimento
    1. Eseguire una SDS-PAGE con 20-40 μL di surnatante dalla reazione chimica a scatto (passo 2.7). Utilizzare gel acrilammidici al 12%, eseguire in SDS all'1%, Tris-HCl da 250 mM, glicina da 2 mM. Eseguire fino a quando la parte anteriore è fuori dal gel.
    2. Trasferire le proteine in una membrana nitrocellulosa o PVDF13.
    3. Incubare la membrana per una notte a 4 °C con l'anticorpo GFP (1:500, la proteina GFP è co-tradotta con MetRS*5) e l'anticorpo della biotina (1:1000) per il rilevamento dell'alchino cliccato, che è coniugato alla biotina.
    4. Lavare l'anticorpo primario 2 volte per 10 minuti e aggiungere l'anticorpo secondario per 1,5 ore.
    5. Lavare l'anticorpo secondario 2 volte per 10 minuti ed eseguire la scansione (se si utilizzano anticorpi coniugati con fluorofori) o esporre a film (se si utilizzano anticorpi coniugati con perossidasi di rafano).
    6. Quantificare il segnale della biotina utilizzando ImageJ o software simili, valutare l'etichettatura generale di ciascun campione dell'esperimento e rilevare possibili valori anomali. Valutare il rapporto segnale-rumore (etichettatura del campione ANL allo sfondo dei controlli negativi) dell'esperimento e rilevare possibili animali che non sono riusciti a prendere / incorporare ANL.
      NOTA: Per campioni con elevata incorporazione di ANL, la purificazione delle proteine è teoricamente possibile utilizzando alchini non scissabili come quello utilizzato in questa sezione per la valutazione dell'incorporazione di ANL. Utilizzando campioni cerebrali, lo sfondo ottenuto nei controlli negativi dalla SM dopo purificazione proteica utilizzando alchini non scissabili è troppo alto14. Pertanto, solo gli alchini più facili da maneggiare e non scissabili sono stati utilizzati per un primo campione generale e una valutazione dell'esperimento. Indipendentemente dal tipo di alchino destinato alla purificazione delle proteine, è consigliabile eseguire i passaggi per l'ottimizzazione del dosaggio di alchine descritti nella sezione seguente (passo 2.9).
  9. Reazione a clic per l'ottimizzazione del dosaggio di alchini divisibili
    1. Preparare quattro provette con 40 μL di un campione rappresentativo (ottenuto nella fase 2.6 e valutato nella fase 2.8) e aggiungere PBS (pH 7,8) ad un volume finale di 120 μL.
    2. Impostare la reazione chimica del clic come spiegato nel passaggio 2.7, ma questa volta, aggiungere quattro diverse quantità di DST-alchino. Per detto alchino, si raccomanda di testare 5 μM, 15 μM, 30 μM e 60 μM.
    3. Ripetere il passaggio 2.8 per decidere quale sia il dosaggio alchino più adatto per la specifica domanda sperimentale in studio, in base alla massima efficienza di etichettatura con il segnale di fondo più basso.
      NOTA: Prima di sottoporre i campioni rimanenti a una reazione di clic, è necessario determinare la quantità ottimale di qualsiasi alchino. Ci sono diverse opzioni di alchini disponibili in commercio che possono essere utilizzati. Differiscono nel modo di scissione (ad esempio, agenti leggeri o riducenti). È anche possibile una chimica a scatto senza rame utilizzando reagenti promossi dal ceppo (ad esempio, reagenti DBCO). Piccoli cambiamenti nella quantità di alchini o reagenti DBCO spesso aumentano significativamente il segnale nel controllo negativo (sfondo). Qui viene descritta la purificazione delle proteine utilizzando un alchino con un ponte disolfuro scissabile da agenti riducenti (disolfuro biotina alchina o DST-alchino15). Quando si utilizza l'alchine DST, per l'esecuzione di SDS-PAGE (passaggio 8.1), evitare di caricare tamponi con agenti riducenti forti come DTT o β-mercaptoetanolo per prevenire la scissione dell'alchino. In questo studio, il riscaldamento a 72 °C, per 5 minuti, utilizzando 5 mM di N-etilmaleimmide (NEM) nel tampone di carico non influisce sulla stabilità dell'alchina DST. Il passo 2.9.2 può essere ripetuto, testando dosaggi più fini nell'intervallo del migliore osservato.
  10. Reazione a scatto preparativa per la purificazione delle proteine
    1. Fare clic su tutti i campioni ottenuti al punto 2.6 con il dosaggio ottimale di alchine determinato nel punto 2.9 e analizzare una frazione mediante SDS-PAGE e Western blot (punto 2.8).
      NOTA: assicurarsi che le pipette siano calibrate correttamente per garantire l'accuratezza dell'upscaling del campione. I campioni cliccati possono essere conservati a -80 °C per diversi mesi (punto di arresto).

3. Purificazione delle proteine

  1. Scambio di buffer
    1. Sottoporre tutti i campioni cliccati a una procedura di scambio del buffer come descritto al punto 2.6, ma utilizzare il buffer di legame della neutravidina come buffer di equilibrio (PBS pH 7,4, 0,15% (wt/vol) SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100 e PI (1:2000)).
      NOTA: I campioni eluiti possono essere conservati a -80 °C per diversi mesi (punto di arresto). In questa fase, l'alchino libero non cliccato viene eliminato e il buffer viene scambiato dal buffer di legame della neutravidina.
  2. Legame alle perle di neutravidina
    1. Lavare le sfere ad alta capacità di Neutravidina con il tampone legante Neutravidina (vedere punto 3.1); Mescolare le perle con il tampone e centrifugare il composto per 5 minuti a 3000 x g e scartare il surnatante. Ripeti tre volte.
    2. Preparare un impasto 1:1 di perle di Neutravidina aggiungendo lo stesso volume di perle secche e tampone legante Neutravidina.
    3. Mettere da parte 20-40 μL di ciascun campione come lisato prepurificato e conservarlo a -20 °C.
    4. Misurare la concentrazione proteica (cfr. punto 2.4) e mescolare 100 μg di proteine con 4 μL del liquame ottenuto al punto 3.2.2.
    5. Incubare la miscela per una notte a 4 °C con rotazione continua, consentendo alle proteine marcate di legarsi alle perle.
      NOTA: Per quanto riguarda la reazione chimica click, la reazione di purificazione di affinità di base descritta al punto 3.2.4 può essere potenziata. Ad esempio, per la purificazione delle proteine dai neuroni eccitatori dell'ippocampo, 1 mg di lisato proteico viene miscelato con 40 μL di perle di neutravidina (liquame 1:1). La quantità di sfere di Neutravidina può essere aumentata o ridotta in base alla quantità di proteine marcate per mg di proteina totale, che dipenderà dal tipo di cellula scelta e dal periodo di etichettatura e deve essere determinata empiricamente.
  3. Lavaggi delle perle di neutravidina ed eluizione delle proteine
    1. Raccogliere i surnatanti mediante centrifugazione (vedere punto 3.2.1). Mettere da parte un'aliquota di 20-40 μl di ciascun surnatante per un'analisi successiva e congelare il resto a -80 °C.
    2. Lavare le perle con tampone di lavaggio Neutravidin raffreddato 1 (PBS pH 7,4, 0,2% (wt/vol) SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100 e PI (1:2000)) aggiungendo il tampone, sedimentando le perle ed eliminando il surnatante. Ripetere questo passaggio tre volte.
    3. Quindi, aggiungere lo stesso tampone e incubare le perle per 10 minuti in rotazione continua a 4 °C prima di scartare il surnatante. Ripetere questo passaggio tre volte.
    4. Lavare le perle come spiegato nei punti 3.3.2-3.3.3 ma utilizzando il tampone di lavaggio Neutravidin 2 (1x PBS, pH 7,4 e PI 1:2000).
    5. Lavare le perle come spiegato al punto 3.3.2-3.3.3 ma utilizzando il tampone di lavaggio Neutravidina 3 (50 mM di bicarbonato di ammonio e PI 1:2000).
    6. Eluire le proteine cliccate incubando le perle per 30 minuti a 20 °C con un volume di tampone di eluizione di neutravidina (5% (vol/vol) β-mercaptoetanolo e 0,03% (wt/vol) SDS) corrispondente ad un volume delle sfere secche utilizzate.
    7. Mantenere le perle in sospensione durante l'eluizione mediante agitazione continua (1000 giri / min) in uno shaker termoblocco. Eluire due volte e unire entrambi gli eluati.
      NOTA: La centrifugazione predisposta per la separazione della frazione solida del liquame (perline) e della fase acquosa (supernatante), come spiegato al punto 3.2.1, si applica alle fasi da 3.3.1 a 3.3.7. La quantità di SDS può essere aumentata se l'eluizione proteica non è completa. Tuttavia, con quantità superiori allo 0,08%-0,1% di SDS, le proteine non specificamente legate alle perle iniziano ad essere eluite. β-mercaptoetanolo è volatile e tossico; Si consiglia l'uso di una cappa per i punti 3.3.6-3.3.7. I campioni raccolti nelle fasi 3.2.3 e 3.3.1 devono essere eseguiti da SDS-PAGE e valutati mediante Western blot (vedere punto 2.8) per valutare l'efficienza della purificazione di affinità (fase 3.3).
  4. Valutazione delle proteine eluite
    1. Caricare 1/3 dei campioni eluiti in una SDS-PAGE (vedere il punto 2.8.1).
    2. Colorare il gel per visualizzare le proteine utilizzando un metodo ad alta sensibilità, come la colorazione dell'argento o un metodo fluorescente.
    3. Se i campioni hanno la qualità attesa, il che significa che c'è 3-4 volte più proteine nei campioni marcati con ANL rispetto al controllo negativo, le proteine eluite possono essere identificate con metodi di spettrometria di massa di routine come quello spiegato nel riferimento5.

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Representative Results

Seguendo il protocollo descritto (riassunto nella Figura 1), l'ANL è stato somministrato ai topi mediante iniezioni intraperitoneali giornaliere (400 mM ANL 10 mL/kg, Nex-Cre::MetRS*) per 7 giorni, o tramite acqua potabile (0,7% Maltosio, 1% ANL, CamkII-Cre::MetRS*) per 21 giorni. Dopo l'etichettatura, le aree cerebrali corrispondenti sono state sezionate, lisate, alchilate e cliccate. Le reazioni di clic sono state analizzate da SDS-PAGE e Western Immunoblot. Le immagini rappresentative degli esperimenti sono mostrate nella Figura 2 per la somministrazione di ANL mediante iniezione IP e nella Figura 3 per la somministrazione di ANL tramite acqua potabile. Si noti che lo scopo delle cifre è mostrare che entrambi i protocolli di etichettatura funzionano, non confrontarli. Il confronto non è possibile perché diverse popolazioni neuronali sono etichettate nei due esperimenti mostrati (neuroni eccitatori dell'ippocampo e della corteccia e neuroni Purkinje del cervelletto).

Un ulteriore esperimento fornisce un esempio per la determinazione della concentrazione ottimale di alchine DST-cleavable (Figura 4). In questo esempio, il cambiamento di piega tra il campione marcato e il controllo è massimo con una concentrazione di alchine di 14 μM. Questa concentrazione di alchine viene quindi applicata a tutti i campioni. Dopo la verifica dell'etichettatura di ciascun campione nell'esperimento con la quantità di alchina scelta, tutti i campioni sono stati sottoposti alla purificazione di proteine marcate con ANL / clic sulla biotina mediante legame di affinità utilizzando perle di Neutravidina (Figura 5). In questa fase, le proteine vengono legate alle perle, lavate e successivamente eluite riducendo il ponte disolfuro presente nell'alchina DST. Dopo quest'ultimo passaggio, la biotina e parte dell'alchino rimangono legate alle perline. Le proteine contenenti ANL (legate al resto dell'alchino) vengono recuperate nel tampone di eluizione. Per valutare l'efficienza della fase di eluizione, un terzo del volume dell'eluato viene caricato su un gel SDS-PAGE e visualizzato utilizzando un metodo sensibile di colorazione proteica totale. È necessario osservare una differenza di intensità di almeno 3 volte della colorazione proteica totale tra i controlli negativi e i campioni marcati con ANL per ottenere risultati interpretabili con la spettrometria di massa. Il completamento di tutte le fasi descritte in questo protocollo sarà seguito dalla preparazione, acquisizione e analisi del campione MS5. Sebbene non vi siano requisiti speciali per la SM (ogni laboratorio può utilizzare il proprio protocollo MS di routine 5,10), va tenuto presente che la quantità di proteine purificate sarà generalmente bassa (nell'ordine dei nanogrammi). La Figura 6 fornisce un esempio dei risultati della SM con un chiaro arricchimento nel campione marcato ANL rispetto al controllo (Figura 6A). Questa differenza era già visibile nella colorazione proteica totale mostrata nella Figura 5. Oltre ai cambiamenti nell'intensità del peptide, ci sono anche proteine uniche trovate in entrambi i campioni (Figura 6B).

Figure 1
Figura 1: Pipeline di lavoro per la purificazione di proteine specifiche del tipo di cellula mediante BONCAT. Dopo la marcatura delle proteine con ANL, il tessuto di interesse viene sezionato e lisato, etichettato con biotina mediante chimica a scatto e la quantità di etichettatura per ciascun campione viene valutata da BONCAT. I valori anomali (che non sono riusciti a incorporare ANL) e i campioni rappresentativi possono essere differenziati in questo passaggio. Uno dei campioni rappresentativi viene nuovamente cliccato per trovare il dosaggio alchino scissivo ottimizzato per la successiva purificazione delle proteine. Il dosaggio di alchini che raggiunge il miglior rapporto segnale-rumore viene applicato a ogni replica biologica. Le proteine specifiche del tipo di cellula sono ottenute per purificazione di affinità. I campioni purificati vengono studiati mediante spettrometria di massa e vengono identificate le proteine. Questa cifra è stata modificata da Alvarez-Castelao et al. (2017)6. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Somministrazione di ANL mediante iniezioni intraperitoneali (IP). BONCAT è stato eseguito per valutare la marcatura delle proteine nell'ippocampo (HP) e nella corteccia (CX) dopo la marcatura metabolica delle proteine con ANL mediante iniezioni IP giornaliere per 7 giorni. I campioni di topi wild-type come controllo negativo (wt) sono stati cliccati in parallelo ai campioni etichettati (MetRS *). Le proteine marcate provengono dai neuroni eccitatori utilizzando una linea16 di Nex-Cre::MetRS*. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Somministrazione di ANL mediante acqua potabile. BONCAT è stato eseguito per valutare la marcatura proteica nei neuroni Purkinje del cervelletto dopo somministrazione di ANL a topi GAD-Cre::MetRS* tramite acqua potabile per 21 giorni. La figura mostra un controllo negativo (wt) e un campione etichettato (MetRS*) lisati e cliccati in parallelo. Questa cifra è stata modificata da Alvarez-Castelao et al. (2017)6. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Titolazione del dosaggio DST-alchini. Una replica biologica per esperimento viene scelta come campione rappresentativo per titolare la concentrazione ottimale di alchini. Tre concentrazioni (14, 28 e 56 μM) di alchino sono state testate qui nella reazione a clic per BONCAT. Il rapporto di etichettatura tra il campione marcato ANL (MetRS*) e il controllo negativo (wt) determina il rapporto segnale/rumore (mostrato nel grafico). 14 μM è la migliore concentrazione di alchine ottenuta in questo esperimento. Per questo esperimento è stato utilizzato tessuto Cortex della linea di topi Nex::MetRS* marcata ANL. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Proteine purificate. Le proteine marcate dei neuroni di Purkinje sono state purificate e colorate utilizzando SYPRO Ruby. Questa cifra è stata modificata da Alvarez-Castelao et al. (2017)6. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Identificazione e quantificazione delle proteine. Il proteoma cellulare di Purkinje è stato ottenuto mediante spettrometria di massa utilizzando cervelletto da una linea di topi GAD-Cre::MetRS* come materiale di partenza. (A) mostra una maggiore abbondanza (intensità del peptide) delle proteine identificate nei campioni marcati con ANL rispetto ai topi wild-type (wt). (B) Il proteoma di Purkinje è stato ottenuto raggruppando proteine arricchite nei campioni marcati con ANL in A (definite da intensità >3 volte superiori nei topi MetRS* rispetto al wt) e proteine uniche trovate nei topi che esprimono MetRS*. Questa cifra è stata modificata da Alvarez-Castelao et al. (2017)6. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

Gli aspetti critici del protocollo sono; l'inclusione di controlli negativi, avere abbastanza repliche biologiche, via di somministrazione di ANL, quantità e durata, alchilazione dei campioni, concentrazione di alchine ed eliminazione del β-mercaptoetanolo quando si utilizza DST-alchini.

È fondamentale includere campioni di controllo negativi provenienti da animali marcati con ANL senza driver Cre e quindi senza espressione MetRS*. Questi campioni devono essere sottoposti a ogni fase descritta nel protocollo in parallelo ai campioni di topi MetRS* indotti da Cre marcati con ANL. I campioni non selezionati non sono controlli validi, poiché i risultati ottenuti utilizzando solo questo controllo possono essere dovuti a clic non specifici. Non abbiamo osservato incorporazione di ANL in cellule che non esprimono il gene MetRS*, né espressione di MetRS* in cellule prive di Cre; pertanto, gli animali WT etichettati con ANL possono essere utilizzati come controllo negativo.

Dato che il protocollo qui descritto consiste in molte fasi in cui i campioni possono essere persi, si raccomanda di calcolare le repliche biologiche tenendo presente il guasto tecnico. Per i campioni di cervello, c'è circa il 30% di perdita di replica.

Descriviamo qui due vie e durate di somministrazione ANL. Ciò non esclude che altre vie di somministrazione (ad esempio, l'aggiunta di ANL al cibo), funzionino altrettanto bene. Per quanto riguarda la quantità di ANL somministrata, gli esperimenti mostrati qui sono stati eseguiti utilizzando quantità relativamente elevate di ANL. L'etichettatura con quantità inferiori è possibile anche a seconda dell'impostazione sperimentale. L'intervallo di tempo più breve dell'etichettatura ANL riportato in questo protocollo è di 1 settimana e il più lungo di 21 giorni. Potrebbero essere applicati periodi di etichettatura più brevi o più lunghi, ma non lo abbiamo determinato. I ricercatori dovrebbero determinare la via di somministrazione dell'ANL, il dosaggio dell'ANL e il periodo di etichettatura dell'ANL adeguati alla specifica domanda sperimentale in studio, considerando le proprietà metaboliche del tessuto, il tipo di cellula di interesse e la domanda sperimentale in studio.

L'alchilazione del campione, nota anche come capping, è un passaggio importante per evitare il clic in background17. Quando l'alchilazione viene eseguita correttamente, il clic non specifico monitorato dai campioni di controllo viene ridotto e la differenza tra il controllo negativo e i campioni marcati con ANL è maggiore. Anche l'eliminazione dell'IAA libera dopo l'alchilazione è un passo chiave. La presenza di piccole quantità di IAA durante la reazione del clic ne limiterà l'efficienza. Occasionalmente, la fase di desalinizzazione che elimina anche l'IAA (fase 2.6) deve essere ripetuta per garantire una corretta rimozione dell'IAA.

Ci sono diversi reagenti biotina-alchini e -DBCO disponibili in commercio da una varietà di aziende. Le principali differenze tra loro riguardano la lunghezza della catena linker del polietilenglicole (PEG) e l'assenza, la presenza e il tipo di gruppi scissabili. Indipendentemente dal tipo utilizzato, quantità eccessive di alchine portano a clic non specifici su proteine contenenti solo amminoacidi naturali. Questo può essere facilmente prevenuto con una titolazione precisa e attenta della quantità di alchini. Come descritto, il modo migliore per raggiungere questo obiettivo è utilizzare i campioni lisati e alchilati effettivi da utilizzare nelle successive fasi di purificazione delle proteine (fase 2.6) e analisi della spettrometria di massa.

Quando i DST-alchini sono usati nella reazione a clic, il β-mercaptoetanolo riduce il ponte disolfuro e dissocia le proteine marcate dalle perle nella fase di eluizione (fase 3.3). β-mercaptoetanolo deve essere rimosso dai campioni per consentire la digestione enzimatica necessaria per la SM. Ci sono diversi modi per farlo (ad esempio, liofilizzazione18, escissione da un gel19 o pulizia utilizzando colonne S-Trap20), e la scelta dovrebbe essere fatta dal laboratorio MS che elabora i campioni.

Le modifiche e la risoluzione dei problemi del metodo devono essere dirette a ottimizzare i passaggi critici menzionati nel protocollo. Ad esempio, se c'è troppa variabilità, aggiungere più repliche biologiche; se l'etichettatura è troppo bassa, aumentare la concentrazione di ANL, utilizzare tempi di etichettatura più lunghi o testare altre vie di somministrazione di ANL che potrebbero essere più efficienti per il tessuto studiato. Per l'alchilazione delle proteine, potrebbe essere implementata una precedente fase di riduzione dell'aggiunta di IAA.

La principale limitazione del metodo è la purificazione dei proteomi derivanti da piccole popolazioni cellulari anche se viene sezionata una piccola area tissutale. Anche i proteomi di popolazioni cellulari più numerose che sono, tuttavia, sparsi su aree tissutali più ampie sono di difficile accesso. Tuttavia, la tecnica di etichettatura in vivo qui descritta può ancora essere applicata per valutare i tipi di cellule riferiti mediante imaging (ad esempio, con FUNCAT o FUNCAT-PLA21).

Questo metodo è attualmente l'unico metodo disponibile per lo studio in vivo di proteomi specifici del tipo cellulare basati su proteine a lunghezza intera e per la visualizzazione in situ di proteine complete specifiche del tipo cellulare. Altri amminoacidi non canonici come l'azidoomoalanina (AHA) possono anche essere utilizzati per la marcatura proteica in vivo e la purificazione dei proteomi, ma mancano di specificità del tipo di cellulacellulare 22,23. Altri approcci come la puromicina sono adatti per fornire un quadro fisso della sintesi proteica24,25. Tuttavia, è possibile utilizzare aminoacidi non canonici per periodi più lunghi di etichettatura, riflettendo anche la degradazione delle proteine e mostrando un proteoma cellulare più accurato. I metodi basati su BioID sono utilizzati per identificare le proteine in specifiche regioni subcellulari, indipendentemente dal loro momento / luogo di sintesi26.

Nella linea murina che abbiamo stabilito (disponibile da Jackson Lab, stock n. 028071), la metionina mutante tRNA sintetasi (MetRS *) che consente l'incorporazione di ANL nelle cellule è espressa in modo Cre dipendente. Con questa linea di mouse come strumento, è possibile esprimere esclusivamente il MetRS* in tipi di celle per i quali sono disponibili linee Cre-driver. Questa disposizione conferisce al metodo una notevole versatilità, rendendolo utile in quasi tutte le aree della ricerca biomedica.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

B.A-C è finanziato dal Ministero spagnolo della Scienza e dell'Innovazione (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), dalla Comunità autonoma di Madrid (Atracción de Talento-2019T1 / BMD-14057) e dalle sovvenzioni MICINN (PID2020-113270RA-I00). R. A-P è finanziato dalla Comunità autonoma di Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). E.M.S. è finanziato dalla Max Planck Society, un premio Advanced Investigator del Consiglio europeo della ricerca (grant 743216), DFG CRC 1080: Molecular and Cellular Mechanisms of Neural Homeostasis, e DFG CRC 902: Molecular Principles of RNA-based Regulation. Ringraziamo D.C Dieterich e P. Landgraf per la loro consulenza tecnica e la sintesi del DST-Alchine. Ringraziamo E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast e la struttura animale dell'MPI for Brain Research per il loro eccellente supporto. Ringraziamo Sandra Goebbels per aver condiviso la linea di mouse Nex-Cre. Ringraziamo Antonio G. Carroggio per il suo aiuto con l'editing in inglese. B.A-C. progettato, condotto e analizzato esperimenti. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E. e S. t. D. ha condotto e analizzato esperimenti. B.A-C e E.M.S. progettarono esperimenti e supervisionarono il progetto, B.A-C scrisse il documento. Tutti gli autori hanno curato l'articolo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Acrylamide gels GenScript SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%
β-Mercaptoethanol Sigma M6250 Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.
Ammonium bicarbonate Sigma 9830 Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood
ANL Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11)
ANL-HCl IrishBotech HAA1625.0500
Benzonase Sigma E1014
Biotin alkyne Thermo, B10185
Chicken antibody anti-GFP Aves 1020
Complete EDTA-free protease inhibitor Roche 4693132001 Toxic; use a lab coat and gloves.
Copper (I) bromide Sigma 254185 99.999% (wt/wt)
Disulfide tag (DST)-alkyne Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20
DMSO Sigma 276855
Filters Merk SCGP00525
Iodo acetamide (IAA) Sigma I1149
IR anti chicken 800 LI-COR IRDye 800CW Donkey anti-Chicken Secondary Antibody
IR anti rabit 680 LI-COR IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody
Maltose Sigma M9171
Manual Mixer BioSpec Products 1083
NaCl Sigma S9888
N-ethylmaleimide Sigma 4259 Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.
NeutrAvidin beads Pierce 29200
Nitrocellulose membrane Bio-rad 1620112
PBS 1X Thermo J62036.K2
PBS 1X pH 7.8 Preparation described in reference number 5
PD SpinTrap G-25 columns GE Healthcare Buffer exchange
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo, 23225 Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life.
Polyclonal rabbit anti-biotin antibody Cell Signaling 5597
PVDF membrane Millipore IPVH00010
SDS 10% Sigma 71736
SDS-PAGE  Running buffer MOPS GenScript M00138
SYPRO Ruby stain Sigma S4942
Table automatic Vortexer Eppendorf Mixmate
Triazole ligand Sigma 678937
Triton X-100 Sigma T9284
Water Sigma W4502 Molecular biology grade

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References

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Neuroscienze Numero 182
Purificazione e identificazione di proteine specifiche per tipo cellulare da tessuti complessi utilizzando una linea murina di topo di metionina tRNA sintetasi mutante
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