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Neuroscience

Purificação e identificação de proteínas específicas do tipo celular de tecidos complexos usando uma linha de camundongo mutante de metionina tRNA sintetase

Published: April 13, 2022 doi: 10.3791/63713
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 1, 2
1Max-Planck-Institute for Brain Research, Synaptic Plasticity Department, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Veterinary School, Complutense University of Madrid

Summary

Este protocolo descreve como realizar a marcação de proteína específica do tipo celular com azidonorleucina (ANL) usando uma linha de camundongo expressando uma L274G-Metionina tRNA sintetase mutante (MetRS*) e as etapas necessárias para o isolamento de proteínas específicas do tipo celular marcadas. Delineamos duas possíveis vias de administração de ANL em camundongos vivos por (1) água potável e (2) injeções intraperitoneais.

Abstract

Compreender a homeostase proteica in vivo é fundamental para saber como as células funcionam em condições fisiológicas e de doença. O presente protocolo descreve a marcação in vivo e a subsequente purificação de proteínas recém-sintetizadas usando uma linha de camundongos modificados para direcionar a marcação de proteínas para populações celulares específicas. É uma linhagem induzível pela expressão da Cre recombinase da L274G-Metionina tRNA sintetase (MetRS*), possibilitando a incorporação de azidonorleucina (ANL) às proteínas, o que de outra forma não ocorrerá. Usando o método descrito aqui, é possível purificar proteomas específicos do tipo celular marcados in vivo e detectar mudanças sutis no teor de proteína devido à redução da complexidade da amostra.

Introduction

A homeostase proteica aberrante é causada por um desequilíbrio na síntese e degradação de proteínas. Diversas doenças estão relacionadas a alterações na homeostase proteica. A marca registrada de algumas doenças é a presença de agregados em diferentes locais subcelulares e áreas cerebrais. A homeostase proteica não é apenas importante na doença, mas também desempenha um papel crucial na função normal dos órgãos e células1. Por exemplo, a síntese proteica é necessária para muitas formas de plasticidade neuronal2,3, conforme determinado pelo uso de inibidores químicos que bloqueiam a síntese proteica4. No entanto, não está claro em quais tipos de células o proteoma é alterado para apoiar a aprendizagem e a memória, nem se entende quais proteínas específicas em cada tipo de célula aumentam ou diminuem sua síntese ou degradação. Assim, um estudo abrangente da homeostase de proteínas requer a capacidade de diferenciar proteomas provenientes de tipos específicos de células. De fato, a identificação de proteomas específicos do tipo celular para estudar processos celulares que ocorrem em um ambiente multicelular tem sido um obstáculo importante na proteômica. Por esse motivo, desenvolvemos uma técnica utilizando a expressão de MetRS* combinada com métodos bioortogonais que tem se mostrado uma forma eficaz de identificar e purificar proteomas específicos do tipo celular, preenchendo essa lacuna 5,6,7.

A expressão de um MetRS* mutante (MetRS L274G) permite a carga do ANL análogo à metionina não canônico no RNAt 8,9 correspondente e sua subsequente incorporação em proteínas. Quando a expressão de MetRS* é regulada por um promotor específico do tipo celular, o aminoácido não canônico será incorporado às proteínas de maneira seletiva celular. Uma vez que o ANL é incorporado nas proteínas, ele pode ser seletivamente funcionalizado por click-chemistry e, posteriormente, visualizado por imagem (FUNCAT) ou por Western Immunoblot (BONCAT). Alternativamente, as proteínas podem ser seletivamente purificadas e identificadas por espectrometria de massa (EM). Usando essa tecnologia, criamos uma linha de camundongo expressando a proteína MetRS* sob o controle da Cre recombinase. Considerando o crescente número de linhas de camundongos Cre disponíveis, o sistema MetRS* pode ser usado em qualquer campo para estudar qualquer tipo de célula de qualquer tecido para o qual exista uma linha Cre existente. A marcação de proteínas com ANL é possível in vitro ou in vivo, e não altera o comportamento do camundongo ou a integridade da proteína6. O período de tempo de rotulagem pode ser adaptado à questão científica de cada pesquisador, marcando proteínas recém-sintetizadas (tempos de rotulagem mais curtos) ou proteomas inteiros (tempos de rotulagem mais longos). O uso dessa técnica é limitado pelo número de células do tipo que o pesquisador está disposto a estudar; portanto, o isolamento proteico de tipos de células com baixo número ou baixas taxas metabólicas não é possível por este método. O objetivo do método apresentado é identificar proteínas/proteomas específicos do tipo celular marcados in vivo. Neste protocolo, descrevemos como rotular proteomas específicos do tipo celular com ANL em camundongos vivos e purificar as proteínas marcadas. Após a purificação, as proteínas podem ser identificadas por protocolos de espectrometria de massas de rotina 5,10. A redução da complexidade da amostra alcançada neste método pela purificação seletiva de proteínas de populações celulares específicas permite ao experimentador detectar mudanças sutis nos proteomas, por exemplo, em resposta a mudanças ambientais. A purificação das proteínas marcadas pode ser alcançada em ~10 dias, não incluindo a análise de EM ou o período de rotulagem. Aqui, descrevemos dois métodos para a administração de ANL em camundongos que expressam MetRS*, a saber: (1) adição do aminoácido na água potável e (2) introdução de ANL por injeções intraperitoneais. Independentemente do método escolhido para a administração de ANL, as etapas de isolamento e purificação são as mesmas (a partir da etapa 2).

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Protocol

Todos os experimentos com animais foram realizados com permissão dos escritórios do governo local na Alemanha (RP Darmstadt; protocolos: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) ou Espanha (Comitê de Experimentos em Animais da UCM e Aconselhamento Ambiental da Comunidade de Madri, número de protocolo: PROEX 005.0/21) e estão em conformidade com as regras da Sociedade Max Planck e regulamentos espanhóis e seguem as diretrizes da UE para o bem-estar animal.

1. Marcação metabólica in vivo com ANL

  1. Água potável:
    1. Dissolva a ANL e a maltose na água potável regular dos camundongos. A concentração recomendada de maltose é de 0,7% (peso / vol). A quantidade máxima de ANL adicionada à água potável é de 1% (m/vol). Quando a mistura estiver pronta, esterilizá-la por filtração e armazená-la a 4 °C.
    2. Fornecer a mistura preparada no passo 1.1 aos ratinhos. Troque as garrafas com frequência (por exemplo, a cada 3 dias) para evitar contaminações e verifique-as todos os dias para procurar possíveis contaminações ou entupimentos. Monitore a quantidade de água ingerida diariamente, pesando-a, para saber a ingestão de ANL dos ratos.
      NOTA: O período máximo de rotulagem avaliado aqui é de 3 semanas usando uma concentração de ANL de 1% na água potável, o que resultou em rotulagem bem detectável no cérebro. Uma boa rotulagem também pode ser alcançada em 2 semanas. Nem tempos de rotulagem mais curtos, nem períodos de tempo mais longos, nem outras quantidades de ANL foram estudados por nós usando este método de administração, o que não implica que o acima exposto não funcionaria. As taxas de incorporação de ANL podem variar dependendo do tecido estudado ou do tipo de célula. O tempo de rotulagem pode variar dependendo da questão científica; por exemplo, se os proteomas fossem marcados, o tempo de marcação deveria ser calculado em função das meias-vidas médias das proteínas no tecido estudado. Se o interesse é apenas identificar proteínas recém-sintetizadas, os tempos podem ser encurtados. Os períodos de rotulagem e as dosagens de ANL devem ser testados empiricamente para cada condição experimental e tipo de célula de interesse.
  2. Administração intraperitoneal:
    1. Dissolva o ANL em solução fisiológica de NaCl a 400 mM, tampão salino fosfato (PBS) ou água.
    2. Certifique-se de que a osmolaridade da solução está dentro da faixa fisiológica. Aqui, 10 mL/kg de peso corporal de solução de ANL são administrados aos camundongos.
      NOTA: Uma boa marcação nos neurônios excitatórios do cérebro é obtida com sucesso por uma injeção intraperitoneal (IP) diária com 400 mM de ANL por 1 semana. Nem concentrações mais baixas de ANL nem outros períodos de marcação por injeções de IP foram testados neste estudo, o que não implica que eles não funcionariam. ANL é fornecido como cloridrato por algumas empresas. Neste caso, o pH das soluções deve ser ajustado ao pH adequado (dependendo da via de administração). A ANL também pode ser sintetizada seguindo o método publicado por Link et al.11 com algumas modificações5. A marcação da ANL pode ser realizada usando outras concentrações, intervalos de tempo e vias de administração da ANL. Para tecidos/tipos celulares com baixas taxas metabólicas, uma dieta de metionina de baixo teor pode ser usada, sempre começando 1 semana antes da administração de ANL. Quando se utiliza um ANL de 400 mM, pode precipitar-se enquanto armazenado a 4 °C; o aquecimento até 37 °C traz a ANL de volta à solução. Deixe atingir a temperatura ambiente antes da injeção. Na maioria das regiões do mundo, a administração de ANL em camundongos é um experimento animal e precisa ser aprovada pelas autoridades competentes.

2. Colheita de tecidos, lise e extração de proteínas

  1. Dissecção de tecido: Dissecar a área de tecido que contém o tipo de célula de interesse e observar o peso do pedaço de tecido coletado.
    NOTA: As amostras podem ser armazenadas a -80 °C durante vários meses (ponto de paragem). No presente protocolo, o córtex e o hipocampo dos camundongos foram dissecados.
  2. Lise tecidual: Homogeneizar o tecido à temperatura ambiente adicionando um volume 12-15 vezes o peso húmido do tecido do tampão de lise (PBS pH 7,4, 1% em peso / vol SDS, 1% (vol / vol) Triton X-100, Benzonase (1:1000 vol / vol), um inibidor de protease (PI) (livre de EDTA 1:4000)). Por exemplo, para uma peça de tecido de 20 mg, adicione 240-300 μL de tampão de lise. Triturar o tecido até que ele seja homogeneizado.
    NOTA: As amostras podem ser armazenadas a -80 °C durante vários meses (ponto de paragem). Para homogeneização direta em tubos de 1,5 mL, recomenda-se o uso de um homogeneizador portátil operado por bateria, especialmente quando pequenos pedaços de tecido são processados. Para peças maiores, um homogeneizador Dounce pode ser usado. A cada tampão onde os inibidores de protease (IP) estão incluídos, eles devem ser adicionados imediatamente antes do uso e não antes.
  3. Desnaturação de proteínas: Aquecer o homogeneizado a 75 °C durante 15 min e centrifugar a 17.000 x g durante 15 min a 10 °C. Transfira o sobrenadante para um novo tubo.
  4. Medição do teor de proteína: Medir a concentração de proteína de cada amostra e ajustar todas as amostras para serem comparadas com a mesma concentração de proteína; ajustar a concentração adicionando tampão de lise. Uma faixa de concentração ideal está entre 2-4 μg/μL.
    NOTA: As amostras podem ser armazenadas a -80 °C durante vários meses (ponto de paragem).
  5. Alkylation
    1. Diluir as amostras homogeneizadas em 2-3 vezes em PBS (pH 7,8) + PI (livre de EDTA 1:4000).
    2. Adicionar iodoacetamida (IAA) a uma concentração final de 20 mM (solução-mãe a 500 mM).
    3. Deixar as amostras durante 1-2 h a 20 °C no escuro. Siga as etapas 2.5.2-2.5.3 duas vezes.
      NOTA: Para alguns tecidos, se o clique inespecífico no controle negativo permanecer alto, pode ser necessário realizar uma etapa de redução antes da alquilação12. Preparar a unidade populacional IAA na hora, imediatamente antes de a adicionar às amostras. As amostras podem ser armazenadas a -80 °C durante vários meses (ponto de paragem).
  6. Troca de tampão: Equilibre as colunas de troca de buffer usando o buffer de troca química de clique (PBS pH 7,8, 0,04% (wt/vol) SDS, 0,08% (vol/vol) Triton X-100 e PI (1:4000)). Siga as instruções do fabricante. Troque todas as amostras alquiladas.
    NOTA: As amostras eluídas podem ser armazenadas a -80 °C durante vários meses (ponto de paragem). Nesta etapa, o IAA é eliminado e o buffer é trocado pelo buffer químico click. A proteína pode ser medida novamente após a etapa de troca de tampão para garantir que as proteínas não foram perdidas durante o processo de troca de tampão. Dependendo do tipo de colunas usadas para troca de tampão, a proteína pode ser massivamente perdida. Use as colunas recomendadas para evitar a perda de proteínas. Para o armazenamento de amostras, recomenda-se a preparação de alíquotas.
  7. Clique na reação para avaliar a incorporação de ANL no experimento
    1. Colher 40 μL das amostras eluídas na etapa 2.6 e adicionar PBS (pH 7,8) a um volume final de 120 μL.
    2. Para configurar a reacção química de clique, adicionar os seguintes reagentes na ordem dada e vórtice durante 20 s após cada adição: 1,5 μL de ligante triazólico (estoque 40 mM), 1,5 μL de alcina biotina (estoque 5 mM) e 1 μL de brometo de(I) (estoque 10 mg/mL, dissolvido em DMSO por pipetagem cuidadosa para cima e para baixo, não vórtice). Adicione os reagentes o mais rápido possível.
    3. Incubar as amostras durante a noite no escuro a 4 °C com rotação contínua.
    4. Centrifugar as amostras a 4 °C durante 5 min a 17.000 x g. Um pellet ligeiramente turquesa será visível. Transfira o sobrenadante para um novo tubo.
      NOTA: Prepare o estoque de brometo de (I) imediatamente antes do uso para evitar a oxidação do cobre. Manter a relação de volumes entre a amostra lisada e a PBS constante entre as amostras é essencial para garantir a mesma concentração final de detergente em cada tubo. Para acelerar a montagem da reação química do clique, recomenda-se um vórtice de mesa com racks para tubos. Conservar as amostras clicadas a -80 °C durante vários meses ou a -20 °C durante algumas semanas até novo processamento (ponto de paragem).
  8. Análise de Western blot para avaliar a incorporação de ANL no experimento
    1. Execute um SDS-PAGE com 20-40 μL do sobrenadante a partir da reação química do clique (etapa 2.7). Use géis de acrilamida a 12%, executados em SDS a 1%, Tris-HCl de 250 mM, glicina de 2 mM. Corra até que a frente esteja fora do gel.
    2. Transfira as proteínas para uma membrana de nitrocelulose ou PVDF13.
    3. Incubar a membrana durante a noite a 4 °C com anticorpo GFP (1:500, proteína GFP é co-traduzida com MetRS*5) e anticorpo biotina (1:1000) para detecção de alquino clicado, que é conjugado à biotina.
    4. Lave o anticorpo primário 2 vezes durante 10 minutos e adicione o anticorpo secundário durante 1,5 h.
    5. Lave o anticorpo secundário 2 vezes durante 10 minutos e analise (se estiver a utilizar anticorpos conjugados com fluoróforos) ou exponha a filmes (se utilizar anticorpos conjugados com peroxidase de rábano).
    6. Quantifique o sinal de biotina usando o ImageJ ou software similar, avalie a rotulagem geral de cada amostra do experimento e detecte possíveis valores atípicos. Avaliar a relação sinal-ruído (marcação da amostra de ANL para o fundo dos controles negativos) do experimento e detectar possíveis animais que não conseguiram retomar/incorporar a ANL.
      NOTA: Para amostras com alta incorporação de ANL, a purificação de proteínas é teoricamente possível usando alcinos não cliváveis como o usado nesta seção para a avaliação da incorporação de ANL. Usando amostras cerebrais, o fundo obtido nos controles negativos pela EM após a purificação de proteínas usando alcinos não cliváveis é muito alto14. Portanto, apenas os alcinos mais fáceis de manusear e não cliváveis foram utilizados para uma primeira amostra geral e avaliação do experimento. Independentemente do tipo de alquino destinado à purificação de proteínas, é aconselhável executar as etapas para a otimização da dosagem de alcino descritas na seção a seguir (etapa 2.9).
  9. Reação de clique para otimização da dosagem de alquino clivável
    1. Preparar quatro tubos com 40 μL de uma amostra representativa (obtida na etapa 2.6 e avaliada na etapa 2.8) e adicionar PBS (pH 7,8) a um volume final de 120 μL.
    2. Configure a reação química do clique, conforme explicado na etapa 2.7, mas, desta vez, adicione quatro quantidades diferentes do DST-alquino. Para o referido alquino, recomenda-se testar 5 μM, 15 μM, 30 μM e 60 μM.
    3. Repita a etapa 2.8 para decidir qual é a dosagem de alcino mais adequada para a questão experimental específica em estudo, com base na maior eficiência de marcação com o menor sinal de fundo.
      NOTA: Antes de submeter as amostras restantes a uma reação de clique, a quantidade ideal de qualquer alcino precisa ser determinada. Existem várias opções de alcinos comercialmente disponíveis que podem ser usados. Eles diferem na forma de clivagem (por exemplo, agentes leves ou redutores). A química de cliques sem cobre usando reagentes promovidos por cepas (por exemplo, reagentes DBCO) também é possível. Pequenas mudanças na quantidade de alcinos ou reagentes DBCO geralmente aumentam significativamente o sinal no controle negativo (fundo). Aqui, a purificação da proteína usando um alcino com uma ponte de dissulfeto clivável por agentes redutores (alcino de biotina dissulfeto ou DST-alquino15) é descrita. Ao usar o DST-alquino, para executar o SDS-PAGE (etapa 8.1), evite carregar buffers com agentes redutores fortes, como TDT ou β-Mercaptoetanol para evitar a clivagem alquina. Neste estudo, o aquecimento a 72 °C, por 5 min, usando 5 mM de N-etilmaleimida (NEM) no tampão de carga não afeta a estabilidade do alcino DST. A etapa 2.9.2 pode ser repetida, testando doses mais finas na faixa da melhor observada.
  10. Reação de clique preparativa para purificação de proteínas
    1. Clique em todas as amostras obtidas na etapa 2.6 com a dosagem ótima de alcino determinada na etapa 2.9 e analise uma fração por SDS-PAGE e Western blot (etapa 2.8).
      NOTA: Certifique-se de que as pipetas estão devidamente calibradas para garantir a precisão do upscaling da amostra. As amostras clicadas podem ser armazenadas a -80 °C durante vários meses (ponto de paragem).

3. Purificação de proteínas

  1. Troca de buffer
    1. Submeta todas as amostras clicadas a um procedimento de troca de buffer, conforme descrito na etapa 2.6, mas use o buffer de ligação Neutravidin como buffer de equilíbrio (PBS pH 7,4, 0,15% (wt/vol) SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100 e PI (1:2000)).
      NOTA: As amostras eluídas podem ser armazenadas a -80 °C durante vários meses (ponto de paragem). Nesta etapa, o alcino livre não clicado é eliminado e o buffer é trocado pelo buffer de ligação Neutravidina.
  2. Ligação a grânulos de Neutravidin
    1. Lavar os grânulos de alta capacidade de Neutravidin com o tampão de ligação Neutravidin (ver passo 3.1); misturar os grânulos com o tampão e centrifugar a mistura durante 5 minutos a 3000 x g e eliminar o sobrenadante. Repita três vezes.
    2. Prepare uma pasta 1:1 de grânulos de Neutravidina, adicionando o mesmo volume de grânulos secos e tampão de ligação de Neutravidina.
    3. Retirar 20-40 μL de cada amostra em lisado pré-purificado e armazená-la a -20 °C.
    4. Medir a concentração de proteínas (ver etapa 2.4) e misturar 100 μg de proteína com 4 μL da pasta de grânulos obtida na etapa 3.2.2.
    5. Incubar a mistura durante a noite a 4 °C com rotação contínua, permitindo que as proteínas marcadas se liguem às contas.
      NOTA: Quanto à reação química do clique, a reação básica de purificação de afinidade descrita na etapa 3.2.4 pode ser aumentada. Por exemplo, para purificação de proteínas dos neurônios excitatórios do hipocampo, 1 mg de lisado de proteína é misturado com 40 μL de contas de Neutravidin (pasta 1:1). A quantidade de esferas de Neutravidin pode ser aumentada ou reduzida de acordo com a quantidade de proteínas marcadas por mg de proteína total, o que dependerá do tipo de célula escolhido e do período de marcação e precisa ser determinado empiricamente.
  3. Lavagens de contas de neutravidina e eluição de proteínas
    1. Recolher os sobrenadantes por centrifugação (ver passo 3.2.1). Deixar de lado uma alíquota de 20-40 μl de cada sobrenadante para análise posterior e congelar o resto a -80 °C.
    2. Lave as contas com tampão de lavagem Neutravidin refrigerado 1 (PBS pH 7,4, 0,2% (wt/vol) SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100 e PI (1:2000)) adicionando o tampão, sedimentando as contas e descartando o sobrenadante. Repita esta etapa três vezes.
    3. Em seguida, adicionar o mesmo tampão e incubar as contas durante 10 minutos sob rotação contínua a 4 °C antes de eliminar o sobrenadante. Repita esta etapa três vezes.
    4. Lave as contas conforme explicado nas etapas 3.3.2-3.3.3, mas usando o tampão de lavagem Neutravidin 2 (1x PBS, pH 7,4 e PI 1:2000).
    5. Lave as contas conforme explicado na etapa 3.3.2-3.3.3, mas usando o tampão de lavagem Neutravidin 3 (bicarbonato de amônio 50 mM e PI 1:2000).
    6. Eluir as proteínas clicadas incubando as contas por 30 min a 20 °C com um volume de tampão de eluição de Neutravidina (5% (vol/vol) β-mercaptoetanol e 0,03% (em peso/vol) SDS) correspondente a um volume das esferas secas utilizadas.
    7. Manter os grânulos em suspensão durante a eluição por agitação contínua (1000 rpm) num agitador termobloco. Elute duas vezes e combine ambos os eluates.
      NOTA: A centrifugação configurada para a separação da fracção sólida do chorume (grânulos) e da fase aquosa (sobrenadante), tal como explicado no passo 3.2.1, aplica-se aos passos 3.3.1-3.3.7. A quantidade de SDS pode ser aumentada se a eluição da proteína não estiver completa. No entanto, com quantidades acima de 0,08%-0,1% de SDS, as proteínas não especificamente ligadas às esferas começam a ser eluídas. β-mercaptoetanol é volátil e tóxico; o uso de um exaustor para as etapas 3.3.6-3.3.7 é aconselhável. As amostras recolhidas nos passos 3.2.3 e 3.3.1 devem ser geridas pelo SDS-PAGE e avaliadas pelo Western blot (ver passo 2.8) para avaliar a eficiência da purificação da afinidade (passo 3.3).
  4. Avaliação de proteínas eluídas
    1. Carregue 1/3 das amostras eliminadas em uma SDS-PAGE (consulte a etapa 2.8.1).
    2. Colora o gel para visualizar proteínas usando um método de alta sensibilidade, como coloração de prata ou um método fluorescente.
    3. Se as amostras tiverem a qualidade esperada, o que significa que há 3-4 vezes mais proteína nas amostras marcadas com ANL em comparação com o controle negativo, as proteínas eluídas podem ser identificadas por métodos rotineiros de espectrometria de massa, como o explicado na referência5.

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Representative Results

Seguindo o protocolo descrito (resumido na Figura 1), a ANL foi administrada a camundongos por injeções intraperitoneais diárias (400 mM de ANL 10 mL/kg, Nex-Cre::MetRS*) por 7 dias, ou via água potável (0,7% de Maltose, 1% de ANL, CamkII-Cre::MetRS*) por 21 dias. Após a rotulagem, as áreas cerebrais correspondentes foram dissecadas, lisadas, alquiladas e clicadas. As reações de cliques foram analisadas por SDS-PAGE e Western Immunoblot. Imagens representativas dos experimentos são mostradas na Figura 2 para administração de ANL por injeção de IP e na Figura 3 para administração de ANL via água potável. Note-se que o objetivo das figuras é mostrar que ambos os protocolos de rotulagem funcionam, não compará-los. A comparação não é possível porque diferentes populações neuronais são marcadas nos dois experimentos mostrados (neurônios excitatórios do hipocampo e córtex e os neurônios de Purkinje do cerebelo).

Um outro experimento fornece um exemplo para a determinação da concentração ótima de alcino clichê DST (Figura 4). Neste exemplo, a mudança de dobra entre a amostra rotulada e o controle é maior em uma concentração de alcino de 14 μM. Esta concentração de alquino é então aplicada a todas as amostras. Após a verificação da marcação de cada amostra no experimento com a quantidade de alquina escolhida, todas as amostras foram submetidas à purificação de proteínas marcadas com ANL/cliques em biotina por ligação de afinidade utilizando esferas de Neutravidin (Figura 5). Nesta etapa, as proteínas são ligadas às contas, lavadas e, posteriormente, eluídas, reduzindo a ponte dissulfeto presente no DST-alquino. Após este último passo, a biotina e parte do alcino permanecem ligadas às contas. As proteínas contendo ANL (ligadas ao resto do alquino) são recuperadas no tampão de eluição. Para avaliar a eficiência da etapa de eluição, um terço do volume de eluato é carregado em um gel SDS-PAGE e visualizado usando um método de coloração de proteína total sensível. Pelo menos uma diferença de intensidade de 3 vezes da coloração de proteína total entre controles negativos e amostras marcadas com ANL deve ser observada para alcançar resultados interpretáveis com espectrometria de massa. A conclusão de todas as etapas descritas neste protocolo será seguida pela preparação, aquisição e análise da amostra de MS5. Embora não haja requisitos especiais para a EM (cada laboratório pode usar seu protocolo de rotina de EM 5,10), deve-se ter em mente que a quantidade de proteínas purificadas será geralmente baixa (na ordem de nanogramas). A Figura 6 fornece um exemplo de resultados de SM com um claro enriquecimento na amostra marcada com ANL em comparação com o controle (Figura 6A). Essa diferença já era visível na coloração proteica total mostrada na Figura 5. Além das alterações na intensidade do peptídeo, também existem proteínas únicas encontradas em ambas as amostras (Figura 6B).

Figure 1
Figura 1: Tubulação de trabalho para purificação de proteína específica do tipo celular pelo BONCAT. Após a marcação de proteínas com ANL, o tecido de interesse é dissecado e lisado, marcado com biotina por clique químico, e a quantidade de marcação para cada amostra é avaliada pelo BONCAT. Outliers (que não incorporaram ANL) e amostras representativas podem ser diferenciados nesta etapa. Uma das amostras representativas é clicada novamente para encontrar a dosagem de alcino clivável otimizada para a purificação subsequente da proteína. A dosagem de alquino que atinge a melhor relação sinal-ruído é aplicada a cada replicação biológica. Proteínas específicas do tipo celular são obtidas por purificação de afinidade. Amostras purificadas são estudadas por espectrometria de massa, e proteínas são identificadas. Esse número foi modificado a partir de Alvarez-Castelao et al. (2017)6. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Administração de ANL por injeções intraperitoneais (IP). O BONCAT foi realizado para avaliar a marcação de proteínas no hipocampo (HP) e córtex (CX) após a marcação metabólica de proteínas com ANL por injeções diárias de IP por 7 dias. Amostras de camundongos do tipo selvagem como controle negativo (wt) foram clicadas em paralelo às amostras marcadas (MetRS*). As proteínas marcadas são dos neurônios excitatórios usando uma linha16 de Nex-Cre::MetRS*. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Administração de ANL por água potável. O BONCAT foi realizado para avaliar a marcação de proteínas nos neurônios de Purkinje do cerebelo após a administração de ANL a camundongos GAD-Cre::MetRS* via água potável por 21 dias. A figura mostra um controle negativo (wt) e uma amostra rotulada (MetRS*) lisada e clicada em paralelo. Esse número foi modificado a partir de Alvarez-Castelao et al. (2017)6. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Titulação da dosagem de alcinos DST. Uma replicação biológica por experimento é escolhida como uma amostra representativa para titular a concentração ideal de alquinos. Três concentrações (14, 28 e 56 μM) do alcino foram testadas aqui na reação de clique para BONCAT. A razão de marcação entre a amostra marcada com ANL (MetRS*) e o controle negativo (wt) determina a relação sinal-ruído (mostrada no gráfico). 14 μM é a melhor concentração de alquino obtida neste experimento. O tecido córtex da linha de camundongos Nex::MetRS* marcada com ANL foi usado para este experimento. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Proteínas purificadas. As proteínas marcadas dos neurônios de Purkinje foram purificadas e coradas usando SYPRO Ruby. Esse número foi modificado a partir de Alvarez-Castelao et al. (2017)6. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Identificação e quantificação de proteínas. O proteoma de células de Purkinje foi obtido por espectrometria de massas utilizando cerebelo de uma linhagem de camundongos GAD-Cre::MetRS* como material de partida. (A) mostra maior abundância (intensidade peptídica) das proteínas identificadas em amostras marcadas com ANL em comparação com camundongos do tipo selvagem (wt). (B) O proteoma de Purkinje foi obtido agrupando proteínas enriquecidas nas amostras marcadas com ANL em A (definidas por intensidades de >3 vezes em camundongos MetRS* em comparação com o wt) e proteínas únicas encontradas nos camundongos que expressam MetRS*. Esse número foi modificado a partir de Alvarez-Castelao et al. (2017)6. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Os aspectos críticos do protocolo são; a inclusão de controles negativos, com replicações biológicas suficientes, via de administração de ANL, quantidade e duração, alquilação das amostras, concentração de alquinos e eliminação de β-mercaptoetanol ao usar o DST-alquino.

É fundamental incluir amostras de controle negativas provenientes de animais marcados com ANL sem condutor Cre e, portanto, sem expressão MetRS*. Essas amostras devem ser submetidas a todas as etapas descritas no protocolo em paralelo às amostras de camundongos MetRS* induzidos por Cre* marcados com ANL. Amostras não clicadas não são controles válidos, pois quaisquer resultados obtidos usando apenas esse controle podem ser devidos a cliques não específicos. Não observamos incorporação de ANL em células que não expressam o gene MetRS*, nem expressão de MetRS* em células sem Cre; assim, os animais bovinos marcados com ANL podem ser utilizados como controle negativo.

Dado que o protocolo aqui descrito consiste em muitas etapas em que as amostras podem ser perdidas, recomenda-se calcular as replicações biológicas tendo em conta a falha técnica. Para amostras cerebrais, há aproximadamente 30% de perda de replicação.

Descrevemos aqui duas rotas e durações de administração da ANL. Isso não exclui que outras vias de administração (por exemplo, adicionando ANL ao alimento) funcionem igualmente bem. Com relação à quantidade de ANL administrada, os experimentos aqui mostrados foram realizados usando quantidades relativamente altas de ANL. A rotulagem com quantidades mais baixas também é possível dependendo da configuração experimental. O menor período de tempo de marcação da ANL relatado neste protocolo é de 1 semana e o maior de 21 dias. Poderiam ser aplicados períodos de rotulagem mais curtos ou mais longos, mas não o determinámos. Os pesquisadores devem determinar a via de administração de ANL, a dosagem de ANL e o período de marcação de ANL adequados para a questão experimental específica em estudo, considerando as propriedades metabólicas do tecido, o tipo de célula de interesse e a questão experimental em estudo.

A alquilação da amostra, também conhecida como tampamento, é um passo importante para evitar o clique em segundo plano17. Quando a alquilação é feita corretamente, o clique não específico, conforme monitorado pelas amostras de controle, é reduzido e a diferença entre as amostras marcadas com controle negativo e ANL é maior. A eliminação do IAA livre após a alquilação também é um passo fundamental. A presença de pequenas quantidades de IAA durante a reação de clique limitará sua eficiência. Ocasionalmente, a etapa de dessalinização, que também elimina o IAA (passo 2.6), tem de ser repetida para garantir a remoção adequada do IAA.

Existem vários reagentes de biotina-alquinos e -DBCO comercialmente disponíveis em uma variedade de empresas. As principais diferenças entre eles dizem respeito ao comprimento da cadeia de ligação do polietilenoglicol (PEG) e à ausência, presença e tipo de grupos cliváveis. Independentemente do tipo utilizado, quantidades excessivas de alcino levam a um clique inespecífico em proteínas que contêm apenas aminoácidos naturais. Isso pode ser facilmente evitado pela titulação precisa e cuidadosa da quantidade de alquino. Conforme descrito, a melhor maneira de conseguir isso é usando as amostras lisadas e alquilados reais a serem usadas nas etapas subsequentes de purificação de proteínas (etapa 2.6) e na análise de espectrometria de massa.

Quando os alcinos DST são usados na reação de clique, o β-mercaptoetanol reduz a ponte de dissulfeto e dissocia as proteínas marcadas das contas na etapa de eluição (etapa 3.3). β-mercaptoetanol deve ser removido das amostras para permitir a digestão enzimática necessária para a EM. Existem várias maneiras de fazer isso (por exemplo, liofilização18, excisão de um gel19 ou limpeza usando colunas S-Trap20), e a escolha deve ser feita pelo laboratório de MS que processa as amostras.

Modificações e solução de problemas do método devem ser direcionadas para otimizar as etapas críticas mencionadas no protocolo. Por exemplo, se houver muita variabilidade, adicione mais replicações biológicas; se a marcação for muito baixa, aumente a concentração de ANL, use períodos de tempo de marcação mais longos ou teste outras vias de administração de ANL que possam ser mais eficientes para o tecido estudado. Para a alquilação de proteínas, uma etapa de redução anterior para a adição de IAA poderia ser implementada.

A principal limitação do método é a purificação de proteomas provenientes de populações de pequenas células, mesmo que uma pequena área de tecido seja dissecada. Proteomas de populações celulares mais numerosas que estão, no entanto, espalhadas por áreas teciduais maiores também são difíceis de acessar. No entanto, a técnica de marcação in vivo aqui descrita ainda pode ser aplicada para avaliar os referidos tipos de células por imagem (por exemplo, com FUNCAT ou FUNCAT-PLA21).

Este método é atualmente o único método disponível para o estudo in vivo de proteomas específicos do tipo celular com base em proteínas de comprimento total e para a visualização in situ de proteínas completas específicas do tipo celular. Outros aminoácidos não canônicos, como a azidohomoalanina (AHA), também podem ser utilizados para marcação proteica in vivo e purificação de proteomas, mas carecem de especificidade do tipo celular22,23. Outras abordagens, como a puromicina, são adequadas para fornecer um quadro fixo da síntese proteica24,25. No entanto, o uso de aminoácidos não canônicos por períodos mais longos de marcação é possível, refletindo também a degradação proteica e mostrando um proteoma celular mais preciso. Métodos baseados em BioID são utilizados para identificar proteínas em regiões subcelulares específicas, independentemente do seu momento/local de síntese26.

Na linha de camundongos que estabelecemos (disponível no Jackson Lab, estoque nº 028071), a metionina mutante tRNA sintetase (MetRS*) que permite a incorporação de ANL nas células é expressa de maneira dependente de Cre. Com esta linha de mouse como ferramenta, é possível expressar exclusivamente o MetRS* em tipos de células para os quais as linhas Cre-driver estão disponíveis. Este arranjo dota o método de uma versatilidade considerável, tornando-o útil em quase todas as áreas da pesquisa biomédica.

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Disclosures

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

O B.A-C é financiado pelo Ministério da Ciência e Inovação espanhol (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), pela Comunidade Autónoma de Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) e pelas subvenções MICINN (PID2020-113270RA-I00). A R. A-P é financiada pela Comunidade Autónoma de Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). O E.M.S. é financiado pela Max Planck Society, um prêmio de Investigador Avançado do Conselho Europeu de Pesquisa (subvenção 743216), DFG CRC 1080: Molecular and Cellular Mechanisms of Neural Homeostasis e DFG CRC 902: Molecular Principles of RNA-based Regulation. Agradecemos a D.C Dieterich e P. Landgraf por seu conselho técnico e pela síntese do DST-Alkyne. Agradecemos a E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast e à instalação de animais do MPI for Brain Research por seu excelente apoio. Agradecemos a Sandra Goebbels por compartilhar a linha de mouse Nex-Cre. Agradecemos a Antonio G. Carroggio por sua ajuda com a edição em inglês. B.A-C. projetou, conduziu e analisou experimentos. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E. e S. t. D. realizou e analisou experimentos. B.A-C e E.M.S. projetaram experimentos e supervisionaram o projeto, B.A-C escreveu o artigo. Todos os autores editaram o artigo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Acrylamide gels GenScript SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%
β-Mercaptoethanol Sigma M6250 Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.
Ammonium bicarbonate Sigma 9830 Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood
ANL Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11)
ANL-HCl IrishBotech HAA1625.0500
Benzonase Sigma E1014
Biotin alkyne Thermo, B10185
Chicken antibody anti-GFP Aves 1020
Complete EDTA-free protease inhibitor Roche 4693132001 Toxic; use a lab coat and gloves.
Copper (I) bromide Sigma 254185 99.999% (wt/wt)
Disulfide tag (DST)-alkyne Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20
DMSO Sigma 276855
Filters Merk SCGP00525
Iodo acetamide (IAA) Sigma I1149
IR anti chicken 800 LI-COR IRDye 800CW Donkey anti-Chicken Secondary Antibody
IR anti rabit 680 LI-COR IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody
Maltose Sigma M9171
Manual Mixer BioSpec Products 1083
NaCl Sigma S9888
N-ethylmaleimide Sigma 4259 Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.
NeutrAvidin beads Pierce 29200
Nitrocellulose membrane Bio-rad 1620112
PBS 1X Thermo J62036.K2
PBS 1X pH 7.8 Preparation described in reference number 5
PD SpinTrap G-25 columns GE Healthcare Buffer exchange
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo, 23225 Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life.
Polyclonal rabbit anti-biotin antibody Cell Signaling 5597
PVDF membrane Millipore IPVH00010
SDS 10% Sigma 71736
SDS-PAGE  Running buffer MOPS GenScript M00138
SYPRO Ruby stain Sigma S4942
Table automatic Vortexer Eppendorf Mixmate
Triazole ligand Sigma 678937
Triton X-100 Sigma T9284
Water Sigma W4502 Molecular biology grade

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References

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Neurociência Edição 182
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Nassim-Assir, B., Ouro Corredera, D., Alvarez-Pardo, R., tom Dieck, S., Ciirdaeva, E., Schuman, E. M., Alvarez-Castelao, B. Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line. J. Vis. Exp. (182), e63713, doi:10.3791/63713 (2022).

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