Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Celletypespesifikk proteinrensing og identifikasjon fra komplekse vev ved bruk av en mutant metionin tRNA-syntetasemuselinje

Published: April 13, 2022 doi: 10.3791/63713
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 1, 2
1Max-Planck-Institute for Brain Research, Synaptic Plasticity Department, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Veterinary School, Complutense University of Madrid

Summary

Denne protokollen beskriver hvordan man utfører celletypespesifikk proteinmerking med azidonorleucin (ANL) ved hjelp av en muselinje som uttrykker en mutant L274G-metionin tRNA-syntetase (MetRS *) og de nødvendige trinnene for merket celletype-spesifikke proteiner isolasjon. Vi skisserer to mulige anl-administrasjonsveier hos levende mus ved (1) drikkevann og (2) intraperitoneale injeksjoner.

Abstract

Å forstå proteinhomeostase in vivo er nøkkelen til å vite hvordan cellene fungerer i både fysiologiske og sykdomstilstander. Denne protokollen beskriver in vivo-merking og påfølgende rensing av nylig syntetiserte proteiner ved hjelp av en konstruert muselinje for å lede proteinmerking til spesifikke cellulære populasjoner. Det er en induserbar linje ved Cre rekombinase ekspresjon av L274G-metionin tRNA syntetase (MetRS *), slik at azidonorleucin (ANL) inkorporering til proteiner, som ellers ikke vil forekomme. Ved hjelp av metoden beskrevet her, er det mulig å rense celletypespesifikke proteomer merket in vivo og oppdage subtile endringer i proteininnhold på grunn av reduksjon av prøvekompleksitet.

Introduction

Avvikende proteinhomeostase er forårsaket av ubalanse i proteinsyntese og nedbrytning. Flere sykdommer er relatert til endringer i proteinhomeostase. Kjennetegnet for noen sykdommer er tilstedeværelsen av aggregater i forskjellige subcellulære steder og hjerneområder. Proteinhomeostase er ikke bare viktig ved sykdom, men spiller også en avgjørende rolle i normal organ- ogcellefunksjon1. For eksempel er proteinsyntese nødvendig for mange former for neuronal plastisitet2,3, som bestemt ved bruk av kjemiske hemmere som blokkerer proteinsyntese4. Det er imidlertid ikke klart i hvilke celletyper proteomet endres for å støtte læring og minne, og det forstås heller ikke hvilke spesifikke proteiner i hver celletype som øker eller reduserer syntesen eller nedbrytningen. Dermed krever en omfattende studie av proteinhomeostase evnen til å skille proteomer som kommer fra bestemte celletyper. Faktisk har identifiseringen av celletypespesifikke proteomer for å studere cellulære prosesser som forekommer i et flercellet miljø vært et viktig hinder i proteomikk. Av denne grunn utviklet vi en teknikk ved hjelp av MetRS*-uttrykk kombinert med bioortogonale metoder som har vist seg å være en effektiv måte å identifisere og rense celletypespesifikke proteomer på, og fylle dette gapet 5,6,7.

Uttrykket av en mutant MetRS * (MetRS L274G) tillater lasting av den ikke-kanoniske metioninanalogen ANL i det tilsvarende tRNA 8,9 og dets påfølgende innlemmelse i proteiner. Når MetRS*-ekspresjon reguleres av en celletypespesifikk promotor, vil den ikke-kanoniske aminosyren bli inkorporert i proteinene på en celleselektiv måte. Når ANL er innlemmet i proteinene, kan det selektivt funksjonaliseres ved klikkkjemi og deretter enten visualiseres ved avbildning (FUNCAT) eller ved Western Immunoblot (BONCAT). Alternativt kan proteiner selektivt renses og identifiseres ved massespektrometri (MS). Ved hjelp av denne teknologien skapte vi en muselinje som uttrykker MetRS*-proteinet under kontroll av Cre-rekombinasen. Med tanke på det økende antallet tilgjengelige Cre-mouse-linjer, kan MetRS*-systemet brukes i alle felt for å studere alle celletyper fra alle vev der det finnes en eksisterende Cre-line. Proteinmerking med ANL er mulig in vitro eller in vivo, og endrer ikke museatferd eller proteinintegritet6. Merkingstiden kan tilpasses det vitenskapelige spørsmålet til hver forsker, merking av nylig syntetiserte proteiner (kortere merkingstider) eller hele proteomer (lengre merkingstider). Bruken av denne teknikken er begrenset av antall celler av typen som forskeren er villig til å studere; Derfor er proteinisolering fra celletyper med lavt antall eller lave metabolske hastigheter ikke mulig ved denne metoden. Målet med den presenterte metoden er å identifisere celletypespesifikke proteiner/proteomer merket in vivo. I denne protokollen beskriver vi hvordan man merker celletypespesifikke proteomer med ANL i levende mus og renser de merkede proteinene. Etter rensing kan proteiner identifiseres ved rutinemessige massespektrometriprotokoller 5,10. Reduksjonen av prøvekompleksitet oppnådd i denne metoden ved selektiv rensing av proteiner fra spesifikke cellulære populasjoner gjør det mulig for eksperimentøren å oppdage subtile endringer i proteomer, for eksempel som svar på miljøendringer. Rensing av de merkede proteinene kan oppnås på ~ 10 dager, ikke inkludert MS-analysen eller merkingsperioden. Her beskriver vi to metoder for ANL-administrasjon til MetRS* som uttrykker mus, nemlig (1) tilsetning av aminosyren i drikkevannet, og (2) innføring av ANL ved intraperitoneale injeksjoner. Uansett hvilken metode som er valgt for ANL-administrasjon, er isolasjons- og rensetrinnene de samme (fra trinn 2 og videre).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter med dyr ble utført med tillatelse fra de lokale regjeringskontorene i Tyskland (RP Darmstadt; protokoller: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) eller Spania (Komité for dyreforsøk ved UCM og miljørådgivning i Comunidad de Madrid, protokollnummer: PROEX 005.0/21) og er i samsvar med Max Planck Society-reglene og spanske forskrifter og følger EUs retningslinjer for dyrevelferd.

1. In vivo metabolsk merking med ANL

  1. Drikkevann:
    1. Løs opp ANL og maltose i musens vanlige drikkevann. Anbefalt maltosekonsentrasjon er 0,7 % (vekt/vol). Maksimal mengde ANL tilsatt drikkevannet er 1% (vekt / vol). Når blandingen er klar, steriliser den ved filtrering og oppbevar den ved 4 °C.
    2. Gi blandingen tilberedt i trinn 1.1 til musene. Bytt flasker ofte (f.eks. hver 3. dag) for å unngå kontaminering, og sjekk dem hver dag for å se etter mulig forurensning eller tilstopping. Overvåk mengden drukket vann daglig ved å veie det, for å vite musens ANL-inntak.
      MERK: Den maksimale merkeperioden som evalueres her er 3 uker ved bruk av en ANL-konsentrasjon på 1% i drikkevannet, noe som resulterte i godt detekterbar merking i hjernen. God merking kan også oppnås på 2 uker. Verken kortere merketider, lengre tidspunkter eller andre ANL-beløp har blitt studert av oss ved hjelp av denne administrasjonsmetoden, noe som ikke betyr at det foregående ikke ville fungere. ANL-inkorporeringsrater kan variere avhengig av det studerte vevet eller celletypen. Tidspunktet for merking kan variere avhengig av det vitenskapelige spørsmålet; For eksempel, hvis proteomer skulle merkes, bør merkingstiden beregnes i funksjon av gjennomsnittlig halveringstid for proteinene i det studerte vevet. Hvis interessen bare er å identifisere nylig syntetiserte proteiner, kan tidene forkortes. Merkingsperioder og ANL-doser må testes empirisk for hver eksperimentell tilstand og celletype av interesse.
  2. Intraperitoneal administrering:
    1. Løs opp ANL i fysiologisk NaCl-oppløsning til 400 mM, fosfatsaltbuffer (PBS) eller vann.
    2. Forsikre deg om at osmolariteten til løsningen er innenfor det fysiologiske området. Her administreres 10 ml/kg kroppsvekt av ANL-oppløsning til musene.
      MERK: God merking i eksitatoriske nevroner i hjernen oppnås vellykket ved en daglig intraperitoneal injeksjon (IP) med 400 mM ANL i 1 uke. Verken lavere ANL-konsentrasjoner eller andre merkeperioder ved IP-injeksjoner har blitt testet i denne studien, noe som ikke betyr at de ikke ville fungere. ANL leveres som hydroklorid av noen selskaper. I dette tilfellet må pH-verdien til oppløsningene justeres til tilstrekkelig pH (avhengig av administrasjonsvei). ANL kan også syntetiseres etter metoden publisert av Link et al.11 med noen modifikasjoner5. ANL-merking kan utføres ved hjelp av andre ANL-konsentrasjoner, tidsperioder og administrasjonsveier. For vev/celletyper med lave metabolske hastigheter kan en diett med lavt innhold av metionin brukes, alltid fra 1 uke før ANL-administrasjon. Når 400 mM ANL brukes, kan den utfelle mens den oppbevares ved 4 °C. oppvarming opp til 37 °C bringer ANL tilbake i løsningen. La den oppnå romtemperatur før injeksjon. I de fleste verdensregioner er ANL-administrasjon til mus et dyreforsøk og må godkjennes av relevante myndigheter.

2. Vevshøsting, lyse og proteinekstraksjon

  1. Vevsdisseksjon: Disseker området av vev som inneholder celletypen av interesse og noter vekten av det oppsamlede vevstykket.
    MERK: Prøver kan lagres ved -80 °C i flere måneder (stopppunkt). I den nåværende protokollen ble mus cortex og hippocampus dissekert.
  2. Vevlyse: Homogeniser vevet ved romtemperatur ved å tilsette et volum 12-15 ganger våtvekten til vevet i lysisbufferen (PBS pH 7,4, 1% wt / vol SDS, 1% (vol / vol) Triton X-100, Benzonase (1: 1000 vol / vol), en proteasehemmer (PI) (EDTA-fri 1: 4000)). For eksempel, for et 20 mg vevstykke, tilsett 240-300 μL lysisbuffer. Triturate vevet til det er homogenisert.
    MERK: Prøver kan lagres ved -80 °C i flere måneder (stopppunkt). For direkte homogenisering i 1,5 ml rør anbefales bruk av en håndholdt, batteridrevet homogenisator, spesielt når små biter av vev behandles. For større stykker kan en Dounce homogenisator brukes. Til hver buffer der proteasehemmere (PI) er inkludert, bør de legges til umiddelbart før bruk og ikke tidligere.
  3. Proteindenaturering: Varm homogenatet til 75 °C i 15 minutter og sentrifugen ved 17 000 x g i 15 minutter ved 10 °C. Overfør supernatanten til et nytt rør.
  4. Proteininnholdsmåling: Mål proteinkonsentrasjonen til hver prøve, og juster alle prøvene som skal sammenlignes med samme proteinkonsentrasjon; Juster konsentrasjonen ved å legge til lysisbuffer. Et optimalt konsentrasjonsområde er mellom 2-4 μg / μL.
    MERK: Prøver kan lagres ved -80 °C i flere måneder (stopppunkt).
  5. Alkylering
    1. Fortynn de homogeniserte prøvene med 2-3 ganger i PBS (pH 7,8) + PI (EDTA-fri 1: 4000).
    2. Tilsett iodoacetamid (IAA) til en endelig konsentrasjon på 20 mM (stamløsning 500 mM).
    3. La prøvene stå i 1-2 timer ved 20 °C i mørket. Utfør trinn 2.5.2-2.5.3 to ganger.
      MERK: Hvis det ikke-spesifikke klikket i den negative kontrollen forblir høyt for noen vev, kan det være nødvendig å utføre et reduksjonstrinn før alkylering12. Forbered IAA-bestanden friskt like før du legger den til prøvene. Prøver kan lagres ved -80 °C i flere måneder (stopppunkt).
  6. Bufferutveksling: Likevektsbufferutvekslingskolonner ved hjelp av klikkkjemiutvekslingsbufferen (PBS pH 7,8, 0,04 % (wt/vol) SDS, 0,08 % (vol/vol) Triton X-100 og PI (1:4000)). Følg produsentens instruksjoner. Utveksle alle alkylerte prøver.
    MERK: Eluterte prøver kan lagres ved -80 °C i flere måneder (stopppunkt). I dette trinnet elimineres IAA, og bufferen utveksles av klikkkjemibufferen. Protein kan måles igjen etter bufferutvekslingstrinnet for å sikre at proteinene ikke gikk tapt under bufferutvekslingsprosessen. Avhengig av hvilken type kolonner som brukes til bufferutveksling, kan protein gå tapt massivt. Bruk de anbefalte kolonnene for å unngå proteintap. For prøveoppbevaring anbefales fremstilling av aliquoter.
  7. Klikk reaksjon for å evaluere ANL-inkorporering i eksperimentet
    1. Ta 40 μL av de eluerte prøvene i trinn 2.6 og tilsett PBS (pH 7.8) til et endelig volum på 120 μL.
    2. For å sette opp klikkkjemireaksjonen, tilsett følgende reagenser i gitt rekkefølge og virvel i 20 s etter hvert tillegg: 1,5 μL triazolligand (stam 40 mM), 1,5 μL biotinalkyn (stam 5 mM) og 1 μL Cu(I)-bromid (stam 10 mg/ml, oppløst i DMSO ved forsiktig pipettering opp og ned, ikke vortex). Tilsett reagensene så raskt som mulig.
    3. Inkuber prøvene over natten i mørket ved 4 °C med kontinuerlig rotasjon.
    4. Sentrifuge prøvene ved 4 °C i 5 minutter ved 17 000 x g. En litt turkis pellet vil være synlig. Overfør supernatanten til et nytt rør.
      MERK: Forbered Cu (I) bromidlager umiddelbart før bruk for å unngå kobberoksidasjon. Det er viktig å holde forholdet mellom volumene mellom den lyserte prøven og PBS konstant mellom prøvene for å sikre den samme endelige vaskemiddelkonsentrasjonen i hvert rør. For å øke hastigheten på monteringen av klikkkjemireaksjonen, anbefales en bordvirvel med stativer for rør. Oppbevar de klikkede prøvene ved -80 °C i flere måneder, eller ved -20 °C i et par uker til videre behandling (stopppunkt).
  8. Western blot-analyse for å evaluere ANL-inkorporering i eksperimentet
    1. Kjør en SDS-PAGE med 20-40 μL av supernatanten fra klikkkjemireaksjonen (trinn 2.7). Bruk 12% akrylamidgeler, kjør i 1% SDS, 250 mM Tris-HCl, 2 mM glycin. Kjør til fronten er ute av gelen.
    2. Overfør proteinene til en nitrocellulose- eller PVDF-membran13.
    3. Inkuber membranen over natten ved 4 ° C med GFP-antistoff (1: 500, GFP-protein er samoversatt med MetRS * 5) og biotinantistoff (1: 1000) for klikket alkyndeteksjon, som er konjugert til biotin.
    4. Vask det primære antistoffet 2 ganger i 10 min og tilsett det sekundære antistoffet i 1,5 time.
    5. Vask det sekundære antistoffet 2 ganger i 10 minutter og skann (hvis du bruker fluoroforkonjugerte antistoffer) eller utsett for filmer (hvis du bruker pepperrotperoksidasekonjugerte antistoffer).
    6. Kvantifiser biotinsignalet ved hjelp av ImageJ eller lignende programvare, evaluer den generelle merkingen av hver prøve av eksperimentet, og oppdag mulige avvik. Evaluer signal-til-støy-forholdet (ANL-prøvemerking til bakgrunn fra de negative kontrollene) av forsøket og påvis mulige dyr som ikke tok opp / innlemmet ANL.
      MERK: For prøver med høy ANL-inkorporering er proteinrensing teoretisk mulig ved bruk av ikke-spaltbare alkyner som den som brukes i denne delen for evaluering av ANL-inkorporering. Ved hjelp av hjerneprøver er bakgrunnen oppnådd i de negative kontrollene av MS etter proteinrensing ved bruk av ikke-spaltbare alkyner for høy14. Derfor ble bare de lettere å håndtere, ikke-spaltbare alkynene brukt til en første generell prøve og eksperimentevaluering. Uansett hvilken type alkyn som er beregnet for proteinrensing, anbefales det å utføre trinnene for optimalisering av alkyndosering beskrevet i følgende avsnitt (trinn 2.9).
  9. Klikk reaksjon for spaltbar alkyn dosering optimalisering
    1. Forbered fire rør med 40 μL av en representativ prøve (oppnådd i trinn 2.6 og evaluert i trinn 2.8) og tilsett PBS (pH 7.8) til et endelig volum på 120 μL.
    2. Sett opp klikkkjemireaksjonen som forklart i trinn 2.7, men denne gangen legger du til fire forskjellige mengder av DST-alkynet. For nevnte alkyn anbefales testing 5 μM, 15 μM, 30 μM og 60 μM.
    3. Gjenta trinn 2.8 for å bestemme hvilken som er den best egnede alkyndosen for det spesifikke eksperimentelle spørsmålet som studeres, basert på den høyeste merkingseffektiviteten med det laveste bakgrunnssignalet.
      MERK: Før de gjenværende prøvene utsettes for en klikkreaksjon, må den optimale mengden alkyn bestemmes. Det finnes flere alternativer for kommersielt tilgjengelige alkyner som kan brukes. De varierer i form av spaltning (f.eks. lette eller reduserende midler). Kobberfri klikkkjemi ved bruk av belastningsfremmede reagenser (f.eks. DBCO-reagenser) er også mulig. Små endringer i mengden av enten alkyner eller DBCO-reagenser øker ofte signalet i den negative kontrollen (bakgrunnen) betydelig. Her beskrives proteinrensingen ved bruk av en alkyn med en disulfidbro som kan spaltes ved reduksjonsmidler (Disulfidbiotin alkyn eller DST-alkyn15). Når du bruker DST-alkyn, for å kjøre SDS-PAGE (trinn 8.1), unngå å laste buffere med sterke reduksjonsmidler som DTT eller β-merkaptoetanol for å forhindre alkynspaltning. I denne studien påvirker ikke oppvarming ved 72 °C i 5 minutter ved bruk av 5 mM N-etylmaleimid (NEM) i belastningsbufferen stabiliteten til DST-alkyn. Trinn 2.9.2 kan gjentas, teste mer finkornede doser i området av den beste observert.
  10. Forberedende klikkreaksjon for proteinrensing
    1. Klikk på alle prøvene oppnådd i trinn 2.6 med den optimale alkyndosen bestemt i trinn 2.9, og analyser en brøkdel av SDS-PAGE og Western blot (trinn 2.8).
      MERK: Forsikre deg om at pipettene er riktig kalibrert for å sikre nøyaktighet av oppskalering av prøver. Klikkprøver kan lagres ved -80 °C i flere måneder (stopppunkt).

3. Protein rensing

  1. Buffer-utveksling
    1. Utsett alle klikkede prøver for en bufferutvekslingsprosedyre som beskrevet i trinn 2.6, men bruk Neutravidin-bindingsbuffer som likevektsbuffer (PBS pH 7.4, 0.15% (wt / vol) SDS, 1% (vol / vol) Triton X-100 og PI (1: 2000)).
      MERK: Eluterte prøver kan lagres ved -80 °C i flere måneder (stopppunkt). I dette trinnet elimineres den ikke-klikkede frie alkynen, og bufferen utveksles av Neutravidin-bindingsbufferen.
  2. Binding til neutravidinperler
    1. Vask neutravidin-perlene med høy kapasitet med Neutravidin-bindingsbufferen (se trinn 3.1); Bland perlene med bufferen og sentrifuger blandingen i 5 minutter ved 3000 x g, og kast supernatanten. Gjenta tre ganger.
    2. Forbered en 1: 1 oppslemming av Neutravidin-perler ved å tilsette samme volum av tørre perler og Neutravidin-bindende buffer.
    3. Sett av 20-40 μL av hver prøve som forhåndsrenset lysat og oppbevar den ved -20 °C.
    4. Mål proteinkonsentrasjonen (se trinn 2.4), og bland 100 μg protein med 4 μL av perleoppslemmingen oppnådd i trinn 3.2.2.
    5. Inkuber blandingen over natten ved 4 ° C med kontinuerlig rotasjon, slik at merkede proteiner kan binde seg til perlene.
      MERK: Når det gjelder klikkkjemireaksjonen, kan den grunnleggende affinitetsrensereaksjonen beskrevet i trinn 3.2.4 oppskaleres. For eksempel, for rensing av proteiner fra hippocampusens eksitatoriske nevroner, blandes 1 mg proteinlysat med 40 μL Neutravidin-perler (1: 1 slurry). Mengden Neutravidin-perler kan skaleres opp eller ned i henhold til mengden merkede proteiner per mg totalt protein, som vil avhenge av den valgte celletypen og merkingsperioden og må bestemmes empirisk.
  3. Neutravidinperler vasker og protein eluering
    1. Samle supernatantene ved sentrifugering (se trinn 3.2.1). Sett en 20-40 μl aliquot av hver supernatant til side for senere analyse og frys resten ved -80 °C.
    2. Vask perlene med kjølt Neutravidin vaskebuffer 1 (PBS pH 7,4, 0,2% (vekt / vol) SDS, 1% (vol / vol) Triton X-100 og PI (1: 2000)) ved å legge til bufferen, sedimentere perlene og kaste supernatanten. Gjenta dette trinnet tre ganger.
    3. Tilsett deretter samme buffer og inkuber perlene i 10 minutter under kontinuerlig rotasjon ved 4 °C før supernatanten kastes. Gjenta dette trinnet tre ganger.
    4. Vask perlene som forklart i trinn 3.3.2-3.3.3, men bruk Neutravidin vaskebuffer 2 (1x PBS, pH 7.4 og PI 1:2000).
    5. Vask perlene som forklart trinn 3.3.2-3.3.3, men bruk Neutravidin vaskebuffer 3 (50 mM ammoniumbikarbonat og PI 1: 2000).
    6. Eluter de klikkede proteinene ved å inkubere perlene i 30 minutter ved 20 ° C med et volum Neutravidin elueringsbuffer (5% (vol / vol) β-merkaptoetanol og 0,03% (wt / vol) SDS) tilsvarende ett volum av de tørre perlene som brukes.
    7. Oppretthold perlene i suspensjon under eluering ved kontinuerlig omrøring (1000 o / min) i en termoblokkrister. Elute to ganger og kombinere begge eluates.
      MERK: Sentrifugeringen som er satt opp for separasjon av den faste fraksjonen av slammet (perlene) og den vandige fasen (supernatant), som forklart i trinn 3.2.1, gjelder for trinn 3.3.1-3.3.7. SDS-mengden kan økes hvis proteineluering ikke er fullført. Imidlertid, med mengder over 0,08% -0,1% av SDS, begynner proteiner som ikke er spesifikt bundet til perlene å bli eluert. β-merkaptoetanol er flyktig og giftig; Bruk av hette for trinn 3.3.6-3.3.7 anbefales. Prøvene samlet inn i trinn 3.2.3 og 3.3.1 skal kjøres av SDS-PAGE og evalueres av Western blot (se trinn 2.8) for å evaluere effektiviteten av affinitetsrensingen (trinn 3.3).
  4. Evaluering av eluerte proteiner
    1. Last inn 1/3 av de eluerte prøvene på en SDS-PAGE (se trinn 2.8.1).
    2. Flekk gelen for å visualisere proteiner ved hjelp av en høysensitivitetsmetode, for eksempel sølvfarging eller en fluorescerende metode.
    3. Hvis prøvene har forventet kvalitet, noe som betyr at det er 3-4 ganger mer protein i de ANL-merkede prøvene sammenlignet med den negative kontrollen, kan de eluerte proteinene identifiseres ved rutinemessige massespektrometrimetoder som den som er forklart i referanse5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter den beskrevne protokollen (oppsummert i figur 1) ble ANL administrert til mus enten ved daglige intraperitoneale injeksjoner (400 mM ANL 10 ml/kg, Nex-Cre::MetRS*) i 7 dager, eller via drikkevann (0,7 % maltose, 1 % ANL, CamkII-Cre::MetRS*) i 21 dager. Etter merking ble de tilsvarende hjerneområdene dissekert, lysert, alkylert og klikket. Klikkreaksjoner ble analysert av SDS-PAGE og Western Immunoblot. Representative bilder av forsøkene er vist i figur 2 for ANL-administrering ved IP-injeksjon og i figur 3 for ANL-administrasjon via drikkevann. Merk at målet med tallene er å vise at begge merkeprotokollene fungerer, ikke å sammenligne dem. Sammenligning er ikke mulig fordi forskjellige nevronpopulasjoner er merket i de to forsøkene som er vist (eksitatoriske nevroner i hippocampus og cortex, og Purkinje-nevronene i cerebellumet).

Et ytterligere eksperiment gir et eksempel for bestemmelse av den optimale DST-spaltbare alkynkonsentrasjonen (figur 4). I dette eksemplet er foldeendringen mellom merket prøve og kontroll høyest ved en alkynkonsentrasjon på 14 μM. Denne alkynkonsentrasjonen påføres deretter alle prøver. Etter verifisering av merkingen av hver prøve i forsøket med den valgte alkynmengden, ble alle prøvene utsatt for rensing av ANL-merkede / biotinklikkede proteiner ved affinitetsbinding ved bruk av Neutravidin-perler (figur 5). I dette trinnet blir proteiner bundet til perlene, vasket og deretter eluert ved å redusere disulfidbroen som er tilstede i DST-alkynet. Etter dette siste trinnet forblir biotinet og en del av alkynet bundet til perlene. De ANL-holdige proteinene (bundet til resten av alkynet) gjenfinnes i elueringsbufferen. For å evaluere effektiviteten av elueringstrinnet, lastes en tredjedel av eluatvolumet på en SDS-PAGE-gel og visualiseres ved hjelp av en sensitiv total proteinflekkmetode. Minst 3 ganger intensitetsforskjell av total proteinflekk mellom negative kontroller og ANL-merkede prøver må observeres for å oppnå tolkbare resultater med massespektrometri. Fullføring av alle trinnene som er beskrevet i denne protokollen, vil bli fulgt av MS-prøveforberedelse, anskaffelse og analyse5. Selv om det ikke er noen spesielle krav til MS (hvert laboratorium kan bruke sin rutinemessige MS-protokoll 5,10), bør det huskes at mengden rensede proteiner generelt vil være lav (i størrelsesorden nanogram). Figur 6 gir et eksempel på MS-resultater med en klar anrikning i den ANL-merkede prøven sammenlignet med kontrollen (figur 6A). Denne forskjellen var allerede synlig i den totale proteinflekken vist i figur 5. I tillegg til endringer i peptidintensitet finnes det også unike proteiner i begge prøvene (figur 6B).

Figure 1
Figur 1: Arbeidsrørledning for celletypespesifikk proteinrensing ved BONCAT. Etter proteinmerking med ANL blir vevet av interesse dissekert og lyst, merket med biotin ved klikkkjemi, og mengden merking for hver prøve evalueres av BONCAT. Outliers (som ikke klarte å innlemme ANL) og representative prøver kan differensieres i dette trinnet. En av de representative prøvene klikkes igjen for å finne den optimaliserte spaltbare alkyndosen for påfølgende proteinrensing. Alkyndosen som oppnår det beste signal-til-støy-forholdet, brukes på hver biologisk replikasjon. Celletypespesifikke proteiner oppnås ved affinitetsrensing. Rensede prøver studeres ved massespektrometri, og proteiner identifiseres. Dette tallet er modifisert fra Alvarez-Castelao og medarbeidere (2017)6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: ANL-administrasjon ved intraperitoneale injeksjoner (IP). BONCAT ble utført for å evaluere proteinmerking i hippocampus (HP) og cortex (CX) etter metabolsk merking av proteiner med ANL ved daglige IP-injeksjoner i 7 dager. Wild-type museprøver som negativ kontroll (wt) ble klikket parallelt med de merkede prøvene (MetRS *). Merkede proteiner er fra de eksitatoriske nevronene ved hjelp av en Nex-Cre::MetRS* linje16. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: ANL-administrasjon ved drikkevann. BONCAT ble utført for å evaluere proteinmerking i Purkinje-nevronene i lillehjernen etter administrering av ANL til GAD-Cre::MetRS* mus via drikkevann i 21 dager. Figuren viser en negativ kontroll (wt) og et merket utvalg (MetRS*) lyset og klikket parallelt. Dette tallet er modifisert fra Alvarez-Castelao og medarbeidere (2017)6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: DST-alkyn doseringstitrering. En biologisk replikasjon per eksperiment er valgt som en representativ prøve for å titrere den optimale alkynkonsentrasjonen. Tre konsentrasjoner (14, 28 og 56 μM) av alkynet ble testet her i klikkreaksjonen for BONCAT. Merkingsforholdet mellom den ANL-merkede prøven (MetRS*) og den negative kontrollen (wt) bestemmer signal-til-støy-forholdet (vist i grafen). 14 μM er den beste alkynkonsentrasjonen oppnådd i dette eksperimentet. Cortexvev fra den ANL-merkede Nex::MetRS*-muselinjen ble brukt til dette eksperimentet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Rensede proteiner. Merkede proteiner fra Purkinje-nevroner ble renset og farget ved hjelp av SYPRO Ruby. Dette tallet er modifisert fra Alvarez-Castelao og medarbeidere (2017)6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Proteinidentifikasjon og kvantifisering. Purkinjecelleproteomet ble oppnådd ved massespektrometri ved bruk av cerebellum fra en GAD-Cre::MetRS* muselinje som utgangsmateriale. (A) viser økt overflod (peptidintensitet) av de identifiserte proteinene i ANL-merkede prøver sammenlignet med villtype (vekt) mus. (B) Purkinje-proteomet ble oppnådd ved å samle proteiner beriket i ANL-merkede prøver i A (definert av >3 ganger intensitet i MetRS * mus sammenlignet med vekt), og unike proteiner funnet i MetRS *-uttrykkende mus. Dette tallet er modifisert fra Alvarez-Castelao og medarbeidere (2017)6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De kritiske aspektene ved protokollen er; inkludering av negative kontroller, å ha nok biologiske replikasjoner, ANL-administrasjonsvei, mengde og varighet, alkylering av prøvene, alkynkonsentrasjon og eliminering av β-merkaptoetanol ved bruk av DST-alkyn.

Det er viktig å inkludere negative kontrollprøver som går fra ANL-merkede dyr uten Cre-driver og derfor ikke noe MetRS*-uttrykk. Disse prøvene må utsettes for hvert trinn som er beskrevet i protokollen parallelt med prøvene fra ANL-merkede Cre-induced MetRS*-mus. Ikke-klikkede prøver er ikke gyldige kontroller, da eventuelle resultater som oppnås bare ved hjelp av denne kontrollen, kan skyldes ikke-spesifikt klikk. Vi har ikke observert inkorporering av ANL i celler som ikke uttrykker MetRS*-genet, eller MetRS*-uttrykk i celler uten Cre; Dermed kan WT-dyr merket med ANL brukes som en negativ kontroll.

Gitt at protokollen som herved er beskrevet, består av mange trinn der prøver kan gå tapt, anbefales det å beregne biologiske replikasjoner med tanke på teknisk svikt. For hjerneprøver er det omtrent 30% replikasjonstap.

Vi beskriver her to ANL-administrasjonsruter og varigheter. Dette utelukker ikke at andre administrasjonsveier (f.eks. tilsetning av ANL til maten) fungerer like bra. Med hensyn til den administrerte ANL-mengden ble forsøkene vist her utført ved bruk av relativt høye mengder ANL. Merking med lavere mengder er også mulig avhengig av eksperimentell oppsett. Det korteste tidsrommet for ANL-merking rapportert i denne protokollen er 1 uke, og de lengste 21 dagene. Kortere eller lengre merkeperioder kan brukes, men vi har ikke bestemt det. Forskere bør bestemme ANL-administrasjonsveien, ANL-doseringen og ANL-merkingsperioden som er tilstrekkelig for det spesifikke eksperimentelle spørsmålet som studeres, ved å vurdere vevets metabolske egenskaper, celletypen og det eksperimentelle spørsmålet som studeres.

Prøvealkylering, også kjent som capping, er et viktig skritt for å unngå bakgrunnsklikk17. Når alkylering er riktig utført, reduseres det ikke-spesifikke klikket som overvåkes av kontrollprøvene, og forskjellen mellom de negative kontrollprøvene og ANL-merkede prøver er større. Eliminering av fri IAA etter alkylering er også et viktig skritt. Tilstedeværelsen av små mengder IAA under klikkreaksjonen vil begrense effektiviteten. Av og til må avsaltingstrinnet som også eliminerer IAA (trinn 2.6), gjentas for å sikre riktig fjerning av IAA.

Det finnes flere biotin-alkyner og-DBCO reagenser kommersielt tilgjengelig fra en rekke selskaper. De viktigste forskjellene mellom dem gjelder polyetylenglykol (PEG) linkerkjedelengde og fravær, tilstedeværelse og type spaltbare grupper. Uansett hvilken type som brukes, fører overskytende mengder alkyn til ikke-spesifikke klikk til proteiner som bare bærer naturlige aminosyrer. Dette kan enkelt forhindres ved presis og forsiktig titrering av alkynmengden. Som beskrevet er den beste måten å oppnå dette på å bruke de faktiske lysede og alkylerte prøvene som skal brukes i de påfølgende proteinrensingstrinnene (trinn 2.6) og massespektrometrianalysen.

Når DST-alkyner brukes i klikkreaksjonen, reduserer β-merkaptoetanol disulfidbroen og dissosierer de merkede proteinene fra perlene i elueringstrinnet (trinn 3.3). β-merkaptoetanol må fjernes fra prøvene for å tillate den enzymatiske fordøyelsen som trengs for MS. Det er flere måter å gjøre dette på (f.eks. lyofilisering18, eksisjon fra en gel19 eller rengjøring ved hjelp av S-Trap-kolonne20), og valget bør gjøres ved MS-laboratoriet som behandler prøvene.

Modifikasjoner og feilsøking av metoden bør rettes for å optimalisere de kritiske trinnene som er nevnt i protokollen. For eksempel, hvis det er for mye variasjon, legg til flere biologiske replikasjoner; Hvis merkingen er for lav, øk ANL-konsentrasjonen, bruk lengre merkingstid eller test andre ANL-administrasjonsveier som kan være mer effektive for det studerte vevet. For proteinalkylering kan et tidligere reduksjonstrinn til tilsetning av IAA implementeres.

Hovedbegrensningen av metoden er rensing av proteomer som oppstår fra småcellepopulasjoner, selv om et lite vevsområde blir dissekert. Proteomer av flere cellepopulasjoner som imidlertid er spredt ut over større vevsområder, er også vanskelig tilgjengelige. Likevel kan in vivo-merkingsteknikken beskrevet her fortsatt brukes til å vurdere de refererte celletypene ved avbildning (f.eks. med FUNCAT eller FUNCAT-PLA21).

Denne metoden er for tiden den eneste metoden som er tilgjengelig for in vivo-studier av celletypespesifikke proteomer basert på proteiner i full lengde og for in situ visualisering av celletypespesifikke komplette proteiner. Andre ikke-kanoniske aminosyrer som azidohomoalanin (AHA) kan også brukes til in vivo proteinmerking og rensing av proteomer, men mangler celletypespesifisitet22,23. Andre tilnærminger som puromycin er egnet for å gi et fast bilde av proteinsyntese24,25. Likevel er det mulig å bruke ikke-kanoniske aminosyrer i lengre perioder med merking, noe som også reflekterer proteinnedbrytning og viser et mer nøyaktig cellulært proteom. BioID-baserte metoder brukes til å identifisere proteiner i spesifikke subcellulære regioner, uavhengig av deres øyeblikk / sted for syntese26.

I muselinjen som vi etablerte (tilgjengelig fra Jackson Lab, lager nr. 028071), uttrykkes den mutante metionin tRNA-syntetasen (MetRS *) som tillater inkorporering av ANL i cellene på en Cre-avhengig måte. Med denne muselinjen som verktøy er det mulig å uttrykke MetRS* utelukkende i celletyper som Cre-driverlinjer er tilgjengelige for. Dette arrangementet gir metoden betydelig allsidighet, noe som gjør den nyttig i nesten alle områder av biomedisinsk forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

BAC er finansiert av det spanske departementet for vitenskap og innovasjon (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), av den autonome regionen Madrid (Atracción de Talento-2019T1 / BMD-14057), og MICINN (PID2020-113270RA-I00) tilskudd. R. A-P er finansiert av Autonomous Community of Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). EMS er finansiert av Max Planck Society, en Advanced Investigator-pris fra European Research Council (grant 743216), DFG CRC 1080: Molecular and Cellular Mechanisms of Neural Homeostase, og DFG CRC 902: Molecular Principles of RNA-based Regulation. Vi takker D.C Dieterich og P. Landgraf for deres tekniske råd og syntesen av DST-Alkyne. Vi takker E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast og dyreanlegget til MPI for hjerneforskning for deres utmerkede støtte. Vi takker Sandra Goebbels for å dele Nex-Cre muselinje. Vi takker Antonio G. Carroggio for hans hjelp med engelsk redigering. B.A.C. designet, gjennomført og analysert eksperimenter. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E., og S. t. D. gjennomførte og analyserte eksperimenter. B.A-C og E.M.S. designet eksperimenter, og overvåket prosjektet, B.A-C skrev papiret. Alle forfatterne redigerte artikkelen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Acrylamide gels GenScript SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12%
β-Mercaptoethanol Sigma M6250 Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.
Ammonium bicarbonate Sigma 9830 Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood
ANL Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11)
ANL-HCl IrishBotech HAA1625.0500
Benzonase Sigma E1014
Biotin alkyne Thermo, B10185
Chicken antibody anti-GFP Aves 1020
Complete EDTA-free protease inhibitor Roche 4693132001 Toxic; use a lab coat and gloves.
Copper (I) bromide Sigma 254185 99.999% (wt/wt)
Disulfide tag (DST)-alkyne Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20
DMSO Sigma 276855
Filters Merk SCGP00525
Iodo acetamide (IAA) Sigma I1149
IR anti chicken 800 LI-COR IRDye 800CW Donkey anti-Chicken Secondary Antibody
IR anti rabit 680 LI-COR IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody
Maltose Sigma M9171
Manual Mixer BioSpec Products 1083
NaCl Sigma S9888
N-ethylmaleimide Sigma 4259 Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood.
NeutrAvidin beads Pierce 29200
Nitrocellulose membrane Bio-rad 1620112
PBS 1X Thermo J62036.K2
PBS 1X pH 7.8 Preparation described in reference number 5
PD SpinTrap G-25 columns GE Healthcare Buffer exchange
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo, 23225 Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life.
Polyclonal rabbit anti-biotin antibody Cell Signaling 5597
PVDF membrane Millipore IPVH00010
SDS 10% Sigma 71736
SDS-PAGE  Running buffer MOPS GenScript M00138
SYPRO Ruby stain Sigma S4942
Table automatic Vortexer Eppendorf Mixmate
Triazole ligand Sigma 678937
Triton X-100 Sigma T9284
Water Sigma W4502 Molecular biology grade

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. The regulation of synaptic protein turnover. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).
  2. Sutton, M. A., Schuman, E. M. Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory. Cell. 127 (1), 49-58 (2006).
  3. Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons. Elife. 9, 52939 (2020).
  4. Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. Memory in mice as affected by intracerebral puromycin. Science. 141 (3575), 57-59 (1963).
  5. Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo. Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).
  6. Alvarez-Castelao, B., et al. Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo. Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).
  7. Ngo, J. T., et al. Cell-selective metabolic labeling of proteins. Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009).
  8. Mahdavi, A., et al. Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis. Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).
  9. Yuet, K. P., et al. Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).
  10. Patel, V. J., et al. A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).
  11. Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer. Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).
  12. Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes. Methods in Molecular Biology. 1266, Clifton, N.J. 199-215 (2015).
  13. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Analysis of proteins by immunoblotting. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
  14. Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).
  15. Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
  16. Goebbels, S., et al. Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice. Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).
  17. van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).
  18. O'Fagain, C. Lyophilization of proteins. Methods in Molecular Biology. 244, Clifton, N.J. 309-321 (2004).
  19. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  20. Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).
  21. tom Dieck, S., et al. Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ. Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).
  22. McShane, E., et al. Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation. Cell. 167 (3), 803-815 (2016).
  23. Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome. Scientific Reports. 6, 32377 (2016).
  24. David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).
  25. Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
  26. Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. BioID: A screen for protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).

Tags

Nevrovitenskap utgave 182
Celletypespesifikk proteinrensing og identifikasjon fra komplekse vev ved bruk av en mutant metionin tRNA-syntetasemuselinje
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nassim-Assir, B., Ouro Corredera,… More

Nassim-Assir, B., Ouro Corredera, D., Alvarez-Pardo, R., tom Dieck, S., Ciirdaeva, E., Schuman, E. M., Alvarez-Castelao, B. Cell-Type Specific Protein Purification and Identification from Complex Tissues Using a Mutant Methionine tRNA Synthetase Mouse Line. J. Vis. Exp. (182), e63713, doi:10.3791/63713 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter