Summary
Этот протокол описывает, как выполнять маркировку белка клеточного типа с помощью азидонорлейцина (ANL) с использованием мышиной линии, экспрессирующей мутантную L274G-метионин-тРНК-синтетазу (MetRS*), и необходимые шаги для выделения меченых белков клеточного типа. Мы описываем два возможных пути введения ANL у живых мышей путем (1) питьевой воды и (2) внутрибрюшинных инъекций.
Abstract
Понимание белкового гомеостаза in vivo является ключом к пониманию того, как клетки работают как в физиологических, так и в болезненных условиях. Настоящий протокол описывает маркировку in vivo и последующую очистку вновь синтезированных белков с использованием инженерной мышиной линии для направления маркировки белка в конкретные клеточные популяции. Это индуцируемая линия cre рекомбиназы экспрессии L274G-метионин тРНК-синтетазы (MetRS*), обеспечивающая включение азидонорлейцина (ANL) в белки, что в противном случае не произойдет. Используя метод, описанный здесь, можно очистить специфические для клеток протеомы, помеченные in vivo , и обнаружить тонкие изменения в содержании белка из-за снижения сложности образца.
Introduction
Аберрантный белковый гомеостаз вызван дисбалансом в синтезе и деградации белка. Некоторые заболевания связаны с изменениями в белковом гомеостазе. Отличительной чертой некоторых заболеваний является наличие агрегатов в разных субклеточных местах и областях мозга. Белковый гомеостаз не только важен при заболевании, но и играет решающую роль в нормальной функции органов и клеток1. Например, синтез белка необходим для многих форм нейрональной пластичности 2,3, что определяется применением химических ингибиторов, блокирующих синтез белка4. Однако неясно, в каких типах клеток протеом изменяется для поддержки обучения и памяти, и непонятно, какие специфические белки в каждом типе клеток увеличивают или уменьшают их синтез или деградацию. Таким образом, всестороннее изучение белкового гомеостаза требует способности дифференцировать протеомы, поступающие от определенных типов клеток. Действительно, идентификация специфических для клеточного типа протеомов для изучения клеточных процессов, происходящих в многоклеточной среде, была важным препятствием в протеомике. По этой причине мы разработали методику с использованием экспрессии MetRS* в сочетании с биоортогональными методами, которая оказалась эффективным способом выявления и очистки специфических протеомов клеточного типа, заполнив этот пробел 5,6,7.
Экспрессия мутантного MetRS* (MetRS L274G) позволяет загружать неканонический аналог метионина ANL в соответствующую тРНК 8,9 и его последующее включение в белки. Когда экспрессия MetRS* регулируется клеточным промотором, неканоническая аминокислота будет включена в белки клеточным селективным образом. Как только ANL включается в белки, он может быть избирательно функционализирован с помощью химии кликов и впоследствии либо визуализирован с помощью визуализации (FUNCAT), либо с помощью Западного иммуноблота (BONCAT). Альтернативно, белки могут быть селективно очищены и идентифицированы с помощью масс-спектрометрии (МС). Используя эту технологию, мы создали линию мыши, экспрессирующую белок MetRS* под контролем рекомбиназы Cre. Учитывая растущее число доступных линий Cre-mouse, система MetRS* может быть использована в любой области для изучения любого типа клеток из любой ткани, для которой существует существующая Cre-line. Маркировка белка ANL возможна in vitro или in vivo и не изменяет поведение мыши или целостность белка6. Промежуток времени маркировки может быть адаптирован к научному вопросу каждого исследователя, маркируя вновь синтезированные белки (более короткое время маркировки) или целые протеомы (более длительное время маркировки). Использование этой методики ограничено количеством клеток того типа, которые исследователь желает изучить; следовательно, выделение белка из типов клеток с низким количеством или низкой скоростью метаболизма невозможно с помощью этого метода. Целью представленного способа является идентификация специфических для клеток белков/протеомов, меченных in vivo. В этом протоколе мы описываем, как маркировать специфические для клеток протеомы ANL у живых мышей и очищать меченые белки. После очистки белки могут быть идентифицированы с помощью обычных протоколов масс-спектрометрии 5,10. Снижение сложности образца, достигаемое этим методом путем селективной очистки белков из конкретных клеточных популяций, позволяет экспериментатору обнаруживать тонкие изменения в протеомах, например, в ответ на изменения окружающей среды. Очистка меченых белков может быть достигнута за ~ 10 дней, не включая анализ РС или период маркировки. Здесь мы описываем два способа введения ANL мышам, экспрессирующим MetRS*, а именно: (1) добавление аминокислоты в питьевую воду и (2) введение ANL путем внутрибрюшинных инъекций. Независимо от метода, выбранного для введения ANL, этапы выделения и очистки одинаковы (начиная с шага 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты с животными проводились с разрешения местных органов власти в Германии (RP Darmstadt; протоколы: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) или Испании (Комитет по экспериментам на животных в UCM и Экологическом консультировании Comunidad de Madrid, номер протокола: PROEX 005.0/21) и соответствуют правилам Общества Макса Планка и испанским нормам и следуют руководящим принципам ЕС по благополучию животных.
1. Метаболическая маркировка in vivo с помощью ANL
- Питьевая вода:
- Растворяют ANL и мальтозу в обычной питьевой воде мышей. Рекомендуемая концентрация мальтозы составляет 0,7% (масс./об.). Максимальное количество ANL, добавляемого в питьевую воду, составляет 1% (мас./об.). Как только смесь будет готова, стерилизуйте ее фильтрацией и храните при температуре 4 °C.
- Предоставьте мышам смесь, приготовленную на стадии 1.1. Часто меняйте бутылки (например, каждые 3 дня), чтобы избежать загрязнений, и проверяйте их каждый день, чтобы найти возможное загрязнение или засорение. Контролируйте количество выпитой воды ежедневно, взвешивая ее, чтобы узнать о потреблении ANL мышами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальный период маркировки, оцениваемый здесь, составляет 3 недели с использованием концентрации ANL 1% в питьевой воде, что привело к хорошо обнаруживаемой маркировке в мозге. Хорошая маркировка также может быть достигнута за 2 недели. Ни более короткие сроки маркировки, ни более длинные временные точки, ни другие суммы ANL не были изучены нами с использованием этого метода администрирования, что не означает, что вышесказанное не будет работать. Частота включения ANL может варьироваться в зависимости от исследуемой ткани или типа клетки. Время маркировки может варьироваться в зависимости от научного вопроса; Например, если протеомы должны быть маркированы, то время маркировки должно быть рассчитано в зависимости от среднего периода полураспада белков в исследуемой ткани. Если интерес заключается только в выявлении вновь синтезированных белков, время может быть сокращено. Периоды маркировки и дозы ANL должны быть эмпирически проверены для каждого экспериментального состояния и типа клетки, представляющей интерес.
- Внутрибрюшинное введение:
- Растворить ANL в физиологическом растворе NaCl до 400 мМ, фосфатном солевом буфере (PBS) или воде.
- Убедитесь, что осмолярность раствора находится в пределах физиологического диапазона. Здесь мышам вводят 10 мл/кг массы тела раствора ANL.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошая маркировка в возбуждающих нейронах головного мозга успешно достигается одной ежедневной внутрибрюшинной инъекцией (ИП) с 400 мМ ANL в течение 1 недели. Ни более низкие концентрации ANL, ни другие периоды маркировки инъекциями IP не были протестированы в этом исследовании, что не означает, что они не будут работать. ANL поставляется в виде гидрохлорида некоторыми компаниями. В этом случае рН растворов должен быть скорректирован до адекватного рН (в зависимости от пути введения). ANL также может быть синтезирован в соответствии с методом, опубликованным Link et al.11 с некоторыми модификациями5. Маркировка ANL может быть выполнена с использованием других концентраций ANL, временных интервалов и путей введения. Для тканей / типов клеток с низкой скоростью метаболизма можно использовать диету с низким содержанием метионина, всегда начиная с 1 недели до введения ANL. При использовании 400 мМ ANL он может выпадать в осадок при хранении при 4 °C; При нагревании до 37 °C ANL возвращается в раствор. Дайте ему достичь комнатной температуры перед инъекцией. В большинстве регионов мира введение ANL мышам является экспериментом на животных и должно быть одобрено соответствующими органами.
2. Сбор тканей, лизис и экстракция белка
- Рассечение ткани: Рассекните область ткани, содержащую интересующий тип клеток, и обратите внимание на вес собранного куска ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут храниться при -80 °C в течение нескольких месяцев (точка остановки). В настоящем протоколе кора головного мозга и гиппокамп мышей были рассечены. - Тканевый лизис: Гомогенизация ткани при комнатной температуре путем добавления объема в 12-15 раз больше влажной массы ткани буфера лизиса (PBS pH 7,4, 1% масс./об. SDS, 1% (об/об), тритона X-100, бензоназы (1:1000 об/об), ингибитора протеазы (PI) (EDTA свободного 1:4000)). Например, для кусочка ткани 20 мг добавьте 240-300 мкл лизисного буфера. Тритурируйте ткань до тех пор, пока она не гомогенизируется.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут храниться при -80 °C в течение нескольких месяцев (точка остановки). Для прямой гомогенизации в трубках объемом 1,5 мл рекомендуется использовать ручной гомогенизатор с батарейным питанием, особенно при обработке небольших кусочков ткани. Для больших деталей можно использовать гомогенизатор Dounce. К каждому буферу, в который включены ингибиторы протеазы (PI), их следует добавлять непосредственно перед использованием, а не раньше. - Денатурация белка: нагревайте гомогенат до 75 °C в течение 15 мин и центрифугу при 17 000 х г в течение 15 мин при 10 °C. Перенесите супернатант в новую трубку.
- Измерение содержания белка: Измерение концентрации белка в каждом образце и корректировка всех образцов для сравнения с той же концентрацией белка; отрегулируйте концентрацию, добавив буфер лизиса. Оптимальный диапазон концентраций составляет 2-4 мкг/мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут храниться при -80 °C в течение нескольких месяцев (точка остановки). - Алкилирование
- Разбавляют гомогенизированные образцы в 2-3 раза в PBS (рН 7,8) + PI (без ЭДТА 1:4000).
- Добавьте йодоацетамид (IAA) до конечной концентрации 20 мМ (исходный раствор 500 мМ).
- Оставьте образцы на 1-2 ч при температуре 20 °C в темноте. Выполните шаги 2.5.2-2.5.3 дважды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для некоторых тканей, если неспецифический щелчок в отрицательном контроле остается высоким, может потребоваться выполнить этап восстановления до алкилирования12. Подготовьте запасы IAA только что перед добавлением их в образцы. Образцы могут храниться при -80 °C в течение нескольких месяцев (точка остановки).
- Буферный обмен: Уравновешивайте буферные обменные колонки с помощью буфера обмена щелчком (PBS pH 7,8, 0,04% (масс./об.) SDS, 0,08% (об/об)) Triton X-100 и PI (1:4000)). Следуйте инструкциям производителя. Замените все алкилированные образцы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Элюированные образцы могут храниться при -80 °C в течение нескольких месяцев (точка остановки). На этом этапе IAA удаляется, а буфер заменяется буфером химии щелчка. Белок может быть измерен снова после стадии буферного обмена, чтобы убедиться, что белки не были потеряны во время процесса буферного обмена. В зависимости от типа колонок, используемых для буферного обмена, белок может быть массово потерян. Используйте рекомендуемые колонки, чтобы избежать потери белка. Для хранения проб рекомендуется приготовление аликвот. - Реакция щелчка для оценки включения ANL в эксперимент
- Возьмите 40 мкл элюированных образцов на стадии 2,6 и добавьте PBS (pH 7,8) к конечному объему 120 мкл.
- Чтобы настроить реакцию щелчковой химии, добавьте следующие реагенты в заданном порядке и вихрь в течение 20 с после каждого добавления: 1,5 мкл лиганда триазола (запас 40 мМ), 1,5 мкл алкина биотина (запас 5 мМ) и 1 мкл Cu(I) бромида (запас 10 мг/мл, растворенный в ДМСО путем тщательного пипетирования вверх и вниз, не вихрь). Добавляйте реагенты как можно быстрее.
- Инкубируйте образцы в течение ночи в темноте при температуре 4 °C с непрерывным вращением.
- Центрифугирование образцов при 4 °C в течение 5 мин при 17 000 х г. Будет видна слегка бирюзовая гранула. Перенесите супернатант в новую трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте запас бромида Cu (I) непосредственно перед использованием, чтобы избежать окисления меди. Поддержание соотношения объемов между лизированным образцом и постоянным PBS между образцами имеет важное значение для обеспечения одинаковой конечной концентрации моющего средства в каждой пробирке. Для ускорения сборки реакции щелкающей химии рекомендуется настольный вихрь со стойками для трубок. Храните щелкнутые образцы при -80 °C в течение нескольких месяцев или при -20 °C в течение нескольких недель до дальнейшей обработки (точка остановки).
- Вестерн-блот-анализ для оценки включения ANL в эксперимент
- Запустите SDS-PAGE с 20-40 мкл супернатанта из химической реакции щелчка (шаг 2.7). Используйте 12% акриламидные гели, содержащие 1% SDS, 250 мМ Tris-HCl, 2 мМ глицина. Бегите до тех пор, пока передняя часть не выйдет из геля.
- Перенос белков на нитроцеллюлозную или PVDF-мембрану13.
- Инкубировать мембрану в течение ночи при 4 °C с антителом GFP (1:500, белок GFP транслируется совместно с MetRS*5) и антителом биотина (1:1000) для обнаружения щелкнутого алкина, который конъюгирован с биотином.
- Промыть первичное антитело 2 раза в течение 10 мин и добавить вторичное антитело в течение 1,5 ч.
- Промыть вторичное антитело 2 раза в течение 10 мин и провести сканирование (при использовании флуорофор-конъюгированных антител) или подвергнуть воздействию пленок (при использовании пероксидазно-конъюгированных антител хрена).
- Количественно оцените сигнал биотина с помощью ImageJ или аналогичного программного обеспечения, оцените общую маркировку каждого образца эксперимента и обнаружите возможные выбросы. Оцените отношение сигнал/шум (маркировка образца ANL к фону от отрицательного контроля) эксперимента и обнаружите возможных животных, которые не смогли принять /включить ANL.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для образцов с высокой инкорпорацией ANL теоретически возможна очистка белка с использованием нерасщепляемых алкинов, подобных тому, который используется в этом разделе для оценки включения ANL. Используя образцы мозга, фон, полученный в отрицательном контроле РС после очистки белка с использованием нерасщепляемых алкинов, слишком высок14. Поэтому для первой общей выборки и оценки эксперимента использовались только более простые в обращении, нерасщепляемые алкины. Независимо от типа алкина, предназначенного для очистки белка, целесообразно выполнить этапы оптимизации дозировки алкина, описанные в следующем разделе (этап 2.9).
- Щелкнувая реакция для оптимизации дозы расщепляемого алкина
- Подготовьте четыре пробирки с 40 мкл одного репрезентативного образца (полученного на стадии 2.6 и оцененного на этапе 2.8) и добавьте PBS (рН 7,8) к конечному объему 120 мкл.
- Настройте химическую реакцию щелчка, как описано в шаге 2.7, но на этот раз добавьте четыре различных количества DST-алкина. Для указанного алкина рекомендуется тестирование 5 мкМ, 15 мкМ, 30 мкМ и 60 мкМ.
- Повторите шаг 2.8, чтобы решить, какая дозировка алкина наиболее подходит для конкретного исследуемого экспериментального вопроса, основываясь на самой высокой эффективности маркировки с наименьшим фоновым сигналом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем подвергнуть оставшиеся образцы реакции щелчка, необходимо определить оптимальное количество любого алкина. Существует несколько вариантов коммерчески доступных алкинов, которые можно использовать. Они различаются по способу расщепления (например, легкие или восстановители). Также возможна химия без меди с использованием реагентов, способствующих деформации (например, реагентов DBCO). Незначительные изменения количества либо алкинов, либо реагентов DBCO часто значительно увеличивают сигнал в отрицательном контроле (фоне). Здесь описана очистка белка с использованием алкина с дисульфидным мостом, расщепляемым восстановителями (дисульфид биотин алкин или DST-алкин15). При использовании DST-алкина для запуска SDS-PAGE (шаг 8.1) избегайте загрузки буферов сильными восстановителями, такими как DTT или β-меркаптоэтанол, чтобы предотвратить расщепление алкина. В этом исследовании нагрев при 72 °C в течение 5 мин с использованием 5 мМ N-этилмалеимида (NEM) в нагрузочном буфере не влияет на стабильность DST-алкина. Шаг 2.9.2 можно повторить, тестируя более мелкозернистые дозировки в диапазоне наилучшего наблюдаемого.
- Реакция препарата для очистки белка
- Щелкните все образцы, полученные на этапе 2.6, с оптимальной дозировкой алкина, определенной на этапе 2.9, и проанализируйте фракцию с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга (шаг 2.8).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что пипетки правильно откалиброваны для обеспечения точности масштабирования образца. Щелкнутые образцы могут храниться при -80 °C в течение нескольких месяцев (точка остановки).
- Щелкните все образцы, полученные на этапе 2.6, с оптимальной дозировкой алкина, определенной на этапе 2.9, и проанализируйте фракцию с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга (шаг 2.8).
3. Очистка белка
- Буферный обмен
- Подвергайте все щелкнутые образцы процедуре буферного обмена, описанной в шаге 2.6, но используйте буфер связывания нейтравидина в качестве буфера равновесия (PBS pH 7,4, 0,15% (масс./об.) SDS, 1% (об/об)) Тритон X-100 и PI (1:2000)).
ПРИМЕЧАНИЕ: Элюированные образцы могут храниться при -80 °C в течение нескольких месяцев (точка остановки). На этом этапе не щелкнутый свободный алкин удаляется, и буфер обменивается буфером связывания нейтравидина.
- Подвергайте все щелкнутые образцы процедуре буферного обмена, описанной в шаге 2.6, но используйте буфер связывания нейтравидина в качестве буфера равновесия (PBS pH 7,4, 0,15% (масс./об.) SDS, 1% (об/об)) Тритон X-100 и PI (1:2000)).
- Связывание с бусинами нейтравидина
- Промывайте бусины нейтравидина высокой емкости буфером связывания нейтравидина (см. шаг 3.1); смешайте шарики с буфером и центрифугируйте смесь в течение 5 мин при 3000 х г и выбросьте супернатант. Повторите три раза.
- Приготовьте суспензию 1:1 из бусин Нейтравидина, добавив тот же объем сухих бусин и буфер связывания нейтравидина.
- Отложите 20-40 мкл каждого образца в качестве предварительно очищенного лизата и храните его при -20 °C.
- Измерьте концентрацию белка (см. этап 2.4) и смешайте 100 мкг белка с 4 мкл шариковой суспензии, полученной на стадии 3.2.2.
- Инкубировать смесь в течение ночи при 4 °C с непрерывным вращением, позволяя меченым белкам связываться с шариками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Что касается химической реакции щелчка, то основная реакция очистки сродства, описанная на этапе 3.2.4, может быть увеличена. Например, для очистки белков из возбуждающих нейронов гиппокампа 1 мг лизата белка смешивают с 40 мкл шариков нейтравидина (суспензия 1:1). Количество шариков нейтравидина может быть увеличено или уменьшено в соответствии с количеством меченых белков на мг общего белка, которое будет зависеть от выбранного типа клеток и периода маркировки и должно быть определено эмпирически.
- Промывка бусин нейтравидина и элюирование белка
- Сбор супернатантов путем центрифугирования (см. этап 3.2.1). Отложите 20-40 мкл аликвоту каждого супернатанта в сторону для последующего анализа и заморозьте остальные при -80 °C.
- Промывайте шарики охлажденным нейтравидиновым моющим буфером 1 (PBS pH 7,4, 0,2% (мас./об.) SDS, 1% (об/об) Тритон X-100 и PI (1:2000)) путем добавления буфера, осаждения шариков и отбрасывая супернатант. Повторите этот шаг три раза.
- Затем добавьте тот же буфер и высиживайте шарики в течение 10 мин при непрерывном вращении при 4 °C перед выбросом супернатанта. Повторите этот шаг три раза.
- Мойте шарики, как описано в шагах 3.3.2-3.3.3, но с использованием нейтравидинового промывочного буфера 2 (1x PBS, pH 7.4 и PI 1:2000).
- Вымойте шарики, как описано на этапе 3.3.2-3.3.3, но используя нейтравидиновый промывочный буфер 3 (50 мМ бикарбоната аммония и PI 1:2000).
- Элюируют щелкающие белки путем инкубации шариков в течение 30 мин при 20 °C с объемом буфера элюирования нейтравидина (5% (об/об) β-меркаптоэтанола и 0,03% (масс./об.) SDS), соответствующего одному объему используемых сухих шариков.
- Поддерживайте шарики в суспензии во время элюирования путем непрерывного перемешивания (1000 об/мин) в термоблочном шейкере. Элют дважды и комбинируют оба элюата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугирование, установленное для разделения твердой фракции суспензии (шариков) и водной фазы (надосадочного вещества), как это разъясняется на этапе 3.2.1, применяется к этапам 3.3.1-3.3.7. Количество SDS может быть увеличено, если элюирование белка не является полным. Однако при количествах выше 0,08%-0,1% SDS белки, не специфически связанные с шариками, начинают элюироваться. β-меркаптоэтанол летучий и токсичный; целесообразно использовать вытяжку для этапов 3.3.6-3.3.7. Образцы, собранные на этапах 3.2.3 и 3.3.1, должны обрабатываться компанией SDS-PAGE и оцениваться с помощью вестерн-блоттинга (см. этап 2.8) для оценки эффективности аффинной очистки (этап 3.3).
- Оценка элюированных белков
- Загрузите 1/3 элюированных образцов на SDS-PAGE (см. шаг 2.8.1).
- Окрашивание геля для визуализации белков с использованием метода высокой чувствительности, такого как окрашивание серебром или флуоресцентный метод.
- Если образцы имеют ожидаемое качество, что означает, что в меченых ANL образцах в 3-4 раза больше белка по сравнению с отрицательным контролем, элюированные белки могут быть идентифицированы обычными методами масс-спектрометрии, подобными тому, который описан в ссылке5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Следуя описанному протоколу (обобщенному на рисунке 1), ANL вводили мышам либо путем ежедневных внутрибрюшинных инъекций (400 мМ ANL 10 мл/кг, Nex-Cre::MetRS*) в течение 7 дней, либо через питьевую воду (0,7% мальтозы, 1% ANL, CamkII-Cre::MetRS*) в течение 21 дня. После маркировки соответствующие области мозга рассекались, лизировали, алкилировали и щелкали. Реакции кликов были проанализированы SDS-PAGE и Western Immunoblot. Репрезентативные изображения экспериментов показаны на рисунке 2 для введения ANL путем инъекции IP и на рисунке 3 для введения ANL через питьевую воду. Обратите внимание, что цель рисунков — показать, что оба протокола маркировки работают, а не сравнить их. Сравнение невозможно, потому что в двух показанных экспериментах помечены разные популяции нейронов (возбуждающие нейроны гиппокампа и коры и нейроны Пуркинье мозжечка).
Дальнейший эксперимент дает пример для определения оптимальной концентрации алкина, расщепляемого DST (рисунок 4). В этом примере изменение складки между меченым образцом и контролем является самым высоким при концентрации алкина 14 мкМ. Эта концентрация алкина затем применяется ко всем образцам. После проверки маркировки каждого образца в эксперименте с выбранным количеством алкина все образцы подвергали очистке anL-меченых/биотин-щелкающих белков путем аффинного связывания с использованием бусин Neutravidin (рисунок 5). На этом этапе белки связываются с шариками, промываются и впоследствии элюируются путем восстановления дисульфидного моста, присутствующего в DST-алкине. После этого последнего шага биотин и часть алкина остаются связанными с шариками. ANL-содержащие белки (связанные с остальной частью алкина) восстанавливаются в буфере элюирования. Чтобы оценить эффективность стадии элюирования, одна треть объема элюата загружается на гель SDS-PAGE и визуализируется с использованием метода чувствительного общего белкового окрашивания. Для достижения интерпретируемых результатов с помощью масс-спектрометрии необходимо наблюдать по меньшей мере 3-кратную разницу интенсивности общего белкового пятна между отрицательными контрольными группами и образцами, помеченными ANL. За завершением всех этапов, описанных в этом протоколе, последует подготовка, сбор и анализ образцовMS 5. Хотя особых требований к РС нет (каждая лаборатория может использовать свой обычный протоколMS 5,10), следует иметь в виду, что количество очищенных белков будет в целом низким (порядка нанограммов). На рисунке 6 приведен пример результатов MS с четким обогащением в образце, помеченном ANL, по сравнению с контролем (рисунок 6A). Эта разница уже была видна в общем белковом пятне, показанном на рисунке 5. Помимо изменений интенсивности пептидов, в обоих образцах также обнаружены уникальные белки (рисунок 6B).
Рисунок 1: Рабочий конвейер для очистки белка клеточного типа с помощью BONCAT. После маркировки белка ANL интересующая ткань рассекается и лизируется, помечается биотином путем щелчковой химии, а количество маркировки для каждого образца оценивается BONCAT. Выбросы (которые не включали ANL) и репрезентативные выборки могут быть дифференцированы на этом этапе. Один из репрезентативных образцов нажимается еще раз, чтобы найти оптимизированную расщепляемую дозу алкина для последующей очистки белка. Доза алкина, достигающая наилучшего соотношения сигнал/шум, применяется к каждой биологической реплике. Специфические для клеток белки получают путем аффинной очистки. Очищенные образцы изучают масс-спектрометрией, а белки идентифицируют. Эта цифра была изменена с Alvarez-Castelao et al. (2017)6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Введение АНЛ путем внутрибрюшинных инъекций (ИП). BONCAT был выполнен для оценки маркировки белка в гиппокампе (HP) и коре головного мозга (CX) после метаболической маркировки белков с ANL путем ежедневных инъекций IP в течение 7 дней. Образцы мышей дикого типа в качестве отрицательного контрольного (wt) нажимали параллельно с мечеными образцами (MetRS*). Меченые белки получены из возбуждающих нейронов с использованием Nex-Cre::MetRS* линии16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Введение ANL питьевой водой. BONCAT был выполнен для оценки маркировки белка в нейронах Пуркинье мозжечка после введения ANL мышам GAD-Cre::MetRS* через питьевую воду в течение 21 дня. На рисунке показан отрицательный элемент управления (wt) и помеченный образец (MetRS*), лизированные и щелкнутые параллельно. Эта цифра была изменена с Alvarez-Castelao et al. (2017)6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Титрование дозы DST-алкина. Один биологический репликатор на эксперимент выбирается в качестве репрезентативного образца для титрования оптимальной концентрации алкина. Три концентрации (14, 28 и 56 мкМ) алкина были протестированы здесь в реакции щелчка для BONCAT. Отношение маркировки между образцом, меченым ANL (MetRS*), и отрицательным контролем (wt) определяет отношение сигнал/шум (показано на графике). 14 мкМ является лучшей концентрацией алкина, полученной в этом эксперименте. Для этого эксперимента использовалась ткань коры головного мозга из мышиной линии Nex::MetRS*, помеченной ANL. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Очищенные белки. Меченые белки из нейронов Пуркинье были очищены и окрашены с использованием рубина SYPRO. Эта цифра была изменена с Alvarez-Castelao et al. (2017)6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Идентификация и количественная оценка белка. Протеом клеток Пуркинье был получен масс-спектрометрией с использованием мозжечка из линии мыши GAD-Cre::MetRS* в качестве исходного материала. (A) показывает повышенное содержание (интенсивность пептидов) идентифицированных белков в образцах, меченных ANL, по сравнению с мышами дикого типа (wt). (B) Протеом Пуркинье был получен путем объединения белков, обогащенных ANL-мечеными образцами в A (определяемыми >3-кратной интенсивностью у мышей MetRS* по сравнению с wt), и уникальных белков, обнаруженных у мышей, экспрессирующих MetRS*. Эта цифра была изменена с Alvarez-Castelao et al. (2017)6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Важнейшими аспектами протокола являются: включение отрицательных контрольных групп, имеющих достаточное количество биологических реплик, путь введения ANL, количество и продолжительность, алкилирование образцов, концентрацию алкина и элиминацию β-меркаптоэтанола при использовании DST-алкина.
Важно включить отрицательные контрольные образцы, полученные от животных, меченных ANL, без драйвера Cre и, следовательно, без выражения MetRS*. Эти образцы должны подвергаться каждому шагу, описанному в протоколе, параллельно с образцами мышей MetRS*, меченых ANL. Образцы без щелчка не являются допустимыми элементами управления, так как любые результаты, достигнутые с помощью только этого элемента управления, могут быть вызваны неспецифическим щелчком. Мы не наблюдали включения ANL в клетки, не экспрессирующие ген MetRS*, или экспрессии MetRS* в клетках без Cre; таким образом, животные, помеченные ANL, могут быть использованы в качестве отрицательного контроля.
Учитывая, что протокол, описанный в настоящем документе, состоит из многих этапов, на которых образцы могут быть потеряны, рекомендуется рассчитать биологические реплики с учетом технического сбоя. Для образцов мозга существует примерно 30% потери репликации.
Здесь мы опишем два маршрута и продолжительности администрирования ANL. Это не исключает, что другие пути введения (например, добавление ANL в пищу), работают одинаково хорошо. Что касается введенного количества ANL, эксперименты, показанные здесь, были выполнены с использованием относительно высоких количеств ANL. Маркировка с меньшими количествами также возможна в зависимости от экспериментальной установки. Самый короткий промежуток времени маркировки ANL, о котором сообщается в этом протоколе, составляет 1 неделю, а самый длинный - 21 день. Можно было бы применять более короткие или более длительные периоды маркировки, но мы не определили это. Исследователи должны определить путь введения ANL, дозировку ANL и период маркировки ANL, достаточный для конкретного исследуемого экспериментального вопроса, рассмотрев метаболические свойства ткани, интересующий тип клеток и исследуемый экспериментальный вопрос.
Алкилирование образца, также известное как укупорка, является важным шагом, чтобы избежать фонового щелчка17. При правильном выполнении алкилирования неспецифический щелчок, контролируемый контрольными образцами, уменьшается, а разница между отрицательным контролем и образцами, маркированными ANL, увеличивается. Устранение свободного IAA после алкилирования также является ключевым шагом. Наличие небольших количеств IAA во время реакции щелчка ограничит ее эффективность. Иногда этап обессоливания, который также устраняет IAA (шаг 2.6), должен быть повторен, чтобы обеспечить надлежащее удаление IAA.
Существует несколько биотин-алкиновых и -DBCO реагентов, коммерчески доступных от различных компаний. Основные различия между ними касаются длины цепи полиэтиленгликоля (ПЭГ), а также отсутствия, наличия и типа расщепляемых групп. Независимо от используемого типа, избыточное количество алкина приводит к неспецифическому щелчку белков, несущих только природные аминокислоты. Это можно легко предотвратить путем точного и тщательного титрования количества алкина. Как описано, лучшим способом достижения этого является использование фактических лизированных и алкилированных образцов, которые будут использоваться на последующих этапах очистки белка (этап 2.6) и масс-спектрометрическом анализе.
Когда DST-алкины используются в реакции щелчка, β-меркаптоэтанол уменьшает дисульфидный мост и диссоциирует меченые белки из шариков на стадии элюирования (стадия 3.3). β-меркаптоэтанол должен быть удален из образцов, чтобы обеспечить ферментативное сбраживание, необходимое для РС. Существует несколько способов сделать это (например, лиофилизация18, иссечение изгеля 19 или очистка с использованием колонок20 S-Trap), и выбор должен быть сделан лабораторией MS, обрабатывающей образцы.
Модификации и устранение неполадок метода должны быть направлены на оптимизацию критических шагов, упомянутых в протоколе. Например, если существует слишком большая изменчивость, добавьте больше биологических реплик; если маркировка слишком низкая, увеличьте концентрацию ANL, используйте более длительные промежутки времени маркировки или протестируйте другие пути введения ANL, которые могут быть более эффективными для исследуемой ткани. Для алкилирования белка может быть реализована предыдущая стадия снижения добавления IAA.
Основным ограничением метода является очистка протеомов, возникающих из популяций мелких клеток, даже если рассечен небольшой участок ткани. Протеомы более многочисленных клеточных популяций, которые, однако, распределены по более крупным участкам тканей, также труднодоступны. Тем не менее, метод маркировки in vivo , описанный здесь, все еще может быть применен для оценки указанных типов клеток с помощью визуализации (например, с помощью FUNCAT или FUNCAT-PLA21).
Этот метод в настоящее время является единственным методом, доступным для исследования in vivo специфических для клеток протеомов на основе полноразмерных белков и для визуализации in situ целых белков, специфичных для клеточного типа. Другие неканонические аминокислоты, такие как азидогомоланин (AHA), также могут быть использованы для маркировки белка in vivo и очистки протеомов, но не имеют специфичности клеточного типа22,23. Другие подходы, такие как пуромицин, подходят для обеспечения фиксированной картины синтеза белка24,25. Тем не менее, возможно использование неканонических аминокислот в течение более длительных периодов маркировки, что также отражает деградацию белка и показывает более точный клеточный протеом. Методы на основе BioID используются для идентификации белков в конкретных субклеточных областях, независимо от их момента/места синтеза26.
В линии мыши, которую мы установили (доступна в Лаборатории Джексона, запас No 028071), мутантная метиониновая тРНК-синтетаза (MetRS*), которая позволяет включать ANL в клетки, экспрессируется в зависимости от Cre. С помощью этой линии мыши в качестве инструмента можно исключительно экспрессировать MetRS* в типах ячеек, для которых доступны линии Cre-драйвера. Такое расположение наделяет метод значительной универсальностью, что делает его полезным практически во всех областях биомедицинских исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
B.A-C финансируется Министерством науки и инноваций Испании (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), автономным сообществом Мадрида (Atracción de Talento-2019T1 /BMD-14057) и грантами MICINN (PID2020-113270RA-I00). R. A-P финансируется Автономным сообществом Мадрида (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). E.M.S. финансируется Обществом Макса Планка, премией Advanced Investigator от Европейского исследовательского совета (грант 743216), DFG CRC 1080: Молекулярные и клеточные механизмы нейронного гомеостаза и DFG CRC 902: Молекулярные принципы регуляции на основе РНК. Мы благодарим Д.К. Дитериха и. Ландграфа за их технические рекомендации и синтез DST-Alkyne. Мы благодарим E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast и лабораторию для животных MPI for Brain Research за их отличную поддержку. Мы благодарим Сандру Геббельс за то, что она поделилась линейкой мышей Nex-Cre. Мы благодарим Антонио Г. Карроджо за помощь в редактировании английского языка. Б.А-К. разрабатывал, проводил и анализировал эксперименты. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C.E. и S. t. Д. проводил и анализировал эксперименты. B.A-C и E.M.S. разрабатывали эксперименты и руководили проектом, B.A-C написал статью. Все авторы редактировали статью.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12% Acrylamide gels | GenScript | SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12% | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood |
| ANL | Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11) | ||
| ANL-HCl | IrishBotech | HAA1625.0500 | |
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Biotin alkyne | Thermo, | B10185 | |
| Chicken antibody anti-GFP | Aves | 1020 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor | Roche | 4693132001 | Toxic; use a lab coat and gloves. |
| Copper (I) bromide | Sigma | 254185 | 99.999% (wt/wt) |
| Disulfide tag (DST)-alkyne | Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20 | ||
| DMSO | Sigma | 276855 | |
| Filters | Merk | SCGP00525 | |
| Iodo acetamide (IAA) | Sigma | I1149 | |
| IR anti chicken 800 | LI-COR | IRDye 800CW | Donkey anti-Chicken Secondary Antibody |
| IR anti rabit 680 | LI-COR | IRDye 680RD | Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody |
| Maltose | Sigma | M9171 | |
| Manual Mixer | BioSpec Products | 1083 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | 4259 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| NeutrAvidin beads | Pierce | 29200 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 1620112 | |
| PBS 1X | Thermo | J62036.K2 | |
| PBS 1X pH 7.8 | Preparation described in reference number 5 | ||
| PD SpinTrap G-25 columns | GE Healthcare | Buffer exchange | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo, | 23225 | Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life. |
| Polyclonal rabbit anti-biotin antibody | Cell Signaling | 5597 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| SDS 10% | Sigma | 71736 | |
| SDS-PAGE Running buffer MOPS | GenScript | M00138 | |
| SYPRO Ruby stain | Sigma | S4942 | |
| Table automatic Vortexer | Eppendorf | Mixmate | |
| Triazole ligand | Sigma | 678937 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Water | Sigma | W4502 | Molecular biology grade |
References
- Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M.
- Sutton, M. A., Schuman, E. M. Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory. Cell. 127 (1), 49-58 (2006).
- Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons. Elife. 9, 52939 (2020).
- Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. Memory in mice as affected by intracerebral puromycin. Science. 141 (3575), 57-59 (1963).
- Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo. Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).
- Alvarez-Castelao, B., et al. Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo. Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).
- Ngo, J. T., et al.
- Mahdavi, A., et al. Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis. Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).
- Yuet, K. P., et al. Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).
- Patel, V. J., et al. A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).
- Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer. Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).
- Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes. Methods in Molecular Biology. 1266, Clifton, N.J. 199-215 (2015).
- Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L.
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).
- Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
- Goebbels, S., et al. Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice. Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).
- van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).
- O'Fagain, C.
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).
- tom Dieck, S., et al. Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ. Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).
- McShane, E., et al. Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation. Cell. 167 (3), 803-815 (2016).
- Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome. Scientific Reports. 6, 32377 (2016).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. BioID: A screen for protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).
