Summary
Detta protokoll beskriver hur man utför celltypspecifik proteinmärkning med azidonorleucin (ANL) med hjälp av en muslinje som uttrycker ett mutant L274G-metionin-tRNA-syntetas (MetRS*) och de nödvändiga stegen för märkt celltypspecifik proteinisolering. Vi beskriver två möjliga ANL-administreringsvägar i levande möss med (1) dricksvatten och (2) intraperitoneala injektioner.
Abstract
Att förstå proteinhomeostas in vivo är nyckeln till att veta hur cellerna fungerar i både fysiologiska och sjukdomstillstånd. Detta protokoll beskriver in vivo-märkning och efterföljande rening av nyligen syntetiserade proteiner med hjälp av en konstruerad muslinje för att rikta proteinmärkning till specifika cellulära populationer. Det är en inducerbar linje genom Cre-rekombinasuttryck av L274G-metionintRNA-syntetas (MetRS*), vilket möjliggör azidonorleucin (ANL) införlivande till proteinerna, vilket annars inte kommer att inträffa. Med hjälp av den metod som beskrivs här är det möjligt att rena celltypspecifika proteomer märkta in vivo och detektera subtila förändringar i proteininnehållet på grund av provkomplexitetsreduktion.
Introduction
Avvikande proteinhomeostas orsakas av en obalans i proteinsyntes och nedbrytning. Flera sjukdomar är relaterade till förändringar i proteinhomeostas. Kännetecknet för vissa sjukdomar är närvaron av aggregat i olika subcellulära platser och hjärnområden. Proteinhomeostas är inte bara viktigt vid sjukdom utan spelar också en avgörande roll i normal organ- och cellulär funktion1. Till exempel är proteinsyntes nödvändig för många former av neuronal plasticitet2,3, vilket bestäms av användningen av kemiska hämmare som blockerar proteinsyntes4. Det är emellertid varken klart i vilka celltyper proteomet förändras för att stödja inlärning och minne, och det är inte heller förstått vilka specifika proteiner i varje celltyp som ökar eller minskar deras syntes eller nedbrytning. Således kräver en omfattande studie av proteinhomeostas förmågan att differentiera proteomer som kommer från specifika celltyper. Faktum är att identifieringen av celltypspecifika proteomer för att studera cellulära processer som förekommer i en flercellig miljö har varit ett viktigt hinder i proteomik. Av denna anledning utvecklade vi en teknik med MetRS*-uttryck i kombination med bio-ortogonala metoder som har visat sig vara ett effektivt sätt att identifiera och rena cellspecifika proteomer och fylla detta gap 5,6,7.
Uttrycket av en mutant MetRS* (MetRS L274G) möjliggör laddning av den icke-kanoniska metioninanalogen ANL i motsvarande tRNA 8,9 och dess efterföljande införlivande i proteiner. När MetRS*-uttryck regleras av en celltypspecifik promotor kommer den icke-kanoniska aminosyran att införlivas i proteinerna på ett cellselektivt sätt. När ANL har införlivats i proteinerna kan det selektivt funktionaliseras genom klickkemi och därefter antingen visualiseras genom avbildning (FUNCAT) eller genom Western Immunoblot (BONCAT). Alternativt kan proteiner selektivt renas och identifieras med masspektrometri (MS). Med hjälp av denna teknik skapade vi en muslinje som uttrycker MetRS*-proteinet under kontroll av Cre-rekombinaset. Med tanke på det ökande antalet tillgängliga Cre-mouse-linjer kan MetRS*-systemet användas inom vilket område som helst för att studera vilken celltyp som helst från vilken vävnad som helst för vilken det finns en befintlig Cre-line. Proteinmärkning med ANL är möjlig in vitro eller in vivo och förändrar inte musens beteende eller proteinintegritet6. Märkningstidsspann kan anpassas till den vetenskapliga frågan för varje forskare, märkning av nyligen syntetiserade proteiner (kortare märkningstider) eller hela proteomer (längre märkningstider). Användningen av denna teknik begränsas av antalet celler av den typ som forskaren är villig att studera; därför är proteinisolering från celltyper med lågt antal eller låga metaboliska hastigheter inte möjlig med denna metod. Målet med den presenterade metoden är att identifiera celltypsspecifika proteiner/proteomer märkta in vivo. I detta protokoll beskriver vi hur man märker celltypspecifika proteom med ANL i levande möss och renar de märkta proteinerna. Efter rening kan proteiner identifieras med hjälp av rutinmässiga masspektrometriprotokoll 5,10. Minskningen av provkomplexiteten som uppnås i denna metod genom selektiv rening av proteiner från specifika cellulära populationer gör det möjligt för experimentet att detektera subtila förändringar i proteomer, till exempel som svar på miljöförändringar. Rening av de märkta proteinerna kan uppnås på ~ 10 dagar, exklusive MS-analysen eller märkningsperioden. Här beskriver vi två metoder för ANL-administrering till MetRS*-uttryckande möss, nämligen (1) tillsats av aminosyran i dricksvattnet och (2) införande av ANL genom intraperitoneala injektioner. Oavsett vilken metod som valts för administrering av ANL är isolerings- och reningsstegen desamma (från steg 2 och framåt).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes med tillstånd från de lokala regeringskontoren i Tyskland (RP Darmstadt; protokoll: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) eller Spanien (kommittén för djurförsök vid UCM och miljörådgivning i Comunidad de Madrid, protokollnummer: PROEX 005.0/21) och följer Max Planck Societys regler och spanska förordningar och följer EU:s riktlinjer för djurskydd.
1. In vivo metabolisk märkning med ANL
- Dricksvatten:
- Lös upp ANL och maltos i mössens vanliga dricksvatten. Den rekommenderade maltoskoncentrationen är 0,7 % (vikt/volym). Den maximala mängden ANL som tillsätts dricksvattnet är 1% (vikt / vol). När blandningen är klar, sterilisera den genom filtrering och förvara den vid 4 °C.
- Ge blandningen beredd i steg 1.1 till mössen. Byt flaskor ofta (t.ex. var 3: e dag) för att undvika föroreningar och kontrollera dem varje dag för att leta efter eventuell kontaminering eller igensättning. Övervaka mängden berusat vatten dagligen genom att väga det, för att känna till mössens ANL-intag.
OBS: Den maximala märkningsperioden som utvärderas här är 3 veckor med en ANL-koncentration på 1% i dricksvattnet, vilket resulterade i väl detekterbar märkning i hjärnan. Bra märkning kan också uppnås om 2 veckor. Varken kortare märkningstider eller längre tidpunkter eller andra ANL-belopp har studerats av oss med hjälp av denna administrationsmetod, vilket inte innebär att ovanstående inte skulle fungera. ANL-inkorporeringsgraden kan variera beroende på den studerade vävnaden eller celltypen. Tidpunkten för märkning kan variera beroende på den vetenskapliga frågan; Till exempel, om proteomer skulle märkas, bör märkningstiden beräknas i funktion av den genomsnittliga halveringstiden för proteinerna i den studerade vävnaden. Om intresset bara är att identifiera nysyntetiserade proteiner kan tiderna förkortas. Märkningsperioderna och ANL-doserna måste testas empiriskt för varje experimentellt tillstånd och celltyp av intresse.
- Intraperitoneal administrering:
- Lös upp ANL i fysiologisk NaCl-lösning till 400 mM, fosfatsaltlösningsbuffert (PBS) eller vatten.
- Se till att lösningens osmolaritet ligger inom det fysiologiska området. Här administreras 10 ml/kg kroppsvikt av ANL-lösning till mössen.
OBS: Bra märkning i hjärnans excitatoriska neuroner erhålls framgångsrikt genom en daglig intraperitoneal injektion (IP) med 400 mM ANL i 1 vecka. Varken lägre ANL-koncentrationer eller andra märkningsperioder med IP-injektioner har testats i denna studie, vilket inte innebär att de inte skulle fungera. ANL levereras som hydroklorid av vissa företag. I detta fall måste lösningarnas pH justeras till adekvat pH (beroende på administreringsväg). ANL kan också syntetiseras enligt metoden publicerad av Link et al.11 med vissa modifieringar5. ANL-märkning kan utföras med andra ANL-koncentrationer, tidsspann och administreringsvägar. För vävnader/celltyper med låga ämnesomsättningar kan en metionindiet med lågt innehåll användas, alltid med början 1 vecka före administrering av ANL. När 400 mM ANL används kan den fällas ut medan den förvaras vid 4 °C. uppvärmning upp till 37 °C ger ANL tillbaka i lösningen. Låt den nå rumstemperatur före injektion. I de flesta världsregioner är ANL-administrering till möss ett djurförsök och måste godkännas av de relevanta myndigheterna.
2. Vävnadsskörd, lys och proteinextraktion
- Vävnadsdissektion: Dissekera vävnadsområdet som innehåller celltypen av intresse och notera vikten av den uppsamlade vävnaden.
OBS: Proverna kan förvaras vid -80 °C i flera månader (stopppunkt). I det nuvarande protokollet dissekerades möss cortex och hippocampus. - Vävnadslys: Homogenisera vävnaden vid rumstemperatur genom att tillsätta en volym 12-15 gånger våtvikten av vävnaden i lysbufferten (PBS pH 7,4, 1% wt / vol SDS, 1% (vol / vol) Triton X-100, Benzonas (1: 1000 vol / vol), en proteashämmare (PI) (EDTA-fri 1: 4000)). Till exempel, för en 20 mg vävnadsbit, tillsätt 240-300 μL lysbuffert. Triturate vävnaden tills den är homogeniserad.
OBS: Proverna kan förvaras vid -80 °C i flera månader (stopppunkt). För direkt homogenisering i 1,5 ml rör rekommenderas användning av en handhållen, batteridriven homogenisator, särskilt när små bitar av vävnad bearbetas. För större bitar kan en Dounce-homogenisator användas. Till varje buffert där proteashämmare (PI) ingår bör de tillsättas omedelbart före användning och inte tidigare. - Proteindenaturering: Värm homogenatet till 75 °C i 15 minuter och centrifugera vid 17 000 x g i 15 minuter vid 10 °C. Överför supernatanten till ett nytt rör.
- Mätning av proteininnehåll: Mät proteinkoncentrationen för varje prov och justera alla prover som ska jämföras med samma proteinkoncentration. justera koncentrationen genom att tillsätta lysbuffert. Ett optimalt koncentrationsintervall är mellan 2-4 μg/μl.
OBS: Proverna kan förvaras vid -80 °C i flera månader (stopppunkt). - Alkylering
- Späd de homogeniserade proverna 2-3 gånger i PBS (pH 7,8) + PI (EDTA-fri 1:4000).
- Tillsätt jodacetamid (IAA) till en slutlig koncentration på 20 mM (stamlösning 500 mM).
- Låt proverna stå i 1–2 timmar vid 20 °C i mörker. Gör steg 2.5.2-2.5.3 två gånger.
OBS: För vissa vävnader, om det ospecifika klicket i den negativa kontrollen förblir högt, kan det vara nödvändigt att utföra ett reduktionssteg före alkylering12. Förbered IAA-beståndet nyligen precis innan du lägger till det i proverna. Proverna kan förvaras vid -80 °C i flera månader (stopppunkt).
- Buffertutbyte: Kolumner för jämviktsbuffertutbyte med hjälp av klickkemins utbytesbuffert (PBS pH 7,8, 0,04% (wt/vol) SDS, 0,08% (vol/vol) Triton X-100 och PI (1:4000)). Följ tillverkarens instruktioner. Byt ut alla alkylerade prover.
OBS: Eluterade prover kan förvaras vid -80 °C i flera månader (stopppunkt). I det här steget elimineras IAA och bufferten utbyts av klickkemibufferten. Protein kan mätas igen efter buffertbytessteget för att säkerställa att proteinerna inte förlorades under buffertutbytesprocessen. Beroende på vilken typ av kolumner som används för buffertutbyte kan protein gå massivt förlorat. Använd de rekommenderade kolumnerna för att undvika proteinförlust. För provlagring rekommenderas beredning av alikvoter. - Klicka på reaktionen för att utvärdera ANL-införlivandet i experimentet
- Ta 40 μl av de eluterade proverna i steg 2.6 och tillsätt PBS (pH 7,8) till en slutlig volym på 120 μl.
- För att ställa in klickkemireaktionen, tillsätt följande reagenser i given ordning och virvel i 20 s efter varje tillsats: 1,5 μl triazolligand (stam 40 mM), 1,5 μl biotinalkyn (stam 5 mM) och 1 μL Cu(I)-bromid (stam 10 mg/ml, upplöst i DMSO genom noggrann pipettering upp och ner, virvla inte). Tillsätt reagenserna så fort som möjligt.
- Inkubera proverna över natten i mörker vid 4 °C med kontinuerlig rotation.
- Centrifugera proverna vid 4 °C i 5 minuter vid 17 000 x g. En något turkos pellets kommer att synas. Överför supernatanten till ett nytt rör.
OBS: Förbered Cu (I) bromidbuljong omedelbart före användning för att undvika kopparoxidation. Det är viktigt att hålla volymförhållandet mellan det lyserade provet och PBS konstant mellan proverna för att säkerställa samma slutliga tvättmedelskoncentration i varje rör. För att påskynda monteringen av klickkemireaktionen rekommenderas en bordsvirvel med rack för rör. Förvara de klickade proverna vid -80 °C i flera månader, eller vid -20 °C i ett par veckor tills vidare bearbetning (stopppunkt).
- Western blot-analys för att utvärdera ANL-införlivande i experimentet
- Kör en SDS-PAGE med 20-40 μL av supernatanten från klickkemireaktionen (steg 2.7). Använd 12% akrylamidgeler, kör i 1% SDS, 250 mM Tris-HCl, 2 mM glycin. Kör tills framsidan är ur gelén.
- Överför proteinerna till ett nitrocellulosa eller PVDF-membran13.
- Inkubera membranet över natten vid 4 °C med GFP-antikropp (1:500, GFP-protein översätts tillsammans med MetRS*5) och biotinantikropp (1:1000) för klickad alkyndetektion, som konjugeras till biotin.
- Tvätta den primära antikroppen 2 gånger i 10 min och tillsätt den sekundära antikroppen i 1,5 timmar.
- Tvätta den sekundära antikroppen 2 gånger i 10 min och skanna (om du använder fluoroforkonjugerade antikroppar) eller utsätt för filmer (om du använder pepparrotsperoxidaskonjugerade antikroppar).
- Kvantifiera biotinsignalen med ImageJ eller liknande programvara, utvärdera den allmänna märkningen av varje prov i experimentet och upptäcka möjliga avvikelser. Utvärdera signal-brusförhållandet (ANL-provmärkning till bakgrund från de negativa kontrollerna) för experimentet och detektera möjliga djur som inte tog upp/införlivade ANL.
OBS: För prover med hög ANL-inkorporering är proteinrening teoretiskt möjlig med hjälp av icke-klyvbara alkyner som den som används i detta avsnitt för utvärdering av ANL-inkorporering. Med hjälp av hjärnprover är bakgrunden som erhålls i de negativa kontrollerna av MS efter proteinrening med icke-klyvbara alkyner för hög14. Därför användes endast de lätthanterliga, icke-klyvbara alkynerna för en första allmän prov- och experimentutvärdering. Oavsett vilken typ av alkyn som är avsedd för proteinrening är det lämpligt att utföra stegen för alkyndosoptimering som beskrivs i följande avsnitt (steg 2.9).
- Klickreaktion för klyvbar alkyndosoptimering
- Bered fyra rör med 40 μl av ett representativt prov (erhållet i steg 2.6 och utvärderat i steg 2.8) och tillsätt PBS (pH 7.8) till en slutlig volym på 120 μl.
- Ställ in klickkemireaktionen enligt förklaringen i steg 2.7 men den här gången lägger du till fyra olika mängder av DST-alkyn. För nämnda alkyn rekommenderas testning av 5 μM, 15 μM, 30 μM och 60 μM.
- Upprepa steg 2.8 för att bestämma vilken som är den mest lämpliga alkyndosen för den specifika experimentella frågan som studeras, baserat på den högsta märkningseffektiviteten med den lägsta bakgrundssignalen.
OBS: Innan de återstående proverna utsätts för en klickreaktion måste den optimala mängden alkyn bestämmas. Det finns flera alternativ av kommersiellt tillgängliga alkyner som kan användas. De skiljer sig åt i sättet att klyva (t.ex. lätta eller reducerande medel). Kopparfri klickkemi med hjälp av stammarknadsförda reagenser (t.ex. DBCO-reagenser) är också möjlig. Små förändringar i mängden antingen alkyner eller DBCO-reagenser ökar ofta signalen i den negativa kontrollen (bakgrunden) avsevärt. Här beskrivs proteinreningen med användning av en alkyn med en disulfidbro som kan klyvas med reduktionsmedel (Disulfid biotin alkyne eller DST-alkyne15). När du använder DST-alkyn, för att köra SDS-PAGE (steg 8.1), undvik att ladda buffertar med starka reduktionsmedel som DTT eller β-merkaptoetanol för att förhindra alkynklyvning. I denna studie påverkar inte uppvärmning vid 72 °C i 5 minuter med användning av 5 mM N-etylmaleimid (NEM) i belastningsbufferten DST-alkynstabiliteten. Steg 2.9.2 kan upprepas och testa mer finkorniga doser i intervallet för den bästa observerade.
- Preparativ klickreaktion för proteinrening
- Klicka på alla prover som erhållits i steg 2.6 med den optimala alkyndosen bestämd i steg 2.9 och analysera en bråkdel av SDS-PAGE och Western blot (steg 2.8).
OBS: Se till att pipetterna är korrekt kalibrerade för att säkerställa provuppskalningsnoggrannhet. Klickade prover kan förvaras vid -80 °C i flera månader (stopppunkt).
- Klicka på alla prover som erhållits i steg 2.6 med den optimala alkyndosen bestämd i steg 2.9 och analysera en bråkdel av SDS-PAGE och Western blot (steg 2.8).
3. Proteinrening
- Buffertutbyte
- Utsätt alla klickade prover för ett buffertutbytesförfarande enligt beskrivningen i steg 2.6, men använd neutravidinbindande buffert som jämviktsbuffert (PBS pH 7,4, 0,15% (wt/vol) SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100 och PI (1:2000)).
OBS: Eluterade prover kan förvaras vid -80 °C i flera månader (stopppunkt). I detta steg elimineras den icke-klickade fria alkynen och bufferten utbyts av neutravidinbindningsbufferten.
- Utsätt alla klickade prover för ett buffertutbytesförfarande enligt beskrivningen i steg 2.6, men använd neutravidinbindande buffert som jämviktsbuffert (PBS pH 7,4, 0,15% (wt/vol) SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100 och PI (1:2000)).
- Bindning till neutravidinpärlor
- Tvätta neutravidinpärlorna med hög kapacitet med neutravidinbindningsbufferten (se steg 3.1). Blanda pärlorna med bufferten och centrifugera blandningen i 5 min vid 3000 x g och kassera supernatanten. Upprepa tre gånger.
- Förbered en 1:1-uppslamning av neutravidinpärlor genom att tillsätta samma volym torra pärlor och neutravidinbindande buffert.
- Lägg åt sidan 20–40 μl av varje prov som förrenat lysat och förvara det vid -20 °C.
- Mät proteinkoncentrationen (se steg 2.4) och blanda 100 μg protein med 4 μl av pärluppslamningen som erhållits i steg 3.2.2.
- Inkubera blandningen över natten vid 4 °C med kontinuerlig rotation, så att märkta proteiner kan binda till pärlorna.
OBS: När det gäller klickkemireaktionen kan den grundläggande affinitetsreningsreaktionen som beskrivs i steg 3.2.4 uppskalas. Till exempel, för rening av proteiner från hippocampus excitatoriska neuroner, blandas 1 mg proteinlysat med 40 μL neutravidinpärlor (1:1 uppslamning). Mängden neutravidinpärlor kan skalas upp eller ner beroende på mängden märkta proteiner per mg totalt protein, vilket beror på den valda celltypen och märkningsperioden och måste bestämmas empiriskt.
- Neutravidinpärlor tvättar och proteineluering
- Samla supernatanterna genom centrifugering (se steg 3.2.1). Lägg en alikvot på 20–40 μl av varje supernatant åt sidan för senare analys och frys resten vid -80 °C.
- Tvätta pärlorna med kyld Neutravidin tvättbuffert 1 (PBS pH 7,4, 0,2% (wt/vol) SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100 och PI (1:2000)) genom att tillsätta bufferten, sedimentera pärlorna och kasta supernatanten. Upprepa detta steg tre gånger.
- Tillsätt sedan samma buffert och inkubera pärlorna i 10 minuter under kontinuerlig rotation vid 4 °C innan supernatanten kasseras. Upprepa detta steg tre gånger.
- Tvätta pärlorna enligt beskrivningen i steg 3.3.2-3.3.3 men med Neutravidin tvättbuffert 2 (1x PBS, pH 7.4 och PI 1:2000).
- Tvätta pärlorna enligt förklaringen i steg 3.3.2-3.3.3 men med neutravidintvättbuffert 3 (50 mM ammoniumbikarbonat och PI 1:2000).
- Eluera de klickade proteinerna genom att inkubera pärlorna i 30 minuter vid 20 °C med en volym neutravidinelueringsbuffert (5 % (vol/vol) β-merkaptoetanol och 0,03 % (vikt/volym) SDS) som motsvarar en volym av de använda torra pärlorna.
- Håll pärlorna i suspension under eluering genom kontinuerlig omrörning (1000 rpm) i en termoblockskakare. Eluera två gånger och kombinera båda eluatesna.
Anmärkning: Den centrifugering som ställts in för separation av den fasta fraktionen av uppslamningen (pärlorna) och vattenfasen (supernatanten), såsom förklaras i steg 3.2.1, gäller för steg 3.3.1-3.3.7. SDS-mängden kan ökas om proteinets eluering inte är fullständig. Men med mängder över 0,08% -0,1% av SDS börjar proteiner som inte är specifikt bundna till pärlorna elueras. β-merkaptoetanol är flyktig och giftig; Användning av en huva för steg 3.3.6-3.3.7 är tillrådligt. De prover som samlas in i steg 3.2.3 och 3.3.1 bör köras av SDS-PAGE och utvärderas av Western blot (se steg 2.8) för att utvärdera effektiviteten hos affinitetsreningen (steg 3.3).
- Utvärdering av eluerade proteiner
- Ladda 1/3 av de eluterade proverna till en SDS-PAGE (se steg 2.8.1).
- Färga gelén för att visualisera proteiner med hjälp av en högkänslig metod, såsom silverfärgning eller en fluorescerande metod.
- Om proverna har den förväntade kvaliteten, vilket innebär att det finns 3-4 gånger mer protein i de ANL-märkta proverna jämfört med den negativa kontrollen, kan de eluterade proteinerna identifieras med rutinmässiga masspektrometrimetoder som den som förklaras i referens5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter det beskrivna protokollet (sammanfattat i figur 1) administrerades ANL till möss antingen genom dagliga intraperitoneala injektioner (400 mM ANL 10 ml/kg, Nex-Cre::MetRS*) i 7 dagar, eller via dricksvatten (0,7 % maltos, 1 % ANL, CamkII-Cre::MetRS*) i 21 dagar. Efter märkning dissekerades motsvarande hjärnområden, lyserades, alkylerades och klickades. Klickreaktioner analyserades av SDS-PAGE och Western Immunoblot. Representativa bilder av experimenten visas i figur 2 för administrering av ANL genom IP-injektion och i figur 3 för administrering av ANL via dricksvatten. Observera att syftet med siffrorna är att visa att båda märkningsprotokollen fungerar, inte att jämföra dem. Jämförelse är inte möjlig eftersom olika neuronala populationer är märkta i de två visade experimenten (excitatoriska neuroner i hippocampus och cortex och Purkinje-neuronerna i cerebellum).
Ytterligare ett experiment ger ett exempel på bestämning av den optimala DST-klyvbara alkynkoncentrationen (figur 4). I det här exemplet är vikförändringen mellan märkt prov och kontroll högst vid en alkynkoncentration på 14 μM. Denna alkynkoncentration appliceras sedan på alla prover. Efter verifiering av märkningen av varje prov i experimentet med den valda alkynmängden utsattes alla prover för rening av ANL-märkta / biotinklickade proteiner genom affinitetsbindning med neutravidinpärlor (Figur 5). I detta steg binds proteiner till pärlorna, tvättas och elueras därefter genom att minska disulfidbron som finns i DST-alkyn. Efter detta sista steg förblir biotinet och en del av alkynen bundna till pärlorna. De ANL-innehållande proteinerna (bundna till resten av alkynen) återvinns i elueringsbufferten. För att utvärdera effektiviteten hos elueringssteget laddas en tredjedel av eluatvolymen på en SDS-PAGE-gel och visualiseras med hjälp av en känslig total proteinfläckmetod. Minst en 3-faldig intensitetsskillnad av total proteinfläck mellan negativa kontroller och ANL-märkta prover måste observeras för att uppnå tolkningsbara resultat med masspektrometri. Slutförandet av alla steg som beskrivs i detta protokoll kommer att följas av MS-provberedning, förvärv och analys5. Även om det inte finns några speciella krav för MS (varje laboratorium kan använda sitt rutinmässiga MS-protokoll 5,10), bör man komma ihåg att mängden renade proteiner i allmänhet kommer att vara låg (i nanogrammens ordning). Figur 6 ger ett exempel på MS-resultat med en tydlig anrikning i det ANL-märkta provet jämfört med kontrollen (figur 6A). Denna skillnad var redan synlig i den totala proteinfläcken som visas i figur 5. Förutom förändringar i peptidintensitet finns det också unika proteiner som finns i båda proverna (figur 6B).
Figur 1: Arbetsledning för celltypspecifik proteinrening med BONCAT. Efter proteinmärkning med ANL dissekeras och lyseras vävnaden av intresse, taggas med biotin genom klickkemi, och mängden märkning för varje prov utvärderas av BONCAT. Outliers (som misslyckades med att införliva ANL) och representativa prover kan differentieras i detta steg. Ett av de representativa proverna klickas igen för att hitta den optimerade klyvbara alkyndosen för efterföljande proteinrening. Alkyndosen som uppnår det bästa signal-brusförhållandet appliceras på varje biologiskt replikat. Celltypspecifika proteiner erhålles genom affinitetsrening. Renade prover studeras med masspektrometri och proteiner identifieras. Denna siffra har modifierats från Alvarez-Castelao m.fl. (2017)6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Administrering av ANL genom intraperitoneala injektioner (IP). BONCAT utfördes för att utvärdera proteinmärkning i hippocampus (HP) och cortex (CX) efter metabolisk märkning av proteiner med ANL genom dagliga IP-injektioner i 7 dagar. Vildtypsmössprover som negativ kontroll (wt) klickades parallellt med de märkta proverna (MetRS*). Märkta proteiner kommer från de excitatoriska neuronerna med hjälp av en Nex-Cre::MetRS* linje16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Administrering av ANL via dricksvatten. BONCAT utfördes för att utvärdera proteinmärkning i Purkinje-neuronerna i lillhjärnan efter administrering av ANL till GAD-Cre::MetRS* möss via dricksvatten i 21 dagar. Figuren visar en negativ kontroll (wt) och ett märkt prov (MetRS*) lyserat och klickat parallellt. Denna siffra har modifierats från Alvarez-Castelao m.fl. (2017)6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: DST-alkyndostitrering. Ett biologiskt replikat per experiment väljs som ett representativt prov för att titrera den optimala alkynkoncentrationen. Tre koncentrationer (14, 28 och 56 μM) av alkyn testades här i klickreaktionen för BONCAT. Märkningsförhållandet mellan det ANL-märkta provet (MetRS*) och den negativa kontrollen (wt) bestämmer signal-brusförhållandet (visas i diagrammet). 14 μM är den bästa alkynkoncentrationen som erhålls i detta experiment. Cortexvävnad från den ANL-märkta Nex::MetRS* muslinjen användes för detta experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Renade proteiner. Märkta proteiner från Purkinje-neuroner renades och färgades med SYPRO Ruby. Denna siffra har modifierats från Alvarez-Castelao m.fl. (2017)6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Identifiering och kvantifiering av protein. Purkinje-cellproteomet erhölls genom masspektrometri med cerebellum från en GAD-Cre::MetRS*-muslinje som utgångsmaterial. (A) visar ökade mängder (peptidintensitet) av de identifierade proteinerna i ANL-märkta prover jämfört med vildtyp (wt) möss. (B) Purkinje-proteomet erhölls genom att samla proteiner berikade i de ANL-märkta proverna i A (definierade av >3-faldiga intensiteter hos MetRS*-möss jämfört med wt) och unika proteiner som finns i MetRS*-uttryckande möss. Denna siffra har modifierats från Alvarez-Castelao m.fl. (2017)6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritiska aspekterna av protokollet är; Införande av negativa kontroller, med tillräckligt med biologiska replikat, administreringsväg för ANL, mängd och varaktighet, alkylering av proverna, alkynkoncentration och eliminering av β-merkaptoetanol vid användning av DST-alkyn.
Det är viktigt att inkludera negativa kontrollprover från ANL-märkta djur utan Cre-drivrutin och därför inget MetRS*-uttryck. Dessa prover måste utsättas för varje steg som beskrivs i protokollet parallellt med proverna från ANL-märkta Cre-inducerade MetRS*-möss. Exempel som inte klickas på är inte giltiga kontroller, eftersom alla resultat som uppnås med endast den här kontrollen kan bero på ospecifika klick. Vi har inte observerat införlivande av ANL i celler som inte uttrycker MetRS*-genen eller MetRS*-uttryck i celler utan Cre; Således kan WT-djur märkta med ANL användas som en negativ kontroll.
Med tanke på att det protokoll som beskrivs härmed består av många steg där prover kan gå förlorade, rekommenderas att man beräknar biologiska replikat med tanke på tekniska fel. För hjärnprover finns det cirka 30% replikera förlust.
Vi beskriver här två ANL-administrationsvägar och varaktigheter. Detta utesluter inte att andra administreringsvägar (t.ex. att lägga till ANL i maten) fungerar lika bra. Med avseende på den administrerade ANL-mängden utfördes experimenten som visas här med relativt höga mängder ANL. Märkning med lägre mängder är också möjlig beroende på experimentell inställning. Den kortaste tidsperioden för ANL-märkning som rapporteras i detta protokoll är 1 vecka och den längsta 21 dagar. Kortare eller längre märkningsperioder skulle kunna tillämpas, men vi har inte bestämt det. Forskare bör bestämma ANL-administreringsvägen, ANL-doseringen och ANL-märkningsperioden som är tillräcklig för den specifika experimentella frågan som studeras genom att överväga vävnadens metaboliska egenskaper, celltypen av intresse och den experimentella frågan som studeras.
Provalkylering, även känd som capping, är ett viktigt steg för att undvika bakgrundsklick17. När alkyleringen är korrekt utförd reduceras det ospecifika klicket som övervakas av kontrollproverna och skillnaden mellan de negativa kontroll- och ANL-märkta proverna är större. Eliminering av fri IAA efter alkylering är också ett viktigt steg. Närvaron av små mängder IAA under klickreaktionen kommer att begränsa dess effektivitet. Ibland måste avsaltningssteget, som också eliminerar IAA (steg 2.6), upprepas för att säkerställa korrekt avlägsnande av IAA.
Det finns flera biotin-alkyner och -DBCO-reagenser kommersiellt tillgängliga från en mängd olika företag. De viktigaste skillnaderna mellan dem gäller polyetylenglykol (PEG) länkkedjelängd och frånvaro, närvaro och typ av klyvbara grupper. Oavsett vilken typ som används leder överskott av alkyn till ospecifika klick till proteiner som endast innehåller naturliga aminosyror. Detta kan lätt förhindras genom exakt och noggrann titrering av alkynmängden. Som beskrivits är det bästa sättet att uppnå detta att använda de faktiska lyserade och alkylerade proverna som ska användas i de efterföljande proteinreningsstegen (steg 2.6) och masspektrometrianalys.
När DST-alkyner används i klickreaktionen minskar β-merkaptoetanol disulfidbryggan och dissocierar de märkta proteinerna från pärlorna i elueringssteget (steg 3.3). β-merkaptoetanol måste avlägsnas från proverna för att möjliggöra den enzymatiska uppslutning som behövs för MS. Det finns flera sätt att göra detta (t.ex. frystorkning18, excision från en gel19 eller rengöring med S-Trap-kolumner20), och valet bör göras av MS-laboratoriet som behandlar proverna.
Ändringar och felsökning av metoden bör riktas för att optimera de kritiska stegen som nämns i protokollet. Till exempel, om det finns för mycket variabilitet, lägg till fler biologiska replikat; om märkningen är för låg, öka ANL-koncentrationen, använd längre märkningstidsintervall eller testa andra ANL-administreringsvägar som kan vara effektivare för den studerade vävnaden. För proteinalkylering kunde ett tidigare reducerande steg till tillsats av IAA genomföras.
Huvudbegränsningen av metoden är rening av proteomer som härrör från småcellspopulationer även om ett litet vävnadsområde dissekeras. Proteomer av fler cellpopulationer som dock är utspridda över större vävnadsområden är också svåra att komma åt. Ändå kan den in vivo-märkningsteknik som beskrivs här fortfarande tillämpas för att bedöma de refererade celltyperna genom avbildning (t.ex. med FUNCAT eller FUNCAT-PLA21).
Denna metod är för närvarande den enda tillgängliga metoden för in vivo-studier av celltypspecifika proteomer baserade på fullängdsproteiner och för in situ-visualisering av celltypspecifika kompletta proteiner. Andra icke-kanoniska aminosyror såsom azidohomoalanin (AHA) kan också användas för in vivo-proteinmärkning och rening av proteomer, men saknar cellcelltypspecificitet22,23. Andra metoder såsom puromycin är lämpliga för att ge en fast bild av proteinsyntesen24,25. Ändå är det möjligt att använda icke-kanoniska aminosyror under längre perioder av märkning, vilket också återspeglar proteinnedbrytning och visar ett mer exakt cellulärt proteom. BioID-baserade metoder används för att identifiera proteiner i specifika subcellulära regioner, oavsett deras ögonblick/plats för syntes26.
I muslinjen som vi etablerade (tillgänglig från Jackson Lab, lager nr 028071) uttrycks det mutanta metionint-tRNA-syntetaset (MetRS*) som möjliggör införlivande av ANL i cellerna på ett Cre-beroende sätt. Med denna muslinje som verktyg är det möjligt att uteslutande uttrycka MetRS* i celltyper för vilka Cre-driver-linjer är tillgängliga. Detta arrangemang ger metoden stor mångsidighet, vilket gör den användbar inom nästan alla områden av biomedicinsk forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
B.A-C finansieras av det spanska ministeriet för vetenskap och innovation (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), av den autonoma regionen Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) och MICINN (PID2020-113270RA-I00) bidrag. R. A-P finansieras av den autonoma regionen Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). E.M.S. finansieras av Max Planck Society, ett Advanced Investigator-pris från European Research Council (grant 743216), DFG CRC 1080: Molecular and Cellular Mechanisms of Neural Homeostasis och DFG CRC 902: Molecular Principles of RNA-based Regulation. Vi tackar D.C Dieterich och P. Landgraf för deras tekniska råd och syntesen av DST-Alkyne. Vi tackar E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast och djuranläggningen för MPI for Brain Research för deras utmärkta stöd. Vi tackar Sandra Goebbels för att hon delade Nex-Cre-muslinjen. Vi tackar Antonio G. Carroggio för hans hjälp med engelsk redigering. B.A-C. designade, genomförde och analyserade experiment. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E. och S. t. D. genomförde och analyserade experiment. B.A-C och E.M.S. designade experiment och övervakade projektet, B.A-C skrev tidningen. Alla författare redigerade tidningen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12% Acrylamide gels | GenScript | SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12% | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood |
| ANL | Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11) | ||
| ANL-HCl | IrishBotech | HAA1625.0500 | |
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Biotin alkyne | Thermo, | B10185 | |
| Chicken antibody anti-GFP | Aves | 1020 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor | Roche | 4693132001 | Toxic; use a lab coat and gloves. |
| Copper (I) bromide | Sigma | 254185 | 99.999% (wt/wt) |
| Disulfide tag (DST)-alkyne | Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20 | ||
| DMSO | Sigma | 276855 | |
| Filters | Merk | SCGP00525 | |
| Iodo acetamide (IAA) | Sigma | I1149 | |
| IR anti chicken 800 | LI-COR | IRDye 800CW | Donkey anti-Chicken Secondary Antibody |
| IR anti rabit 680 | LI-COR | IRDye 680RD | Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody |
| Maltose | Sigma | M9171 | |
| Manual Mixer | BioSpec Products | 1083 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | 4259 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| NeutrAvidin beads | Pierce | 29200 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 1620112 | |
| PBS 1X | Thermo | J62036.K2 | |
| PBS 1X pH 7.8 | Preparation described in reference number 5 | ||
| PD SpinTrap G-25 columns | GE Healthcare | Buffer exchange | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo, | 23225 | Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life. |
| Polyclonal rabbit anti-biotin antibody | Cell Signaling | 5597 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| SDS 10% | Sigma | 71736 | |
| SDS-PAGE Running buffer MOPS | GenScript | M00138 | |
| SYPRO Ruby stain | Sigma | S4942 | |
| Table automatic Vortexer | Eppendorf | Mixmate | |
| Triazole ligand | Sigma | 678937 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Water | Sigma | W4502 | Molecular biology grade |
References
- Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M.
- Sutton, M. A., Schuman, E. M. Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory. Cell. 127 (1), 49-58 (2006).
- Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons. Elife. 9, 52939 (2020).
- Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. Memory in mice as affected by intracerebral puromycin. Science. 141 (3575), 57-59 (1963).
- Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo. Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).
- Alvarez-Castelao, B., et al. Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo. Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).
- Ngo, J. T., et al.
- Mahdavi, A., et al. Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis. Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).
- Yuet, K. P., et al. Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).
- Patel, V. J., et al. A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).
- Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer. Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).
- Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes. Methods in Molecular Biology. 1266, Clifton, N.J. 199-215 (2015).
- Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L.
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).
- Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
- Goebbels, S., et al. Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice. Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).
- van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).
- O'Fagain, C.
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).
- tom Dieck, S., et al. Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ. Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).
- McShane, E., et al. Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation. Cell. 167 (3), 803-815 (2016).
- Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome. Scientific Reports. 6, 32377 (2016).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. BioID: A screen for protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).
