Summary
Dit protocol beschrijft hoe celtypespecifieke eiwitetikettering kan worden uitgevoerd met azidonorleucine (ANL) met behulp van een muislijn die een mutant L274G-Methionine-tRNA-synthetase (MetRS*) tot expressie brengt en de noodzakelijke stappen voor gelabelde celtypespecifieke eiwitisolatie. We schetsen twee mogelijke ANL-toedieningsroutes bij levende muizen door (1) drinkwater en (2) intraperitoneale injecties.
Abstract
Het begrijpen van eiwithomeostase in vivo is de sleutel om te weten hoe de cellen werken in zowel fysiologische als ziekteomstandigheden. Het huidige protocol beschrijft in vivo etikettering en daaropvolgende zuivering van nieuw gesynthetiseerde eiwitten met behulp van een gemanipuleerde muislijn om eiwitetikettering naar specifieke cellulaire populaties te leiden. Het is een induceerbare lijn door Cre-recombinase-expressie van L274G-Methionine-tRNA-synthetase (MetRS*), waardoor azidonorleucine (ANL) kan worden opgenomen in de eiwitten, die anders niet zullen optreden. Met behulp van de hier beschreven methode is het mogelijk om celtypespecifieke proteomen die in vivo zijn gelabeld te zuiveren en subtiele veranderingen in het eiwitgehalte te detecteren als gevolg van vermindering van de complexiteit van het monster.
Introduction
Afwijkende eiwithomeostase wordt veroorzaakt door een onbalans in eiwitsynthese en -afbraak. Verschillende ziekten zijn gerelateerd aan veranderingen in eiwithomeostase. Het kenmerk van sommige ziekten is de aanwezigheid van aggregaten op verschillende subcellulaire locaties en hersengebieden. Eiwithomeostase is niet alleen belangrijk bij ziekte, maar speelt ook een cruciale rol in de normale orgaan- en cellulaire functie1. Eiwitsynthese is bijvoorbeeld noodzakelijk voor vele vormen van neuronale plasticiteit 2,3, zoals bepaald door het gebruik van chemische remmers die eiwitsynthese blokkeren4. Het is echter niet duidelijk in welke celtypen het proteoom wordt gewijzigd om leren en geheugen te ondersteunen, noch wordt begrepen welke specifieke eiwitten in elk celtype toenemen of afnemen in hun synthese of afbraak. Een uitgebreide studie van eiwithomeostase vereist dus het vermogen om proteomen te onderscheiden die afkomstig zijn van specifieke celtypen. Inderdaad, de identificatie van celtype-specifieke proteomen om cellulaire processen te bestuderen die plaatsvinden in een meercellige omgeving is een belangrijke hindernis geweest in proteomics. Om deze reden hebben we een techniek ontwikkeld met behulp van MetRS* expressie in combinatie met bio-orthogonale methoden die bewezen heeft een effectieve manier te zijn om celtype specifieke proteomen te identificeren en te zuiveren, waardoor deze kloof 5,6,7 wordt opgevuld.
De expressie van een mutant MetRS* (MetRS L274G) maakt het mogelijk om het niet-canonieke methionine-analoog ANL in het overeenkomstige tRNA 8,9 te laden en vervolgens in eiwitten op te nemen. Wanneer metRS*-expressie wordt gereguleerd door een celtypespecifieke promotor, wordt het niet-canonieke aminozuur op een celselectieve manier in de eiwitten opgenomen. Zodra ANL in de eiwitten is opgenomen, kan het selectief worden gefunctionaliseerd door klikchemie en vervolgens worden gevisualiseerd door beeldvorming (FUNCAT) of door Western Immunoblot (BONCAT). Als alternatief kunnen eiwitten selectief worden gezuiverd en geïdentificeerd door massaspectrometrie (MS). Met behulp van deze technologie creëerden we een muislijn die het MetRS*-eiwit tot expressie brengt onder controle van het Cre-recombinase. Gezien het toenemende aantal beschikbare Cre-muislijnen, kan het MetRS*-systeem op elk gebied worden gebruikt om elk celtype te bestuderen uit elk weefsel waarvoor een bestaande Cre-lijn bestaat. Eiwitetikettering met ANL is mogelijk in vitro of in vivo en verandert het gedrag van de muis of de eiwitintegriteit niet6. De etiketteringstijdspanne kan worden aangepast aan de wetenschappelijke vraag van elke onderzoeker, waarbij nieuw gesynthetiseerde eiwitten (kortere etiketteringstijden) of hele proteomen (langere etiketteringstijden) worden geëtiketteerd. Het gebruik van deze techniek wordt beperkt door het aantal cellen van het type dat de onderzoeker bereid is te bestuderen; vandaar dat eiwitisolatie van celtypen met lage aantallen of lage stofwisselingen niet mogelijk is met deze methode. Het doel van de gepresenteerde methode is om celtype-specifieke eiwitten /proteomen te identificeren die in vivo zijn gelabeld. In dit protocol beschrijven we hoe we celtypespecifieke proteomen kunnen labelen met ANL in levende muizen en de gelabelde eiwitten kunnen zuiveren. Na zuivering kunnen eiwitten worden geïdentificeerd door routinematige massaspectrometrieprotocollen 5,10. De vermindering van de complexiteit van het monster die in deze methode wordt bereikt door de selectieve zuivering van eiwitten uit specifieke cellulaire populaties, stelt de experimentator in staat om subtiele veranderingen in proteomen te detecteren, bijvoorbeeld als reactie op veranderingen in de omgeving. Zuivering van de gelabelde eiwitten kan worden bereikt in ~ 10 dagen, exclusief de MS-analyse of de etiketteringsperiode. Hier beschrijven we twee methoden voor ANL-toediening aan MetRS * die muizen tot expressie brengen, namelijk (1) het toevoegen van het aminozuur in het drinkwater en (2) het introduceren van ANL door intraperitoneale injecties. Ongeacht de gekozen methode voor ANL-toediening, zijn de isolatie- en zuiveringsstappen hetzelfde (vanaf stap 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd met toestemming van de lokale overheidskantoren in Duitsland (RP Darmstadt; protocollen: V54-19c20/15-F122/14, V54-19c20/15-F126/1012) of Spanje (Comité van Dierproeven bij de UCM en Milieubegeleiding van de Comunidad de Madrid, protocolnummer: PROEX 005.0/21) en voldoen aan de regels en Spaanse voorschriften van de Max Planck Society en volgen de EU-richtlijnen voor dierenwelzijn.
1. In vivo metabole etikettering met ANL
- Drinkwater:
- Los ANL en maltose op in het reguliere drinkwater van de muizen. De aanbevolen maltoseconcentratie is 0,7% (wt/vol). De maximale hoeveelheid ANL die aan het drinkwater wordt toegevoegd is 1% (wt/vol). Zodra het mengsel klaar is, steriliseert u het door filtratie en bewaart u het bij 4 °C.
- Geef het in stap 1.1 bereide mengsel aan de muizen. Vervang flessen regelmatig (bijvoorbeeld om de 3 dagen) om besmettingen te voorkomen en controleer ze elke dag op mogelijke besmetting of verstopping. Controleer de hoeveelheid gedronken water per dag door het te wegen, om de ANL-inname van muizen te kennen.
OPMERKING: De maximale etiketteringsperiode die hier wordt geëvalueerd, is 3 weken met een ANL-concentratie van 1% in het drinkwater, wat resulteerde in goed detecteerbare etikettering in de hersenen. Een goede etikettering kan ook in 2 weken worden bereikt. Noch kortere etiketteringstijden, noch langere tijdspunten, noch andere ANL-bedragen zijn door ons bestudeerd met behulp van deze toedieningsmethode, wat niet impliceert dat het voorgaande niet zou werken. ANL-opnamepercentages kunnen variëren afhankelijk van het bestudeerde weefsel of celtype. Het tijdstip van etikettering kan variëren afhankelijk van de wetenschappelijke vraag; als proteomen bijvoorbeeld zouden worden gelabeld, moet de etiketteringstijd worden berekend in functie van de gemiddelde halfwaardetijd van de eiwitten in het bestudeerde weefsel. Als het belang alleen is om nieuw gesynthetiseerde eiwitten te identificeren, kunnen de tijden worden verkort. De etiketteringsperioden en ANL-doseringen moeten empirisch worden getest voor elke experimentele aandoening en celtype van belang.
- Intraperitoneale toediening:
- Los ANL op in fysiologische NaCl-oplossing tot 400 mM, fosfaatzoutbuffer (PBS) of water.
- Zorg ervoor dat de osmolariteit van de oplossing binnen het fysiologische bereik ligt. Hier wordt 10 ml / kg lichaamsgewicht anl-oplossing toegediend aan de muizen.
OPMERKING: Goede etikettering in de exciterende neuronen van de hersenen wordt met succes verkregen door één dagelijkse intraperitoneale injectie (IP) met 400 mM ANL gedurende 1 week. Noch lagere ANL-concentraties, noch andere etiketteringsperioden door IP-injecties zijn in deze studie getest, wat niet betekent dat ze niet zouden werken. ANL wordt door sommige bedrijven geleverd als hydrochloride. In dit geval moet de pH van de oplossingen worden aangepast aan de juiste pH (afhankelijk van de toedieningsweg). ANL kan ook worden gesynthetiseerd volgens de methode gepubliceerd door Link et al.11 met enkele wijzigingen5. ANL-etikettering kan worden uitgevoerd met behulp van andere ANL-concentraties, tijdspannes en toedieningsroutes. Voor weefsels/celtypen met een laag metabolisme kan een methioninedieet met een laag gehalte worden gebruikt, altijd vanaf 1 week voor anl-toediening. Wanneer 400 mM ANL wordt gebruikt, kan het neerslaan terwijl het bij 4 °C wordt bewaard; verwarming tot 37 °C brengt ANL terug in de oplossing. Laat het vóór injectie op kamertemperatuur komen. In de meeste regio's van de wereld is ANL-toediening aan muizen een dierproef en moet deze worden goedgekeurd door de relevante autoriteiten.
2. Weefseloogst, lysis en eiwitextractie
- Weefseldissectie: Ontleed het gebied van weefsel dat het celtype van belang bevat en noteer het gewicht van het verzamelde stuk weefsel.
OPMERKING: Monsters kunnen enkele maanden bij -80 °C worden bewaard (stoppunt). In het huidige protocol werden de cortex en hippocampus van muizen ontleed. - Weefsellysis: Homogeniseer het weefsel bij kamertemperatuur door een volume toe te voegen 12-15 keer het natte gewicht van het weefsel van de lysisbuffer (PBS pH 7,4, 1% wt / vol SDS, 1% (vol / vol) Triton X-100, Benzonase (1: 1000 vol / vol), een proteaseremmer (PI) (EDTA-vrij 1:4000)). Voeg bijvoorbeeld voor een stukje weefsel van 20 mg 240-300 μL lysisbuffer toe. Trituur het weefsel totdat het gehomogeniseerd is.
OPMERKING: Monsters kunnen enkele maanden bij -80 °C worden bewaard (stoppunt). Voor directe homogenisatie in buizen van 1,5 ml wordt het gebruik van een draagbare, op batterijen werkende homogenisator aanbevolen, vooral wanneer kleine stukjes weefsel worden verwerkt. Voor grotere stukken kan een Dounce homogenisator worden gebruikt. Aan elke buffer waarin proteaseremmers (PI) zijn opgenomen, moeten ze onmiddellijk voor gebruik worden toegevoegd en niet eerder. - Eiwitdenaturatie: Verwarm het homogenaat tot 75 °C gedurende 15 minuten en centrifugeer bij 17.000 x g gedurende 15 minuten bij 10 °C. Breng het supernatant over in een nieuwe buis.
- Eiwitgehaltemeting: Meet de eiwitconcentratie van elk monster en pas alle monsters aan om te worden vergeleken met dezelfde eiwitconcentratie; pas de concentratie aan door lysisbuffer toe te voegen. Een optimaal concentratiebereik ligt tussen 2-4 μg/μL.
OPMERKING: Monsters kunnen enkele maanden bij -80 °C worden bewaard (stoppunt). - Alkylering
- Verdun de gehomogeniseerde monsters met 2-3 keer in PBS (pH 7,8) + PI (EDTA-vrij 1:4000).
- Voeg jodoacetamide (IAZ) toe aan een eindconcentratie van 20 mM (stamoplossing 500 mM).
- Laat de monsters 1-2 uur bij 20 °C in het donker staan. Voer stap 2.5.2-2.5.3 tweemaal uit.
OPMERKING: Voor sommige weefsels, als de niet-specifieke klik in de negatieve controle hoog blijft, kan het nodig zijn om een reductiestap uit te voeren voorafgaand aan alkylering12. Bereid de IAA-voorraad vers voor vlak voordat u deze aan de monsters toevoegt. Monsters kunnen enkele maanden bij -80 °C worden bewaard (stoppunt).
- Bufferuitwisseling: Equilibrate bufferuitwisselingskolommen met behulp van de click chemistry exchange buffer (PBS pH 7,8, 0,04% (wt/vol) SDS, 0,08% (vol/vol) Triton X-100 en PI (1:4000)). Volg de instructies van de fabrikant. Wissel alle gealkyleerde monsters uit.
OPMERKING: Eluted monsters kunnen gedurende enkele maanden bij -80 °C worden bewaard (stoppunt). In deze stap wordt de IAA geëlimineerd en wordt de buffer uitgewisseld door de klikchemiebuffer. Eiwit kan na de bufferuitwisselingsstap opnieuw worden gemeten om ervoor te zorgen dat de eiwitten niet verloren zijn gegaan tijdens het bufferuitwisselingsproces. Afhankelijk van het type kolommen dat wordt gebruikt voor bufferuitwisseling, kan eiwit massaal verloren gaan. Gebruik de aanbevolen kolommen om eiwitverlies te voorkomen. Voor monsteropslag wordt de bereiding van aliquots aanbevolen. - Klik op reactie om ANL-opname in het experiment te evalueren
- Neem 40 μL van de geëlueerde monsters in stap 2.6 en voeg PBS (pH 7,8) toe aan een eindvolume van 120 μL.
- Om de klikchemiereactie in te stellen, voegt u de volgende reagentia in de gegeven volgorde en vortex toe gedurende 20 s na elke toevoeging: 1,5 μL triazole ligand (bouillon 40 mM), 1,5 μL biotine-alkyn (voorraad 5 mM) en 1 μL Cu(I)bromide (bouillon 10 mg/ml, opgelost in DMSO door zorgvuldig op en neer te pipetteren, niet vortex). Voeg de reagentia zo snel mogelijk toe.
- Incubeer de monsters een nacht in het donker bij 4 °C met continue rotatie.
- Centrifugeer de monsters bij 4 °C gedurende 5 minuten bij 17.000 x g. Een licht turquoise pellet zal zichtbaar zijn. Breng het supernatant over in een nieuwe buis.
OPMERKING: Bereid Cu (I) bromidebouillon onmiddellijk voor gebruik om koperoxidatie te voorkomen. Het is van essentieel belang dat de verhouding tussen de volumes tussen het gelyseerde monster en de PBS tussen de monsters constant blijft om dezelfde uiteindelijke concentratie detergenten in elke buis te waarborgen. Om de assemblage van de klikchemiereactie te versnellen, wordt een tafelvortexer met rekken voor buizen aanbevolen. Bewaar de aangeklikte monsters enkele maanden bij -80 °C of enkele weken bij -20 °C tot verdere verwerking (stoppunt).
- Western blot-analyse om ANL-integratie in het experiment te evalueren
- Voer een SDS-PAGE uit met 20-40 μL van het supernatant uit de klikchemiereactie (stap 2.7). Gebruik 12% acrylamide gels, uitgevoerd in 1% SDS, 250 mM Tris-HCl, 2 mM glycine. Loop tot de voorkant uit de gel is.
- Breng de eiwitten over naar een nitrocellulose- of PVDF-membraan13.
- Incubeer het membraan 's nachts bij 4 °C met GFP-antilichaam (1:500, GFP-eiwit wordt samen met MetRS*5) en biotine-antilichaam (1:1000) voor geklikte alkyndetectie, dat wordt geconjugeerd tot biotine.
- Was het primaire antilichaam 2 keer gedurende 10 minuten en voeg het secundaire antilichaam gedurende 1,5 uur toe.
- Was het secundaire antilichaam 2 keer gedurende 10 minuten en scan (bij gebruik van fluorofoor-geconjugeerde antilichamen) of stel het bloot aan films (bij gebruik van mierikswortelperoxidase-geconjugeerde antilichamen).
- Kwantificeer het biotinesignaal met Behulp van ImageJ of vergelijkbare software, evalueer de algemene etikettering van elk monster van het experiment en detecteer mogelijke uitschieters. Evalueer de signaal-ruisverhouding (ANL-monsteretikettering op achtergrond van de negatieve controles) van het experiment en detecteer mogelijke dieren die anl niet hebben opgenomen/opgenomen.
OPMERKING: Voor monsters met een hoge ANL-opname is eiwitzuivering theoretisch mogelijk met behulp van niet-splijtbare alkynen zoals die in deze sectie worden gebruikt voor de evaluatie van ANL-opname. Met behulp van hersenmonsters is de achtergrond verkregen in de negatieve controles door MS na eiwitzuivering met behulp van niet-splijtbare alkynen te hoog14. Daarom werden alleen de gemakkelijker te hanteren, niet-splijtbare alkynen gebruikt voor een eerste algemene monster- en experimentevaluatie. Ongeacht het type alkyn dat bedoeld is voor eiwitzuivering, is het raadzaam om de stappen voor alkyne doseringsoptimalisatie uit te voeren die in de volgende sectie (stap 2.9) worden beschreven.
- Klikreactie voor cleavable alkyne dosering optimalisatie
- Bereid vier buisjes met 40 μL van één representatief monster (verkregen in stap 2.6 en geëvalueerd in stap 2.8) en voeg PBS (pH 7,8) toe aan een eindvolume van 120 μL.
- Stel de klikchemiereactie in zoals uitgelegd in stap 2.7, maar voeg deze keer vier verschillende hoeveelheden van de DST-alkyn toe. Voor genoemde alkyn wordt het testen van 5 μM, 15 μM, 30 μM en 60 μM aanbevolen.
- Herhaal stap 2.8 om te beslissen welke de meest geschikte alkyndosering is voor de specifieke experimentele vraag die wordt bestudeerd, op basis van de hoogste etiketteringsefficiëntie met het laagste achtergrondsignaal.
OPMERKING: Voordat de resterende monsters aan een klikreactie worden onderworpen, moet de optimale hoeveelheid alkyn worden bepaald. Er zijn verschillende opties van in de handel verkrijgbare alkynes die kunnen worden gebruikt. Ze verschillen in de manier van decolleté (bijvoorbeeld licht of reductiemiddelen). Kopervrije klikchemie met behulp van rekpropagerende reagentia (bijv. DBCO-reagentia) is ook mogelijk. Kleine veranderingen in de hoeveelheid alkynen of DBCO-reagentia verhogen vaak het signaal in de negatieve controle (achtergrond) aanzienlijk. Hier wordt de eiwitzuivering beschreven met behulp van een alkyn met een disulfidebrug die kan worden gesplitst door reductiemiddelen (Disulfide biotine alkyne of DST-alkyne15). Vermijd bij gebruik van de DST-alkyne voor het uitvoeren van de SDS-PAGE (stap 8.1) belastingsbuffers met sterke reductiemiddelen zoals DTT of β-Mercaptoethanol om alkynsplitsing te voorkomen. In dit onderzoek heeft verhitting bij 72 °C, gedurende 5 minuten, met 5 mM N-ethylmaleimide (NEM) in de laadbuffer geen invloed op de stabiliteit van DST-alkyn. Stap 2.9.2 kan worden herhaald, waarbij meer fijnkorrelige doseringen worden getest in het bereik van de beste waargenomen doseringen.
- Preparatieve klikreactie voor eiwitzuivering
- Klik op alle monsters verkregen in stap 2.6 met de optimale alkyn dosering bepaald in stap 2.9 en analyseer een fractie door SDS-PAGE en Western blot (stap 2.8).
OPMERKING: Zorg ervoor dat de pipetten correct zijn gekalibreerd om de nauwkeurigheid van de opschaling van het monster te garanderen. Aangeklikte monsters kunnen enkele maanden bij -80 °C worden bewaard (stoppunt).
- Klik op alle monsters verkregen in stap 2.6 met de optimale alkyn dosering bepaald in stap 2.9 en analyseer een fractie door SDS-PAGE en Western blot (stap 2.8).
3. Eiwitzuivering
- Buffer uitwisseling
- Onderwerp alle aangeklikte monsters aan een bufferuitwisselingsprocedure zoals beschreven in stap 2.6, maar gebruik Neutravidine-bindingsbuffer als equilibratiebuffer (PBS pH 7,4, 0,15% (wt/vol) SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100 en PI (1:2000)).
OPMERKING: Eluted monsters kunnen gedurende enkele maanden bij -80 °C worden bewaard (stoppunt). In deze stap wordt het niet-geklikte vrije alkyn geëlimineerd en wordt de buffer uitgewisseld door de Neutravidine-bindingsbuffer.
- Onderwerp alle aangeklikte monsters aan een bufferuitwisselingsprocedure zoals beschreven in stap 2.6, maar gebruik Neutravidine-bindingsbuffer als equilibratiebuffer (PBS pH 7,4, 0,15% (wt/vol) SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100 en PI (1:2000)).
- Binding aan Neutravidin kralen
- Was de Neutravidin-kralen met hoge capaciteit met de Neutravidine-bindingsbuffer (zie stap 3.1); meng de kralen met de buffer en centrifugeer het mengsel gedurende 5 minuten bij 3000 x g en gooi het supernatant weg. Herhaal dit drie keer.
- Bereid een 1:1 slurry van Neutravidin kralen door hetzelfde volume droge kralen en Neutravidine binding buffer toe te voegen.
- Leg 20-40 μL van elk monster opzij als voorgezuiverd lysaat en bewaar het bij -20 °C.
- Meet de eiwitconcentratie (zie stap 2.4) en meng 100 μg eiwit met 4 μL van de in stap 3.2.2 verkregen kraaldrijfmest.
- Incubeer het mengsel een nacht bij 4 °C met continue rotatie, waardoor gelabelde eiwitten aan de kralen kunnen binden.
OPMERKING: Wat de klikchemiereactie betreft, kan de basisaffiniteitszuiveringsreactie zoals beschreven in stap 3.2.4 worden opgeschaald. Voor de zuivering van eiwitten uit de exciterende neuronen van de hippocampus wordt bijvoorbeeld 1 mg eiwitlysaat gemengd met 40 μL Neutravidine-kralen (1:1 slurry). De hoeveelheid Neutravidine-kralen kan omhoog of omlaag worden geschaald op basis van de hoeveelheid gelabelde eiwitten per mg totaal eiwit, die afhankelijk is van het gekozen celtype en de etiketteringsperiode en empirisch moet worden bepaald.
- Neutravidine kralen wast en eiwit elutie
- Verzamel de supernatanten door centrifugeren (zie stap 3.2.1). Zet een aliquot van 20-40 μl van elk supernatant opzij voor latere analyse en vries de rest in bij -80 °C.
- Was de kralen met gekoelde Neutravidine wasbuffer 1 (PBS pH 7,4, 0,2% (wt/vol) SDS, 1% (vol/vol) Triton X-100 en PI (1:2000)) door de buffer toe te voegen, de kralen te bezinken en het supernatant weg te gooien. Herhaal deze stap drie keer.
- Voeg vervolgens dezelfde buffer toe en incubeer de kralen gedurende 10 minuten onder continue rotatie bij 4 °C voordat u het supernatant weggooit. Herhaal deze stap drie keer.
- Was de kralen zoals uitgelegd in stap 3.3.2-3.3.3, maar gebruik Neutravidine wasbuffer 2 (1x PBS, pH 7.4 en PI 1:2000).
- Was de kralen zoals uitgelegd in stap 3.3.2-3.3.3, maar gebruik Neutravidine wasbuffer 3 (50 mM ammoniumbicarbonaat en PI 1:2000).
- Eluteer de aangeklikte eiwitten door de kralen gedurende 30 minuten bij 20 °C te incuberen met een volume Neutravidine-elutiebuffer (5% (vol/vol) β-mercaptoethanol en 0,03% (wt/vol) SDS) dat overeenkomt met één volume van de gebruikte droge kralen.
- Houd de kralen in suspensie tijdens elutie door continue agitatie (1000 rpm) in een thermoblock shaker. Elute twee keer en combineer beide eluaten.
OPMERKING: De centrifugatie die is ingesteld voor de scheiding van de vaste fractie van de slurry (kralen) en de waterige fase (supernatant), zoals uitgelegd in stap 3.2.1, is van toepassing op stap 3.3.1-3.3.7. De SDS-hoeveelheid kan worden verhoogd als de eiwitelution niet volledig is. Echter, met hoeveelheden boven 0,08% -0,1% van sds, eiwitten die niet-specifiek gebonden zijn aan de kralen beginnen te worden geëlueerd. β-mercaptoethanol vluchtig en giftig is; het gebruik van een kap voor stappen 3.3.6-3.3.7 is raadzaam. De monsters die in de stappen 3.2.3 en 3.3.1 worden verzameld, moeten door SDS-PAGE worden uitgevoerd en door Western blot worden geëvalueerd (zie stap 2.8) om de efficiëntie van de affiniteitszuivering te evalueren (stap 3.3).
- Evaluatie van geëlueerde eiwitten
- Laad 1/3 van de geëlueerde monsters op een SDS-PAGINA (zie stap 2.8.1).
- Kleur de gel om eiwitten te visualiseren met behulp van een zeer gevoelige methode, zoals zilverkleuring of een fluorescerende methode.
- Als de monsters de verwachte kwaliteit hebben, wat betekent dat er 3-4 keer meer eiwit in de ANL-gelabelde monsters zit in vergelijking met de negatieve controle, kunnen de geëlueerde eiwitten worden geïdentificeerd door routinematige massaspectrometriemethoden zoals die in referentie5 worden uitgelegd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens het beschreven protocol (samengevat in figuur 1) werd ANL toegediend aan muizen, hetzij door dagelijkse intraperitoneale injecties (400 mM ANL 10 ml/kg, Nex-Cre::MetRS*) gedurende 7 dagen, of via drinkwater (0,7% Maltose, 1% ANL, CamkII-Cre::MetRS*) gedurende 21 dagen. Na het labelen werden de overeenkomstige hersengebieden ontleed, gelyseerd, gealkyleerd en geklikt. Klikreacties werden geanalyseerd door SDS-PAGE en Western Immunoblot. Representatieve beelden van de experimenten worden weergegeven in figuur 2 voor ANL-toediening via IP-injectie en in figuur 3 voor ANL-toediening via drinkwater. Merk op dat het doel van de cijfers is om aan te tonen dat beide etiketteringsprotocollen werken, niet om ze te vergelijken. Vergelijking is niet mogelijk omdat verschillende neuronale populaties worden gelabeld in de twee getoonde experimenten (exciterende neuronen van de hippocampus en cortex, en de Purkinje-neuronen van het cerebellum).
Een ander experiment geeft een voorbeeld voor de bepaling van de optimale DST-splijtbare alkynconcentratie (figuur 4). In dit voorbeeld is de vouwverandering tussen gelabeld monster en controle het hoogst bij een alkynconcentratie van 14 μM. Deze alkynconcentratie wordt vervolgens op alle monsters toegepast. Na verificatie van de etikettering van elk monster in het experiment met de gekozen hoeveelheid alkyn, werden alle monsters onderworpen aan de zuivering van ANL-gelabelde / biotine-geklikte eiwitten door affiniteitsbinding met behulp van Neutravidine-kralen (figuur 5). In deze stap worden eiwitten aan de kralen gebonden, gewassen en vervolgens geëlueerd door de disulfidebrug in de DST-alkyn te verminderen. Na deze laatste stap blijven de biotine en een deel van het alkyn gebonden aan de kralen. De ANL-bevattende eiwitten (gebonden aan de rest van het alkyn) worden teruggewonnen in de elutiebuffer. Om de efficiëntie van de elutiestap te evalueren, wordt een derde van het eluaatvolume op een SDS-PAGE-gel geladen en gevisualiseerd met behulp van een gevoelige totale eiwitkleuringsmethode. Ten minste een 3-voudig intensiteitsverschil van totale eiwitvlek tussen negatieve controles en ANL-gelabelde monsters moet worden waargenomen om interpreteerbare resultaten te bereiken met massaspectrometrie. De voltooiing van alle stappen die in dit protocol worden beschreven, wordt gevolgd door de voorbereiding, acquisitie en analyse van MS-monsters5. Hoewel er geen speciale vereisten zijn voor MS (elk laboratorium kan zijn routinematige MS-protocol 5,10 gebruiken), moet er rekening mee worden gehouden dat de hoeveelheid gezuiverde eiwitten over het algemeen laag zal zijn (in de volgorde van nanogram). Figuur 6 geeft een voorbeeld van MS-resultaten met een duidelijke verrijking in het ANL-gelabelde monster in vergelijking met de controle (figuur 6A). Dit verschil was al zichtbaar in de totale eiwitvlek in figuur 5. Naast veranderingen in peptide-intensiteit zijn er ook unieke eiwitten gevonden in beide monsters (figuur 6B).
Figuur 1: Werkpijplijn voor celtypespecifieke eiwitzuivering door BONCAT. Na eiwitetikettering met ANL wordt het weefsel van belang ontleed en gelyseerd, gelabeld met biotine door klikchemie en de hoeveelheid etikettering voor elk monster wordt geëvalueerd door BONCAT. Uitschieters (die anl niet bevatten) en representatieve steekproeven kunnen in deze stap worden gedifferentieerd. Een van de representatieve monsters wordt opnieuw aangeklikt om de geoptimaliseerde splijtbare alkyndosering te vinden voor daaropvolgende eiwitzuivering. De alkyndosering die de beste signaal-ruisverhouding bereikt, wordt toegepast op elke biologische replicaat. Celtypespecifieke eiwitten worden verkregen door affiniteitszuivering. Gezuiverde monsters worden bestudeerd door massaspectrometrie en eiwitten worden geïdentificeerd. Dit cijfer is aangepast van Alvarez-Castelao et al. (2017)6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: ANL-toediening via intraperitoneale injecties (IP). BONCAT werd uitgevoerd om eiwitetikettering in de hippocampus (HP) en cortex (CX) te evalueren na metabole etikettering van eiwitten met ANL door dagelijkse IP-injecties gedurende 7 dagen. Wild-type muizenmonsters als negatieve controle (wt) werden parallel aan de gelabelde monsters (MetRS*) geklikt. Gelabelde eiwitten zijn afkomstig van de exciterende neuronen met behulp van een Nex-Cre::MetRS* lijn16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: ANL-toediening door drinkwater. BONCAT werd uitgevoerd om eiwitetikettering in de Purkinje-neuronen van het cerebellum te evalueren na toediening van ANL aan GAD-Cre::MetRS*-muizen via drinkwater gedurende 21 dagen. De figuur toont een negatief besturingselement (wt) en een gelabeld monster (MetRS*) dat parallel wordt gelyseerd en geklikt. Dit cijfer is aangepast van Alvarez-Castelao et al. (2017)6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: DST-alkyn dosering titratie. Eén biologische replicatie per experiment wordt gekozen als een representatief monster om de optimale alkynconcentratie te titreren. Drie concentraties (14, 28 en 56 μM) van het alkyn werden hier getest in de klikreactie voor BONCAT. De labelverhouding tussen het ANL-gelabelde monster (MetRS*) en de negatieve controle (wt) bepaalt de signaal-ruisverhouding (weergegeven in de grafiek). 14 μM is de beste alkynconcentratie die in dit experiment wordt verkregen. Voor dit experiment werd cortexweefsel van de ANL-gelabelde Nex::MetRS*-muislijn gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Gezuiverde eiwitten. Gelabelde eiwitten van Purkinje neuronen werden gezuiverd en gekleurd met behulp van SYPRO Ruby. Dit cijfer is aangepast van Alvarez-Castelao et al. (2017)6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Eiwitidentificatie en kwantificering. Het Purkinje-celproteoom werd verkregen door massaspectrometrie met behulp van cerebellum uit een GAD-Cre::MetRS* muislijn als uitgangsmateriaal. (A) toont verhoogde abundanties (peptide-intensiteit) van de geïdentificeerde eiwitten in ANL-gelabelde monsters in vergelijking met wild-type (wt) muizen. (B) Het Purkinje-proteoom werd verkregen door eiwitten verrijkt in de ANL-gelabelde monsters in A (gedefinieerd door >3-voudige intensiteiten in MetRS* muizen in vergelijking met wt) en unieke eiwitten in de MetRS*-expresserende muizen te bundelen. Dit cijfer is aangepast van Alvarez-Castelao et al. (2017)6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritische aspecten van het protocol zijn; de opname van negatieve controles, met voldoende biologische replicaties, ANL-toedieningsroute, hoeveelheid en duur, alkylering van de monsters, alkynconcentratie en eliminatie van β-mercaptoethanol bij gebruik van DST-alkyn.
Het is van cruciaal belang om negatieve controlemonsters op te nemen die afkomstig zijn van ANL-gelabelde dieren zonder Cre-driver en dus geen MetRS*-expressie. Deze monsters moeten worden onderworpen aan elke stap die in het protocol wordt beschreven, parallel aan de monsters van ANL-gelabelde Cre-geïnduceerde MetRS*-muizen. Niet-aangeklikte voorbeelden zijn geen geldige besturingselementen, omdat alle resultaten die alleen met dit besturingselement worden bereikt, te wijten kunnen zijn aan niet-specifieke klikken. We hebben geen opname van ANL waargenomen in cellen die het MetRS*-gen niet tot expressie brengen, noch MetRS*-expressie in cellen zonder Cre; wt-dieren die zijn gelabeld met ANL kunnen dus worden gebruikt als een negatieve controle.
Aangezien het hierbij beschreven protocol bestaat uit vele stappen waarbij monsters verloren kunnen gaan, is het aan te raden om biologische replicaties te berekenen met technisch falen in het achterhoofd. Voor hersenmonsters is er ongeveer 30% replicatieverlies.
We beschrijven hier twee ANL-toedieningsroutes en -duur. Dit sluit niet uit dat andere toedieningsroutes (bijvoorbeeld het toevoegen van ANL aan het voedsel) even goed werken. Met betrekking tot de toegediende ANL-hoeveelheid werden de hier getoonde experimenten uitgevoerd met relatief hoge hoeveelheden ANL. Labeling met lagere hoeveelheden is ook mogelijk, afhankelijk van de experimentele opstelling. De kortste tijdspanne van ANL-etikettering die in dit protocol wordt gerapporteerd, is 1 week en de langste 21 dagen. Kortere of langere etiketteringsperioden kunnen worden toegepast, maar we hebben het niet bepaald. Onderzoekers moeten de ANL-toedieningsroute, ANL-dosering en ANL-etiketteringsperiode bepalen die geschikt is voor de specifieke experimentele vraag die wordt bestudeerd door rekening te houden met de metabole eigenschappen van het weefsel, het celtype van interesse en de experimentele vraag die wordt bestudeerd.
Monsteralkylering, ook bekend als capping, is een belangrijke stap om achtergrondklik17 te voorkomen. Wanneer alkylering correct wordt uitgevoerd, wordt de niet-specifieke klik zoals gecontroleerd door de controlemonsters verminderd en is het verschil tussen de negatieve controle en ANL-gelabelde monsters groter. Eliminatie van vrije IAZ na alkylering is ook een belangrijke stap. De aanwezigheid van kleine hoeveelheden IAZ tijdens de klikreactie zal de efficiëntie ervan beperken. Af en toe moet de ontzoutingsstap die ook IAZ elimineert (stap 2.6), worden herhaald om een goede verwijdering van IAZ te garanderen.
Er zijn verschillende biotine-alkynen en -DBCO-reagentia in de handel verkrijgbaar bij verschillende bedrijven. De belangrijkste verschillen tussen hen hebben betrekking op de polyethyleenglycol (PEG) linkerketenlengte en de afwezigheid, aanwezigheid en het type splitsbare groepen. Ongeacht het gebruikte type, leiden overtollige hoeveelheden alkyn tot niet-specifieke klik op eiwitten die alleen natuurlijke aminozuren bevatten. Dit kan eenvoudig worden voorkomen door nauwkeurige en zorgvuldige titratie van de hoeveelheid alkyn. Zoals beschreven, is de beste manier om dit te bereiken het gebruik van de werkelijke gelyseerde en gealkyleerde monsters die worden gebruikt in de daaropvolgende eiwitzuiveringsstappen (stap 2.6) en massaspectrometrieanalyse.
Wanneer DST-alkynen worden gebruikt in de klikreactie, vermindert β-mercaptoethanol de disulfidebrug en dissocieert de gelabelde eiwitten van de kralen in de elutiestap (stap 3.3). β-mercaptoethanol moet uit de monsters worden verwijderd om de enzymatische vertering mogelijk te maken die nodig is voor MS. Er zijn verschillende manieren om dit te doen (bijv. lyofilisatie18, excisie uit een gel19 of reiniging met behulp van S-Trap kolommen20), en de keuze moet worden gemaakt door het MS-laboratorium dat de monsters verwerkt.
Wijzigingen en probleemoplossing van de methode moeten worden gericht op het optimaliseren van de kritieke stappen die in het protocol worden genoemd. Als er bijvoorbeeld te veel variabiliteit is, voeg dan meer biologische replicaties toe; als de etikettering te laag is, verhoog dan de ANL-concentratie, gebruik langere etiketteringstijdsspannes of test andere ANL-toedieningsroutes die efficiënter kunnen zijn voor het bestudeerde weefsel. Voor eiwitalkylering zou een eerdere reductiestap naar de toevoeging van IAZ kunnen worden geïmplementeerd.
De belangrijkste beperking van de methode is de zuivering van proteomen die voortkomen uit kleine celpopulaties, zelfs als een klein weefselgebied wordt ontleed. Proteomen van talrijkere celpopulaties die echter verspreid zijn over grotere weefselgebieden zijn ook moeilijk toegankelijk. Niettemin kan de hier beschreven in vivo etiketteringstechniek nog steeds worden toegepast om de verwezen celtypen te beoordelen door middel van beeldvorming (bijvoorbeeld met FUNCAT of FUNCAT-PLA21).
Deze methode is momenteel de enige methode die beschikbaar is voor in vivo studie van celtypespecifieke proteomen op basis van volledige eiwitten en voor in situ visualisatie van celtypespecifieke complete eiwitten. Andere niet-canonieke aminozuren zoals azidohomoalanine (AHA) kunnen ook worden gebruikt voor in vivo eiwitetikettering en zuivering van proteomen, maar missen celtypespecificiteit22,23. Andere benaderingen zoals puromycine zijn geschikt om een vast beeld te geven van de eiwitsynthese24,25. Niettemin is het gebruik van niet-canonieke aminozuren voor langere perioden van etikettering mogelijk, wat ook de eiwitafbraak weerspiegelt en een nauwkeuriger cellulair proteoom laat zien. BioID-gebaseerde methoden worden gebruikt om eiwitten in specifieke subcellulaire regio's te identificeren, ongeacht hun moment / plaats van synthese26.
In de muislijn die we hebben vastgesteld (verkrijgbaar bij Jackson Lab, voorraadnummer 028071), wordt de mutant methionine-tRNA-synthetase (MetRS *) die de opname van ANL in de cellen mogelijk maakt, op een Cre-afhankelijke manier tot expressie gebracht. Met deze muislijn als hulpmiddel is het mogelijk om de MetRS* uitsluitend uit te drukken in celtypen waarvoor Cre-driver lijnen beschikbaar zijn. Deze opstelling geeft de methode een aanzienlijke veelzijdigheid, waardoor deze nuttig is op bijna elk gebied van biomedisch onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
B.A-C wordt gefinancierd door het Spaanse ministerie van Wetenschap en Innovatie (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), door de autonome gemeenschap Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) en MICINN (PID2020-113270RA-I00) subsidies. R. A-P wordt gefinancierd door de autonome gemeenschap Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). E.M.S. wordt gefinancierd door de Max Planck Society, een Advanced Investigator award van de European Research Council (grant 743216), DFG CRC 1080: Molecular and Cellular Mechanisms of Neural Homeostasis en DFG CRC 902: Molecular Principles of RNA-based Regulation. Wij danken D.C. Dieterich en P. Landgraf voor hun technisch advies en de synthese van de DST-Alkyne. We bedanken E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast en de dierenfaciliteit van de MPI for Brain Research voor hun uitstekende ondersteuning. Wij danken Sandra Goebbels voor het delen van de Nex-Cre muislijn. Wij danken Antonio G. Carroggio voor zijn hulp bij de Engelse redactie. B.A-C. ontworpen, uitgevoerde en geanalyseerde experimenten. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E., en S.t. D. voerde experimenten uit en analyseerde deze. B.A-C en E.M.S. ontwierpen experimenten en begeleidden het project, B.A-C schreef het artikel. Alle auteurs redigeerden het artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12% Acrylamide gels | GenScript | SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12% | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood |
| ANL | Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11) | ||
| ANL-HCl | IrishBotech | HAA1625.0500 | |
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Biotin alkyne | Thermo, | B10185 | |
| Chicken antibody anti-GFP | Aves | 1020 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor | Roche | 4693132001 | Toxic; use a lab coat and gloves. |
| Copper (I) bromide | Sigma | 254185 | 99.999% (wt/wt) |
| Disulfide tag (DST)-alkyne | Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20 | ||
| DMSO | Sigma | 276855 | |
| Filters | Merk | SCGP00525 | |
| Iodo acetamide (IAA) | Sigma | I1149 | |
| IR anti chicken 800 | LI-COR | IRDye 800CW | Donkey anti-Chicken Secondary Antibody |
| IR anti rabit 680 | LI-COR | IRDye 680RD | Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody |
| Maltose | Sigma | M9171 | |
| Manual Mixer | BioSpec Products | 1083 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | 4259 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| NeutrAvidin beads | Pierce | 29200 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 1620112 | |
| PBS 1X | Thermo | J62036.K2 | |
| PBS 1X pH 7.8 | Preparation described in reference number 5 | ||
| PD SpinTrap G-25 columns | GE Healthcare | Buffer exchange | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo, | 23225 | Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life. |
| Polyclonal rabbit anti-biotin antibody | Cell Signaling | 5597 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| SDS 10% | Sigma | 71736 | |
| SDS-PAGE Running buffer MOPS | GenScript | M00138 | |
| SYPRO Ruby stain | Sigma | S4942 | |
| Table automatic Vortexer | Eppendorf | Mixmate | |
| Triazole ligand | Sigma | 678937 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Water | Sigma | W4502 | Molecular biology grade |
References
- Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M.
- Sutton, M. A., Schuman, E. M. Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory. Cell. 127 (1), 49-58 (2006).
- Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons. Elife. 9, 52939 (2020).
- Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. Memory in mice as affected by intracerebral puromycin. Science. 141 (3575), 57-59 (1963).
- Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo. Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).
- Alvarez-Castelao, B., et al. Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo. Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).
- Ngo, J. T., et al.
- Mahdavi, A., et al. Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis. Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).
- Yuet, K. P., et al. Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).
- Patel, V. J., et al. A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).
- Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer. Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).
- Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes. Methods in Molecular Biology. 1266, Clifton, N.J. 199-215 (2015).
- Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L.
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).
- Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
- Goebbels, S., et al. Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice. Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).
- van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).
- O'Fagain, C.
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).
- tom Dieck, S., et al. Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ. Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).
- McShane, E., et al. Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation. Cell. 167 (3), 803-815 (2016).
- Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome. Scientific Reports. 6, 32377 (2016).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. BioID: A screen for protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).
