Summary
このプロトコルでは、変異型L274G-メチオニンtRNA合成酵素(MetRS*)を発現するマウス株を使用して、アジドノールロイシン(ANL)による細胞種特異的タンパク質標識を実行する方法と、標識された細胞種特異的タンパク質の単離に必要な手順について説明します。生きたマウスにおける2つの可能なANL投与経路を、(1)飲料水と(2)腹腔内注射によって概説します。
Abstract
in vivoでのタンパク質恒常性を理解することは、生理学的条件と疾患状態の両方で細胞がどのように機能するかを知るための鍵です。本プロトコルは、タンパク質標識を特定の細胞集団に向けるために改変されたマウス系統を使用して、新たに合成されたタンパク質のin vivo標識およびその後の精製を記載する。これは、L274G-メチオニンtRNA合成酵素(MetRS*)のCreリコンビナーゼ発現による誘導可能な系統であり、他の方法では起こらないタンパク質へのアジドノルロイシン(ANL)の取り込みを可能にします。ここで説明した方法を使用すると、in vivoで標識された細胞種特異的プロテオームを精製し、サンプルの複雑さの減少によるタンパク質含有量の微妙な変化を検出することができます。
Introduction
異常なタンパク質恒常性は、タンパク質の合成と分解の不均衡によって引き起こされます。いくつかの疾患は、タンパク質恒常性の変化に関連しています。いくつかの疾患の特徴は、異なる細胞内位置および脳領域に凝集体が存在することです。タンパク質の恒常性は、疾患において重要であるだけでなく、正常な臓器および細胞機能においても重要な役割を果たします1。例えば、タンパク質合成は、タンパク質合成を阻害する化学阻害剤の使用によって決定されるように、多くの形態のニューロン可塑性2,3に必要である4。しかし、学習と記憶をサポートするためにプロテオームがどの細胞型で変化しているかは明らかではなく、各細胞型のどの特定のタンパク質がそれらの合成または分解において増加または減少するかも理解されていません。したがって、タンパク質の恒常性を包括的に研究するには、特定の細胞型に由来するプロテオームを区別する能力が必要です。実際、多細胞環境で起こる細胞プロセスを研究するための細胞種特異的プロテオームの同定は、プロテオミクスにおける重要なハードルでした。このため、MetRS*発現と生体直交法を組み合わせた技術を開発し、細胞型特異的プロテオームを同定および精製する効果的な方法であることが証明され、このギャップを埋めました5,6,7。
変異体MetRS*(MetRS L274G)の発現により、非標準的なメチオニン類似体ANLを対応するtRNA 8,9にロードし、その後タンパク質に組み込むことができます。MetRS*発現が細胞型特異的プロモーターによって調節されると、非標準アミノ酸が細胞選択的にタンパク質に取り込まれます。ANLがタンパク質に組み込まれると、クリックケミストリーによって選択的に機能化され、その後、イメージング(FUNCAT)またはウエスタンイムノブロット(BONCAT)によって視覚化されます。あるいは、タンパク質を選択的に精製し、質量分析(MS)によって同定することができる。この技術を用いて、Creリコンビナーゼの制御下でMetRS*タンパク質を発現するマウス株を作製しました。利用可能なCreマウス株の数が増えていることを考慮すると、MetRS*システムは、既存のCre-lineが存在するあらゆる組織からあらゆる細胞タイプを研究するために、あらゆる分野で使用することができます。ANLによるタンパク質標識は、in vitroまたはin vivoで可能であり、マウスの行動やタンパク質の完全性を変化させません6。標識期間は、各研究者の科学的問題に適合させることができ、新しく合成されたタンパク質(より短い標識時間)またはプロテオーム全体(より長い標識時間)を標識します。この技術の使用は、研究者が研究を希望するタイプの細胞の数によって制限されます。したがって、この方法では、数が少ない、または代謝率が低い細胞型からのタンパク質の単離は不可能です。提示された方法の目標は、in vivoで標識された細胞型特異的タンパク質/プロテオームを特定することです。このプロトコルでは、生きたマウスで細胞種特異的プロテオームをANLで標識し、標識タンパク質を精製する方法について説明しています。精製後、タンパク質は、ルーチン質量分析プロトコル5、10によって同定することができる。特定の細胞集団からのタンパク質の選択的精製によってこの方法において達成される試料の複雑さの低減は、例えば環境変化に応答して、プロテオームの微妙な変化を検出することを可能にする。標識タンパク質の精製は、MS分析や標識期間を含まない~10日で達成できます。ここでは、MetRS*発現マウスへのANL投与の2つの方法、すなわち(1)飲料水にアミノ酸を添加する方法と、(2)腹腔内注射によるANLの導入方法について説明する。ANL投与に選択した方法に関係なく、分離および精製のステップは同じです(ステップ2以降)。
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Protocol
動物を用いたすべての実験は、ドイツ(RP Darmstadt、プロトコル:V54-19c20/15-F122/14、V54-19c20/15-F126/1012)またはスペイン(UCMの動物実験委員会およびマドリッド市環境カウンセリング、プロトコル番号:PROEX 005.0/21)の許可を得て実施され、マックスプランク協会の規則およびスペインの規制に準拠し、動物福祉に関するEUガイドラインに準拠しています。
1. ANLによる 生体内 代謝標識
- 飲料水：
- ANLとマルトースをマウスの通常の飲料水に溶かします。推奨されるマルトース濃度は0.7%(wt /体積)です。.飲料水に添加されるANLの最大量は1%(wt / vol)です。混合物の準備ができたら、ろ過して滅菌し、4°Cで保管します。
- ステップ1.1で調製した混合物をマウスに提供します。汚染を避けるためにボトルを頻繁に(たとえば、3日ごと)交換し、汚染や目詰まりの可能性がないか毎日チェックしてください。マウスのANL摂取量を知るために、毎日それを計量することによって飲んだ水の量を監視します。
注:ここで評価された最大標識期間は、飲料水中の1%のANL濃度を使用して3週間であり、その結果、脳内で十分に検出可能な標識が得られました。良好なラベリングも2週間で達成できます。より短いラベリング時間、より長い時点、または他のANL量は、この投与方法を使用して当社によって研究されておらず、前述のことが機能しないことを意味するものではありません。ANLの取り込み率は、研究対象の組織または細胞タイプによって異なります。ラベリングの時間は、科学的な質問によって異なります。例えば、プロテオームを標識する場合、標識時間は、研究対象組織中のタンパク質の平均半減期の関数で計算する必要があります。新しく合成されたタンパク質を特定することだけに関心がある場合は、時間を短縮できます。標識期間とANL投与量は、実験条件と目的の細胞タイプごとに経験的にテストする必要があります。
- 腹腔内投与:
- ANLを生理的NaCl溶液に溶解し、400 mM、リン酸生理食塩水バッファー(PBS)、または水に溶解します。
- 溶液の浸透圧が生理学的範囲内にあることを確認してください。ここでは、10 mL / kg体重のANL溶液をマウスに投与します。
注:脳の興奮性ニューロンにおける良好な標識は、400 mM ANLを1週間1日1回腹腔内注射(IP)することによって首尾よく得られます。この研究では、IPインジェクションによるANL濃度の低下も他の標識期間もテストされておらず、それらが機能しないことを意味するものではありません。ANLは一部の企業から塩酸塩として供給されています。この場合、溶液のpHは適切なpHに調整する必要があります(投与経路によって異なります)。ANLは、Linkら11 によって公開された方法に従って、いくつかの変更を加えて合成することもできます5。ANL標識は、他のANL濃度、タイムスパン、および投与経路を使用して実行できます。代謝率の低い組織/細胞型の場合、ANL投与の1週間前に常に低含有量のメチオニン食を使用できます。.400 mM ANLを使用すると、4°Cで保存している間に沈殿する可能性があります。37°Cまで加熱すると、ANLが溶液に戻ります。注射前に室温に到達させます。世界のほとんどの地域では、マウスへのANL投与は動物実験であり、関係当局の承認が必要です。
2.組織の採取、溶解、およびタンパク質抽出
- 組織解剖:目的の細胞型を含む組織の領域を解剖し、採取した組織片の重量を記録します。
注:サンプルは-80°Cで数ヶ月間保存できます(停止点)。本プロトコールでは、マウス皮質および海馬を解剖した。 - 組織溶解:溶解バッファーの組織の湿重量の12〜15倍の体積を添加して、室温で組織を均質化します(PBS pH 7.4、1%wt / vol SDS、1%(vol / vol)Triton X-100、ベンゾナーゼ(1:1000 vol / vol)、プロテアーゼ阻害剤(PI)(EDTAフリー1:4000))。例えば、20 mgの組織片の場合、240〜300 μLの溶解バッファーを追加します。均質になるまで組織を粉砕します。
注:サンプルは-80°Cで数ヶ月間保存できます(停止点)。1.5 mLチューブでの直接均質化には、特に小さな組織片を処理する場合は、ハンドヘルドの電池式ホモジナイザーの使用をお勧めします。より大きな作品の場合は、Dounceホモジナイザーを使用できます。プロテアーゼ阻害剤(PI)を含むすべてのバッファーには、使用前ではなく使用直前に添加する必要があります。 - タンパク質変性:ホモジネートを75°Cで15分間加熱し、17,000 x g で10°Cで15分間遠心分離します。 上清を新しいチューブに移します。
- タンパク質含有量測定:各サンプルのタンパク質濃度を測定し、同じタンパク質濃度と比較するすべてのサンプルを調整します。溶解バッファーを加えて濃度を調整します。最適な濃度範囲は2〜4μg/μLです。
注:サンプルは-80°Cで数ヶ月間保存できます(停止点)。 - アルキル 化
- 均質化したサンプルをPBS(pH 7.8)+ PI(EDTAフリー1:4000)で2〜3倍希釈します。
- ヨードアセトアミド(IAA)を最終濃度20 mM(原液500 mM)まで添加します。
- サンプルを暗所で20°Cで1〜2時間放置します。手順 2.5.2-2.5.3 を 2 回実行します。
注:一部の組織では、陰性対照の非特異的クリックが高いままである場合、アルキル化12の前に還元ステップを実行する必要がある場合があります。IAAストックは、サンプルに追加する直前に新たに準備します。サンプルは-80°Cで数ヶ月間保存できます(停止点)。
- バッファー交換:クリックケミストリー交換バッファー(PBS pH 7.8、0.04% (wt/vol) SDS、0.08% (vol/vol) Triton X-100 および PI (1:4000)) を使用してバッファー交換カラムを平衡化します。製造元の指示に従ってください。すべてのアルキル化サンプルを交換します。
注:溶出したサンプルは、-80°Cで数ヶ月間保存できます(停止点)。このステップでは、IAAが除去され、バッファがクリックケミストリーバッファによって交換されます。バッファー交換プロセス中にタンパク質が失われていないことを確認するために、バッファー交換ステップの後にタンパク質を再度測定できます。バッファー交換に使用されるカラムの種類によっては、タンパク質が大幅に失われる可能性があります。タンパク質の損失を避けるために、推奨されるカラムを使用してください。サンプル保存には、アリコートの調製をお勧めします。 - 反応をクリックして、実験へのANLの組み込みを評価します
- ステップ2.6で溶出したサンプルを40 μL採取し、PBS(pH 7.8)を最終容量120 μLまで加えます。
- クリックケミストリー反応を設定するには、次の試薬を所定の順序で添加し、各添加後に20秒間渦巻きます:1.5 μLのトリアゾールリガンド(ストック40 mM)、1.5 μLのビオチンアルキン(ストック5 mM)、および1 μLの臭化Cu(I)(ストック10 mg / mL、慎重に上下にピペッティングしてDMSOに溶解)。 渦を巻かないでください)。できるだけ早く試薬を追加します。
- サンプルを4°Cの暗所で一晩インキュベートし、連続回転させます。
- サンプルを4°Cで17,000 x gで5分間遠心分離します。わずかにターコイズブルーのペレットが見えます。上清を新しいチューブに移します。
注意: 銅の酸化を避けるために、使用直前に臭化Cu(I)ストックを準備してください。溶解したサンプルとPBSの間の体積の比率をサンプル間で一定に保つことは、各チューブ内の最終的な洗剤濃度を同じに保つために不可欠です。クリック化学反応の組み立てをスピードアップするために、チューブ用のラックを備えたテーブルボルテクサーが推奨されます。クリックしたサンプルを-80°Cで数か月間、または-20°Cで数週間保存して、さらに処理します(停止点)。
- 実験におけるANLの取り込みを評価するためのウェスタンブロット解析
- クリック化学反応からの上清20〜40 μLでSDS-PAGEを実行します(ステップ2.7)。12%アクリルアミドゲルを使用し、1% SDS、250 mM Tris-HCl、2 mMグリシンで実行します。前面がゲルから外れるまで実行します。
- タンパク質をニトロセルロースまたはPVDF膜13に移す。
- メンブレンをGFP抗体(1:500、GFPタンパク質はMetRS*5と共翻訳)、ビオチンに結合させたクリックアルキン検出用のビオチン抗体(1:1000)を用いて4°Cで一晩インキュベートします。
- 一次抗体を2回10分間洗浄し、二次抗体を1.5時間添加します。
- 二次抗体を2回10分間洗浄し、スキャンするか(蛍光色素標識抗体を使用する場合)、フィルムにさらします(西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体を使用する場合)。
- ImageJまたは同様のソフトウェアを使用してビオチンシグナルを定量し、実験の各サンプルの一般的な標識を評価し、可能性のある外れ値を検出します。実験の信号対雑音比(ネガティブコントロールからのバックグラウンドに対するANLサンプルの標識)を評価し、ANLを取り込み/組み込むことができなかった可能性のある動物を検出します。
注:ANLの取り込みが高いサンプルの場合、ANLの取り込みの評価にこのセクションで使用されているような切断不可能なアルキンを使用してタンパク質の精製が理論的に可能です。脳試料を用いて、非開裂性アルキンを用いたタンパク質精製後のMSによる陰性対照で得られたバックグラウンドは高すぎる14。したがって、取り扱いが簡単で切断不可能なアルキンのみを最初の一般的なサンプルおよび実験評価に使用しました。タンパク質精製を目的としたアルキンの種類にかかわらず、次のセクションで説明するアルキン投与量最適化の手順を実行することをお勧めします(ステップ2.9)。
- 切断可能なアルキン投与量の最適化のためのクリック反応
- 代表的なサンプル(ステップ2.6で取得し、ステップ2.8で評価)を40 μL入れたチューブを4本用意し、最終容量120 μLになるようにPBS(pH 7.8)を加えます。
- ステップ2.7で説明したようにクリック化学反応を設定しますが、今回は4つの異なる量のDST-アルキンを追加します。上記のアルキンについては、5 μM、15 μM、30 μM、および60 μMのテストが推奨されます。
- ステップ2.8を繰り返して、最も高い標識効率と最も低いバックグラウンドシグナルに基づいて、研究中の特定の実験課題に最も適したアルキン投与量を決定します。
注:残りのサンプルをクリック反応にかける前に、アルキンの最適量を決定する必要があります。使用できる市販のアルキンにはいくつかの選択肢がある。それらは切断の方法が異なります(例えば、光または還元剤)。ひずみ促進試薬(DBCO試薬など)を用いた銅フリークリックケミストリーも可能です。アルキンまたはDBCO試薬の量のわずかな変化は、多くの場合、ネガティブコントロール(バックグラウンド)のシグナルを大幅に増加させます。ここでは、還元剤により開裂可能なジスルフィド架橋を有するアルキン(ジスルフィドビオチンアルキンまたはDST-アルキン15)を用いたタンパク質精製について説明する。DST-アルキンを使用する場合、SDS-PAGE(ステップ8.1)を実行するために、アルキン切断を防ぐために、DTTやβ-メルカプトエタノールなどの強力な還元剤を含むバッファーのロードを避けてください。この研究では、ローディングバッファーに5 mMのN-エチルマレイミド(NEM)を使用して72°Cで5分間加熱しても、DST-アルキンの安定性には影響しません。ステップ2.9.2を繰り返して、観察された最良の投与量の範囲でよりきめの細かい投与量をテストすることができます。
- タンパク質精製のための分取クリック反応
- ステップ2.6で得られたすべてのサンプルをステップ2.9で決定された最適なアルキン投与量でクリックし、SDS-PAGEおよびウェスタンブロットによって画分を分析します(ステップ2.8)。
注意: サンプルのアップスケーリング精度を確保するために、ピペットが適切に校正されていることを確認してください。クリックしたサンプルは、-80°Cで数ヶ月間保存できます(停止点)。
- ステップ2.6で得られたすべてのサンプルをステップ2.9で決定された最適なアルキン投与量でクリックし、SDS-PAGEおよびウェスタンブロットによって画分を分析します(ステップ2.8)。
3.タンパク質精製
- バッファ交換
- クリックしたすべてのサンプルをステップ2.6に記載されているバッファー交換手順にかけますが、平衡化バッファーとしてニュートラアビジン結合バッファーを使用します(PBS pH 7.4、0.15%(wt/vol)SDS、1%(vol/vol)Triton X-100およびPI(1:2000))。
注:溶出したサンプルは、-80°Cで数ヶ月間保存できます(停止点)。このステップでは、クリックされていない遊離アルキンが除去され、バッファーがニュートラアビジン結合バッファーによって交換されます。
- クリックしたすべてのサンプルをステップ2.6に記載されているバッファー交換手順にかけますが、平衡化バッファーとしてニュートラアビジン結合バッファーを使用します(PBS pH 7.4、0.15%(wt/vol)SDS、1%(vol/vol)Triton X-100およびPI(1:2000))。
- ニュートラアビジンビーズへの結合
- ニュートラアビジン大容量ビーズをニュートラアビジン結合バッファーで洗浄します(ステップ3.1を参照)。ビーズをバッファーと混合し、混合物を3000 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。3回繰り返します。
- 同量の乾燥ビーズとニュートラアビジン結合バッファーを加えて、ニュートラアビジンビーズの1:1スラリーを調製します。
- 各サンプル20〜40 μLを前精製ライセートとして取っておき、-20°Cで保存します。
- タンパク質濃度を測定し(ステップ2.4を参照)、100 μgのタンパク質をステップ3.2.2で得られた4 μLのビーズスラリーと混合します。
- 混合物を連続回転させながら4°Cで一晩インキュベートし、標識タンパク質がビーズに結合できるようにします。
注:クリック化学反応に関しては、ステップ3.2.4で説明されている基本的なアフィニティー精製反応をアップスケールできます。例えば、海馬の興奮性ニューロンからのタンパク質の精製のために、1mgのタンパク質ライセートを40μLのニュートラアビジンビーズ(1:1スラリー)と混合する。ニュートラアビジンビーズの量は、総タンパク質1mgあたりの標識タンパク質の量に応じてスケールアップまたはスケールダウンすることができ、これは選択した細胞タイプと標識期間に依存し、経験的に決定する必要があります。
- ニュートラアビジンビーズ洗浄とタンパク質溶出
- 遠心分離により上清を回収する(ステップ3.2.1を参照)。後で分析するために各上清の20〜40μlのアリコートを取っておき、残りを-80°Cで凍結します。
- 冷却したニュートラアビジン洗浄バッファー1(PBS pH 7.4、0.2%(wt/vol)SDS、1%(vol/vol)Triton X-100およびPI(1:2000))でビーズを洗浄し、バッファーを添加し、ビーズを沈降させ、上清を廃棄します。この手順を 3 回繰り返します。
- その後、同緩衝液を添加し、ビーズを4°Cで連続回転下で10分間インキュベートしてから上清を捨てた。この手順を 3 回繰り返します。
- 手順3.3.2〜3.3.3で説明されているようにビーズを洗浄しますが、ニュートラアビジン洗浄バッファー2(1x PBS、pH 7.4、およびPI 1:2000)を使用します。
- ステップ3.3.2〜3.3.3の説明に従ってビーズを洗浄しますが、ニュートラアビジン洗浄バッファー3(50 mM重炭酸アンモニウムおよびPI 1:2000)を使用します。
- 使用した乾燥ビーズの1容量に相当する量のノイトラアビジン溶出バッファー(5%(vol/vol)β-メルカプトエタノールおよび0.03%(wt/vol)SDS)を用いてビーズを20°Cで30分間インキュベートすることにより、クリックしたタンパク質を溶出します。
- サーモブロックシェーカーでの連続攪拌(1000 rpm)により、溶出中にビーズを懸濁状態に維持します。2回溶出し、両方の溶出液を結合します。
注:ステップ3.2.1で説明したように、スラリー(ビーズ)と水相(上清)の固形分画を分離するために設定された遠心分離は、ステップ3.3.1〜3.3.7に適用されます。タンパク質の溶出が完了していない場合は、SDS量を増やすことができます。しかし、SDSの0.08%〜0.1%を超える量では、ビーズに非特異的に結合したタンパク質が溶出し始めます。β-メルカプトエタノールは揮発性で有毒です。ステップ3.3.6-3.3.7にはフードを使用することをお勧めします。ステップ3.2.3および3.3.1で収集されたサンプルは、SDS-PAGEによって実行され、アフィニティー精製の効率を評価するためにウェスタンブロット(ステップ2.8を参照)によって評価されるべきである(ステップ3.3)。
- 溶出タンパク質の評価
- 溶出したサンプルの1/3をSDS-PAGEにロードします(ステップ2.8.1を参照)。
- ゲルを染色し、銀染色や蛍光法などの高感度法を使用してタンパク質を可視化します。
- サンプルの品質が期待される場合、つまり陰性対照と比較してANL標識サンプルに3〜4倍多くのタンパク質がある場合、溶出したタンパク質は、参考文献5で説明されているような日常的な質量分析法によって同定できます。
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Representative Results
記載されたプロトコル(図1に要約)に従って、ANLを毎日の腹腔内注射(400 mM ANL 10 mL / kg、Nex-Cre::MetRS *)で7日間、または飲料水(0.7%マルトース、1%ANL、CamkII-Cre::MetRS *)を介して21日間マウスに投与しました。標識後、対応する脳領域を解剖し、溶解し、アルキル化し、クリックした。クリック反応は、SDS-PAGEおよびウエスタンイムノブロットによって分析した。実験の代表的な画像を、IP注入によるANL投与については図2に、飲料水を介したANL投与については図3に示す。図の目的は、両方のラベリングプロトコルが機能することを示すことであり、それらを比較することではないことに注意してください。示された2つの実験(海馬および皮質の興奮性ニューロン、および小脳のプルキンエニューロン)において異なるニューロン集団が標識されているため、比較は不可能である。
さらなる実験は、最適なDST切断可能なアルキン濃度を決定するための例を提供する(図4)。この例では、標識サンプルとコントロールの間のフォールド変化は、14 μMのアルキン濃度で最も高くなります。このアルキン濃度は、すべてのサンプルに適用されます。選択したアルキン量で実験中の各サンプルの標識を検証した後、すべてのサンプルをニュートラアビジンビーズを用いたアフィニティー結合によるANL標識/ビオチンクリックタンパク質の精製に供しました(図5)。この工程では、タンパク質をビーズに結合させ、洗浄し、続いてDST−アルキン中に存在するジスルフィド架橋を還元することによって溶出する。この最後のステップの後、ビオチンとアルキンの一部はビーズに結合したままになります。ANL含有タンパク質(残りのアルキンに結合)は、溶出バッファーで回収されます。溶出ステップの効率を評価するために、溶出液量の3分の1をSDS-PAGEゲルにロードし、高感度総タンパク質染色法を使用して視覚化します。質量分析で解釈可能な結果を得るには、ネガティブコントロールとANL標識サンプルの間で総タンパク質染色の少なくとも3倍の強度差を観察する必要があります。このプロトコルに記載されているすべてのステップの完了後、MSサンプルの準備、取得、および分析が行われます5。MSに特別な要件はありませんが(各ラボではルーチンMSプロトコル5,10を使用できます)、精製タンパク質の量は一般的に少ない(ナノグラムのオーダー)ことに注意してください。図6は、対照と比較してANL標識サンプルに明確な濃縮度を示したMS結果の例を示しています(図6A)。この違いは、図5に示す総タンパク質染色剤ですでに見られていました。ペプチド強度の変化に加えて、両方のサンプルに見られるユニークなタンパク質もあります(図6B)。
図1:BONCATによる細胞種特異的タンパク質精製のための作業パイプライン。 ANLによるタンパク質標識に続いて、目的の組織を解剖および溶解し、クリックケミストリーによってビオチンでタグ付けし、各サンプルの標識量をBONCATで評価します。外れ値(ANLを組み込むことができなかった)と代表的なサンプルは、このステップで区別できます。代表的なサンプルの1つを再度クリックして、後続のタンパク質精製のために最適化された切断可能なアルキン投与量を見つけます。最高のS/N比を達成するアルキン投与量は、すべての生物学的複製に適用されます。細胞種特異的タンパク質は、アフィニティー精製によって得られる。精製されたサンプルは質量分析によって研究され、タンパク質が同定されます。この図は、Alvarez-Castelao et al. (2017)6から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:腹腔内注射(IP)によるANL投与。 BONCATは、7日間の毎日のIP注射によるANLによるタンパク質の代謝標識後の海馬(HP)および皮質(CX)のタンパク質標識を評価するために実施されました。陰性対照(wt)として野生型マウスサンプルを、標識サンプル(MetRS*)と平行にクリックした。標識されたタンパク質は、Nex-Cre::MetRS*ライン16を用いた興奮性ニューロンからのものである。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:飲料水によるANL投与。 BONCATは、飲料水 を介して GAD-Cre::MetRS*マウスにANLを投与した後の小脳のプルキンエニューロンにおけるタンパク質標識を評価するために実施されました。この図は、ネガティブコントロール(wt)と標識サンプル(MetRS*)を並行して溶解およびクリックしたものです。この図は、Alvarez-Castelao et al. (2017)6から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:DST-アルキン投与量の滴定。 最適なアルキン濃度を滴定するための代表的なサンプルとして、実験ごとに1つの生物学的複製が選択されます。ここでは、3つの濃度(14、28、および56 μM)のアルキンをBONCATのクリック反応でテストしました。ANL標識サンプル(MetRS*)とネガティブコントロール(wt)の間の標識比によって、信号対雑音比が決まります(グラフに表示)。14μMは、この実験で得られた最良のアルキン濃度です。ANL標識Nex::MetRS*マウス系統の皮質組織をこの実験に使用した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:精製タンパク質。 プルキンエニューロン由来の標識タンパク質を精製し、SYPRO Rubyを用いて染色した。この図は、Alvarez-Castelao et al. (2017)6から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:タンパク質の同定と定量。 プルキンエ細胞プロテオームは、GAD-Cre::MetRS*マウス系統の小脳を出発物質として用いた質量分析によって得られた。(A)は、野生型(wt)マウスと比較したANL標識サンプル中の同定されたタンパク質の存在量(ペプチド強度)の増加を示す。(B)プルキンエプロテオームは、AのANL標識サンプルに富むタンパク質(MetRS*マウスの重量と比較して>3倍の強度で定義)と、MetRS*発現マウスに見られる固有のタンパク質をプールすることによって得られました。この図は、Alvarez-Castelao et al. (2017)6から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
プロトコルの重要な側面は次のとおりです。陰性対照を含めること、十分な生物学的複製を有すること、ANL投与経路、量、および期間、サンプルのアルキル化、アルキン濃度、およびDST-アルキンを使用する場合のβ-メルカプトエタノールの除去。
Creドライバーなしで、したがってMetRS*発現のないANL標識動物から進行する陰性対照サンプルを含めることが重要です。これらのサンプルは、ANL標識されたCre誘導MetRS*マウスのサンプルと並行して、プロトコルに記載されているすべてのステップにかける必要があります。クリックされていないサンプルは、このコントロールのみを使用して達成された結果が非特定のクリックが原因である可能性があるため、有効なコントロールではありません。MetRS*遺伝子を発現していない細胞でのANLの取り込みや、Creのない細胞でのMetRS*発現は観察されていません。したがって、ANLで標識されたwt動物は、陰性対照として使用することができる。
本明細書に記載されるプロトコルは、サンプルが失われる可能性のある多くのステップからなることを考えると、技術的な失敗を念頭に置いて生物学的反復を計算することが推奨される。脳サンプルの場合、約30%の複製損失があります。
ここでは、2つのANL投与ルートと期間について説明します。これは、他の投与経路(例えば、食品にANLを添加する)が同様にうまく機能することを排除するものではない。投与されたANL量に関して、ここに示す実験は、比較的多量のANLを用いて行った。実験のセットアップによっては、より少ない量での標識も可能です。このプロトコルで報告されるANLラベリングの最短期間は1週間で、最長期間は21日です。より短いまたはより長い表示期間が適用される可能性がありますが、決定されていません。研究者は、組織の代謝特性、関心のある細胞タイプ、および研究中の実験的質問を考慮して、研究中の特定の実験的質問に適したANL投与経路、ANL投与量、およびANL標識期間を決定する必要があります。
キャッピングとしても知られるサンプルアルキル化は、バックグラウンドクリックを回避するための重要なステップです17。アルキル化が適切に行われると、対照サンプルによって監視される非特異的クリックが減少し、陰性対照サンプルとANL標識サンプルの差が大きくなります。アルキル化後の遊離IAAの除去も重要なステップです。クリック反応中に少量のIAAが存在すると、その効率が制限されます。時折、IAAの適切な除去を確実にするために、IAAも除去する脱塩ステップ(ステップ2.6)を繰り返す必要があります。
様々な企業から市販されているビオチン-アルキンおよび-DBCO試薬がいくつかあります。それらの間の主な違いは、ポリエチレングリコール(PEG)リンカー鎖の長さと、切断可能な基の不在、存在、およびタイプに関するものです。使用する種類に関係なく、過剰な量のアルキンは、天然アミノ酸のみを含むタンパク質への非特異的クリックにつながります。これは、アルキン量の正確かつ慎重な滴定によって容易に防止することができる。記載されたように、これを達成するための最良の方法は、後続のタンパク質精製ステップ(ステップ2.6)および質量分析において使用される実際の溶解およびアルキル化サンプルを使用することである。
クリック反応にDST-アルキンを使用すると、β-メルカプトエタノールはジスルフィド架橋を還元し、溶出ステップで標識タンパク質をビーズから解離します(ステップ3.3)。β-メルカプトエタノールは、MSに必要な酵素消化を可能にするためにサンプルから除去する必要があります。これを行うにはいくつかの方法(例えば、凍結乾燥18、ゲル19からの切除、またはS-Trapカラム20を使用した洗浄)があり、選択はサンプルを処理するMSラボによって行われるべきである。
メソッドの変更とトラブルシューティングは、プロトコルに記載されている重要な手順を最適化するように指示する必要があります。たとえば、変動性が多すぎる場合は、生物学的複製を追加します。標識が低すぎる場合は、ANL濃度を上げるか、標識期間を長くするか、研究対象の組織にとってより効率的な他のANL投与経路をテストします。タンパク質アルキル化については、IAAを添加するための以前の還元ステップを実施することができる。
この方法の主な制限は、たとえ小さな組織領域が解剖されたとしても、小さな細胞集団から生じるプロテオームの精製である。しかし、より広い組織領域に広がっているより多数の細胞集団のプロテオームもアクセスが困難です。それにもかかわらず、本明細書に記載の インビボ 標識技術は、イメージング(例えば、FUNCATまたはFUNCAT−PLA21)によって参照される細胞型を評価するために依然として適用することができる。
この方法は現在、完全長タンパク質に基づく細胞型特異的プロテオームのin vivo研究および細胞型特異的完全タンパク質のin situ可視化に利用できる唯一の方法です。アジドホモアラニン(AHA)などの他の非標準アミノ酸も、プロテオームのin vivoタンパク質標識および精製に使用できますが、細胞細胞タイプの特異性に欠けています22,23。ピューロマイシンなどの他のアプローチは、タンパク質合成の固定画像を提供するのに適している24、25。それにもかかわらず、非標準的なアミノ酸を長期間の標識に使用することは可能であり、タンパク質分解を反映し、より正確な細胞プロテオームを示します。BioIDベースの方法は、合成の瞬間/場所に関係なく、特定の細胞内領域のタンパク質を同定するために使用されます26。
我々が確立したマウス系統(ジャクソン研究所、ストック番号028071)では、ANLの細胞への取り込みを可能にする変異型メチオニンtRNA合成酵素(MetRS*)がCre依存的に発現しています。このマウスラインをツールとして、Creドライバラインが利用可能なセルタイプでMetRS*を排他的に表現することが可能です。この配置は、この方法にかなりの汎用性を与え、生物医学研究のほぼすべての分野で有用になります。
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Disclosures
著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。
Acknowledgments
B.A-Cは、スペイン科学イノベーション省(Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I)、マドリード自治州(Atracción de Talento-2019T1 / BMD-14057)、およびMICINN(PID2020-113270RA-I00)の助成金によって資金提供されています。R. A-Pは、マドリード自治州(Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057)から資金提供を受けています。E.M.S.は、欧州研究会議の上級研究者賞であるマックスプランク協会(助成金743216)、DFG CRC 1080:神経恒常性の分子および細胞メカニズム、およびDFG CRC 902:RNAベースの制御の分子原理によって資金提供されています。我々は、D.C DieterichとP. Landgrafの技術的助言とDST-Alkyneの合成に感謝する。E. Northrup、S. Zeissler、S. Gil Mast、およびMPI for Brain Researchの動物施設の優れたサポートに感謝します。Nex-Creマウスラインを共有してくれたサンドラゲッベルスに感謝します。アントニオ・G・カロッジョ氏の英文校正にご協力いただき、ありがとうございました。学士実験を設計、実施、分析しました。B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E., および S. T.D.実験を実施し、分析した。B.A-CとE.M.S.は実験を設計し、プロジェクトを監督し、B.A-Cは論文を書いた。すべての著者が論文を編集した。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12% Acrylamide gels | GenScript | SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12% | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood |
| ANL | Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11) | ||
| ANL-HCl | IrishBotech | HAA1625.0500 | |
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Biotin alkyne | Thermo, | B10185 | |
| Chicken antibody anti-GFP | Aves | 1020 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor | Roche | 4693132001 | Toxic; use a lab coat and gloves. |
| Copper (I) bromide | Sigma | 254185 | 99.999% (wt/wt) |
| Disulfide tag (DST)-alkyne | Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20 | ||
| DMSO | Sigma | 276855 | |
| Filters | Merk | SCGP00525 | |
| Iodo acetamide (IAA) | Sigma | I1149 | |
| IR anti chicken 800 | LI-COR | IRDye 800CW | Donkey anti-Chicken Secondary Antibody |
| IR anti rabit 680 | LI-COR | IRDye 680RD | Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody |
| Maltose | Sigma | M9171 | |
| Manual Mixer | BioSpec Products | 1083 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | 4259 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| NeutrAvidin beads | Pierce | 29200 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 1620112 | |
| PBS 1X | Thermo | J62036.K2 | |
| PBS 1X pH 7.8 | Preparation described in reference number 5 | ||
| PD SpinTrap G-25 columns | GE Healthcare | Buffer exchange | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo, | 23225 | Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life. |
| Polyclonal rabbit anti-biotin antibody | Cell Signaling | 5597 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| SDS 10% | Sigma | 71736 | |
| SDS-PAGE Running buffer MOPS | GenScript | M00138 | |
| SYPRO Ruby stain | Sigma | S4942 | |
| Table automatic Vortexer | Eppendorf | Mixmate | |
| Triazole ligand | Sigma | 678937 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Water | Sigma | W4502 | Molecular biology grade |
References
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