Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Mikroskopiteknikker til fortolkning af svampekolonisering i mycoheterotrofiske plantevæv og symbiotisk spiring af frø

Published: May 17, 2022 doi: 10.3791/63777
Automatic Translation
1, 1, 1
1LabPlaM - Mycoheterotrophic Plants Research Lab, Department of Plant Biology, University of Campinas (UNICAMP)

Summary

Denne protokol har til formål at give detaljerede procedurer til indsamling, fiksering og vedligeholdelse af mycoheterotrofe planteprøver ved anvendelse af forskellige mikroskopiteknikker såsom scanning og transmissionselektronmikroskopi, lys-, konfokal og fluorescensmikroskopi for at studere svampekolonisering i plantevæv og frø spiret med mycorrhizal svampe.

Abstract

Strukturel botanik er et uundværligt perspektiv for fuldt ud at forstå økologi, fysiologi, udvikling og udvikling af planter. Når man forsker i mycoheterotrofe planter (dvs. planter, der får kulstof fra svampe), kan bemærkelsesværdige aspekter af deres strukturelle tilpasninger, mønstre af vævskolonisering af svampe og underjordiske organers morfoanatomi oplyse deres udviklingsstrategier og deres forhold til hyfer, kilden til næringsstoffer. En anden vigtig rolle af symbiotiske svampe er relateret til spiring af orkidéfrø; alle Orchidaceae-arter er mycoheterotrofe under spiring og frøplantestadium (indledende mycoheterotrofi), selv dem, der fotosyntetiserer i voksne stadier. På grund af manglen på ernæringsmæssige reserver i orkidéfrø er svampesymbionter afgørende for at tilvejebringe substrater og muliggøre spiring. Analyse af spiringsstadier ved strukturelle perspektiver kan også besvare vigtige spørgsmål vedrørende svampeinteraktionen med frøene. Forskellige billeddannelsesteknikker kan anvendes til at afsløre svampeendofytter i plantevæv, som det foreslås i denne artikel. Frihånd og tynde sektioner af planteorganer kan farves og derefter observeres ved hjælp af lysmikroskopi. En fluorokrom, der er konjugeret til hvedekimagglutinin, kan påføres svampene og co-inkuberes med Calcofluor White for at fremhæve plantecellevægge i konfokal mikroskopi. Derudover er metoderne til scanning og transmissionselektronmikroskopi detaljeret for mycoheterotrofe orkideer, og mulighederne for at anvende sådanne protokoller i beslægtede planter undersøges. Symbiotisk spiring af orkidéfrø (dvs. i nærvær af mycorrhizal svampe) er beskrevet i protokollen detaljeret sammen med muligheder for at forberede strukturerne opnået fra forskellige spiringsstadier til analyser med lys-, konfokal og elektronmikroskopi.

Introduction

Strukturel forskning i botanik, der dækker plantemorfologi og anatomi, er grundlæggende for at forstå hele organismen1,2 og giver uundværlige perspektiver til at integrere og bidrage til viden om økologi, fysiologi, udvikling og udvikling af planter3. Metoder inden for plantemorfologi og anatomi omfatter i øjeblikket protokoller, udstyr og viden, der er udviklet for nylig såvel som for mere end et århundrede siden2. Den kontinuerlige udførelse og tilpasning af klassiske metoder (f.eks. lysmikroskopi) sammen med nyere teknikker (f.eks. konfokal mikroskopi, røntgenmikrotomografi) har det samme væsentlige grundlag: teoretisk viden, der muliggør udvikling af en metode.

Det vigtigste værktøj i planteanatomi og morfologi er billedet. På trods af den misforståelse, at sådanne analyser er enkle observationer, der giver plads til subjektive fortolkninger2, kræver analyse og forståelse af billeder på dette område kendskab til de anvendte metoder (udstyr, analysetype, metodologiske procedurer), cellekomponenter, histokemi og plantekroppen (vævsorganisation og funktion, ontogeni, morfologiske tilpasninger). Fortolkning af de billeder, der er opnået via en række forskellige metoder, kan føre til korrelering af form og funktion, dechifrering af en strukturs kemiske sammensætning, bekræftelse af beskrivelse af taxa, forståelse af infektioner med fytopatogener og andre sådanne vurderinger.

Når man forsker i mycoheterotrofe (MH) planter (dvs. ikke-fotosyntetiske planter, der opnår kulstof fra mycorrhizal svampe4,5), kan bemærkelsesværdige aspekter af deres strukturelle tilpasninger, mønstre af vævskolonisering af svampe og underjordiske organers morfoanatomi oplyse deres udviklingsstrategier og forhold til hyfer, som er kilden til næringsstoffer. De underjordiske organer af MH-planter viser normalt vigtige tilpasninger relateret til deres tilknytning til jordsvampe, og det er derfor vigtigt at udføre disse anatomiske og morfologiske undersøgelser6. MH-arters luftorganer bør ikke ignoreres, da endofytter også kan være til stede i disse væv, selvom de ikke er mycorrhizal svampe (personlige observationer, ikke offentliggjort endnu).

Udover den veletablerede væsentlighed af mycorrhizal svampe tilknytning til MH-arter i hele deres livscyklus7, har hver orkidéart, selv de autotrofiske, et indledende obligatorisk mycoheterotrofisk stadium i naturlige miljøer. Det opstår, fordi orkideernes embryo er udifferentieret og mangler endosperm eller cotyledoner, hvilket er ude af stand til at udvikle sig og etablere sig i naturlige miljøer uden ernæringsmæssig støtte fra svampepartnere 4,8. I betragtning af at symbiotiske spiringsprotokoller ikke kun kan anvendes på MH-arter, men også på fotosyntetiserende orkideer, der sigter mod at undersøge orkidésvampspecificitet i spiring og protocormudvikling, en meget anvendt metode i initiativer til bevarelse af truede arter 9,10,11.

I denne metodesamling beskriver vi vigtige trin involveret i indsamling, fiksering og opbevaring af MH-planteprøver til anatomiske undersøgelser (afsnit 1), overfladeanalyse og prøveudvælgelse (afsnit 2), sektionsmetoder (frihånd: afsnit 3, mikrotomi: afsnit 4, kryomikrotomi: sektion 5), farvning og montering (afsnit 6), fluorescens og konfokal mikroskopi af svampeendofytter (afsnit 7), scanningselektronmikroskopi (afsnit 8), og transmissionselektronmikroskopi (afsnit 9). Derudover beskriver vi en symbiotisk spiringsmetode til orkidéfrø (MH og autotrofisk, afsnit 10), da de tidligere nævnte billeddannelsesmetoder med succes kan anvendes til at analysere svampekolonisering af frø, protocormer og frøplanter i spiringsprocessen.

Figure 1
Figur 1: Skematisk opsummering af billeddannelsesmetoder. Skemaerne giver indikationer af protokoltrin, hvor de er detaljerede. Forkortelser: GMA = glycolmethacrylat, OCT = optimal skæretemperaturforbindelse, SEM = scanningselektronmikroskopi. Klik her for at se en større version af denne figur.

De mikroskopiteknikker, der er beskrevet her i detaljer (figur 1), indledes med følgende væsentlige trin: indsamling, fiksering, dehydrering, indlejring og sektionering af prøver. Da trinene er variable (figur 1) afhængigt af den eller de valgte teknikker, er det vigtigt at tænke fremad i betragtning af de fikseringsmidler, der skal fremstilles og transporteres til indsamlingsstedet, hvordan prøverne skal forberedes inden fastgørelse, de dehydreringsprocesser, der skal anvendes (afsnit 1), og forskellige indlejringsmuligheder og sektioneringsmetoder (afsnit 4, 5, og 9). Figur 1 opsummerer sekventielt alle de trin, der kræves for hver mikroskopiteknik, der er grundigt beskrevet nedenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Indsamling, fastsættelse og vedligeholdelse af prøver

BEMÆRK: Fuldt MH-planter kan normalt findes i den mørke skovundergrund 12,13, hovedsageligt i fugtige og kuldrige, mens delvist MH-planter kan findes i mere åbne skove 12,13. MH-planter har normalt veludviklede underjordiske organer i forskellige former og størrelser.

  1. Når du samler MH-arter, skal du udforske jorden omkring plantebasen, passe på ikke at beskadige underjordiske organer og undgå at trække planterne fra jorden for at forhindre afbrydelse af luftorganerne fra de underjordiske.
  2. Grav forsigtigt rundt om luftstrukturer ved hjælp af en havearbejde murske, mens du udforsker de underjordiske organer som rødder, stilke, jordstængler og opbevaringsorganer uden at beskadige disse strukturer.
  3. Fjern jordpartikler for at bevare skrøbelige strukturer, og vask forsigtigt disse organer med ledningsvand for at skylle de resterende jordpartikler af, inden prøverne fastgøres.
  4. MH-planter forbundet med bladkuld kræver ekstra opmærksomhed; Saml omhyggeligt organer, der er forbundet med det nedbrydende materiale gennem deres hyfer, undgå at trække disse organer fra de tilsluttede strukturer, og saml dem omhyggeligt, da disse dele er meget sarte. Bevar strukturer med sådanne forbindelser og saml også kuldet til analyse.
  5. Hvis du vælger at analysere frisk materiale ved hjælp af billeddannelsesteknikker, skal du vedligeholde prøverne i lukkede plastposer med tilstrækkelig fugtighed, nok vand, der fordamper og fugter planten, hvilket forhindrer overdreven vand i at komme i kontakt med prøverne. Transporter dem straks til laboratoriet og analyser prøverne samme dag, som de blev indsamlet, mens du er opmærksom på, om prøverne stadig bevares, når de analyseres.
  6. Bær fikseringsmidler til indsamlingsstedet i godt forseglede beholdere. Fix prøver hurtigt efter indsamling til lysmikroskopi (LM) og scanning elektronmikroskopi (SEM) i et af følgende fikseringsmidler: 10% neutral bufferet formalin (NBF14, tabel 1) eller Karnovskys opløsning (modificeret15, tabel 2). Karnovskys opløsning kan fremstilles med 0,2 M fosfatbuffer15, hvis opskrift er beskrevet i tabel 3.
  7. Til analyse ved transmissionselektronmikroskopi (TEM) opdeles prøverne med en tykkelse på 4-3 mm inde i en dråbe glutaraldehyd-natriumcacodylatbuffer (modificeret16, tabel 4) i mindre sektioner med en tykkelse på 1-2 mm. Kassér kanterne, der er skåret uden for dråben. Overfør straks sektionerne til et opsamlingsrør med et volumen fikseringsmiddel, der er mere end 10 gange større end volumenet af prøverne, da det er et additivfikseringsmiddel (dvs. dets molekyler tilsættes kemisk til proteinernefastgjort 16).
    FORSIGTIG: De tre beskrevne fikseringsmidler er meget giftige. Undgå indånding, især under deres brug i marken. Forbered alle fikseringsmidler i en røghætte ved hjælp af handsker. Bland ikke cacodylate og syrer, da arsengas kan dannes16.
  8. Hvis de faste prøver flyder i fikseringsmidlet, indikerer dette tilstedeværelsen af gas i plantevæv. Luft og andre gasser forhindrer fikseringsmidlet i at trænge ind i hele prøven2. Fjern gas fra væv ved at genprøve dem i mindre dele og bruge en vakuumpumpe (-300 til -400 inHg tryk), indtil alle prøverne synker til bunden af opløsningen17. Vær forsigtig, da for stort tryk, der udøves af pumpen, kan beskadige prøver.
  9. Efter mindst 48 timer i Karnovskys opløsning eller 10% NBF vaskes prøverne i 0,2 M PB (tabel 3) og dehydreres med en serie på 10%, 30%, 50% og endelig 70% ethanol. For sarte prøver dehydreres i 30 minutter i hver koncentration; Ved større prøver dehydreres i 1 time eller længere.
    BEMÆRK: En 70% ethanolopløsning er det ideelle medium til opbevaring af prøver. Prøver i 70% ethanol kan opbevares ved stuetemperatur i årevis. Opbevar ikke plantemateriale i lange perioder i fikseringsmidlerne, da fjernelse af fikseringsmidler er et vigtigt trin efter fiksering2.
  10. Prøverne opbevares i glutaraldehyladylat ved 4 °C, inden de fortsætter til postfiksering (trin 9.1).
10% neutral bufferformalin (NBF)14
Trin 1 tilsæt 10 ml 37-40% formaldehydopløsning i 80 ml destilleret vand
Trin 2 der tilsættes 0,4 g natriumphosphatmonobasisk monohydrat (NaH2PO4· H2O) til opløsningen
Trin 3 tilsæt 0,65 g natriumphosphat dibasisk, vandfri (Na2HPO4)
Trin 4 fyld volumen op til 100 ml

Tabel 1: 10% neutral bufferet formalin opskrift 14.

Karnovskys løsning (modificeret15)
Trin 1 i 20 ml destilleret vand ved 60-70 °C
Trin 2 Tilsæt 0,8 g paraformaldehyd (for at opnå 4% w/v) under omrøring
Trin 3 tilsæt 1-4 dråber 40% NaOH og rør, indtil opløsningen bliver klar
Trin 4 afkøles og tilsættes 30 ml 0,2 M fosfatbuffer pH 7,2 (tabel 3)
Trin 5 fortyndes 25% glutaraldehyd i 0,1 M PB (pH 7,2) for at opnå 1% glutaraldehyd (slutvolumen: ~60 ml)
Trin 6 Der tilsættes 1 % glutaraldehyd (trin 5) til opløsningen opnået i trin 4, indtil der fremstilles op til 100 ml fikseringsmiddel

Tabel 2: Karnovskys løsningsopskrift (ændret15).

0,2 M fosfatbuffer (PB) pH 7,2
Trin 1 tilsæt 14.196 g natriumphosphatdibasisk, vandfrit (Na2HPO4) til 400 ml destilleret vand
Trin 2 der tilsættes 13,8 g monobasisk monohydrat af natriumphosphat (NaH2PO4· H2O)
Trin 3 Rør, indtil opløsningen er klar
Trin 4 juster det endelige volumen til 500 ml med destilleret vand
Trin 5 juster pH til 7,2
Trin 6 for en 0,1 M PB, fortyndes 1:1

Tabel 3: 0,2 M fosfatbufferopskrift.

3% glutaraldehyd 0,2 M natriumcacodylatbuffer (modificeret16)
Trin 1 0,2 M cacodylatbuffer: Tilsæt 4,28 g natriumcacodylattrihydrat i 100 ml destilleret vand
Trin 2 juster pH til 7,2
Trin 3 tilsæt 12 ml 25 % glutaraldehyd i 25 ml af opløsningen i trin 2 (0,2 M cacodylatbuffer pH 7,2)
Trin 4 fyld volumen op til 100 ml med destilleret vand

Tabel 4: 3% glutaraldehyd 0,2 M natriumcacodylatbufferopskrift (modificeret16).

2. Overfladeanalyse af organer i fast og ikke-fast materiale

  1. For at analysere overfladiske hyfer i organer, især underjordiske, og dem, der er i kontakt med bladkuld, skal du observere fast eller frisk materiale i et dissekerende mikroskop (stereomikroskop) ved en forstørrelse på 7,5x eller derover, afhængigt af de analyserede prøver.
    1. Visualiser prøverne nedsænket i fikseringsmidlet, 70% ethanol (hvis det opbevares i det) eller ledningsvand i tilfælde af frisk materiale. Undgå direkte lys fra dissekeringsmikroskopet, da det kan tørre og beskadige prøver.
    2. Søg efter interesseområder i prøverne, styret af overfladiske hyfer og rhizomorphs. Vælg prøver, der indeholder områder med overfladiske rhizomorphs, da disse kan sektioneres for at visualisere pelotoner og hyferspoler i kortikale celler i rødder og stilke.
    3. Efter udvælgelsen skal du følge trin 1.6 og 1.9, hvis prøverne endnu ikke er rettet. Hvis det ønskes, fotograferes friske prøver ved hjælp af et lysmikroskop uden fastgørelse, som beskrevet i afsnit 3.
    4. Brug kameraet koblet til stereomikroskopet til at indsamle billeder fra orgeloverflader, rhizomorphs og andre observerede strukturer. I sådanne tilfælde skal du sørge for en passende baggrundsfarve for at kontrastere godt med materialet og om muligt vælge et baggrundsmateriale med en mindre ru overflade (f.eks. Papir).

3. Frihåndssektioner af planteorganer

BEMÆRK: Frihåndssektioner af planteorganer kan være udfordrende, især for små og tynde strukturer. Imidlertid kan disse sektioner af væv med svampeendofytter i nogle tilfælde bedre udvise hyfer og andre funktioner i sammenligning med tynde sektioner.

  1. Sektion friske eller faste prøver med et skarpt blad, skære dem så tynde som muligt og placere dem straks i en lille petriskål med vand (hvis frisk) eller 70% ethanol (hvis fastgjort). Brug en lille pensel til at manipulere sektionerne uden at beskadige dem.
  2. For at lette sektionering af mere udfordrende materialer (dvs. små, tynde, fleksible organer) omgiver prøven i en struktur, for eksempel polystyren eller Cecropia petiole. Skær støtten for at rumme prøven og lav en tynd del af prøven og støtten helt.
  3. Pletter og monter prøverne som beskrevet i afsnit 6.

4. Indlejring af planteprøver i harpiks og sektionering

  1. Dehydrere prøverne opbevaret i 70% ethanol yderligere i 80%, 96% og 2x i 100% ethanol i 30 minutter til 2 timer afhængigt af prøvernes størrelse og sammensætning.
  2. Brug et glykolmethacrylat (GMA) harpikssæt i henhold til producentens anvisninger. Tjek Gerrits og Horobin (1996)18 for yderligere overvejelser. Følg infiltrations- og indlejringstrinnene i overensstemmelse hermed.
    FORSIGTIG: GMA-harpiks er giftig, det kan forårsage allergisk reaktion og hud-, øjen- og slimhindeirritation. Brug reagenserne i en røghætte og brug handsker.
  3. Brug polyethylenstøbebakker til indlejring, valgt efter prøvestørrelse (f.eks. 13 mm x 19 mm x 5 mm for større prøver, 6 mm x 8 mm x 5 mm for mindre). Vær opmærksom på den ønskede prøveorientering inde i formen, og brug en nål til at hjælpe med at orientere.
  4. Lad det stå til polymerisation, helst ved stuetemperatur, indtil det er helt størknet. Hærdningsprocessen tager normalt et par timer, selvom det anbefales at udforme blokkene den følgende dag. Efter polymerisation skal du forsigtigt løsne harpiksblokkene fra formene og fortsætte med at fastgøre blokkene så hurtigt som muligt for at undgå blokbue.
  5. Slib ansigtet på harpiksblokken, der vil blive fastgjort, hvilket skaber en flad overflade. Lim harpiksblokken på en trækuboid (2 cm x 2 cm x 3 cm anbefales) med et flydende cyanoacrylatklæbemiddel med medium viskositet (se Materialetabel). Sørg for, at harpiksen er helt fastgjort for at undgå at gå på kompromis med sektionering.
  6. Udfør sektionering i et roterende mikrotom som beskrevet nedenfor.
    FORSIGTIG: Knivene på mikrotomknive er meget skarpe og kan forårsage ulykker. Sørg for at håndtere dem efter alle sikkerhedsforanstaltninger. Før du nærmer dig kniven (f.eks. for at skifte blok, for at fugte harpiksen), skal du låse det grove håndhjul og placere bladets sikkerhedsdæksel på. Opbevar engangsblade i passende tilfælde. Vær yderst forsigtig, når du udskifter knive.
    BEMÆRK: Forskellige typer knive (f.eks. engangsbrug eller fast; glas eller stål) kan bruges til at sektionere GMA-harpiks18. Kvaliteten af sektionerne afhænger af, hvor skarp kniven er. Sørg for, at kniven er godt fastgjort og ikke kan bevæge sig. Engangsknive skal muligvis udskiftes regelmæssigt for at opnå bedre sektionering.
    1. Fastgør trækuboiden fast til blokholderen. Juster retningen af sektionering ved hjælp af orienteringsskruerne, og sørg for en passende vinkel på kniven ved hjælp af knivhældningen. Vælg tykkelsen af sektionerne; brug en tykkere indstilling til trimning og en tyndere indstilling til udvalgte sektioner, da GMA-sektioner klæber mere passende til glasrutsjebanen, når de er tyndere; Foreslået tykkelse for plantevæv er 5-8 μm.
    2. Før du starter, afkøles rummet, hvis det er nødvendigt, da højere temperaturer forværrer sektionernes kvalitet. Forbered følgende til sektionering: et bægerglas med destilleret vand, en kogeplade, pensler (mindst to), finpunktpincet, en Pasteur-pipette, glasrutsjebaner, filterpapir (eller silkepapir) og en blyant (til identifikation af de prøver, der er sektioneret).
    3. Kogepladen justeres til 50 °C, og bægerglasset anbringes på det. Vær opmærksom på forskelle i opvarmning afhængigt af kogepladens område (normalt opvarmes det midterste område mere end kanterne; opvarm vandet i midten, helst).
    4. Vælg et glasglas, identificer det med en blyant, og pipetter det varme destillerede vand over hele glidefladen. Brug om nødvendigt en opløsning (f.eks. Vaskemiddel og vand eller 70% ethanol) til at bryde spændingen mellem vandet og glasset, så hele rutsjebanen er lige dækket. Nogle glidetyper skal forrenses med 70% ethanol for at opnå tilstrækkelig sektionsadhærens.
    5. Start med gradvist at føre harpiksblokkens overflade mod knivbladet. Prøv ikke sektionering uden at fremme blokken først, ellers kan udstyret og blokken blive beskadiget. Trim om nødvendigt blokken ved hjælp af en højere tykkelse (10 μm og derover).
    6. Når du nærmer dig en passende sektion, skal du foretage en fast envejsbevægelse med håndhjulet, så sektionen er lavet på én gang. Hold øje med harpiksfugtigheden. Under sektionering skal du regelmæssigt fugte forsiden af blokken, der skæres, ved hjælp af en pensel dyppet i destilleret vand, hvis der er et problem med krøllesektioner. Fjern overskydende vand med et silkepapir.
    7. Med en fin punktpincet placeres den opnåede sektion i vandet over rutsjebanen. Når man kommer i kontakt med vand, strækker GMA-harpiks sig. Brug om nødvendigt en pensel til forsigtigt at folde sektionerne ud og strække dem. Brug en anden pensel til konstant at holde bladet fri for harpiksaffald. Skift ikke mellem penslerne for at undgå befugtning af bladet.
    8. Når du har sat alle de ønskede sektioner i diaset i kø, skal du tørre diasets nederste side og placere det over kogepladen. Fjern det overskydende vand fra toppen af rutsjebanen ved forsigtigt at duppe med et filterpapir (valgfrit). Sektionerne klæber, når vandet fordamper fra diaset. Efterlad ikke diasene for længe for at forhindre, at sektionerne bliver beskadiget af overdreven varme.
    9. Opbevar diasene i en glideboks væk fra støv og sol, og brug dem til farvning og andre procedurer. Diasene kan opbevares i flere år.

5. Frysning af planteprøver og sektionering med en kryostat

BEMÆRK: Den væsentlige overvejelse ved kryosektion af biologisk væv er at reducere skader på grund af iskrystaldannelse ved frysning af prøver. Kryobeskyttelse udføres normalt ved infusion af kemisk inerte opløsninger såsom glycerol eller saccharose19,20.

  1. Udfør følgende trin en dag før sektionsopdeling af prøver.
    1. Der fortyndes 100 ml 0,2 M PB (tabel 3) i 100 ml destilleret vand for at opnå 200 ml 0,1 M PB. Der tilsættes 10 %, 20 % og 30 % saccharoseopløsninger i 0,1 M PB (f.eks. tilsættes 2 g saccharose i 20 ml buffer til en 10 % opløsning).
    2. For friske prøver vaskes dem i 0,1 M PB i 30 min. For prøver i et fikseringsmiddel vaskes dem i den samme buffer, der bruges til fremstilling af fikseringsmidlet i 30 minutter. For prøver i 70% ethanol hydreres dem i 50% og 30% ethanol og vaskes i 0,1 M PB i 1 time i hver opløsning.
    3. Prøverne inkuberes i 2 timer i 10% saccharose, 2 timer i 20% saccharose og 2 timer i 30% saccharose ved stuetemperatur. Derefter inkuberes natten over i 30% saccharose ved 4 °C (eller i det mindste i 3 timer; maksimal tid er 48 timer).
  2. På dagen for sektionering fremstilles 40% og 50% saccharose i 0,1 M PB; Tilbered ikke saccharoseopløsninger mere end 12 timer i forvejen. Der inkuberes i 2 timer i hver saccharosekoncentration ved 4 °C.
  3. Til indlejring fremstilles et lag OCT-forbindelse i små forme (optimalt skæretemperaturmedium, der bruges til indlejring og frysning af prøverne) og holdes ved -20 ° C for at fryse. Formene kan være almindelige histologiske forme, selvom for at lette udformning af blokke, papir eller stanniol kan fremstilles ved hjælp af en lille kuboid som ramme og tape.
  4. Når det nederste lag af OCT-forbindelsen er frosset i formene, arbejdes inde i et kryostatkammer (ca. -27 °C). Placer prøverne inkuberet i 50% saccharose i formene i den retning, hvori de vil blive opdelt. Oversiden af en kuboid blok er normalt et bedre ansigt af sektionering. Marker i formen, hvor prøverne er placeret, så blokken let kan trimmes, og den korrekte orientering opretholdes.
  5. Omgiv prøverne i OCT-forbindelse, og spræng enhver luftboble, der berører prøverne. De fryses ved -20 °C. Når blokkene er helt frosne, anbringes de inde i kryostatkammeret (ca. -27 °C). Udpak kun hver enkelt før brug, og vær opmærksom på de mærker, der angiver prøveplacering inde i blokken.
  6. Da OCT-forbindelsen let skæres med et blad, skal du trimme blokkene korrekt, før du placerer dem på chucks. Sæt noget OCT-forbindelse i kryostatpatronen, og placer blokken, så overansigtet er opdelt. Ansigter med mindre områder giver bedre sektioner. Vent, indtil blokken er godt fastgjort til borepatronen, og test den, før du begynder at sektionere.
  7. Placer chucken fast i chuckholderen. Juster retningen af sektionering ved hjælp af orienteringsskruerne. Juster knivens vinkel ved hjælp af knivhældningen. Vælg tykkelsen af sektionerne. Prøverne kan sektioneres tykkere end sædvanlige harpikssektioner. Sektioner i et interval mellem 5-20 μm opnås med succes, hvor tykkere sektioner er lettere at lave (mindre krølle og mindre beskadigelse af strukturer).
  8. Skub den frosne bloks overflade mod knivbladet. Prøv ikke sektionering uden at gøre det, ellers kan blokken løsnes fra chucken og beskadiges. Trim om nødvendigt blokken ved hjælp af en højere tykkelse (10 μm og derover).
  9. Når du nærmer dig en passende sektion, skal du placere anti-rullepladen (dvs. en gennemsigtig plade, der bevarer sektionen) over kniven og foretage en fast envejsbevægelse med håndhjulet, så sektionen er lavet på én gang. Der kan opstå krølleproblemer, hvis anti-rullepladen skal justeres (den kan normalt justeres i forhold til klingen), eller hvis der er snavs i bladet. Rengør bladet konstant med en pensel for at fjerne snavs.
  10. Brug specielle dias, så sektionerne let fastgøres, som silaniserede dias (kommercielle eller tilberedte med 2% aminoalkylsilan i acetone 21) eller dias fremstillet med 500 μg / ml poly-L-lysin i destilleret vand 21 eller 0,2% gelatine (se detaljer21). Vedligehold diasene ved stuetemperatur.
  11. For at klæbe sektionen til et dias skal du løfte anti-rullepladen og hurtigt få diaset til at røre sektionen. Da diaset er ved stuetemperatur, smelter sektionen straks og klæber til diaset. Vær opmærksom på at dreje det behandlede ansigt af diaset til sektionen, som kan forblive over kniven eller på indersiden af anti-rullepladen. For at undgå krølning af sektioner skal du udføre dette trin hurtigt, så snart pladen løftes, og pas på ikke at forvrænge sektionen.
  12. Lad glideren stå uden for kryostatkammeret (ved stuetemperatur), hvis der skal tilføjes nye sektioner til det. Når du har klæbet alle de ønskede sektioner til diaset, skal du holde det inde i kryostatkammeret eller i fryseren (-20 ° C eller derunder). Udsæt ikke diasene for fugtighed. Opbevar dem i en diasboks, og husk at identificere diasene med en blyant.
    BEMÆRK: Dias og blokke af OCT kan opbevares ved -20 ° C, men ikke for længe. For at opnå bedre resultater skal du bruge diasene og blokkene inden for få dage.

6. Farvning af plantesektioner og endofytter til lysmikroskopi

BEMÆRK: Mange typer pletter kan bruges til plantesektioner. Det er udfordrende at differentielt plette endofytiske svampe og plantevæv. Selvom det ikke er en farvningsprocedure, præsenteres en metode til mærkning af svampestrukturer i afsnit 7 (fluorescens med et hvedekimagglutininkonjugat). Frihåndssektioner (forklaret i afsnit 3), harpikssektioner (afsnit 4) og kryosektioner (afsnit 5) kan farves, selvom phenol- og alkoholbaserede pletter er udfordrende for disse prøver, da GMA-harpiks og OCT mister klæbende til diaset i disse tilfælde.

  1. Brug en eller kombiner følgende sædvanlige farvningsmetoder til planteprøver.
    1. Toluidinblå O22,23, en meget anvendt metode til generel farvning af plantesektioner. Forbered en opløsning af 0,05% toluidinblåt O i 0,1 M phosphat (pH 6,8) eller 0,09 M citratbuffer (pH 4,5-4,8), afhængigt af art og vævstyper. Inkuber GMA-harpikssektioner i 2-10 minutter ved hjælp af en diasfarvningskrukke eller ved at placere nogle dråber over sektionerne, hvis der er plettet få dias. Der vaskes forsigtigt med destilleret vand eller buffer efter inkubation, og rutsjebanerne monteres med vand, eller de tørres på en kogeplade for at frembringe permanente glider som beskrevet i trin 6.3.
    2. Lugol reagens2 indikerer tilstedeværelsen af stivelse. Forbered en 5% jod (I2) og 10% kaliumiodid (KI) opløsning i destilleret vand. Pletsektioner i 2 minutter ved at tilføje få dråber over diaset, og vask derefter med destilleret vand. Denne histokemiske test anvendes normalt på midlertidige dias.
    3. Sudan III, IV og sort B24,25 plet til forskellige lipider. Forbered en opløsning af 0,3% Sudan (III, IV eller sort B) i 70% ethanol, varm den op til kogning, og lad afkøle. Brug supernatanten, filtrer den og inkuber sektioner i 15-30 minutter i en lukket petriskål. Vask sektionerne omhyggeligt med 70% ethanol og destilleret vand. Monter diasene med vand (anvendes normalt kun på midlertidige dias).
      BEMÆRK: Da Sudan er et alkoholbaseret farvestof, er det mere velegnet til frihåndsafsnit. Udfør GMA-harpikssektionsfarvning omhyggeligt, da de normalt løsner sig fra diaset.
  2. For midlertidige dias skal du montere sektionerne i vand eller glycerin og observere efterfølgende. Forsegl dækslet med neglelak for at bevare dem lidt længere.
  3. For permanente dias skal du montere sektionerne med syntetiske harpikser (f.eks. Hurtigt monteringsmedium, se Materialetabel). Dryp et par dråber af monteringsmediet (det kan løbe over dækslippet), læg dækslippet forsigtigt for at undgå bobler, og brug tøjpinde til at trykke diaset mod dækslippet, indtil det er helt tørt. Fjern overskydende tørret monteringsmedium med et barberblad.

7. Anvendelse af et fluorokromkonjugeret på hvedekimagglutinin i fluorescens og konfokal mikroskopi

BEMÆRK: Denne metode kan anvendes på frihåndssektioner (forklaret i afsnit 3), harpiksafsnit (afsnit 4) og kryosektioner (afsnit 5). Kryosektioner kan være tilstrækkelige til konfokal mikroskopi, da tykkere prøver kan leveres sammenlignet med harpikssektioner, men ikke så tykke som frihånds. Et fluorokrom, der er konjugeret til hvedekimagglutinin (WGA, se Materialetabel), anvendes til svampebilleddannelse i fluorescensmikroskopi26. Et konfokalt mikroskop er ikke afgørende, selvom det kan give klare tredimensionelle billeder af plantestrukturer27.

  1. Der fremstilles en opløsning af 0,2 mg/ml WGA-fluorokromkonjugat i 0,1 M PB28 (pH 7,2, kontroltrin 5.1.1 og tabel 3). Der fremstilles en opløsning af 1% Calcofluor White i 0,1 M PB (pH 7,2). Forbered små mængder af disse opløsninger, da sektionerne inkuberes direkte med dem.
  2. Inkuber sektionerne i glasglassene i 30 minutter i WGA-fluorokromkonjugatopløsningen29 ved hjælp af tilstrækkelig volumen til at dække sektionerne, og vask derefter i 0,1 M PB.
  3. Inkuber sektionerne i calcofluoropløsningen ved hjælp af tilstrækkelig volumen som monteringsmedium. Løsningen kan opretholdes i observationsperioden.
  4. Sæt dæksler på diasene og observer i et konfokalmikroskop eller et fluorescenslysmikroskop ved hjælp af følgende filtre: TC / GFP (excitation: 470-440, emission: 525-550, for WGA-fluorokrom i materialetabellen - svampecellevæg fluorescerer grønt under dette filter29) og DAPI (excitation: 358, emission: 463, for Calcofluor White)30.
    BEMÆRK: Tredimensionelle billeder kan fås ved hjælp af Z-seriens funktion i det konfokale mikroskop27.

8. Scanning elektronmikroskopi af planteorganer

  1. Efter fastgørelse af prøver, udførelse af dehydrering og opbevaring i 70% ethanol (afsnit 1) er en mulighed at skære prøver for at udsætte enhver ønsket overflade til SEM-analyse, hvis det er nødvendigt (f.eks. Indre væv, æggestokstruktur). Brug et skarpt og nyt barberblad og lav snit med en envejsbevægelse, så du undgår et beskadiget udseende af disse områder i SEM. Brug om nødvendigt et stereomikroskop til at vælge prøverne og overveje metalstubbeområdet for at bestemme prøvestørrelser.
  2. Yderligere dehydratprøver for SEM i en ethanolserie: 80%, 96% og 2x i absolut ethylalkohol (≥99,8%). Oprethold små og delikate prøver i 30 minutter i hver koncentration og større og tættere prøver i 1 time.
  3. Fold små konvolutter ved hjælp af silkepapir for at organisere prøver til de næste trin, større prøver kan håndteres uden en konvolut. Identificer konvolutterne med en blyant ved at skrive et bogstav eller et tal, og hold en log over alle prøverne i hver enkelt. Opbevar prøverne i absolut ethanol, men ikke for længe, og fortsæt til trin 8.4 så hurtigt som muligt.
  4. Fortsæt til tørring af kritisk punkt (CP). Betjen en CP-tørretumbler i henhold til standardprocedurer. Prøverne anbringes i absolut ethanol (mellemvæske) i et trykkammer. Ved det kritiske punkt CO2 (31 °C, 7,3 x 106 Pa) opløses mellemvæsken i overgangsvæsken (flydende kuldioxid), og prøverne tørres31.
  5. Efter CP-tørring opbevares prøverne så hurtigt som muligt i en udtørringsbeholder, f.eks. en forseglet kolbe indeholdende silicagel. Luftfugtighed kan ødelægge prøverne, hvis de reabsorberes31.
  6. Brug metalstubbe til at montere prøverne. Før montering skal du tage handsker på for at manipulere stubbene, nedsænke dem i acetone i 5 minutter for at fjerne fedt og lade dem tørre. Brug et ledende dobbeltsidet kulstofklæbebånd til at fastgøre prøver på stubben og et stereomikroskop til at hjælpe med at placere prøver, idet du husker på, at synet ovenfra er det eneste mulige perspektiv i SEM-billeder.
  7. Manipuler prøver med finpunktspletten, og vær forsigtig, da prøvedelen, der berøres af pincetten, normalt er beskadiget, så prøv at røre ved dele, der er placeret væk fra interesseområderne (f.eks. Områder i kontakt med båndet). Vedligehold stubbene med prøver i en forseglet petriskål med silicagel. Fortsæt til trin 8.8 så hurtigt som muligt.
  8. Brug en sputter coater til at deponere et lag metal, normalt guld eller platin, på overfladen af prøverne i en lavtryksatmosfære af en inert gas, ofte argon31. Følg standardprocedurerne, når du bruger en sputter coater. Belægningstykkelsen afhænger af prøvens topografi, normalt mellem 15-40 nm32.
  9. Vedligehold de overtrukne stubbe i en forseglet petriskål med silicagel, og forudsat at silicagelen bevarer fugtigheden, kan prøver opbevares på denne måde i uger. Brug et scanningselektronmikroskop til at analysere prøverne. Prøverne i vacuo rammes af en stråle af elektroner, og udsendelsen af signaler fra en sådan interaktion fortolkes som billede31. For detaljer om betjening af et scanningselektronmikroskop, læs Jeffree og Read (1991) 31 og Bozzola og Russell (1999)32.
  10. For at genbruge stubbene skal du trække i klæbebåndet og skrubbe dem med tråduld. Vask i ledningsvand, nedsænk i absolut ethanol, og tør dem tilstrækkeligt, hvilket forhindrer oxidation af det bestanddele, der er tale om.

9. Transmissionselektronmikroskopi

  1. Præfiksprøver med glutaraldehyd-cacodylatbuffer som forklaret i trin 1.7 og 1.10. Efter 12-24 timers præfiks vaskes prøverne 3x i 0,2 M cacodylatbuffer (pH 7,25) i 10 min. Udfør postfiksering med 1% osmiumtetroxid (OsO4) i 0,2 M cacodylatbuffer i 12 timer i mørke ved stuetemperatur. Vask 3x med destilleret vand i 5 min.
    FORSIGTIG: Cacodylate og osmiumtetroxid er meget giftige og bør ikke indåndes. Brug dem i stinkskabe efter de respektive sikkerhedsdatablade.
  2. Dehydrere prøverne med 30%, 50%, 70% og 96% ethanol, 2x i hver koncentration, i 10 min. Derefter dehydreres 3x i absolut alkohol i 15 minutter hver gang.
  3. Prøverne infiltreres i hydrofile akrylharpikser (se Materialetabel), en gang med 1:1 harpiks + absolut ethanol og 3x med ren harpiks i 8-12 timer hver. Polymerisation i gelatinekapsler ved 60 °C udføres, indtil den er fuldstændig størknet (maks.12 timer 17).
  4. Vurder nøje orienteringen af prøver inde i harpiksblokken; Skær den øverste del af blokken med et barberblad, hvilket gør en pyramideform, der koncentrerer prøven i sektionsområdet. Opnå halvtynde sektioner (250-500 nm)33 i et ultramikrotom med en diamantkniv og læg på glasrutschebaner i få dråber vand.
  5. Slides på en kogeplade ved 60 °C. Plet sektionerne med toluidinblå O som i trin 6.1.1 og lad pletten tørre helt. Vask forsigtigt med ledningsvand. Evaluer det opnåede afsnit ved at tegne fire kvadranter og vælge den bedst egnede kvadrant til analyse.
  6. Trim blokken, så pyramideformen koncentrerer den valgte kvadrant på blokkens overside. Fremstil ultratynde sektioner (50-100 nm)33,34. Tykkelsen vurderes i henhold til sektionernes interferensfarve: sektioner med ca. 70 nm vises sølvguld, med ca. 100 nm vises guld og med ca. 200 nm vises blå34.
  7. Opsamling de ultratynde sektioner fra vand ved hjælp af kobbergitter og fortsæt til kontrastfarvningsmetoden med uranylacetat og blycitrat som beskrevet nedenfor.
    1. Der fremstilles en blycitratopløsning (tabel 5), og den endelige opløsning fryses ned i mikrocentrifugerør med 1 ml opløsning i hver, og optøning kun lige før brug.
    2. Klargør en uranylacetatopløsning: 0,625 g uranylacetat [UO 2(CH3COO)2] opløses i 25 ml nyligt kogt og afkølet destilleret vand. Opbevares i en mørk kolbe i fryseren.
      FORSIGTIG: Blynitrat er giftigt, hvis det indtages. 1 N NaOH er stærkt ætsende. Uranylacetat er radioaktivt og giftigt. Det må ikke indtages, indåndes eller komme i kontakt med huden.
    3. Ved farvning anbringes begge tilberedte reagenser i separate 3 ml sprøjter med filterenheder (0,22 μm pore, se Materialetabel). Forbered en petriskål vendt på hovedet med en forseglende termoplastisk film over den (se Materialetabel) og inde i en bredere skål med NaOH-pellets på kanterne som en fælde for CO 2 32 (se figur 2).
    4. Kassér den første dråbe, og over filmen placeres en dråbe uranylacetat og tre dråber destilleret vand for hvert gitter, der farves. Gør det samme med blycitrat og tilsæt yderligere tre dråber destilleret vand.
    5. Inkuber gitteret (med den uigennemsigtige side nedad, hvor sektionerne er) i uranyl i 30 minutter (variabel tid). Vask 3x i de destillerede vanddråber, og tør gitteret hver gang forsigtigt med filterpapir på den strålende side. Gentag med blycitratfaldet (30 min) og vask det.
  8. Efter mindst 4 timer analyseres nettene i et transmissionselektronmikroskop. I dette mikroskop passerer en stråle af elektroner gennem sektionerne i vacuo , og billedet projiceres på en fluorescerende skærm. For detaljer om drift af et transmissionselektronmikroskop, læs Bozzola og Russell (1999)32.
blycitratopløsning (til TEM-kontrastfarvning)
Trin 1 Omgiv et bægerglas med stanniol
Trin 2 0,266 g blynitrat [Pb(NO3)2] opløses i 6 ml nykogt og afkølet destilleret vand
Trin 3 agitere i 2 minutter
Trin 4 Der tilsættes 0,352 g trinatriumcitrat [Na3(C6H5O7).2H2O] (opløsningen skal haveet mælkeagtigt udseende)
Trin 5 omrør i 15 minutter, luk bægerglasset med stanniol og overfør opløsningen til et 10 ml bægerglas
Trin 6 tilsæt 1,6 ml 1N NaOH og 2,4 ml destilleret vand (opløsningen skal være gennemskinnelig)
Trin 7 juster om nødvendigt pH-værdien tæt på 12

Tabel 5: Opskrift på blycitratopløsning.

Figure 2
Figur 2: Kontrastfarveskema med blycitrat og uranylacetatopløsninger . (A) Forbered petriskålene, en vendt på hovedet (i midten) med termoplastisk film, så dråber kan placeres over den, inde i en bredere. NaOH pellets er steder omkring den centrale skål. (B) Uranylacetatdråber placeres i cirklerne med bogstavet U, og blycitrat falder i cirklerne mærket L. DW angiver dråber destilleret vand. Gitterene farves sekventielt i kolonnen, så fem gitre kan farves samtidigt som repræsenteret. Klik her for at se en større version af denne figur.

10. Symbiotisk spiring af orkidéfrø

  1. Sørg for, at opløsningerne og alle de materialer, der anvendes til symbiotisk spiring af frø, er sterile for at undgå forurening. Start med at autoklavere dem i 20 minutter ved 121 °C. De symbiotiske spiringstrin er opsummeret i figur 3.
  2. Desinficer overfladisk frugt og frø ved at nedsænke dem i natriumhypochloritopløsning indeholdende 2% aktivt chlor i 10-15 minutter for frugt og 7-10 minutter for frø, i betragtning af stivheden og tykkelsen af frøbeklædning9. Slanke og skrøbelige frø kan nedsænkes i en 1:1 fortyndet natriumhypochloritopløsning. Vask derefter 3x i autoklaveret destilleret vand for at fjerne hypochloritopløsningen.
  3. Gendan frøene ved at filtrere i serigrafisk stof og brug frøene til at fortsætte med spiringstest (helst). Opbevar dem om nødvendigt i filterpapirkuverter i glaskolber med silicagel ved 4 °C, luk kolberne hermetisk og forsegl dem med husholdningsfilm. Overfør nogle dråber vand fra den sidste vask til kartoffel dextrose agar (PDA, 39 g / L) for at evaluere effektiviteten af vaskeprocessen.
  4. Før såning af frø i kulturmediet evalueres deres levedygtighed gennem tetrazoliumtesten (valgfrit) som beskrevet nedenfor35.
    1. Der inkuberes ca. 10 mg frø i et mikrocentrifugerør med 1 ml 10% saccharose i destilleret vand i 24 timer ved stuetemperatur (ca. 25 °C) i lys.
    2. Saccharoseopløsningen fjernes med en mikropipette, og der tilsættes 1 ml 1% tetrazoliumopløsning (triphenyltetrazoliumchlorid) i destilleret vand. Inkuberes ved 40 °C i en termoblok i 24 timer i mørke.
    3. Tetrazoliumopløsningen fjernes med en mikropipette og frøene vaskes med destilleret vand 2x eller indtil opløsningen er fjernet. Fjern alle væsker. Om nødvendigt kan frøene opbevares i fryseren i op til en uge (som i trin 10.3), før de analyseres.
    4. Resuspend frøene i destilleret vand og analyser dem under et lysmikroskop. Levedygtige frø erhverver lys til mørk rød farve, mens ikke-levedygtige frø bevarer deres naturlige farve.
  5. Udfør følgende tilpassede9 protokol til symbiotisk spiring af orkidéfrø.
    1. Inkuber frøene over autoklaverede filterpapirskiver (1-2 cm i diameter) anbragt i petriskåle med havregryn agar (OMA) kulturmedium (2,5 g / L havreflager og 7 g / L agar, pH 6).
    2. I midten af petriskålen podes et fragment af kulturmedium (ca. 1 cm2) indeholdende mycelium fra den valgte isolerede svamp til spiringsprocedure. Forsegl petriskålene med husholdningsfilm og inkuber dem i mørke ved omkring 25 °C eller stuetemperatur, da det er mere passende til svampevækst.
    3. Forbered nogle retter med frø og uden svampepodning som en negativ kontrol til spiringstesten.
  6. Analyser spiringsresultaterne ugentligt ved at indsamle kvantitative og kvalitative data og fotografere protocormer og frøplanter. Observationen af frø og protocormer bør udføres ved hjælp af et stereomikroskop for en mere præcis vurdering af spiring. Brug en lyskilde, der kommer nedenfra, da det giver mulighed for større kontrast, hvilket gør det lettere at skelne svampemyceliet fra protocormer.
    1. Indsamle prøver i forskellige udviklingsstadier og fiksere til anatomiske analyser (afsnit 1). Anvend alle de tidligere beskrevne billedanalyser til at undersøge svampeendofytter i frø, protocormer og frøplanter under spiring (lysmikroskopi - afsnit 4, 5 og 6; konfokal og fluorescens - afsnit 7; SEM og TEM - afsnit 8 og 9).
    2. Generer kvantitative resultater efter klassificering af faser i henhold til tabel 6. Stadierne beskriver den sædvanlige udvikling af frø fra mycoheterotrofiske orkideer. Indsaml data ugentligt og tabel med de indledende datoer for hvert observeret trin.
    3. Derudover indsamle kvantitative data, der estimerer spiringsprocent og hastighed. Tæl mindst 100 frø eller definer tællefelter35. Afgræns tre eller flere tællefelter pr. petriskål, der består af faste regioner med et standardiseret område, og evaluer ugentligt. Beregn indsamlede data i henhold til vækstindeksligningen (GI):
      Equation 1
      hvor N 0 er antallet af tællede frø i trin0 , henviser N 1 til trin1 , og det følger indtil trin 6 (registreret som N6)36.

Figure 3
Figur 3: Skematisk opsummering af symbiotisk spiring af frømetode. Skemaerne giver indikationer af detaljerede trin i protokollen. Forkortelser: OMA = havregryn agar, PDA = kartoffel dextrose agar. Klik her for at se en større version af denne figur.

Spiring fase Beskrivelse: __________
0 Ingen spiring
1 Hævelse af embryoet
2 Testa brud
3 Absorberende hår udvikler sig
4 Stem-projektion udvikler sig
5 Beskyttelse af vægte (skovle) udvikler sig
6 Første rødder udvikler sig

Tabel 6: Beskrivelse af protocormudviklingsstadier anvendt til periodiske analyser af spiringstest. Modificeret fra stadier beskrevet i Otero et al.36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter de væsentlige stadier af fastgørelse af plantevæv giver cellulære strukturer så ens som muligt til den levende tilstand i betragtning af morfologien, volumen og rumlig organisering af cellulære komponenter og væv16. Overhold sådanne træk i prøverne efter kemisk fiksering (figur 4). Figur 4C-F repræsenterer tilstrækkeligt faste prøver under lysmikroskopi. Efter de beskrevne fikseringsprocedurer og erhvervelse af kendskab til prøvestrukturen hjælper med at analysere fikseringssucces.

Figure 4
Figur 4: Overfladisk analyse og sektioner fra filiforme rødder af MH-orkidéen Wullschlaegelia aphylla (Sw.) Rchb.f. (A og B) Rhizomorphs i filiform rodoverflade. (C og D) Frihåndssektioner ikke farvede, evincing pelotoner i kortikale celler. (E og F) Tynde sektioner farvet med toluidinblå O. Forkortelser: en = endodermis, ep = epidermis, ct = cortex, hy = hypha, pc = parenchymatøs celle, pe = phloem elementer, pl = peloton, rfl = rod (filiform), rm = rhizomorph, vc = vaskulær cylinder, xe = xylem element. Skalastænger: A = 2 mm; B = 500 μm; C og E = 200 μm; D = 100 μm; F = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

I figur 4C anføres konstruktionernes regelmæssighed og fraværet af beskadigede områder i en frihåndssektion af en prøve fastsat med 10% NBF. Det cellulære volumen bevares, der ligner levende væv. Sammenligning med et frihåndsskåret frisk organ er også vigtigt for at genkende velfaste prøver. I figur 4E, F blev sektioner fra prøver indlejret i GMA-harpiks og fastgjort med 10% NBF farvet med toluidinblå O. Bemærk de velbevarede strukturer af cellevægge uden forvrængninger eller beskadigede områder, der viser meget lignende træk som i en frihåndssnittet prøve (figur 4C, D).

Ved analyse af overfladen af underjordiske organer indikerer tilstedeværelsen af rhizomorphs hyphae koloniserende indre væv. Rhizomorphs er vegetative strukturer sammensat af et aggregat af stærkt differentierede hyfer og dannet af nogle få svampearter, hovedsageligt saprotrofisk, der nedbryder træ37,38. Rhizomorphs kan let genkendes, normalt som mørke skostrenglignende strukturer37, set i figur 4A, B og figur 7D. Søgning efter disse svampestrukturer letter prøveudvælgelsen for at observere mønsteret af svampekolonisering i planteorganer. I figur 4C,D blev sektionerne opnået i områder med overfladiske rhizomorphs, mens der i figur 4E er vist et afsnit af det samme organ uden valg af sådant kriterium. Individualiserede hyfer kan også identificeres under et dissekerende mikroskop med en opfattende observation.

Figure 5
Figur 5: Frihåndssektioner af Uleiorchis sp. opbevaringsstruktur . (A) Sektion under et dissekerende mikroskop. (B) Pelotoner under et let mikroskop, koncentreret i et område af organets cortex. (C og D) Hyphae detaljer om de analyserede pelotoner. Forkortelser: hy = hypha, pc = parenkymatøs celle, pl = peloton, s = septa. Skalastænger: A = 2 mm; B = 500 μm; C og D = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Som tidligere forklaret kan frihåndssektionering foretrækkes i forhold til tynd sektionering afhængigt af målet. Frihånd eller andre metoder til opnåelse af tykkere sektioner (mere end 10 μm tykke) kan bedre vise pelotoner og give mere repræsentative billeder af svampemønstre for kolonisering (for eksempel figur 4C, D og figur 5A, B). Frihåndssektioner kan også være egnede til hyphaeanalyse i højere forstærkning, som vist i figur 5C, D, selvom detaljer bedre opnås i tyndere sektioner, som i figur 7A, fra en prøve indlejret i GMA-harpiks. Nogle detaljer om plantecellestrukturer observeres tilstrækkeligt i tynde sektioner, for eksempel figur 4F. Montering er også et vigtigt skridt, da billeder af bedre kvalitet kan afhænge af monteringsmediet. GMA-harpiksglas kan monteres i vand eller glycerin, selvom et kommercielt monteringsmedium (se Materialetabel) vil forbedre det endelige billede, da det udfylder ufuldkommenheder fra sektionsprocessen. I figur 6C kan der ses ufuldkommenheder (pilespidser) i en GMA-harpikssektion, da rutsjebanen var monteret med vand.

Figure 6
Figur 6: Sektioner af fusiforme rødder af W. aphylla farvet med Lugol-opløsning. (A) Frihåndssektion farvet med toluidinblå O og Lugol. (B) Kun farvet med toluidinblå O. (C) Tyndt snit i GMA-harpiks farvet med lactophenol bomuldsblå og Lugol, pilespidser: ufuldkommenheder fra uregelmæssigheder i bladet. (D) Frihåndssektion kun farvet med Lugol. Forkortelser: cw = cellevæg, pc = parenkymatøs celle, sg = stivelseskorn, vc = vaskulær cylinder. Skala søjler: A = 200 μm; B og C = 100 μm; D = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Den største fordel ved at bruge toluidinblå O (mere passende resultater i tynde sektioner) er de vigtige metakromatiske egenskaber ved denne plet, hvilket betyder, at den erhverver forskellige farver afhængigt af den cellulære komponent, den binder til og fungerer som en polykromatisk plet, der er egnet til at differentiere forskellige sammensætninger af cellevægge23. I figur 4F kan sekundære cellevægge i xylemelementer let identificeres ved den lyse farve, toluidin erhverver. I mellemtiden identificeres phloemelementer, der kun består af primære cellevægge, ved deres tyndere og mørkere cellevægge. En anden vigtig plet, hovedsageligt i betragtning af MH-planter, er Lugol-opløsning, da stivelseskorn let identificeres, når de farves af det. Afsnit er repræsenteret i figur 6A-D: frihåndssektion farvet med toluidinblå O og Lugol i figur 6A og kun toluidinblå O i figur 6B; tyndt afsnit i GMA-harpiks farvet med lactophenol bomuldsblå og Lugol i figur 6C; frihåndssektion kun farvet med Lugol i figur 6D.

Inkubation af frihånd (figur 7C), GMA-harpiks (figur 7B) eller OCT-sektioner med WGA-fluorokromkonjugat og Calcofluor White kan forbedre strukturerne i henholdsvis svampecellevæggen og plantecellevæggen. Det er en vigtig metode til bekræftelse af hyfer, da WGA-konjugat har specificitet over for N-acetylglucosaminylrester, der findes i svampens cellevæg. Figur 7A viser en sektion af blomsterstilk farvet med toluidinblåt O, mens figur 7B er fra samme organ og bekræfter, at strukturerne i figur 7A er hyfer. Artefakter ved autofluorescens kan ses i GMA-harpiksafsnit (pilespidser, figur 7B). Disse artefakter er normalt relateret til fluorokromkoncentration og kan undgås ved at vaske prøverne flere gange med bufferen. I figur 7C vises en frihåndssektion af rod med interne og eksterne hyfer. Det samme organ kan ses af SEM i figur 7D, med en overflod af rhizomorphs og individuelle hyfer på overfladen. Tilstrækkelige SEM-mikrografer har god kontrast mellem gråtoner, så tridimensionalitet kan ses og fortolkes godt. Vælg repræsentative billeder og undgå vildledende (yderligere læsning: tips til valg af elektronmikrografer32).

Figure 7
Figur 7: Sektioner fra blomsterstammen og filiformrødderne af W. aphylla og overfladisk analyse af filiformrod ved SEM. (A) Tynd sektion af blomsterstammen i GMA-harpiks, farvet med toluidinblå O. (B) Tynd sektion af blomsterstamme i GMA-harpiks inkuberet med WGA-fluorokromkonjugat + Calcofluor White, pilespidser: artefakter ved autofluorescens. (C) Frihåndssektion af filiform rod inkuberet med WGA-fluorokromkonjugat + Calcofluor White. (D) Scanning elektronmikrograf af filiform rodoverfladen. Forkortelser: cw = cellevæg, hy = hy = hyfer, pc = parenkymatøs celle, pl = peloton, rfl = rod (filiform), rm = rhizomorph. Skalabjælker: A, C og D = 100 μm; B = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Frugter fra forskellige orkidéarter blev nedsænket i natriumhypochlorit med 2% aktivt klor i 15 minutter for at garantere fuldstændig overfladisk desinfektion af organerne (figur 8A). Frø med mere stive frølag fra Vanilla sp. (figur 8A) og Pogoniopsis schenckii (figur 9B-D) blev nedsænket i den samme opløsning i 10 minutter (figur 8C), mens slankere, som fra Laelia sp. og Cattleya sp., blev opretholdt i 7 minutter (figur 9A). Overførsel af en aliquot vand fra den sidste vask bekræftede effektiviteten af desinfektionsprocessen, inden man fortsatte til spiringstestene i betragtning af begge varigheder af nedsænkning beskrevet.

Figure 8
Figur 8: Overfladisk desinfektion af frugt og frø af Vanilla panifolia, en fotosyntetisk orkidéart . (A) Nedsænkning af frugt i natriumhypochlorit med aktivt chlor. (B) Frugter i længderetningen. C) Frø filtreret med serigrafisk stof efter nedsænkning i natriumhypochlorit, klar til at blive sået eller opbevaret i silicagel. Klik her for at se en større version af denne figur.

Såning af frøene over filterpapirskiver sikrer, at der er nok fugtighed og ilt til spiring og embryoudvikling (figur 9A-D) uden at blive helt nedsænket under det overfladiske vandlag fra kulturmediet. Nogle svampeisolater kan vokse kraftigt over frøene. Mediet, der indeholder 2 g/l knuste havreflager, giver bedre kontrol med svampevæksten, hvilket forbedrer visualiseringen og analysen af frø (figur 9B). Efter ca. 50-60 dages isolatpodning skal mediet fornyes, så svampen forbliver aktiv. Dette kan gøres ved at overføre frøene til et nyt OMA-medium med samme formulering. Frøene kan overføres med filterpapiret, hvilket letter deres overførsel uden at beskadige protocorms sarte strukturer, udover at holde dem i den oprindelige position uden at gå på kompromis med de tidligere etablerede tællefelter.

Figure 9
Figur 9: Protokol for symbiotisk spiring . (A) Frø arrangeret over filterpapir i OMA-medium. (B) Petriskåle med frø og en podet svamp (potentielt mycorrhizal), inkuberet i ca. 21 dage. (C og D) Symbiotiske spiringsretter med forskellige svampeisolater. Klik her for at se en større version af denne figur.

De fleste orkidéarter spirer inden for nogle uger efter at være blevet inficeret af den podede svamp eller indtil næsten mere end en måned (figur 10). Frø, der ikke spirer inden for 3 måneder, vil sandsynligvis ikke spire, medmindre metoden justeres. I sådanne tilfælde skal du overveje muligheder som frødvale eller svampeisolatet, der ikke er mycorrhizal. Nogle arter har brug for specifikke protokoller for at bryde dvale, andre præsenterer simpelthen en høj specificitet for visse mycorrhizal partnere, forskellige fra dem, der er valgt til den symbiotiske spiringstest (data ikke offentliggjort).

Figure 10
Figur 10: Pogoniopsis schenckii frø, en achlorophyllous og MH orkidé, i OMA medium med svampepode39 i stand til at stimulere spiring. (A-D) Ikke spirede frø og protocormer i forskellige udviklingsstadier. Forkortelser: ng = ingen spiring, pt = protocorm, ri = bristet integument, ts = turgid frø. Skalabjælker = 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

I de første par uger efter podning af isolatet evalueres opvasken, da det normalt tager 7-14 dage, før hyferne opnår frøene. Overvej denne periode, da det er overvejende at begynde at registrere udviklingen af embryonerne. De subtile ændringer under spiringsstadier kan kun detekteres under et dissekerende mikroskop, i betragtning af at strukturerne er så små. Nogle arter protocorms skal analyseres under et lysmikroskop for at identificere absorberende hår og fortælle dem bortset fra hyfer. GI-analyse kan give mere sandsynligt sammenlignelige resultater, generere en repræsentation af indsamlede data og give mere vægt til værdier svarende til mere avancerede spiringstrin. De endelige værdier kan variere mellem nul og seks (eller i henhold til det sidste trin, der er defineret). Forskellige statistiske tests kan anvendes til GI-analyser (f.eks. ANOVA, signifikansniveau), afhængigt af forskerens spørgsmål og krav, når der udføres symbiotiske spiringstest.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Billedanalyser i planteanatomi og morfologi har et vigtigt potentiale til at opfylde mål og hjælpe med at forstå forholdet mellem mycoheterotrofe planter og deres uundværlige svampeendofytter, som det fremgår af undersøgelser af underjordiske organer 6,40, strukturelle analyser af symbiotisk spiring af frø39 og luft- og reproduktionsstrukturer 41 . Strukturel botanik, på trods af at have mistet sin prestige og plads til andre områder inden for plantevidenskab i det sidste årti1, er stadig fremtrædende i at besvare spørgsmål og hjælpe med at afsløre nyheder og væsentlige planteegenskaber relateret til udvikling, økologi, fysiologi og evolution. Disse metoder er samlet set et grundlag for strukturelle undersøgelser af planter, idet der tages hensyn til vigtige aspekter af MH-planteanalyse.

Der gives væsentlige oplysninger til omhyggeligt at indsamle MH-planter, da ellers kan de veludviklede underjordiske organer blive beskadiget og ikke fuldstændigt indsamlet. Bemærkelsesværdige tilpasninger af disse strukturer6 og den intime kontakt med svampe fra jord, der er forbundet med autotrofe planter42 eller nedbrydende bladkuld40, skal overvejes ved indsamling og bevarelse af de underjordiske strukturer. De væsentlige trin i prøvefiksering skal følges på passende vis med hensyn til korrekt forberedelse af fikseringsmidler og tidsproblemer, minimumstid, der kræves mellem indsamling og fastgørelse, og minimumstid, der kræves i fikseringsmidlet, før der fortsættes til opbevaring. Strukturel analyse af velbevarede prøver afhænger af fikseringsprocessen, og de mest almindelige og bedst bevarende fikseringsmidler, der anvendes til undersøgelse af planteanatomi og elektronmikroskopi, er beskrevet i protokolafsnittet. Andre fikseringsmidler14,16,25 kan også anvendes.

Som tidligere nævnt er processen med at anvende kemiske fikseringsmidler afgørende og kan evalueres ved opnåelse af prøvebilleder. I LM bør cellulære strukturer være så ens som muligt i sammenligning med levende væv16. Volumen, morfologi og rumlig disposition af identificerbare cellulære komponenter skal ligne så meget som muligt til det friske væv (ikke-fast). I TEM kan velbevarede væv ses, når tonoplasten er synlig, med glatte konturer og ikke trækkes væk fra cytoplasmaet16. Plasmamembranen kan ikke løsnes og krympes væk fra cellevæggen. Prøver til TEM skal indsamles så tyndt som muligt og inde i en dråbe fikseringsmiddel, som forklaret i protokolafsnittet. Anvendelsen af buffere forbundet med fikseringsmidler giver vigtige betingelser for osmolaritet og ionisk sammensætning til prøverne, der fastgøres, idet man undgår så mange ændringer som muligt i cellulær struktur og ultrastruktur16. I SEM er en stor bekymring med isotoniske fikseringsmidler og forberedelse af dem med buffere, så der er ingen væsentlige ændringer i prøvevolumen (hævelse eller krympning)16.

Mange forskellige indlejringsmetoder til LM er tilgængelige for at få sektioner til forskellige formål. I betragtning af farvning og fluorescerende farvestoffer inkubation præsenteres to vigtige metoder til at analysere MH-planteorganer. De ovenfor beskrevne (frihåndsafsnit, GMA-harpiks og OCT-indlejring) er blandt de mest almindelige og enkle, hvilket giver metodologisk frihed og egnethed til mange typer analyser. Den konjugerede WGA-fluorokrom har et betydeligt potentiale i MH-planteundersøgelser, da den i øjeblikket anvendes mere på svampepatogener28,29,30 og næppe anvendes med MH-planter svampeendofytter. De grundlæggende og væsentlige trin til scanning og transmission elektronmikroskopi er detaljerede, da disse teknikker i høj grad kan bidrage til den strukturelle analyse af planter. SEM- og TEM-litteratur er rig, og yderligere læsning 32,33,34,43 anbefales, hvis andre typer elektronmikroskopianalyser skal testes.

Med hensyn til symbiotiske spiringsprocedurer er det muligt at udføre frugt asepsis før dehiscens uden behov for at desinficere frøene direkte. Frø fra frugter, der allerede er åbne eller koloniseret af endofytter (allerede beskrevet for MH-arter39,41), skal dog desinficeres direkte. En vigtig bemærkning: tid og betingelser for opbevaring og asepsisprocesser kan reducere levedygtigheden af frøene fra nogle arter som observeret under udførelsen af disse eksperimenter. Tetrazoliumreagens giver en farve, der spænder fra lys til mørkerød til embryoner fra levedygtige frø. Embryoner fra ikke-levedygtige frø forbliver med deres naturlige farve. Frø med stærkt pigmenterede tegumenter eller stive frøfrakker kan have brug for en forbehandling inden spiringstesten. Det anbefales at udføre scarification af deres tegument, hvilket muliggør visualisering af embryoet35.

Nogle potentielle mycorrhizal svampeisolater fra tropiske orkideer, for eksempel Ceratobasidium-arter , har en kraftig og accelereret vækst i et næringsrigt kulturmedium. Under behandlingen er det muligt, at isolaterne helt dækker frøene, når de vokser, hvilket gør dataindsamling vanskelig eller endda umulig. Den almindeligt anvendte protokol indeholdende 4 g/l knuste havreflager9 forhindrede dataindsamling ved symbiotisk spiring af P. schenckii, hvilket krævede en adequation til 2 g/l knuste havreflager39. Brug af ca. 2,5 g / l havreflager til at komponere OMA-medium i symbiotisk spiring synes at være tilfredsstillende med hensyn til at begrænse væksten af kraftigere svampeisolater (upublicerede data).

Begrænsninger kan opstå som følge af de beskrevne metoder, hvoraf nogle effektivt kan overvindes ved at tilpasse procedurerne eller anvende andre metoder. Som diskuteret før er GMA-indlejring kun effektiv til sektionering op til 8 μm tyk. OCT-indlejring giver dog forskellige tykkelsessektioner, herunder tykkere (f.eks. 10-20 μm). Farvning af kun svampestrukturer i plantevæv er ikke let udført, selvom WGA-fluorokrom er et vigtigt og effektivt konjugeret fluorkrom, der markerer svampecellevægge, selvom det er dyrt. Andre omkostningsbegrænsninger kan opstå i SEM- og TEM-metoder, da udstyrets høje omkostninger og væsentlighed gør sådanne analyser ikke trivielle og sædvanlige for enhver forskningsgruppe. Den symbiotiske spiring af frøtest, selvom de er enkle og billigere, kræver mycorrhizal svampe til at inokulere frøene og omhyggelige procedurer for at undgå forurening.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker finansiering fra FAEPEX og FAPESP (2015/26479-6). MPP takker Capes for sit kandidatgradsstipendium (proces 88887.600591/2021-00) og CNPq. JLSM takker CNPq for produktivitetstilskud (303664/2020-7). Forfatterne takker også adgangen til udstyr og bistand fra LME (Laboratory of Electron Microscopy - IB / Unicamp), INFABiC (National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology - Unicamp) og LaBiVasc (Laboratory of Vascular Biology - DBEF / IB / Unicamp); LAMEB (UFSC) og Eliana de Medeiros Oliveira (UFSC) for bidrag til kryobeskyttelsesprotokollen LME for bidrag til TEM-protokollen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma-Aldrich 179124 (for SEM stubs mounting)
Agar-agar (AA) Sigma-Aldrich A1296 (for seeds germination tests)
Calcofluor White Stain Sigma-Aldrich 18909 fluorescent dye (detects cellulose)
Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8 Sigma-Aldrich C2488 (for toluidine blue O staining)
Conductive Double-Sided Carbon Tape Fisher Scientific 50-285-81 (for SEM)
Confocal Microscope Zeiss (any model)
Copper Grids Sigma-Aldrich G4776 (for TEM)
Critical-point dryer Balzers (any model)
Cryostat Leica Biosystems (any model)
Dissecting microscope Leica Biosystems (= stereomicroscope, any model)
Entellan Sigma-Aldrich 107960 rapid mounting medium for microscopy
Ethyl alcohol, pure (≥99.5%) Sigma-Aldrich 459836 (= ethanol, for dehydration processes)
Formaldehyde solution, 37% Sigma-Aldrich 252549 (for NBF solution preparation)
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128 histological tissue fixative
Gelatin capsules for TEM Fisher Scientific 50-248-71 (for resin polymerisation in TEM)
Gelatin solution, 2% in H2O Sigma-Aldrich G1393 (dilute for slides preparation - OCT adherence)
Glutaraldehyde solution, 25% Sigma-Aldrich G6257 (for Karnovsky’s solution preparation)
HistoResin Leica Biosystems 14702231731 glycol methacrylate (GMA) embedding kit
Iodine Sigma-Aldrich 207772 (for Lugol solution preparation)
Lead(II) nitrate Sigma-Aldrich 228621 Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)
Light Microscope Olympus (any model)
LR White acrylic resin Sigma-Aldrich L9774 hydrophilic acrylic resin for TEM
Lugol solution Sigma-Aldrich 62650 (for staining)
Metal stubs for specimen mounts Rave Scientific (for SEM, different models)
Microtome Leica Biosystems manual rotary microtome or other model
Oatmeal agar (OMA) Millipore O3506 (for seeds germination tests)
OCT Compound, Tissue-Tek Sakura Finetek USA 4583 embedding medium for frozen tissues
Osmium tetroxide Sigma-Aldrich 201030 OsO4 (for TEM postfixation)
Parafilm M Sigma-Aldrich P7793 sealing thermoplastic film
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 (for Karnovsky’s solution preparation)
Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O Sigma-Aldrich P8920 (for slides preparation - OCT adherence)
Poly-Prep Slides Sigma-Aldrich P0425 poly-L-lysine coated glass slides
Polyethylene Molding Cup Trays Polysciences 17177A-3 (6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Polyethylene Molding Cup Trays Polysciences 17177C-3 (13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Potassium iodide Sigma-Aldrich 221945 (for Lugol solution preparation)
Potato Dextrose Agar (PDA) Millipore 70139 (for seeds germination tests)
Scanning Electron Microscope Jeol (any model)
Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane] Sigma-Aldrich A3648 (for slides preparation - OCT adherence)
Silane-Prep Slides Sigma-Aldrich S4651 glass slides coated with silane
Silica gel orange, granular Supelco 10087 (for dessicating processes)
Sodium cacodylate trihydrate Sigma-Aldrich C0250 (for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881 NaOH (for Karnovsky’s solution preparation and TEM contrast staining)
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 425044 NaClO (for seeds surface disinfection)
Sodium phosphate dibasic, anhydrous Sigma-Aldrich 71640 Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich S9638 NaH2PO4·H2O (for NBF and PB)
Sputter coater Balzers (any model)
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)
Sudan III Sigma-Aldrich S4131 (for staining)
Sudan IV Sigma-Aldrich 198102 (for staining)
Sudan Black B Sigma-Aldrich 199664 (for staining)
Syringe (3 mL, any brand, for TEM contrast staining)
Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 µm Millipore SLGV033R PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)
Tek Bond Super Glue 793 Tek Bond Saint-Gobain 78072720018 liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity
Toluidine Blue O Sigma-Aldrich T3260 (for staining)
Transmission Electron Microscope Jeol (any model)
Triphenyltetrazolium chloride Sigma-Aldrich T8877 (for the tetrazolium test in seeds germination)
Trisodium citrate dihydrate Sigma-Aldrich S1804 Na3(C6H5O7)·2H2O (for TEM contrast staining)
Ultramicrotome Leica Biosystems (any model)
Uranyl acetate Fisher Scientific 18-607-645 UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)
Vacuum pump (any model)
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate TermoFisher Scientific W11261 fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Evert, R. F. Esau’s Plant Anatomy: Meristems, Cells, and Tissues of the Plant Body: Their Structure, Function, and Development. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ, USA. (2006).
  2. Yeung, E. C. T., Stasolla, C., Sumner, M. J., Huang, B. Q. Plant Microtechniques and Protocols. , Springer International Publishing. Cham, Switzerland. (2015).
  3. Sokoloff, D. D., Jura-Morawiec, J., Zoric, L., Fay, M. F. Plant anatomy: at the heart of modern botany. Botanical Journal of the Linnean Society. 195 (3), 249-253 (2021).
  4. Leake, J. R. The biology of myco-heterotrophic (‘saprophytic’) plants. New Phytologist. 127 (2), 171-216 (1994).
  5. Bidartondo, M. I. The evolutionary ecology of myco-heterotrophy. New Phytologist. 167 (2), 335-352 (2005).
  6. Imhof, S., Massicotte, H. B., Melville, L. H., Peterson, R. L. Subterranean morphology and mycorrhizal structures. Mycoheterotrophy. , Springer. New York, NY. 157-214 (2013).
  7. Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style. Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).
  8. Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jersáková, J., Těšitelová, T. Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements. Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).
  9. Zettler, L. W. Terrestrial orchid conservation by symbiotic seed germination: techniques and perspectives. Selbyana. 18 (2), 188-194 (1997).
  10. Stewart, S. L., Kane, M. E. Symbiotic seed germination and evidence for in vitro mycobiont specificity in Spiranthes brevilabris (Orchidaceae) and its implications for species-level conservation. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. 43 (3), 178-186 (2007).
  11. Zhao, D. -K., et al. Orchid reintroduction based on seed germination-promoting mycorrhizal fungi derived from protocorms or seedlings. Frontiers in Plant Science. 12, 701152 (2021).
  12. Selosse, M. A., Roy, M. Green plants that feed on fungi: facts and questions about mixotrophy. Trends in Plant Science. 14 (2), 64-70 (2009).
  13. Merckx, V. S. F. T., Mennes, C. B., Peay, K. G., Geml, J. Evolution and diversification. Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , Springer. New York, NY. 215-244 (2013).
  14. Boon, M. E., Drijver, J. Routine Cytological Staining Techniques: Theoretical Background and Practice. Macmillan International Higher Education. , Hampshire, UK. (1986).
  15. Karnovsky, M. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27 (2), 137-138 (1964).
  16. Hayat, M. Fixation for Electron Microscopy. , Academic Press. New York, USA. (1981).
  17. Roland, J. C., Vian, B. General preparation and staining of thin sections. Electron Microscopy of Plant Cells. 1, 675 (1991).
  18. Gerrits, P. O., Horobin, R. W. Glycol methacrylate embedding for light microscopy: basic principles and trouble-shooting. Journal of Histotechnology. 19 (4), 297-311 (1996).
  19. Zhang, Z., Niu, L., Chen, X., Xu, X., Ru, Z. Improvement of plant cryosection. Frontiers in Biology. 7 (4), 374-377 (2012).
  20. BeneŠ, K. On the media improving freeze-sectioning of plant material. Biologia Plantarum. 15 (1), 50-56 (1973).
  21. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Preparation of slides and coverslips for microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), (2008).
  22. Sakai, W. S. Simple method for differential staining of paraffin embedded plant material using toluidine blue O. Stain Technology. 48 (5), 247-249 (1973).
  23. O’Brien, T., Feder, N., McCully, M. E. Polychromatic staining of plant cell walls by toluidine blue O. Protoplasma. 59 (2), 368-373 (1964).
  24. Ventrella, M. C., Almeida, A. L., Nery, L. A., Coelho, V. P. deM. Métodos Histoquímicos Aplicados às Sementes. Universidade Federal de Viçosa. , Viçosa, Brazil. (2013).
  25. Pearse, A. G. E. Histochemistry, Theoretical and Applied. , J & A Churchill. London, UK. (1960).
  26. Andrade-Linares, D. R., Franken, P. Fungal endophytes in plant roots: taxonomy, colonization patterns, and functions. Symbiotic Endophytes. , Springer. Berlin. 311-334 (2013).
  27. Wymer, C. L., Beven, A. F., Boudonck, K., Lloyd, C. W. Confocal microscopy of plant cells. Confocal Microscopy Methods and Protocols. , Humana Press. Totowa. 103-130 (1999).
  28. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. Manual de Técnicas Aplicadas à Histopatologia Vegetal. FEALQ. , Piracicaba, Brazil. (2021).
  29. Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera. European Journal of Plant Pathology. 154 (4), 1185-1193 (2019).
  30. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum. Frontiers in Plant Science. 9, 698 (2018).
  31. Jeffree, C. E., Read, N. D. Ambient-and low-temperature scanning electron microscopy. Electron Microscopy of Plant Cells. , 313-413 (1991).
  32. Bozzola, J. J., Russell, L. D. Electron Microscopy: Principles and Techniques for Biologists. , Jones & Bartlett Learning. Sudbury, MA, USA. (1999).
  33. Murray, S. Basic transmission and scanning electron microscopy. Introduction to electron Microscopy for Biologists. , Academic Press. 3-18 (2008).
  34. Tanaka, M. Glossary of TEM terms. , Available from: https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/ (2021).
  35. Seaton, P. T., et al. Orchid seed and pollen: a toolkit for long-term storage, viability assessment and conservation. Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses—Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 71-98 (2018).
  36. Otero, J. T., Ackerman, J. D., Bayman, P. Differences in mycorrhizal preferences between two tropical orchids. Molecular Ecology. 13 (8), 2393-2404 (2004).
  37. Koch, R. A., et al. Marasmioid rhizomorphs in bird nests: Species diversity, functional specificity, and new species from the tropics. Mycologia. 112 (6), 1086-1103 (2020).
  38. Webster, J., Weber, R. Introduction to Fungi. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
  39. Sisti, L. S., et al. The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn. Frontiers in Plant Science. 10, 1589 (2019).
  40. Martos, F., et al. Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids. New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).
  41. Alves, M. F., et al. Reproductive development and genetic structure of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn. BMC Plant Biology. 21 (1), 332 (2021).
  42. Merckx, V. S. F. T. Mycoheterotrophy: an introduction. Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , 1-17 (2013).
  43. Hall, J. L., Hawes, C. Electron Microscopy of Plant Cells. , Academic Press. Cambridge, UK. (1991).

Tags

Biologi udgave 183 kryosektioner endofytiske svampe lysmikroskopi mikrotomi mycoheterotrofe planter planteanatomi scanningselektronmikroskopi frøspiring farvningsteknikker symbiotisk spiring transmissionselektronmikroskopi hvedekimagglutininkonjugat
Mikroskopiteknikker til fortolkning af svampekolonisering i mycoheterotrofiske plantevæv og symbiotisk spiring af frø
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pena-Passos, M., Sisti, L. S.,… More

Pena-Passos, M., Sisti, L. S., Mayer, J. L. S. Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds. J. Vis. Exp. (183), e63777, doi:10.3791/63777 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter