Mikroskopische Techniken zur Interpretation der Pilzbesiedlung in mykoheterotrophen Pflanzengeweben und der symbiotischen Keimung von Samen

Summary

Dieses Protokoll zielt darauf ab, detaillierte Verfahren zum Sammeln, Fixieren und Pflegen mykoheterotropher Pflanzenproben bereitzustellen, wobei verschiedene Mikroskopietechniken wie Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie, Licht-, Konfokal- und Fluoreszenzmikroskopie angewendet werden, um die Pilzbesiedlung in Pflanzengeweben und Samen zu untersuchen, die mit Mykorrhizapilzen gekeimt sind.

Abstract

Strukturelle Botanik ist eine unverzichtbare Perspektive, um die Ökologie, Physiologie, Entwicklung und Evolution von Pflanzen vollständig zu verstehen. Bei der Erforschung mykoheterotropher Pflanzen (d.h. Pflanzen, die Kohlenstoff aus Pilzen gewinnen) können bemerkenswerte Aspekte ihrer strukturellen Anpassungen, die Muster der Gewebebesiedlung durch Pilze und die Morphoanatomie unterirdischer Organe ihre Entwicklungsstrategien und ihre Beziehungen zu Hyphen, der Quelle von Nährstoffen, aufklären. Eine weitere wichtige Rolle symbiotischer Pilze hängt mit der Keimung von Orchideensamen zusammen; Alle Orchidaceae-Arten sind während der Keimung und des Keimlingsstadiums (anfängliche Mykoheterotrophie) mykoheterotroph, auch diejenigen, die in erwachsenen Stadien Photosynthese betreiben. Aufgrund des Mangels an Nahrungsreserven in Orchideensamen sind Pilzsymbionten unerlässlich, um Substrate bereitzustellen und die Keimung zu ermöglichen. Die Analyse der Keimungsstadien nach strukturellen Perspektiven kann auch wichtige Fragen zur Interaktion der Pilze mit den Samen beantworten. Verschiedene bildgebende Verfahren können angewendet werden, um Pilzendophyten in Pflanzengeweben zu enthüllen, wie in diesem Artikel vorgeschlagen. Freihändige und dünne Schnitte von Pflanzenorganen können gefärbt und anschließend lichtmikroskopisch beobachtet werden. Ein mit Weizenkeimagglutinin konjugiertes Fluorochrom kann auf die Pilze aufgetragen und mit Calcofluor White co-inkubiert werden, um Pflanzenzellwände in der konfokalen Mikroskopie hervorzuheben. Darüber hinaus werden die Methoden der Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie für mykoheterotrophe Orchideen detailliert beschrieben und die Möglichkeiten der Anwendung solcher Protokolle in verwandten Pflanzen untersucht. Die symbiotische Keimung von Orchideensamen (d.h. in Gegenwart von Mykorrhizapilzen) wird im Protokoll ausführlich beschrieben, ebenso wie Möglichkeiten, die aus verschiedenen Keimungsstadien erhaltenen Strukturen für Analysen mit Licht-, Konfokal- und Elektronenmikroskopie vorzubereiten.

Introduction

Strukturforschung in der Botanik, die Pflanzenmorphologie und Anatomie abdeckt, ist grundlegend für das Verständnis des gesamten Organismus^1,2 und bietet unverzichtbare Perspektiven, um Wissen über die Ökologie^, Physiologie, Entwicklung und Evolution von Pflanzen zu integrieren und dazu beizutragen³. Methoden in der Pflanzenmorphologie und Anatomie umfassen derzeit Protokolle, Geräte und Kenntnisse, die in jüngster Zeit sowie vor mehr als einem Jahrhundert entwickelt wurden². Die kontinuierliche Durchführung und Anpassung klassischer Methoden (z.B. Lichtmikroskopie) sowie neuerer Techniken (z.B. konfokale Mikroskopie, Röntgenmikrotomographie) haben die gleiche wesentliche Grundlage: theoretisches Wissen, das die Entwicklung einer Methodik ermöglicht.

Das Hauptwerkzeug in der Pflanzenanatomie und -morphologie ist das Bild. Trotz des Missverständnisses, dass es sich bei solchen Analysen um einfache Beobachtungen handelt, die subjektiven Interpretationen Raum geben², erfordert die Analyse und das Verständnis von Bildern in diesem Bereich Kenntnisse der angewandten Methoden (Ausrüstung, Art der Analyse, methodische Verfahren), der Zellbestandteile, der Histochemie und des Pflanzenkörpers (Gewebeorganisation und -funktion, Ontogenese, morphologische Anpassungen). Die Interpretation der mit einer Vielzahl von Methoden erhaltenen Bilder kann dazu führen, Form und Funktion zu korrelieren, die chemische Zusammensetzung einer Struktur zu entschlüsseln, die Beschreibung von Taxa zu bestätigen, Infektionen durch Phytopathogene zu verstehen und andere solche Bewertungen.

Bei der Erforschung mykoheterotropher (MH) Pflanzen (d.h. nicht-photosynthetischer Pflanzen, die Kohlenstoff aus Mykorrhizapilzen gewinnen^4,5), können bemerkenswerte Aspekte ihrer strukturellen Anpassungen, die Muster der Gewebebesiedlung durch Pilze und die Morphoanatomie unterirdischer Organe ihre Entwicklungsstrategien und Beziehungen zu Hyphen^, die die Quelle von Nährstoffen sind, aufklären. Die unterirdischen Organe von MH-Pflanzen zeigen in der Regel wichtige Anpassungen im Zusammenhang mit ihrer Assoziation mit Bodenpilzen, daher ist es wichtig, diese anatomischen und morphologischen Untersuchungen durchzuführen⁶. Die Luftorgane von MH-Arten sollten nicht ignoriert werden, da in diesen Geweben auch Endophyten vorhanden sein können, auch wenn es sich nicht um Mykorrhizapilze handelt (persönliche Beobachtungen, noch nicht veröffentlicht).

Neben der gut etablierten Wesentlichkeit der Assoziation von Mykorrhizapilzen mit MH-Arten während ihres gesamten Lebenszyklus⁷ hat jede Orchideenart, auch die autotrophen, ein initiales obligates mykoheterotrophes Stadium in natürlichen Umgebungen. Es tritt auf, weil der Embryo der Orchideen undifferenziert ist und kein Endosperm oder Keimblätter aufweist, so dass er ohne die Ernährungsunterstützung von Pilzpartnern nicht in der Lage ist, sich in natürlichen Umgebungen zu entwickeln und zu etablieren ^4,8. In Anbetracht dessen können symbiotische Keimungsprotokolle nicht nur auf MH-Arten, sondern auch auf photosynthetisierende Orchideen angewendet werden, um die Spezifität von Orchideen und Pilzen bei der Keimung und Protocormentwicklung zu untersuchen, eine weitgehend angewandte Methodik in Initiativen zur Erhaltung bedrohter Arten 9,10,11.

In dieser Methodenmontage beschreiben wir wichtige Schritte zur Entnahme, Fixierung und Lagerung von MH-Pflanzenproben für anatomische Studien (Abschnitt 1), Oberflächenanalyse und Probenauswahl (Abschnitt 2), Schnittmethoden (Freihand: Abschnitt 3, Mikrotomie: Abschnitt 4, Kryomikrotomie: Abschnitt 5), Färbung und Montage (Abschnitt 6), Fluoreszenz- und Konfokalmikroskopie von Pilzendophyten (Abschnitt 7), Rasterelektronenmikroskopie (Abschnitt 8), und Transmissionselektronenmikroskopie (Abschnitt 9). Darüber hinaus beschreiben wir eine symbiotische Keimungsmethode für Orchideensamen (MH und autotroph, Abschnitt 10), da die zuvor genannten bildgebenden Verfahren erfolgreich angewendet werden können, um die Pilzbesiedlung von Samen, Protocormen und Keimlingen im Keimprozess zu analysieren.

Abbildung 1: Schematische Zusammenfassung bildgebender Verfahren. Die Schaltpläne geben Hinweise auf Protokollschritte, in denen sie detailliert sind. Abkürzungen: GMA = Glykolmethacrylat, OCT = optimale Schnitttemperaturverbindung, REM = Rasterelektronenmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Den hier im Detail beschriebenen Mikroskopietechniken (Abbildung 1) gehen folgende wesentliche Schritte voraus: Sammeln, Fixieren, Dehydrieren, Einbetten und Schneiden von Proben. Da die Schritte je nach gewählter Technik(en) unterschiedlich sind (Abbildung 1), ist es wichtig, vorausschauend zu denken und zu berücksichtigen, welche Fixiermittel vorbereitet und zur Sammelstelle transportiert werden sollen, wie die Proben vor der Fixierung vorbereitet werden müssen, welche Dehydratisierungsverfahren anzuwenden sind (Abschnitt 1) und welche Möglichkeiten und Schnittmethoden es gibt (Abschnitte 4, 5, und 9). Abbildung 1 fasst nacheinander alle Schritte zusammen, die für jede unten beschriebene Mikroskopietechnik erforderlich sind.

Protocol

1. Sammeln, Reparieren und Pflegen von Mustern

ANMERKUNG: Voll-MH-Pflanzen können normalerweise im dunklen Waldunterholz 12,13 gefunden werden, hauptsächlich in feuchten und streureichen Gebieten, während MH-Pflanzen teilweise in offeneren Wäldern ^12,13 gefunden werden können. MH-Pflanzen haben in der Regel gut entwickelte unterirdische Organe in einer Vielzahl von Formen und Größen.

1. Erkunden Sie beim Sammeln von MH-Arten den Boden um die Pflanzenbasis, achten Sie darauf, die unterirdischen Organe nicht zu beschädigen, und vermeiden Sie es, die Pflanzen vom Boden zu ziehen, um zu verhindern, dass die Luftorgane von den unterirdischen getrennt werden.
2. Graben Sie vorsichtig mit einer Gartenkelle um Luftstrukturen herum, während Sie die unterirdischen Organe wie Wurzeln, Stängel, Rhizome und Speicherorgane erkunden, ohne diese Strukturen zu beschädigen.
3. Entfernen Sie Bodenpartikel, um zerbrechliche Strukturen zu erhalten, und waschen Sie diese Organe vorsichtig mit Leitungswasser, um die verbleibenden Bodenpartikel abzuspülen, bevor Sie die Proben fixieren.
4. MH-Pflanzen, die mit Laubstreu verbunden sind, erfordern besondere Aufmerksamkeit; Sammeln Sie sorgfältig Organe, die durch ihre Hyphen mit dem zersetzenden Material verbunden sind, vermeiden Sie es, diese Organe aus den verbundenen Strukturen zu ziehen, und sammeln Sie sie sorgfältig, da diese Teile sehr empfindlich sind. Bewahren Sie Strukturen mit solchen Verbindungen und sammeln Sie auch die Einstreu zur Analyse.
5. Wenn Sie sich für die Analyse von frischem Material mit bildgebenden Verfahren entscheiden, bewahren Sie die Proben in geschlossenen Plastikbeuteln mit ausreichender Feuchtigkeit auf, wobei genügend Wasser verdunstet und die Pflanze befeuchtet, um zu verhindern, dass übermäßiges Wasser mit den Proben in Kontakt kommt. Transportieren Sie sie sofort ins Labor und analysieren Sie die Proben noch am selben Tag, an dem sie entnommen wurden, wobei darauf geachtet wird, ob die Proben bei der Analyse noch erhalten sind.
6. Tragen Sie Fixiermittel in gut verschlossenen Behältern zur Sammelstelle. Fixieren Sie die Proben schnell nach der Entnahme für die Lichtmikroskopie (LM) und Rasterelektronenmikroskopie (REM) in einem der folgenden Fixiermittel: 10% neutrales gepuffertes Formalin (NBF¹⁴, Tabelle 1) oder Karnovsky-Lösung (modifiziert¹⁵, Tabelle 2). Karnovskys Lösung kann mit 0,2 M Phosphatpuffer¹⁵ hergestellt werden, dessen Rezeptur in Tabelle 3 beschrieben ist.
7. Für die Analyse mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) schneiden Sie die Proben mit einer Dicke von 4-3 mm in einem Tropfen Glutaraldehyd-Natrium-Cacodylat-Puffer (modifiziert¹⁶, Tabelle 4) in kleinere Abschnitte von 1-2 mm Dicke. Verwerfen Sie die außerhalb des Tropfens geschnittenen Kanten. Übertragen Sie die Abschnitte sofort in ein Sammelröhrchen mit einem Fixiermittelvolumen, das mehr als 10-mal größer ist als das Volumen der Proben, da es sich um ein additives Fixiermittel handelt (dh seine Moleküle werden chemisch zu den fixierten Proteinen^{hinzugefügt 16}).
   ACHTUNG: Die drei beschriebenen Fixiermitteln sind hochgiftig. Vermeiden Sie die Inhalation, besonders während der Verwendung auf dem Feld. Bereiten Sie alle Fixiermittel in einem Abzug mit Handschuhen vor. Cacodylat und Säuren nicht mischen, da Arsengas gebildet werden kann¹⁶.
8. Wenn die fixierten Proben im Fixiermittel schwimmen, deutet dies auf das Vorhandensein von Gas in Pflanzengeweben hin. Luft und andere Gase verhindern, dass das Fixiermittel in die gesamte Probe eindringt². Entfernen Sie Gas aus Geweben, indem Sie es in kleineren Teilen erneut beproben und eine Vakuumpumpe (-300 bis -400 inHg Druck) verwenden, bis alle Proben auf den Boden der Lösung^{sinken 17}. Seien Sie vorsichtig, da ein übermäßiger Druck durch die Pumpe die Proben beschädigen kann.
9. Nach mindestens 48 h in Karnovsky-Lösung oder 10% NBF waschen Sie die Proben in 0,2 M PB (Tabelle 3) und dehydrieren Sie sie mit einer Reihe von 10%, 30%, 50% und schließlich 70% Ethanol. Bei empfindlichen Proben 30 min in jeder Konzentration dehydrieren; Bei größeren Proben 1 h oder länger dehydrieren.
   HINWEIS: Eine 70% ige Ethanollösung ist das ideale Medium für die Lagerung von Proben. Proben aus 70% Ethanol können jahrelang bei Raumtemperatur gelagert werden. Lagern Sie Pflanzenmaterial nicht über längere Zeit in den Fixiermitteln, da das Entfernen von Fixiermitteln ein wesentlicher Schritt nach der Fixierung^{ist 2}.
10. Lagern Sie die Proben in Glutaraldehyd-Cacodylat bei 4 °C, bevor Sie mit der Postfixierung fortfahren (Schritt 9.1).

10% neutral gepuffertes Formalin (NBF)14
Schritt 1	10 mL 37-40% ige Formaldehydlösung in 80 mL destilliertes Wasser geben
Schritt 2	0,4 g natriumphosphat monobasisches Monohydrat (NaH2PO4· H2O) zur Lösung
Schritt 3	0,65 g Natriumphosphat dibasisch, wasserfrei (Na2HPO4) zugeben
Schritt 4	das Volumen auf 100 mL erhöhen

Tabelle 1: 10% neutrales gepuffertes Formalin Rezept 14.

Karnovskys Lösung (modifiziert15)
Schritt 1	in 20 mL destilliertem Wasser bei 60-70 °C
Schritt 2	0,8 g Paraformaldehyd zugeben (um 4 % w/v unter Rühren zu erhalten
Schritt 3	1-4 Tropfen 40% NaOH hinzufügen und umrühren, bis die Lösung klar wird
Schritt 4	kühlen und 30 mL 0,2 M Phosphatpuffer pH 7,2 hinzufügen (Tabelle 3)
Schritt 5	25% Glutaraldehyd in 0,1 M PB (pH 7,2) verdünnen, um 1% Glutaraldehyd zu erhalten (Endvolumen: ~60 ml)
Schritt 6	1% Glutaraldehyd (Schritt 5) zu der in Schritt 4 erhaltenen Lösung hinzufügen, bis bis bis zu 100 ml Fixiermittel hergestellt werden

Tabelle 2: Karnovskys Lösungsrezept (modifiziert¹⁵).

0,2 M Phosphatpuffer (PB) pH 7,2
Schritt 1	14,196 g natriumphosphat dibasisch, wasserfrei (Na2HPO4) zu 400 mL destilliertem Wasser hinzufügen
Schritt 2	13,8 g natriumphosphat einbasisches Monohydrat (NaH2PO4· H2O)
Schritt 3	Umrühren, bis die Lösung klar ist
Schritt 4	Stellen Sie das Endvolumen mit destilliertem Wasser auf 500 ml ein
Schritt 5	pH-Wert auf 7,2 einstellen
Schritt 6	bei 0,1 M PB 1:1 verdünnen

Tabelle 3: 0,2 M Phosphatpufferrezeptur.

3% Glutaraldehyd 0,2 M Natriumcacodylatpuffer (modifiziert16)
Schritt 1	0,2 M Cacodylatpuffer: 4,28 g Natriumcacodylattrihydrat in 100 ml destilliertes Wasser geben
Schritt 2	pH-Wert auf 7,2 einstellen
Schritt 3	12 mL 25% Glutaraldehyd in 25 mL der Lösung in Schritt 2 zugeben (0,2 M Cacodylatpuffer pH 7,2)
Schritt 4	das Volumen mit destilliertem Wasser auf 100 ml auffüllen

Tabelle 4: 3% Glutaraldehyd 0,2 M Natriumcacodylatpufferrezeptur (modifiziert¹⁶).

2. Oberflächenanalyse von Organen in fixiertem und nicht fixiertem Material

1. Um oberflächliche Hyphen in Organen, insbesondere unterirdischen, und solchen, die mit Blattstreu in Kontakt kommen, zu analysieren, beobachten Sie festes oder frisches Material in einem Seziermikroskop (Stereomikroskop) bei einer Vergrößerung von 7,5x oder höher, abhängig von den analysierten Proben.
   1. Visualisieren Sie die Proben, die in das Fixiermittel 70% Ethanol (falls darin gespeichert) oder Leitungswasser bei frischem Material eingetaucht sind. Verhindern Sie direktes Licht aus dem Seziermikroskop, da es Proben trocknen und beschädigen kann.
   2. Suchen Sie nach Interessengebieten in den Proben, geleitet von den oberflächlichen Hyphen und Rhizomorphen. Wählen Sie Proben aus, die Bereiche mit oberflächlichen Rhizomorphen enthalten, da diese geschnitten werden können, um Pelotone und Hyphenspiralen innerhalb kortikaler Zellen in Wurzeln und Stängeln sichtbar zu machen.
   3. Führen Sie nach der Auswahl die Schritte 1.6 und 1.9 aus, wenn die Stichproben noch nicht festgelegt sind. Falls gewünscht, fotografieren Sie frische Proben mit einem Lichtmikroskop ohne Fixierung, wie in Abschnitt 3 beschrieben.
   4. Verwenden Sie die Kamera, die mit dem Stereomikroskop gekoppelt ist, um Bilder von Organoberflächen, Rhizomorphen und anderen beobachteten Strukturen zu sammeln. Achten Sie in solchen Fällen auf eine angemessene Hintergrundfarbe, um einen guten Kontrast zum Material zu bilden, und wählen Sie, wenn möglich, ein Hintergrundmaterial mit einer weniger rauen Oberfläche (z. B. Papier).

3. Freihändige Abschnitte von Pflanzenorgeln

HINWEIS: Freihandabschnitte von Pflanzenorganen können eine Herausforderung darstellen, insbesondere für kleine und dünne Strukturen. Diese Abschnitte von Geweben mit Pilzendophyten können jedoch in einigen Fällen Hyphen und andere Merkmale im Vergleich zu dünnen Schnitten besser aufweisen.

1. Schneiden Sie frische oder fixierte Proben mit einer scharfen Klinge, schneiden Sie sie so dünn wie möglich und legen Sie sie sofort in eine kleine Petrischale mit Wasser (wenn frisch) oder 70% Ethanol (falls fixiert). Verwenden Sie einen kleinen Pinsel, um die Abschnitte zu manipulieren, ohne sie zu beschädigen.
2. Um das Schneiden anspruchsvollerer Materialien (d. H. Kleine, dünne, flexible Organe) zu erleichtern, umgeben Sie die Probe in einer Struktur, z. B. Polystyrol oder Cecropia petiole. Schnitzen Sie die Stütze, um die Probe aufzunehmen, und machen Sie einen dünnen Schnitt der Probe und der Stütze insgesamt.
3. Färben und montieren Sie die Proben wie in Abschnitt 6 beschrieben.

4. Einbetten von Pflanzenproben in Harz und Schneiden

1. Dehydrieren Sie die Proben, die in 70% Ethanol in 80%, 96% und 2x in 100% Ethanol gelagert sind, für 30 min bis 2 h, abhängig von der Größe und Zusammensetzung der Proben.
2. Verwenden Sie ein Glykolmethacrylat (GMA) Harzkit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Siehe Gerrits und Horobin (1996)¹⁸ für weitere Überlegungen. Befolgen Sie die Infiltrations- und Einbettungsschritte entsprechend.
   ACHTUNG: GMA-Harz ist giftig, es kann allergische Reaktionen und Haut-, Augen- und Schleimhautreizungen verursachen. Verwenden Sie die Reagenzien in einem Abzug und verwenden Sie Handschuhe.
3. Verwenden Sie Polyethylen-Formschalen zum Einbetten, die nach Probengröße ausgewählt sind (z. B. 13 mm x 19 mm x 5 mm für größere Proben, 6 mm x 8 mm x 5 mm für kleinere). Achten Sie auf die gewünschte Probenorientierung in der Form und verwenden Sie eine Nadel zur Orientierung.
4. Zur Polymerisation, vorzugsweise bei Raumtemperatur, bis sie vollständig erstarrt ist. Der Aushärtungsprozess dauert in der Regel einige Stunden, obwohl es empfohlen wird, die Blöcke am nächsten Tag zu entformen. Lösen Sie nach der Polymerisation die Harzblöcke vorsichtig von den Formen und befestigen Sie die Blöcke so schnell wie möglich, um eine Blockkrümmung zu vermeiden.
5. Schleifen Sie die Vorderseite des Harzblocks, der befestigt wird, und erzeugen Sie eine flache Oberfläche. Kleben Sie den Harzblock mit einem flüssigen Cyanacrylatkleber mittlerer Viskosität auf einen Holzquader (2 cm x 2 cm x 3 cm empfohlen) (siehe Materialtabelle). Stellen Sie sicher, dass das Harz vollständig befestigt ist, um eine Beeinträchtigung der Schnitte zu vermeiden.
6. Führen Sie die Schnitte in einem rotierenden Mikrotom wie unten beschrieben durch.
   ACHTUNG: Die Klingen von Mikrotommessern sind sehr scharf und können Unfälle verursachen. Achten Sie darauf, sie nach allen Sicherheitsmaßnahmen zu behandeln. Bevor Sie sich dem Messer nähern (z. B. um den Block zu wechseln, das Harz zu befeuchten), verriegeln Sie das grobe Handrad und setzen Sie die Klingensicherheitsabdeckung auf. Lagern Sie Einwegklingen in geeigneten Koffern. Seien Sie äußerst vorsichtig, wenn Sie die Klingen austauschen.
   HINWEIS: Verschiedene Arten von Messern (z. B. Einwegmesser oder fest; Glas oder Stahl) können verwendet werden, um GMA-Harz¹⁸ zu schneiden. Die Qualität der Abschnitte hängt davon ab, wie scharf das Messer ist. Stellen Sie sicher, dass das Messer gut befestigt ist und sich nicht bewegen kann. Einwegmesser müssen möglicherweise regelmäßig gewechselt werden, um eine bessere Aufteilung zu erreichen.
   1. Befestigen Sie den Holzquader fest am Blockhalter. Stellen Sie die Ausrichtung der Schnitte mit den Orientierungsschrauben ein und sorgen Sie mit der Messerneigung für einen angemessenen Winkel des Messers. Wählen Sie die Dicke der Abschnitte aus; Verwenden Sie eine dickere Einstellung für das Trimmen und eine dünnere Einstellung für ausgewählte Abschnitte, da GMA-Abschnitte besser am Glasobjektträger haften, wenn sie dünner sind. Die empfohlene Dicke für Pflanzengewebe beträgt 5-8 μm.
   2. Bevor Sie beginnen, kühlen Sie den Raum, falls erforderlich, da höhere Temperaturen die Qualität der Abschnitte verschlechtern. Bereiten Sie Folgendes zum Schneiden vor: ein Becherglas mit destilliertem Wasser, eine Kochplatte, Pinsel (mindestens zwei), eine Feinspitzenpinzette, eine Pasteur-Pipette, Glasobjektträger, Filterpapier (oder Seidenpapier) und einen Bleistift (zur Identifizierung der zu schneidenden Proben).
   3. Stellen Sie die Heizplatte auf 50 °C ein und stellen Sie das Becherglas darauf. Achten Sie auf Unterschiede in der Erwärmung in Abhängigkeit von der Fläche der Heizplatte (normalerweise erwärmt sich der mittlere Bereich mehr als die Kanten; erwärmen Sie das Wasser vorzugsweise in der Mitte).
   4. Wählen Sie einen Glasobjektträger, identifizieren Sie ihn mit einem Bleistift und pipetten Sie das warme destillierte Wasser auf der gesamten Objektträgeroberfläche. Verwenden Sie bei Bedarf eine Lösung (z. B. Reinigungsmittel und Wasser oder 70% Ethanol), um die Spannung zwischen Wasser und Glas zu brechen, so dass der gesamte Objektträger gleichmäßig bedeckt ist. Einige Objektträgertypen müssen mit 70% Ethanol vorgereinigt werden, um eine ausreichende Schnitthaftung zu erreichen.
   5. Beginnen Sie, indem Sie die Vorderseite des Harzblocks allmählich in Richtung der Messerklinge vorschieben. Versuchen Sie nicht, den Block zu trennen, ohne zuerst den Block voranzubringen, da sonst die Ausrüstung und der Block beschädigt werden können. Falls erforderlich, trimmen Sie den Block mit einer höheren Dicke (10 μm und mehr).
   6. Wenn Sie sich einem geeigneten Abschnitt nähern, machen Sie eine feste Einwegbewegung mit dem Handrad, so dass der Abschnitt sofort gemacht wird. Kontrollieren Sie die Harzfeuchtigkeit. Befeuchten Sie während des Schneidens regelmäßig die Vorderseite des zu schneidenden Blocks mit einem Pinsel, der in destilliertes Wasser getaucht wird, wenn es ein Problem mit Curling-Abschnitten gibt. Entfernen Sie überschüssiges Wasser mit einem Seidenpapier.
   7. Legen Sie den erhaltenen Abschnitt mit einer feinen Pinzette über die Rutsche ins Wasser. Bei Kontakt mit Wasser dehnt sich GMA-Harz aus. Verwenden Sie bei Bedarf einen Pinsel, um die Abschnitte vorsichtig zu entfalten und zu dehnen. Verwenden Sie einen anderen Pinsel, um die Klinge ständig frei von Harzablagerungen zu halten. Wechseln Sie nicht zwischen den Pinseln, um eine Benetzung der Klinge zu vermeiden.
   8. Nachdem Sie alle gewünschten Abschnitte in der Folie aufgereiht haben, trocknen Sie die Unterseite der Folie und legen Sie sie über die Heizplatte. Entfernen Sie das überschüssige Wasser von der Oberseite des Objektträgers, indem Sie es vorsichtig mit einem Filterpapier tupfen (optional). Die Abschnitte haften, wenn das Wasser von der Rutsche verdunstet. Lassen Sie die Dias nicht zu lange, um zu verhindern, dass die Abschnitte durch übermäßige Hitze beschädigt werden.
   9. Bewahren Sie die Dias in einer Diabox auf, fern von Staub und Sonne, und verwenden Sie sie zum Färben und anderen Verfahren. Die Dias können mehrere Jahre gelagert werden.

5. Einfrieren von Pflanzenproben und Schneiden mit einem Kryostaten

HINWEIS: Die wesentliche Überlegung beim Kryoschneiden von biologischem Gewebe besteht darin, Schäden durch Eiskristallbildung beim Einfrieren von Proben zu reduzieren. Kryoprotektion wird normalerweise durch Infusion chemisch inerter Lösungen wie Glycerin oder Saccharose^19,20 durchgeführt.

1. Führen Sie einen Tag vor dem Probenschneiden die folgenden Schritte aus.
   1. 100 ml 0,2 M PB (Tabelle 3) werden in 100 ml destilliertem Wasser verdünnt, um 200 mL 0,1 M PB zu erhalten. Bereiten Sie 10%, 20% und 30% Saccharoselösungen in 0,1 M PB vor (z. B. für eine 10% ige Lösung 2 g Saccharose in 20 ml Puffer hinzufügen).
   2. Für frische Proben waschen Sie sie in 0,1 M PB für 30 min. Für Proben in einem Fixiermittel waschen Sie sie in demselben Puffer, der für die Vorbereitung des Fixiermittels verwendet wurde, für 30 min. Für Proben aus 70% Ethanol hydratisieren Sie sie in 50% und 30% Ethanol und waschen Sie sie in 0,1 M PB für 1 h in jeder Lösung.
   3. Die Proben werden bei Raumtemperatur für 2 h in 10% Saccharose, 2 h in 20% Saccharose und 2 h in 30% Saccharose inkubiert. Anschließend über Nacht in 30%iger Saccharose bei 4 °C (oder mindestens 3 h; maximale Zeit beträgt 48 h) inkubieren.
2. Am Tag des Schneidens 40% und 50% Saccharose in 0,1 M PB vorbereiten; Bereiten Sie Saccharoselösungen nicht mehr als 12 Stunden im Voraus vor. Für 2 h in jeder Saccharosekonzentration bei 4 °C inkubieren.
3. Zum Einbetten in kleine Formen eine Schicht OCT-Compound (optimales Schnitttemperaturmedium, das zum Einbetten und Einfrieren der Proben verwendet wird) herstellen und bei -20 °C einfrieren. Die Formen können normale histologische Formen sein, obwohl Papier- oder Alufolienformen mit einem kleinen Quader als Rahmen und Klebeband hergestellt werden können, um das Ausformen der Blöcke zu erleichtern.
4. Nachdem die untere Schicht der OCT-Verbindung in den Formen eingefroren wurde, arbeiten Sie in einer Kryostatkammer (ca. -27 °C). Legen Sie die in 50% iger Saccharose inkubierten Proben in die Formen, in der Orientierung, in der sie geschnitten werden. Die Oberseite eines quaderförmigen Blocks ist normalerweise eine bessere Seite des Schnitts. Markieren Sie in der Form, in der die Proben platziert werden, damit der Block leicht zugeschnitten und die korrekte Ausrichtung beibehalten werden kann.
5. Umgeben Sie die Proben mit OCT-Verbindung und platzen Sie jede Luftblase, die die Proben berührt. Bei -20 °C einfrieren. Wenn die Blöcke vollständig gefroren sind, legen Sie sie in die Kryostatkammer (ca. -27 °C). Entformen Sie jeden einzelnen nur vor dem Gebrauch und achten Sie auf die Markierungen, die die Probenposition im Block anzeigen.
6. Da OCT-Compound leicht mit einer Klinge geschnitten werden kann, trimmen Sie die Blöcke entsprechend, bevor Sie sie auf die Chucks positionieren. Geben Sie etwas OCT-Verbindung in das Kryostatfutter und positionieren Sie den Block so, dass die Oberseite geschnitten ist. Flächen mit kleineren Flächen bieten bessere Schnitte. Warten Sie, bis der Block gut am Spannfutter befestigt ist, und testen Sie ihn, bevor Sie mit dem Schneiden beginnen.
7. Legen Sie das Spannfutter fest in den Futterhalter. Passen Sie die Ausrichtung der Schnitte mit den Ausrichtungsschrauben an. Stellen Sie den Winkel des Messers mit der Messerneigung ein. Wählen Sie die Dicke der Schnitte aus. Die Proben können dicker geschnitten werden als übliche Harzabschnitte. Es werden erfolgreich Abschnitte in einem Bereich zwischen 5-20 μm erzielt, wobei dickere Abschnitte leichter herzustellen sind (weniger Kräuseln und weniger Beschädigung der Strukturen).
8. Schieben Sie die Vorderseite des gefrorenen Blocks in Richtung Messerklinge. Versuchen Sie nicht, ohne dies zu tun, sonst kann sich der Block vom Spannfutter lösen und beschädigt werden. Falls erforderlich, trimmen Sie den Block mit einer höheren Dicke (10 μm und mehr).
9. Wenn Sie sich einem geeigneten Abschnitt nähern, platzieren Sie die Anti-Roll-Platte (dh eine transparente Platte, die den Abschnitt hält) über dem Messer und machen Sie eine feste Einwegbewegung mit dem Handrad, so dass der Abschnitt sofort gemacht wird. Kräuselprobleme können verursacht werden, wenn die Stabilisatorplatte eingestellt werden muss (sie ist normalerweise in Bezug auf die Klinge einstellbar) oder wenn sich Schmutz in der Klinge befindet. Reinigen Sie die Klinge ständig mit einem Pinsel, um Schmutz zu entfernen.
10. Verwenden Sie spezielle Objektträger, damit die Abschnitte leicht befestigt werden können, wie silanisierte Objektträger (kommerziell oder mit 2% Aminoalkylsilan in Aceton 21 hergestellt) oder Objektträger, die mit 500 μg / ml Poly-L-Lysin in destilliertem Wasser 21 oder 0,2% Gelatine hergestellt wurden (siehe Details²¹). Halten Sie die Objektträger auf Raumtemperatur.
11. Um den Abschnitt an einem Schieber zu befestigen, heben Sie die Stabilisatorplatte an und lassen Sie den Schieber den Abschnitt schnell berühren. Da der Schlitten Raumtemperatur hat, schmilzt der Abschnitt sofort und haftet am Objektträger. Achten Sie darauf, die behandelte Seite des Objektträgers auf den Abschnitt zu drehen, der über dem Messer oder auf der Innenseite der Stabilisatorplatte verbleiben kann. Um ein Kräuseln der Abschnitte zu vermeiden, führen Sie diesen Schritt schnell durch, sobald die Platte angehoben wird, und achten Sie darauf, den Abschnitt nicht zu verzerren.
12. Lassen Sie den Objektträger außerhalb der Kryostatkammer (bei Raumtemperatur), wenn neue Abschnitte hinzugefügt werden sollen. Nachdem Sie alle gewünschten Abschnitte auf den Objektträger geklebt haben, bewahren Sie ihn in der Kryostatkammer oder im Gefrierschrank auf (-20 °C oder darunter). Setzen Sie die Objektträger keiner Feuchtigkeit aus. Bewahren Sie sie in einer Folienbox auf und denken Sie daran, die Folien mit einem Bleistift zu identifizieren.
    HINWEIS: Dias und OCT-Blöcke können bei -20 °C gelagert werden, wenn auch nicht zu lange. Um bessere Ergebnisse zu erzielen, verwenden Sie die Folien und die Blöcke innerhalb weniger Tage.

6. Färbung von Pflanzenschnitten und Endophyten für die Lichtmikroskopie

HINWEIS: Viele Arten von Flecken können für Pflanzenabschnitte verwendet werden. Es ist schwierig, endophytische Pilze und Pflanzengewebe unterschiedlich zu färben. Obwohl es sich nicht um ein Färbeverfahren handelt, wird in Abschnitt 7 ein Verfahren zur Markierung von Pilzstrukturen vorgestellt (Fluoreszenz mit einem Weizenkeimagglutinin-Konjugat). Freihandschnitte (erklärt in Abschnitt 3), Harzschnitte (Abschnitt 4) und Kryosektionen (Abschnitt 5) können gefärbt werden, obwohl Phenol- und Alkoholfärbungen für diese Proben eine Herausforderung darstellen, da GMA-Harz und OCT in diesen Fällen die Haftung am Objektträger verlieren.

1. Verwenden Sie eine oder kombinieren Sie die folgenden üblichen Färbemethoden für Pflanzenproben.
   1. Toluidinblau O^22,23, eine weit verbreitete Methode zur allgemeinen Färbung von Pflanzenabschnitten. Bereiten Sie eine Lösung von 0,05% Toluidinblau O in 0,1 M Phosphat (pH 6,8) oder 0,09 M Citratpuffer (pH 4,5-4,8) je nach Art und Art des Gewebes vor. Inkubieren Sie GMA-Harzschnitte für 2-10 Minuten mit einem Objektträgerfärbeglas oder indem Sie einige Tropfen über die Abschnitte legen, wenn nur wenige Objektträger gefärbt sind. Nach der Inkubation vorsichtig mit destilliertem Wasser oder Puffer waschen und die Objektträger mit Wasser montieren oder auf einer Heizplatte trocknen, um dauerhafte Objektträger wie in Schritt 6.3 beschrieben herzustellen.
   2. Lugol-Reagenz² zeigt das Vorhandensein von Stärke an. Eine 5%ige Jod- (_I2) und 10%ige Kaliumiodidlösung (KI) in destilliertem Wasser herstellen. Schichten für 2 min einfärben, indem Sie einige Tropfen über dem Objektträger hinzufügen, und dann mit destilliertem Wasser waschen. Dieser histochemische Test wird normalerweise auf temporäre Objektträger angewendet.
   3. Sudan III, IV und schwarz B^24,25 färben sich für verschiedene Lipide. Bereiten Sie eine Lösung von 0,3% Sudan (III, IV oder schwarz B) in 70% Ethanol vor, erwärmen Sie sie bis zum Kochen und lassen Sie sie abkühlen. Verwenden Sie den Überstand, filtern Sie ihn und inkubieren Sie Abschnitte für 15-30 min in einer geschlossenen Petrischale. Waschen Sie die Abschnitte sorgfältig mit 70% Ethanol und destilliertem Wasser. Montieren Sie die Objektträger mit Wasser (normalerweise nur auf temporäre Objektträger angewendet).
      HINWEIS: Da Sudan ein Farbstoff auf Alkoholbasis ist, ist er besser für Freihandabschnitte geeignet. Führen Sie die GMA-Harzschnittfärbung sorgfältig durch, da sie sich normalerweise vom Objektträger lösen.
2. Für temporäre Objektträger montieren Sie die Abschnitte in Wasser oder Glycerin und beobachten Sie sie anschließend. Versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack, um es etwas länger zu konservieren.
3. Bei permanenten Objektträgern montieren Sie die Profile mit Kunstharzen (z.B. Schnellmontagemedium, siehe Materialtabelle). Tropfen Sie ein paar Tropfen des Montagemediums ab (es kann das Deckglas überlaufen), legen Sie das Deckglas vorsichtig, um Blasen zu vermeiden, und drücken Sie das Objektblatt mit Wäscheklammern gegen das Deckglas, bis es vollständig trocken ist. Entfernen Sie das überschüssige getrocknete Montagemedium mit einer Rasierklinge.

7. Anwendung eines an Weizenkeimagglutinin konjugierten Fluorochroms in der Fluoreszenz- und Konfokalmikroskopie

HINWEIS: Diese Methode kann auf Freihandschnitte (siehe Abschnitt 3), Harzschnitte (Abschnitt 4) und Kryosektionen (Abschnitt 5) angewendet werden. Kryosektionen können für konfokale Mikroskopiezwecke geeignet sein, da im Vergleich zu Harzschnitten dickere Proben bereitgestellt werden können, aber nicht so dick wie Freihandproben. Ein mit Weizenkeimagglutinin konjugiertes Fluorochrom (WGA, siehe Table of Materials) wird zur Pilzbildgebung in der Fluoreszenzmikroskopie²⁶ angewendet. Ein konfokales Mikroskop ist nicht unbedingt erforderlich, obwohl es klare dreidimensionale Bilder von Pflanzenstrukturen liefern kann²⁷.

1. Es wird eine Lösung von 0,2 mg/ml WGA-Fluorochrom-Konjugat in 0,1 M PB²⁸ hergestellt (pH 7,2, siehe Schritt 5.1.1 und Tabelle 3). Bereiten Sie eine Lösung von 1% Calcofluorweiß in 0,1 M PB (pH 7,2) vor. Bereiten Sie kleine Mengen dieser Lösungen vor, da die Abschnitte direkt mit ihnen inkubiert werden.
2. Die Abschnitte in den Glasobjektträgern 30 min lang in der WGA-Fluorochrom-Konjugatlösung²⁹ inkubieren, mit genügend Volumen zum Abdecken der Abschnitte, dann in 0,1 M PB waschen.
3. Inkubieren Sie die Abschnitte in der Calcofluorlösung unter Verwendung eines ausreichenden Volumens als Montagemedium. Die Lösung kann während des Beobachtungszeitraums beibehalten werden.
4. Deckgläser auf die Objektträger legen und in einem konfokalen Mikroskop oder einem Fluoreszenzlichtmikroskop mit folgenden Filtern beobachten: TC/GFP (Anregung: 470-440, Emission: 525-550, für WGA-Fluorochrom in der Materialtabelle - Pilzzellwand fluoresziert grün unter diesem Filter²⁹) und DAPI (Anregung: 358, Emission: 463, für Calcofluorweiß)³⁰.
   HINWEIS: Dreidimensionale Bilder können mit der Funktion der Z-Serie im konfokalen Mikroskop²⁷ erhalten werden.

8. Rasterelektronenmikroskopie pflanzlicher Organe

1. Nach der Fixierung der Proben, der Dehydratisierung und der Lagerung in 70% Ethanol (Abschnitt 1) besteht eine Möglichkeit darin, Proben zu schneiden, um bei Bedarf jede gewünschte Oberfläche für die REM-Analyse freizulegen (z. B. innere Gewebe, Eierstockstruktur). Verwenden Sie eine scharfe und neue Rasierklinge und machen Sie Schnitte mit einer Einwegbewegung, um ein beschädigtes Aussehen dieser Bereiche im REM zu vermeiden. Verwenden Sie bei Bedarf ein Stereomikroskop, um die Proben auszuwählen, und berücksichtigen Sie den Bereich der Metallstummeln, um die Probengrößen zu bestimmen.
2. Weitere Dehydratproben für REM in einer ethanolischen Reihe: 80%, 96% und 2x in absolutem Ethylalkohol (≥99,8%). Bewahren Sie kleine und empfindliche Proben für 30 min in jeder Konzentration und größere und dichtere Proben für 1 h auf.
3. Falten Sie kleine Umschläge mit Seidenpapier, um Proben für die nächsten Schritte zu organisieren, größere Proben können ohne Umschlag gehandhabt werden. Identifizieren Sie die Umschläge mit einem Bleistift, indem Sie einen Buchstaben oder eine Zahl schreiben, und führen Sie ein Protokoll aller Proben in jedem einzelnen. Bewahren Sie die Proben in absolutem Ethanol auf, wenn auch nicht lange, und fahren Sie so bald wie möglich mit Schritt 8.4 fort.
4. Fahren Sie mit der Trocknung am kritischen Punkt (CP) fort. Betreiben Sie einen CP-Trockner gemäß den Standardarbeitsanweisungen. Legen Sie Proben in absolutes Ethanol (Zwischenflüssigkeit) in eine Druckkammer. Am_{CO2-kritischen} Punkt (31 °C, 7,3 x 10⁶ Pa) löst sich die Zwischenflüssigkeit in die Übergangsflüssigkeit (flüssiges Kohlendioxid) und die Proben werden getrocknet³¹.
5. Lagern Sie die Proben nach der CP-Trocknung so schnell wie möglich in einem Austrocknungsbehälter, z. B. in einem verschlossenen Kolben mit Silikagel. Luftfeuchtigkeit kann die Proben zerstören, wenn sie resorbiert^{wird 31}.
6. Verwenden Sie Metallstummeln, um die Proben zu montieren. Vor der Montage Handschuhe anziehen, um die Stummel zu manipulieren, sie 5 Minuten lang in Aceton eintauchen, um Fett zu entfernen, und trocknen lassen. Verwenden Sie ein leitfähiges doppelseitiges Kohleklebeband, um Proben auf dem Stummel zu fixieren, und ein Stereomikroskop, um die Proben zu positionieren, wobei zu beachten ist, dass der Blick von oben die einzig mögliche Perspektive in REM-Bildern ist.
7. Bearbeiten Sie Proben mit einer Feinpunktpinzette, seien Sie vorsichtig, da das von der Pinzette berührte Probenteil normalerweise beschädigt ist, also versuchen Sie, Teile zu berühren, die von den interessierenden Bereichen entfernt sind (z. B. Bereiche, die mit dem Band in Berührung kommen). Pflegen Sie die Stubs mit Proben in einer verschlossenen Petrischale mit Silikagel. Fahren Sie so schnell wie möglich mit Schritt 8.8 fort.
8. Verwenden Sie einen Sputterbeschichter, um eine Metallschicht, normalerweise Gold oder Platin, auf der Oberfläche der Proben in einer Niederdruckatmosphäre eines Inertgases, häufig Argon³¹, abzuscheiden. Befolgen Sie die Standardarbeitsanweisungen, wenn Sie einen Sputterbeschichter verwenden. Die Schichtdicke hängt von der Topographie der Proben ab, in der Regel zwischen 15-40 nm³².
9. Bewahren Sie die beschichteten Stummel in einer verschlossenen Petrischale mit Silikagel auf, und vorausgesetzt, dass das Silikagel Feuchtigkeit speichert, können Proben auf diese Weise wochenlang gelagert werden. Verwenden Sie ein Rasterelektronenmikroskop, um die Proben zu analysieren. Die Proben im Vakuum werden von einem Elektronenstrahl getroffen, und die Emission von Signalen aus einer solchen Wechselwirkung wird als Bild³¹ interpretiert. Einzelheiten zum Betrieb eines Rasterelektronenmikroskops finden Sie in Jeffree und Read (1991) ³¹ und Bozzola und Russell (1999) ³².
10. Um die Stummel wiederzuverwenden, ziehen Sie das Klebeband und schrubben Sie sie mit Drahtwolle. In Leitungswasser waschen, in absolutes Ethanol eintauchen und angemessen trocknen, um eine Oxidation des Metallbestandteils zu verhindern.

9. Transmissionselektronenmikroskopie

1. Präfix Proben mit Glutaraldehyd-Cacodylat-Puffer, wie in den Schritten 1.7 und 1.10 erläutert. Nach 12-24 h Vorfixierung waschen Sie die Proben 3x in 0,2 M Cacodylatpuffer (pH 7,25) für 10 min. Die Postfixation mit 1% Osmiumtetroxid (_OsO4) in 0,2 M Cacodylatpuffer für 12 h im Dunkeln bei Raumtemperatur durchführen. 3x mit destilliertem Wasser 5 min waschen.
   ACHTUNG: Cacodylat und Osmiumtetroxid sind hochgiftig und sollten nicht inhaliert werden. Verwenden Sie sie in Abzügen gemäß den jeweiligen Sicherheitsdatenblättern.
2. Dehydrieren Sie die Proben mit 30%, 50%, 70% und 96% Ethanol, 2x in jeder Konzentration, für 10 min. Dann dehydrieren Sie 3x in absolutem Alkohol, jeweils für 15 Minuten.
3. Infiltrieren Sie die Proben in hydrophilen Acrylharzen (siehe Materialtabelle), einmal mit 1:1 Harz + absolutem Ethanol und 3x mit reinem Harz für jeweils 8-12 h. Die Polymerisation wird in Gelatinekapseln bei 60 °C durchgeführt, bis sie vollständig erstarrt ist (12 h maximal¹⁷).
4. Bewerten Sie die Ausrichtung der Proben innerhalb des Harzblocks genau; Schneiden Sie den oberen Teil des Blocks mit einer Rasierklinge ab und bilden Sie eine pyramidenförmige Form, die die Probe im Schnittbereich konzentriert. Halbdünne Schnitte (250-500 nm)³³ in einem Ultramikrotom mit einem Diamantmesser erhalten und in wenigen Tropfen Wasser auf Glasobjektträger legen.
5. Bewahren Sie die Dias auf einer Heizplatte bei 60 °C auf. Die Abschnitte wie in Schritt 6.1.1 mit Toluidinblau O färben und den Fleck vollständig trocknen lassen. Vorsichtig mit Leitungswasser waschen. Bewerten Sie den erhaltenen Schnitt, indem Sie vier Quadranten zeichnen und den am besten geeigneten Quadranten für die Analyse auswählen.
6. Schneiden Sie den Block so, dass die pyramidenförmige Form den ausgewählten Quadranten auf die Oberseite des Blocks konzentriert. Ultradünne Schnitte (50-100 nm) ^{erzeugen33,34}. Die Dicke wird nach der Interferenzfarbe der Schnitte bewertet: Abschnitte mit etwa 70 nm erscheinen silber-gold, mit etwa 100 nm erscheinen Gold und mit etwa 200 nm erscheinen blau³⁴.
7. Sammeln Sie die ultradünnen Schnitte aus Wasser mit Kupfergittern und fahren Sie mit der Kontrastfärbungsmethode mit Uranylacetat und Bleicitrat fort, wie unten beschrieben.
   1. Bereiten Sie eine Bleicitratlösung (Tabelle 5) vor und frieren Sie die endgültige Lösung in Mikrozentrifugenröhrchen mit jeweils 1 ml Lösung ein, wobei sie erst unmittelbar vor Gebrauch auftauen.
   2. Bereiten Sie eine Uranylacetatlösung vor: 0,625 g Uranylacetat [_UO2(_CH3COO)₂] werden in 25 ml frisch gekochtem und abgekühltem destilliertem Wasser gelöst. In einem dunklen Kolben im Gefrierschrank aufbewahren.
      VORSICHT: Bleinitrat ist giftig, wenn es eingenommen wird. 1 N NaOH ist stark korrosiv. Uranylacetat ist radioaktiv und giftig. Es darf nicht eingenommen, eingeatmet oder mit der Haut in Berührung kommen.
   3. Geben Sie beim Färben beide vorbereiteten Reagenzien in separate 3-ml-Spritzen mit Filtereinheiten (0,22 μm Pore, siehe Materialtabelle). Bereiten Sie eine auf den Kopf gestellte Petrischale mit einer versiegelnden thermoplastischen Folie darüber (siehe Materialtabelle) und in einer breiteren Schale mit NaOH-Pellets an den Rändern als Fangbehälter für CO₂³² vor (siehe Abbildung 2).
   4. Verwerfen Sie den ersten Tropfen und geben Sie einen Tropfen Uranylacetat und drei Tropfen destilliertes Wasser für jedes gefärbte Gitter über den Film. Machen Sie dasselbe mit Bleicitrat und fügen Sie drei weitere Tropfen destilliertes Wasser hinzu.
   5. Inkubieren Sie das Gitter (mit der undurchsichtigen Seite nach unten, wo sich die Abschnitte befinden) in Uranyl für 30 min (variable Zeit). Waschen Sie 3x in den destillierten Wassertropfen und trocknen Sie den Rost jedes Mal vorsichtig mit Filterpapier auf der brillanten Seite. Wiederholen Sie dies mit dem Bleicitrattropfen (30 min) und waschen Sie es.
8. Nach mindestens 4 h analysieren Sie die Gitter in einem Transmissionselektronenmikroskop. In diesem Mikroskop durchläuft ein Elektronenstrahl die Abschnitte im Vakuum und das Bild wird auf eine fluoreszierende Leinwand projiziert. Einzelheiten zum Betrieb eines Transmissionselektronenmikroskops finden Sie unter Bozzola und Russell (1999)³².

Bleicitratlösung (zur TEM-Kontrastfärbung)
Schritt 1	Einen Becher mit Alufolie umhüllen
Schritt 2	0,266 g Bleinitrat [Pb(NO3)2] werden in 6 ml frisch gekochtem und abgekühltem destilliertem Wasser gelöst
Schritt 3	2 min rühren
Schritt 4	0,352 g Trinatriumcitrat [Na3(C6H5O7).2H2O] zugeben (die Lösung muss milchig aussehen)
Schritt 5	15 min rühren, Becherglas mit Alufolie verschließen und die Lösung in ein 10-ml-Becherglas geben
Schritt 6	1,6 mL 1N NaOH und 2,4 mL destilliertes Wasser hinzufügen (die Lösung muss durchscheinend sein)
Schritt 7	wenn nötig, stellen Sie den pH-Wert in der Nähe von 12 ein

Tabelle 5: Rezept für Bleicitratlösung.

Abbildung 2: Kontrastfärbeschema mit Bleicitrat und Uranylacetatlösungen . (A) Bereiten Sie die Petrischalen vor, eine auf den Kopf gestellt (in der Mitte) mit thermoplastischer Folie, damit Tropfen darüber platziert werden können, in eine breitere. NaOH-Pellets werden um die zentrale Schale herum platziert. (B) Uranylacetat-Tropfen werden in die Kreise mit dem Buchstaben U gegeben, und Bleicitrat-Tropfen in den mit L gekennzeichneten Kreisen. DW bezeichnet Tropfen von destilliertem Wasser. Die Gitter werden sequentiell in der Spalte gefärbt, so dass fünf Gitter gleichzeitig wie dargestellt gefärbt werden können. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

10. Symbiotische Keimung von Orchideensamen

1. Stellen Sie sicher, dass die Lösungen und alle Materialien, die bei der symbiotischen Keimung von Samen verwendet werden, steril sind, um eine Kontamination zu vermeiden. Beginnen Sie mit dem Autoklavieren für 20 Minuten bei 121 °C. Die symbiotischen Keimschritte sind in Abbildung 3 zusammengefasst.
2. Desinfizieren Sie oberflächlich Früchte und Samen, indem Sie sie in Natriumhypochloritlösung mit 2% aktivem Chlor für 10-15 min für Früchte und 7-10 min für Samen tauchen, unter Berücksichtigung der Steifigkeit und Dicke der Samenhülle⁹. Schlanke und zerbrechliche Samen können in eine 1:1 verdünnte Natriumhypochloritlösung getaucht werden. Anschließend 3x in autoklaviertem destilliertem Wasser waschen, um die Hypochloritlösung zu entfernen.
3. Rekuperieren Sie die Samen durch Filtern in siebgrafischem Gewebe und verwenden Sie die Samen, um mit Keimungstests fortzufahren (vorzugsweise). Gegebenenfalls in Filterpapierhüllen in Glaskolben mit Silikagel bei 4 °C aufbewahren, die Kolben hermetisch verschließen und mit Frischhaltefolie verschließen. Einige Tropfen Wasser aus der letzten Wäsche in Kartoffeldextrose-Agar (PDA, 39 g / L) geben, um die Wirksamkeit des Waschprozesses zu bewerten.
4. Vor der Aussaat von Samen im Kulturmedium ist ihre Lebensfähigkeit durch den Tetrazoliumtest (fakultativ) wie unten beschrieben^{zu bewerten 35}.
   1. Etwa 10 mg Samen in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml 10%iger Saccharose in destilliertem Wasser für 24 h bei Raumtemperatur (ca. 25 °C) bei Licht bebrüten.
   2. Entfernen Sie die Saccharoselösung mit einer Mikropipette und fügen Sie 1 ml 1% ige Tetrazoliumlösung (Triphenyltetrazoliumchlorid) in destilliertes Wasser hinzu. Bei 40 °C in einem Thermoblock für 24 h im Dunkeln inkubieren.
   3. Entfernen Sie die Tetrazoliumlösung mit einer Mikropipette und waschen Sie die Samen mit destilliertem Wasser 2x oder bis die Lösung entfernt ist. Entfernen Sie alle Flüssigkeiten. Bei Bedarf können die Samen bis zu einer Woche im Gefrierschrank gelagert werden (wie in Schritt 10.3), bevor sie analysiert werden.
   4. Resuspendieren Sie die Samen in destilliertem Wasser und analysieren Sie sie unter einem Lichtmikroskop. Lebensfähige Samen erhalten eine hell- bis dunkelrote Farbe, während nicht lebensfähige Samen ihre natürliche Farbe behalten.
5. Führen Sie das folgende angepasste^9-Protokoll für die symbiotische Keimung von Orchideensamen durch.
   1. Inkubieren Sie die Samen über autoklavierte Filterpapierscheiben (1-2 cm Durchmesser), die in Petrischalen mit Haferflocken-Agar (OMA) Kulturmedium (2,5 g / L Haferflocken und 7 g / L Agar, pH 6) platziert werden.
   2. In der Mitte der Petrischale ein Fragment des Kulturmediums (ca. 1 cm²) mit Myzel aus dem gewählten isolierten Pilz für den Keimvorgang beimpfen. Verschließen Sie die Petrischalen mit Frischhaltefolie und brüten Sie sie im Dunkeln bei ca. 25 °C oder Raumtemperatur aus, da dies für das Pilzwachstum besser geeignet ist.
   3. Bereiten Sie einige Gerichte mit Samen und ohne Pilzimpfung als Negativkontrolle für den Keimtest zu.
6. Analysieren Sie die Keimergebnisse wöchentlich, indem Sie quantitative und qualitative Daten sammeln und Protocorms und Sämlinge fotografieren. Die Beobachtung von Samen und Protocormen sollte mit einem Stereomikroskop durchgeführt werden, um die Keimung genauer beurteilen zu können. Verwenden Sie eine Lichtquelle, die von unten kommt, da sie einen größeren Kontrast ermöglicht und es ermöglicht, das Pilzmyzel leichter von Protocormen zu unterscheiden.
   1. Proben in verschiedenen Entwicklungsstadien sammeln und für anatomische Analysen fixieren (Abschnitt 1). Wenden Sie alle zuvor beschriebenen Bildanalysen an, um Pilzendophyten in Samen, Protocormen und Keimlingen während der Keimung zu untersuchen (Lichtmikroskopie - Abschnitte 4, 5 und 6; konfokal und Fluoreszenz - Abschnitt 7; SEM und TEM - Abschnitte 8 und 9).
   2. Generieren Sie quantitative Ergebnisse nach der Klassifizierung der Stufen gemäß Tabelle 6. Die Stadien beschreiben die übliche Entwicklung von Samen aus mykoheterotrophen Orchideen. Sammeln Sie wöchentlich Daten und Tabelle mit den Anfangsdaten jeder beobachteten Phase.
   3. Sammeln Sie außerdem quantitative Daten, die den Prozentsatz und die Rate der Keimung schätzen. Zählen Sie mindestens 100 Samen oder definieren Sie Zählfelder³⁵. Markieren Sie drei oder mehr Zählfelder pro Petrischale, bestehend aus festen Regionen mit einer standardisierten Fläche, und werten Sie wöchentlich aus. Berechnen Sie die gesammelten Daten gemäß der Wachstumsindexgleichung (GI):
      
      wobei N 0 die Anzahl der gezählten Samen in Stufe₀ ist, N 1 sich auf Stufe₁ bezieht und bis Stufe 6 (registriert als N₆) ³⁶ folgt.

Abbildung 3: Schematische Zusammenfassung der Methodik der symbiotischen Keimung von Saatgut. Die Schaltpläne geben Hinweise auf detaillierte Schritte im Protokoll. Abkürzungen: OMA = Haferflocken-Agar, PDA = Kartoffel-Dextrose-Agar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Keimphase	Beschreibung
0	Keine Keimung
1	Schwellung des Embryos
2	Testa-Ruptur
3	Saugfähige Haare entwickeln sich
4	Stielprojektion entwickelt sich
5	Schützende Schuppen (Hochblätter) entwickeln sich
6	Erste Wurzeln entstehen

Tabelle 6: Beschreibung der Protocorm-Entwicklungsstadien für periodische Analysen von Keimungstests. Modifiziert von den in Otero et ^al.36 beschriebenen Stadien.

Representative Results

Nach den wesentlichen Stadien der Fixierung von Pflanzengewebe ergeben Zellstrukturen, die dem Lebenszustand unter Berücksichtigung der Morphologie, des Volumens und der räumlichen Organisation von Zellkomponenten und Geweben so ähnlich wie möglich sind¹⁶. Beobachten Sie solche Merkmale in den Proben nach der chemischen Fixierung (Abbildung 4). Abbildung 4C-F stellt ausreichend fixierte Proben unter Lichtmikroskopie dar. Die Befolgung der beschriebenen Fixierungsverfahren und die Vertrautheit mit der Probenstruktur helfen bei der Analyse des Fixierungserfolgs.

Abbildung 4: Oberflächliche Analyse und Schnitte aus filiformen Wurzeln der MH-Orchidee Wullschlaegelia aphylla (Sw.) Rchb.f . (A und B) Rhizomorphe in der filiformen Wurzeloberfläche. (C und D) Freihandabschnitte nicht gefärbt, zeigen Pelotone in kortikalen Zellen. (E und F) Dünnschliffe mit Toluidinblau gefärbt O. Abkürzungen: en = Endodermis, ep = Epidermis, ct = Kortex, hy = Hyphe, pc = parenchymatöse Zelle, pe = Phloemelemente, pl = Peloton, rfl = Wurzel (filiform), rm = Rhizomorph, vc = Gefäßzylinder, xe = Xylemelement. Maßstabsbalken: A = 2 mm; B = 500 μm; C und E = 200 μm; D = 100 μm; F = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

In Abbildung 4C,D ist die Regelmäßigkeit der Strukturen und das Fehlen beschädigter Bereiche in einem Freihandschnitt einer mit 10 % NBF fixierten Probe zu beachten. Das Zellvolumen bleibt erhalten und ähnelt lebenden Geweben. Der Vergleich mit einem freihändig geschnittenen frischen Organ ist auch wichtig, um gut fixierte Proben zu erkennen. In Abbildung 4E,F wurden Schnitte von Proben, die in GMA-Harz eingebettet und mit 10% NBF fixiert waren, mit Toluidinblau O gefärbt. Beachten Sie die gut erhaltenen Strukturen der Zellwände ohne Verzerrungen oder beschädigte Bereiche, die sehr ähnliche Merkmale wie in einer freihändig geschnittenen Probe aufweisen (Abbildung 4C, D).

Bei der Analyse der Oberfläche unterirdischer Organe weist das Vorhandensein von Rhizomorphen auf Hyphen hin, die innere Gewebe besiedeln. Rhizomorphe sind vegetative Strukturen, die aus einem Aggregat hochdifferenzierter Hyphen bestehen und von einigen wenigen Pilzarten gebildet werden, hauptsächlich saprotrophen, die Holz zersetzen^37,38. Die Rhizomorphen sind leicht zu erkennen, gewöhnlich als dunkle Shoestring-ähnliche Strukturen³⁷, die in Abbildung 4A, B und Abbildung 7D zu sehen sind. Die Suche nach diesen Pilzstrukturen erleichtert die Probenauswahl, um das Muster der Pilzbesiedlung in Pflanzenorganen zu beobachten. In Abbildung 4C,D wurden die Schnitte in Bereichen mit oberflächlichen Rhizomorphen erhalten, während in Abbildung 4E ein Schnitt desselben Organs ohne Auswahl eines solchen Kriteriums gezeigt ist. Individualisierte Hyphen können auch unter einem Seziermikroskop mit einer perzeptiven Beobachtung identifiziert werden.

Abbildung 5: Freihandschnitte der Speicherstruktur von Uleiorchis sp . (A) Schnitt unter einem Seziermikroskop. (B) Pelotonen unter einem Lichtmikroskop, konzentriert in einer Region des Kortex des Organs. (C und D) Hyphendetails der analysierten Pelotone. Abkürzungen: hy = Hypha, pc = parenchymatöse Zelle, pl = Peloton, s = Septen. Maßstabsbalken: A = 2 mm; B = 500 μm; C und D = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Wie bereits erläutert, kann der Freihandschnitt je nach Zielsetzung gegenüber dem Dünnschnitt bevorzugt werden. Freihand- oder andere Methoden zur Erzielung dickerer Abschnitte (mehr als 10 μm Dicke) können Pelotone besser nachweisen und repräsentativere Bilder von Pilzmustern der Besiedlung liefern (z. B. Abbildung 4C, D und Abbildung 5A, B). Freihandschnitte können auch für die Hyphenanalyse in höherer Amplifikation geeignet sein, wie in Abbildung 5C,D gezeigt, obwohl Details in dünneren Abschnitten, wie in Abbildung 7A, aus einer in GMA-Harz eingebetteten Probe besser erreicht werden. Einige Details der pflanzlichen Zellstrukturen sind in dünnen Schnitten ausreichend beobachtet, zum Beispiel Abbildung 4F. Die Montage ist ebenfalls ein wichtiger Schritt, da eine bessere Bildqualität vom Montagemedium abhängen kann. GMA-Harzobjektträger können in Wasser oder Glycerin montiert werden, obwohl ein handelsübliches Montagemedium (siehe Materialtabelle) das endgültige Bild verbessert, da es Unvollkommenheiten aus dem Schnittprozess füllt. In Abbildung 6C sind Unvollkommenheiten (Pfeilspitzen) in einem GMA-Harzabschnitt zu sehen, da der Objektträger mit Wasser montiert wurde.

Abbildung 6: Schnitte fusiformer Wurzeln von W. aphylla , mit Lugol-Lösung gefärbt. (A) Freihandschnitt mit Toluidinblau O und Lugol gefärbt. (B) Nur mit Toluidinblau gefärbt O. (C) Dünnschliff aus GMA-Harz, gefärbt mit Lactophenol-Baumwollblau und Lugol, Pfeilspitzen: Unvollkommenheiten durch Unregelmäßigkeiten der Klinge. (D) Freihandteil nur mit Lugol gefärbt. Abkürzungen: cw = Zellwand, pc = parenchymatöse Zelle, sg = Stärkekörner, vc = Gefäßzylinder. Maßstabsbalken: A = 200 μm; B und C = 100 μm; D = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Der Hauptvorteil bei der Verwendung von Toluidinblau O (angemessenere Ergebnisse in dünnen Schnitten) sind die wichtigen metachromatischen Eigenschaften dieser Färbung, was bedeutet, dass sie je nach zellulärer Komponente, an die sie bindet, unterschiedliche Farben annimmt und als polychromatische Färbung fungiert, die geeignet ist, verschiedene Zusammensetzungen von Zellwänden zu unterscheiden²³. In Abbildung 4F können sekundäre Zellwände in Xylemelementen leicht durch die Lichtfarbe identifiziert werden, die Toluidin erwirbt. Währenddessen werden Phloemelemente, die nur aus primären Zellwänden bestehen, durch ihre dünneren und dunkleren Zellwände identifiziert. Ein weiterer wichtiger Fleck, der hauptsächlich MH-Pflanzen berücksichtigt, ist Lugol-Lösung, da Stärkekörner leicht zu erkennen sind, wenn sie von ihr gefärbt werden. Die Schnitte sind in Abbildung 6A-D dargestellt: Freihandschnitt mit Toluidinblau O und Lugol in Abbildung 6A und nur Toluidinblau O in Abbildung 6B; dünner Schnitt aus GMA-Harz, gefärbt mit Lactophenol-Baumwolle blau und Lugol in Abbildung 6C; Freihandschnitt nur mit Lugol in Abbildung 6D gefärbt.

Die Inkubation von Freihand- (Abbildung 7C), GMA-Harz (Abbildung 7B) oder OCT-Abschnitten mit WGA-Fluorochrom-Konjugat und Calcofluor White kann die Strukturen der Pilzzellwand bzw. der Pflanzenzellwand verbessern. Es ist eine wichtige Methode zur Bestätigung von Hyphen, da WGA-Konjugat Spezifität zu N-Acetylglucosaminylresten aufweist, die in der Zellwand von Pilzen vorhanden sind. Abbildung 7A zeigt einen Ausschnitt des Blütenstiels, der mit Toluidinblau O gefärbt ist, während Abbildung 7B aus demselben Organ stammt und bestätigt, dass die in Abbildung 7A gezeigten Strukturen Hyphen sind. Artefakte durch Autofluoreszenz sind in GMA-Harzschnitten zu sehen (Pfeilspitzen, Abbildung 7B). Diese Artefakte hängen normalerweise mit der Fluorchromkonzentration zusammen und können vermieden werden, indem die Proben häufiger mit dem Puffer gewaschen werden. In Abbildung 7C ist ein freihändiger Wurzelabschnitt mit inneren und äußeren Hyphen dargestellt. Das gleiche Organ ist von REM in Abbildung 7D zu sehen, mit einer Fülle von Rhizomorphen und einzelnen Hyphen auf seiner Oberfläche. Adäquate REM-Mikroskopaufnahmen haben einen guten Kontrast zwischen Grautönen, so dass die Tridimensionalität gesehen und gut interpretiert werden kann. Wählen Sie repräsentative Bilder und vermeiden Sie irreführende Bilder (weiterführende Literatur: Tipps zur Auswahl elektronenmikroskopischer Aufnahmen³²).

Abbildung 7: Schnitte aus dem Blütenstamm und den filiformen Wurzeln von W. aphylla und oberflächliche Analyse der filiformen Wurzel durch REM . (A) Dünner Schnitt des Blütenstiels aus GMA-Harz, gefärbt mit Toluidinblau O. (B) Dünner Schnitt des Blütenstiels aus GMA-Harz, inkubiert mit WGA-Fluorochrom-Konjugat + Calcofluorweiß, Pfeilspitzen: Artefakte durch Autofluoreszenz. (C) Freihandschnitt der filiformen Wurzel, inkubiert mit WGA-Fluorochrom-Konjugat + Calcofluorweiß. (D) Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme der filiformen Wurzeloberfläche. Abkürzungen: cw = Zellwand, hy = Hyphen, pc = parenchymatöse Zelle, pl = Peloton, rfl = Wurzel (filiform), rm = Rhizomorph. Maßstabsbalken: A, C und D = 100 μm; B = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Früchte verschiedener Orchideenarten wurden 15 min lang in Natriumhypochlorit mit 2% Aktivchlor getaucht, um eine vollständige oberflächliche Desinfektion der Organe zu gewährleisten (Abbildung 8A). Samen mit steiferen Samenhüllen wie aus Vanille sp. (Abbildung 8A) und Pogoniopsis schenckii (Abbildung 9B-D) wurden für 10 min in die gleiche Lösung getaucht (Abbildung 8C), während schlankere, wie von Laelia sp. und Cattleya sp., für 7 min beibehalten wurden (Abbildung 9A). Der Transfer eines aliquoten Wassers aus der letzten Wäsche bestätigte die Wirksamkeit des Desinfektionsprozesses vor den Keimungstests, wobei beide beschriebenen Immersionsdauern berücksichtigt wurden.

Abbildung 8: Oberflächliche Desinfektion von Früchten und Samen von Vanilla panifolia, einer photosynthetischen Orchideenart . (A) Eintauchen von Früchten in Natriumhypochlorit mit aktivem Chlor. (B) Früchte längs geschnitten. (C) Samen, die nach dem Eintauchen in Natriumhypochlorit mit serographischem Gewebe filtriert und bereit sind, ausgesät oder in Kieselgel gelagert zu werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Aussaat der Samen über Filterpapierscheiben stellt sicher, dass genügend Feuchtigkeit und Sauerstoff für die Keimung und die Entwicklung des Embryos vorhanden sind (Abbildung 9A-D), ohne vollständig unter die oberflächliche Wasserschicht des Kulturmediums getaucht zu werden. Einige Pilzisolate können kräftig über den Samen wachsen. Das Medium, das 2 g/L zerkleinerte Haferflocken enthält, bietet eine bessere Kontrolle des Pilzwachstums und verbessert die Visualisierung und Analyse von Samen (Abbildung 9B). Nach ca. 50-60 Tagen Isolierimpfung muss das Medium erneuert werden, damit der Pilz aktiv bleibt. Dies kann durch Übertragung der Samen auf ein neues OMA-Medium der gleichen Formulierung erfolgen. Die Samen können mit dem Filterpapier übertragen werden, was ihre Übertragung erleichtert, ohne die empfindlichen Strukturen der Protocorme zu beschädigen, und sie in der ursprünglichen Position hält, ohne die zuvor eingerichteten Zählfelder zu beeinträchtigen.

Abbildung 9: Protokoll der symbiotischen Keimung . (A) Samen, die über Filterpapier in OMA-Medium angeordnet sind. (B) Petrischalen mit Samen und einem inokulierten Pilz (potentiell Mykorrhiza), ca. 21 Tage inkubiert. (C und D) Symbiotische Keimschalen mit verschiedenen Pilzisolaten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die meisten Orchideenarten keimen innerhalb weniger Wochen nach der Infektion mit dem beimpften Pilz oder bis fast mehr als einen Monat (Abbildung 10). Samen, die nicht innerhalb von 3 Monaten keimen, werden wahrscheinlich nicht keimen, es sei denn, sie passen die Methodik an. In solchen Fällen sollten Sie Möglichkeiten wie die Samenruhe oder das Pilzisolat in Betracht ziehen, das nicht mykorrhizal ist. Einige Arten benötigen spezifische Protokolle, um die Ruhephase zu durchbrechen, andere zeigen einfach eine hohe Spezifität für bestimmte Mykorrhizapartner, die sich von denen unterscheidet, die für den symbiotischen Keimtest ausgewählt wurden (Daten nicht veröffentlicht).

Abbildung 10: Pogoniopsis schenckii-Samen, eine achlorophylle und MH-Orchidee, in OMA-Medium mit Pilzimpfung³⁹, das die Keimung stimulieren kann. (A-D) Nicht gekeimte Samen und Protocorme in verschiedenen Entwicklungsstadien. Abkürzungen: ng = keine Keimung, pt = Protocorm, ri = gerissenes Integument, ts = turgider Samen. Maßstäbe = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

In den ersten Wochen nach der Impfung des Isolats werden die Gerichte ausgewertet, da es in der Regel 7-14 Tage dauert, bis die Hyphen die Samen erreichen. Betrachten Sie diesen Zeitraum, da es überwiegt, die Entwicklung der Embryonen zu registrieren. Die subtilen Veränderungen während der Keimungsstadien können nur unter einem Seziermikroskop nachgewiesen werden, wenn man bedenkt, dass die Strukturen so winzig sind. Einige Speziesprotocorme müssen unter einem Lichtmikroskop analysiert werden, um saugfähige Haare zu identifizieren und sie von Hyphen zu unterscheiden. Die GI-Analyse kann plausibler vergleichbare Ergebnisse liefern, indem sie eine Darstellung der gesammelten Daten generiert und Werten mehr Gewicht verleiht, die fortgeschritteneren Keimungsstadien entsprechen. Die endgültigen Werte können zwischen Null und sechs liegen (oder entsprechend der letzten definierten Stufe). Verschiedene statistische Tests können auf GI-Analysen angewendet werden (z. B. ANOVA, Signifikanzniveau), abhängig von den Fragen und Anforderungen des Forschers bei der Durchführung von symbiotischen Keimungstests.

Discussion

Bildanalysen in der Pflanzenanatomie und -morphologie haben ein wichtiges Potenzial, Ziele zu erreichen und zum Verständnis der Beziehungen zwischen mykoheterotrophen Pflanzen und ihren unverzichtbaren Pilzendophyten beizutragen, wie Untersuchungen unterirdischer Organe^6,40, Strukturanalysen der symbiotischen Keimung von Samen³⁹ sowie Luft- und Fortpflanzungsstrukturen ⁴¹ zeigen. . Obwohl die strukturelle Botanik in den letzten zehn Jahren ihr Prestige und ihren Platz an andere Bereiche der Pflanzenwissenschaften verloren hat¹, ist sie immer noch führend bei der Beantwortung von Fragen und hilft dabei, Neuheiten und wesentliche Pflanzenmerkmale im Zusammenhang mit Entwicklung, Ökologie, Physiologie und Evolution zu enthüllen. Diese Methoden bilden zusammen eine Grundlage für Strukturstudien von Pflanzen unter Berücksichtigung wichtiger Aspekte der MH-Pflanzenanalyse.

Wichtige Informationen werden bereitgestellt, um MH-Pflanzen sorgfältig zu sammeln, da sonst die gut entwickelten unterirdischen Organe geschädigt und nicht vollständig gesammelt werden können. Bemerkenswerte Anpassungen dieser Strukturen⁶ und der enge Kontakt mit Pilzen aus dem Boden, die mit autotrophen Pflanzen⁴² oder zersetzender Laubstreu⁴⁰ verbunden sind, sind beim Sammeln und Bewahren der unterirdischen Strukturen zu berücksichtigen. Die wesentlichen Schritte der Probenfixierung müssen angemessen befolgt werden, was die korrekte Vorbereitung der Fixiermittel und Zeitprobleme, die Mindestzeit zwischen dem Sammeln und Fixieren und die Mindestzeit des Fixiermittels vor der Lagerung betrifft. Die Strukturanalyse gut erhaltener Proben hängt vom Fixierungsprozess ab, und die gebräuchlichsten und am besten erhaltenden Fixiermittel, die zur Untersuchung der Pflanzenanatomie und Elektronenmikroskopie angewendet werden, sind im Abschnitt Protokolle beschrieben. Andere Fixiermittel^14,16,25 können ebenfalls angewendet werden.

Wie bereits erwähnt, ist der Prozess der Verwendung chemischer Fixiermittel entscheidend und kann bei der Gewinnung von Probenbildern bewertet werden. In LM sollten zelluläre Strukturen im Vergleich zu lebenden Geweben so ähnlich wie möglich sein¹⁶. Das Volumen, die Morphologie und die räumliche Anordnung identifizierbarer zellulärer Komponenten sollten so weit wie möglich dem frischen Gewebe (nicht fixiert) ähneln. In TEM können gut erhaltene Gewebe nachgewiesen werden, wenn der Tonoplast sichtbar ist, mit glatten Konturen und nicht vom Zytoplasma^{weggezogen wird 16}. Die Plasmamembran kann sich nicht lösen und von der Zellwand weggeschrumpft werden. Proben für TEM müssen so dünn wie möglich und in einem Tropfen Fixiermittel gesammelt werden, wie im Protokollabschnitt erläutert. Die Verwendung von Puffern, die mit Fixiermitteln verbunden sind, bietet wichtige Bedingungen für Osmolarität und ionische Zusammensetzung der zu fixierenden Proben, wodurch so viele Veränderungen wie möglich in der Zellstruktur und Ultrastruktur vermieden^{werden 16}. Im REM ist ein Hauptanliegen isotonische Fixiermittel und deren Vorbereitung mit Puffern, so dass es keine wesentlichen Änderungen des Probenvolumens (Quellung oder Schrumpfung) ^gibt16.

Viele verschiedene Einbettungsmethoden für LM stehen zur Verfügung, um Abschnitte für verschiedene Zwecke zu erhalten. Unter Berücksichtigung der Färbung und der Inkubation von Fluoreszenzfarbstoffen werden zwei wichtige Methoden zur Analyse der Organe von MH-Pflanzen vorgestellt. Die oben beschriebenen (Freihandschnitte, GMA-Harz und OCT-Einbettung) gehören zu den gebräuchlichsten und einfachsten und bieten methodische Freiheit und Eignung für viele Arten von Analysen. Das Konjugat WGA-Fluorochrom hat erhebliches Potenzial in MH-Pflanzenstudien, da es derzeit eher auf pilzliche Krankheitserreger 28,29,30 angewendet wird und kaum mit MH-Pflanzenpilzendophyten verwendet wird. Die grundlegenden und wesentlichen Schritte für die Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie sind detailliert, da diese Techniken einen großen Beitrag zur Strukturanalyse von Pflanzen leisten können. Die REM- und TEM-Literatur ist reichhaltig, und weitere Lektüre^32,33,34,43 wird empfohlen^, wenn andere Arten von elektronenmikroskopischen Analysen getestet werden sollen.

Bei symbiotischen Keimungsverfahren ist es möglich, eine Fruchtasepsis vor der Dehiszenz durchzuführen, ohne dass die Samen direkt desinfiziert werden müssen. Samen von bereits offenen oder von Endophyten besiedelten Früchten (bereits für MH-Spezies ^39,41 beschrieben) müssen jedoch direkt desinfiziert werden. Eine wichtige Anmerkung: Zeit und Bedingungen der Lagerung und Asepsis-Prozesse können die Lebensfähigkeit der Samen von einigen Arten reduzieren, wie bei der Durchführung dieser Experimente beobachtet. Tetrazolium-Reagenz verleiht Embryonen aus lebensfähigen Samen eine Farbe, die von hell bis dunkelrot reicht. Embryonen aus nicht lebensfähigen Samen behalten ihre natürliche Farbe. Samen mit stark pigmentierten Tegumenten oder starren Samenhüllen benötigen möglicherweise eine Vorbehandlung vor dem Keimtest. Es wird empfohlen, eine Skarifizierung ihres Teguments durchzuführen, um die Visualisierung des Embryos^{zu ermöglichen 35}.

Einige potenzielle Mykorrhizapilzisolate aus tropischen Orchideen, zum Beispiel Ceratobasidium-Arten , haben ein kräftiges und beschleunigtes Wachstum in einem nährstoffreichen Kulturmedium. Während der Behandlung ist es möglich, dass die Isolate die Samen beim Wachstum vollständig bedecken, was die Datenerfassung erschwert oder sogar unmöglich macht. Das allgemein verwendete Protokoll, das 4 g/L zerkleinerte Haferflocken⁹ enthielt, verhinderte die Datensammlung bei der symbiotischen Keimung von P. schenckii und erforderte eine Adgleichung an 2 g/L zerkleinerte Haferflocken³⁹. Die Verwendung von etwa 2,5 g / L Haferflocken zur Zusammensetzung von OMA-Medium in symbiotischer Keimung scheint zufriedenstellend zu sein, um das Wachstum von kräftigeren Pilzisolaten zu begrenzen (unveröffentlichte Daten).

Einschränkungen können sich aus den beschriebenen Methoden ergeben, von denen einige durch Anpassung der Verfahren oder Anwendung anderer Methoden effektiv überwunden werden können. Wie bereits erwähnt, ist die GMA-Einbettung nur für Schnitte bis zu 8 μm Dicke wirksam. Die OCT-Einbettung bietet jedoch unterschiedliche Dickenabschnitte, auch dickere (z. B. 10-20 μm). Die Färbung nur von Pilzstrukturen in Pflanzengeweben ist nicht einfach durchzuführen, obwohl WGA-Fluorochrom ein wichtiges und wirksames konjugiertes Fluorochrom ist, das Pilzzellwände markiert, obwohl es teuer ist. Andere Kostenbeschränkungen können sich bei REM- und TEM-Methoden ergeben, da die hohen Kosten und die Wesentlichkeit der Ausrüstung solche Analysen nicht trivial und für jede Forschungsgruppe üblich machen. Die symbiotischen Keimungstests von Saatgut, obwohl einfach und kostengünstig, erfordern Mykorrhizapilze zur Impfung der Samen und sorgfältige Verfahren, um Kontaminationen zu vermeiden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	179124	(for SEM stubs mounting)
Agar-agar (AA)	Sigma-Aldrich	A1296	(for seeds germination tests)
Calcofluor White Stain	Sigma-Aldrich	18909	fluorescent dye (detects cellulose)
Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8	Sigma-Aldrich	C2488	(for toluidine blue O staining)
Conductive Double-Sided Carbon Tape	Fisher Scientific	50-285-81	(for SEM)
Confocal Microscope	Zeiss		(any model)
Copper Grids	Sigma-Aldrich	G4776	(for TEM)
Critical-point dryer	Balzers		(any model)
Cryostat	Leica Biosystems		(any model)
Dissecting microscope	Leica Biosystems		(= stereomicroscope, any model)
Entellan	Sigma-Aldrich	107960	rapid mounting medium for microscopy
Ethyl alcohol, pure (≥99.5%)	Sigma-Aldrich	459836	(= ethanol, for dehydration processes)
Formaldehyde solution, 37%	Sigma-Aldrich	252549	(for NBF solution preparation)
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	histological tissue fixative
Gelatin capsules for TEM	Fisher Scientific	50-248-71	(for resin polymerisation in TEM)
Gelatin solution, 2% in H2O	Sigma-Aldrich	G1393	(dilute for slides preparation - OCT adherence)
Glutaraldehyde solution, 25%	Sigma-Aldrich	G6257	(for Karnovsky’s solution preparation)
HistoResin	Leica Biosystems	14702231731	glycol methacrylate (GMA) embedding kit
Iodine	Sigma-Aldrich	207772	(for Lugol solution preparation)
Lead(II) nitrate	Sigma-Aldrich	228621	Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)
Light Microscope	Olympus		(any model)
LR White acrylic resin	Sigma-Aldrich	L9774	hydrophilic acrylic resin for TEM
Lugol solution	Sigma-Aldrich	62650	(for staining)
Metal stubs for specimen mounts	Rave Scientific		(for SEM, different models)
Microtome	Leica Biosystems		manual rotary microtome or other model
Oatmeal agar (OMA)	Millipore	O3506	(for seeds germination tests)
OCT Compound, Tissue-Tek	Sakura Finetek USA	4583	embedding medium for frozen tissues
Osmium tetroxide	Sigma-Aldrich	201030	OsO4 (for TEM postfixation)
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793	sealing thermoplastic film
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	(for Karnovsky’s solution preparation)
Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O	Sigma-Aldrich	P8920	(for slides preparation - OCT adherence)
Poly-Prep Slides	Sigma-Aldrich	P0425	poly-L-lysine coated glass slides
Polyethylene Molding Cup Trays	Polysciences	17177A-3	(6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Polyethylene Molding Cup Trays	Polysciences	17177C-3	(13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Potassium iodide	Sigma-Aldrich	221945	(for Lugol solution preparation)
Potato Dextrose Agar (PDA)	Millipore	70139	(for seeds germination tests)
Scanning Electron Microscope	Jeol		(any model)
Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane]	Sigma-Aldrich	A3648	(for slides preparation - OCT adherence)
Silane-Prep Slides	Sigma-Aldrich	S4651	glass slides coated with silane
Silica gel orange, granular	Supelco	10087	(for dessicating processes)
Sodium cacodylate trihydrate	Sigma-Aldrich	C0250	(for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881	NaOH (for Karnovsky’s solution preparation and TEM contrast staining)
Sodium hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	425044	NaClO (for seeds surface disinfection)
Sodium phosphate dibasic, anhydrous	Sigma-Aldrich	71640	Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638	NaH2PO4·H2O (for NBF and PB)
Sputter coater	Balzers		(any model)
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)
Sudan III	Sigma-Aldrich	S4131	(for staining)
Sudan IV	Sigma-Aldrich	198102	(for staining)
Sudan Black B	Sigma-Aldrich	199664	(for staining)
Syringe			(3 mL, any brand, for TEM contrast staining)
Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 µm	Millipore	SLGV033R	PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)
Tek Bond Super Glue 793	Tek Bond Saint-Gobain	78072720018	liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	T3260	(for staining)
Transmission Electron Microscope	Jeol		(any model)
Triphenyltetrazolium chloride	Sigma-Aldrich	T8877	(for the tetrazolium test in seeds germination)
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S1804	Na3(C6H5O7)·2H2O (for TEM contrast staining)
Ultramicrotome	Leica Biosystems		(any model)
Uranyl acetate	Fisher Scientific	18-607-645	UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)
Vacuum pump			(any model)
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate	TermoFisher Scientific	W11261	fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)