Techniques de microscopie pour interpréter la colonisation fongique dans les tissus végétaux mycohétérotrophes et germination symbiotique des graines

Summary

Ce protocole vise à fournir des procédures détaillées pour la collecte, la fixation et la conservation d’échantillons de plantes mycohétérotrophes, en appliquant différentes techniques de microscopie telles que la microscopie électronique à balayage et à transmission, la microscopie optique, confocale et à fluorescence pour étudier la colonisation fongique dans les tissus et les graines des plantes germées avec des champignons mycorhiziens.

Abstract

La botanique structurale est une perspective indispensable pour bien comprendre l’écologie, la physiologie, le développement et l’évolution des plantes. Lors de la recherche sur les plantes mycohétérotrophes (c’est-à-dire les plantes qui obtiennent du carbone des champignons), des aspects remarquables de leurs adaptations structurelles, les modèles de colonisation des tissus par les champignons et la morphoanatomie des organes souterrains peuvent éclairer leurs stratégies de développement et leurs relations avec les hyphes, la source de nutriments. Un autre rôle important des champignons symbiotiques est lié à la germination des graines d’orchidées; toutes les espèces d’Orchidaceae sont mycohétérotrophes pendant la germination et le stade des plantules (mycohétérotrophie initiale), même celles qui photosynthétisent à l’âge adulte. En raison du manque de réserves nutritionnelles dans les graines d’orchidées, les symbiotes fongiques sont essentiels pour fournir des substrats et permettre la germination. L’analyse des stades de germination par perspective structurelle peut également répondre à des questions importantes concernant l’interaction des champignons avec les graines. Différentes techniques d’imagerie peuvent être appliquées pour dévoiler des champignons endophytes dans les tissus végétaux, comme le proposent cet article. Des sections à main levée et minces d’organes végétaux peuvent être colorées puis observées à l’aide de la microscopie optique. Un fluorochrome conjugué à l’agglutinine de germe de blé peut être appliqué sur les champignons et co-incubé avec Calcofluor White pour mettre en évidence les parois cellulaires végétales en microscopie confocale. En outre, les méthodologies de microscopie électronique à balayage et à transmission sont détaillées pour les orchidées mycohétérotrophes, et les possibilités d’appliquer de tels protocoles dans des plantes apparentées sont explorées. La germination symbiotique des graines d’orchidées (c’est-à-dire en présence de champignons mycorhiziens) est décrite en détail dans le protocole, ainsi que les possibilités de préparer les structures obtenues à partir de différentes étapes de la germination pour des analyses par microscopie optique, confocale et électronique.

Introduction

La recherche structurale en botanique, couvrant la morphologie et l’anatomie des plantes, est fondamentale pour comprendre l’organisme entier^1,2, et fournit des perspectives indispensables pour intégrer et contribuer à la connaissance de l’écologie^, de la physiologie, du développement et de l’évolution des plantes³. Les méthodes en morphologie et anatomie des plantes comprennent actuellement des protocoles, des équipements et des connaissances développés récemment ainsi qu’il y a plus d’un siècle². L’exécution et l’adaptation continues de méthodes classiques (par exemple, la microscopie optique) ainsi que des techniques plus récentes (par exemple, la microscopie confocale, la microtomographie à rayons X) ont la même base essentielle: des connaissances théoriques permettant le développement d’une méthodologie.

L’outil principal en anatomie et morphologie des plantes est l’image. Malgré l’idée fausse que de telles analyses sont de simples observations, laissant place aux interprétations subjectives², l’analyse et la compréhension des images dans ce domaine nécessitent une connaissance des méthodes appliquées (équipement, type d’analyse, procédures méthodologiques), des composants cellulaires, de l’histochimie et du corps végétal (organisation et fonction tissulaire, ontogenèse, adaptations morphologiques). L’interprétation des images obtenues par diverses méthodes peut conduire à corréler la forme et la fonction, à déchiffrer la composition chimique d’une structure, à corroborer la description des taxons, à comprendre les infections par les phytopathogènes et à d’autres évaluations similaires.

Lors de la recherche sur les plantes mycohétérotrophes (MH) (c’est-à-dire les plantes non photosynthétiques qui obtiennent du carbone à partir de champignons mycorhiziens^4,5), des aspects remarquables de leurs adaptations structurelles, les modèles de colonisation des tissus par les champignons et la morphoanatomie des organes souterrains peuvent éclairer leurs stratégies de développement et leurs relations avec les hyphes^, qui sont la source de nutriments. Les organes souterrains des plantes MH présentent généralement des adaptations importantes liées à leur association avec les champignons du sol, il est donc essentiel d’effectuer ces investigations anatomiques et morphologiques⁶. Les organes aériens des espèces MH ne doivent pas être ignorés, car les endophytes peuvent également être présents dans ces tissus, même s’ils ne sont pas des champignons mycorhiziens (observations personnelles, pas encore publiées).

Outre l’essentialité bien établie de l’association des champignons mycorhiziens avec les espèces MH tout au long de leur cycle de vie⁷, toutes les espèces d’orchidées, même les autotrophes, ont un stade mycohétérotrophe obligatoire initial dans les milieux naturels. Elle se produit parce que l’embryon des orchidées est indifférencié et dépourvu d’endosperme ou de cotylédons, étant donc incapable de se développer et de s’établir dans des environnements naturels sans le soutien nutritionnel de partenaires fongiques ^4,8. Considérant que, les protocoles de germination symbiotique peuvent être appliqués non seulement aux espèces MH, mais aussi aux orchidées photosynthétiques, visant à étudier la spécificité orchidée-champignon dans la germination et le développement du protocorme, une méthodologie largement appliquée dans les initiatives de conservation des espèces menacées 9,10,11.

Dans cet assemblage de méthodes, nous décrivons les étapes importantes impliquées dans la collecte, la fixation et le stockage d’échantillons de plantes MH pour les études anatomiques (section 1), l’analyse de surface et la sélection des échantillons (section 2), les méthodes de sectionnement (à main levée: section 3, microtomie: section 4, cryomicrotomie: section 5), coloration et montage (section 6), la fluorescence et la microscopie confocale des endophytes fongiques (section 7), la microscopie électronique à balayage (section 8), et la microscopie électronique à transmission (section 9). De plus, nous décrivons une méthode de germination symbiotique pour les graines d’orchidées (MH et autotrophe, section 10), car les méthodes d’imagerie mentionnées précédemment peuvent être appliquées avec succès pour analyser la colonisation fongique des graines, des protocormes et des plantules dans le processus de germination.

Figure 1 : Résumé schématique des méthodes d’imagerie. Les schémas fournissent des indications sur les étapes du protocole dans lesquelles ils sont détaillés. Abréviations : GMA = méthacrylate de glycol, OCT = composé à température de coupe optimale, MEB = microscopie électronique à balayage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les techniques de microscopie décrites ici en détail (Figure 1) sont précédées des étapes essentielles suivantes : prélèvement, fixation, déshydratation, enrobage et sectionnement des échantillons. Comme les étapes sont variables (figure 1) en fonction de la ou des techniques choisies, il est important de penser à l’avenir, en tenant compte des fixateurs à préparer et à transporter vers le site de prélèvement, de la façon dont les échantillons doivent être préparés avant la fixation, des processus de déshydratation à utiliser (section 1), des différentes possibilités d’encastrement et des méthodes de sectionnement (sections 4, 5, et 9). La figure 1 résume séquentiellement toutes les étapes requises pour chaque technique de microscopie décrite en détail ci-dessous.

Protocol

1. Collecte, fixation et conservation des échantillons

NOTE: Les plantes entièrement MH peuvent généralement être trouvées dans le sous-étage de la forêt sombre 12,13, principalement dans les zones humides et abondantes en litière, tandis que les plantes partiellement MH peuvent être trouvées dans les forêts plus ouvertes^12,13. Les plantes MH ont généralement des organes souterrains bien développés dans une variété de formes et de tailles.

1. Lors de la collecte d’espèces MH, explorez le sol autour de la base végétale, en prenant soin de ne pas endommager les organes souterrains, et évitez de tirer les plantes du sol pour éviter de déconnecter les organes aériens des organes souterrains.
2. Creusez soigneusement autour des structures aériennes à l’aide d’une truelle de jardinage tout en explorant les organes souterrains comme les racines, les tiges, les rhizomes et les organes de stockage, sans endommager ces structures.
3. Enlevez les particules de sol pour préserver les structures fragiles et lavez délicatement ces organes à l’eau du robinet pour rincer les particules de sol restantes avant de fixer les échantillons.
4. Les plantes MH associées à la litière de feuilles exigent une attention particulière; Collectez soigneusement les organes connectés au matériau en décomposition à travers leurs hyphes, évitez de retirer ces organes des structures connectées et collectez-les soigneusement car ces parties sont très délicates. Préservez les structures avec de telles connexions et collectez également la litière pour analyse.
5. Si vous choisissez d’analyser des matériaux frais à l’aide de techniques d’imagerie, conservez les échantillons dans des sacs en plastique fermés avec suffisamment d’humidité, suffisamment d’eau s’évapore et hydrate la plante, empêchant ainsi un excès d’eau d’entrer en contact avec les échantillons. Transportez-les immédiatement au laboratoire et analysez les échantillons le jour même où ils ont été prélevés, tout en veillant à ce que les échantillons soient encore conservés lors de leur analyse.
6. Transporter les fixateurs jusqu’au site de collecte dans des contenants bien fermés. Fixer rapidement les échantillons après le prélèvement pour la microscopie optique (LM) et la microscopie électronique à balayage (MEB) dans l’un des fixateurs suivants : formol tamponné neutre à 10 % (FBN¹⁴, tableau 1) ou solution de Karnovsky (modifié¹⁵, tableau 2). La solution de Karnovsky peut être préparée avec du tampon phosphate¹⁵ 0,2 M, dont la recette est décrite dans le tableau 3.
7. Pour l’analyse par microscopie électronique à transmission (MET), couper les échantillons d’une épaisseur de 4-3 mm à l’intérieur d’une goutte de tampon cacodylate de glutaraldéhyde-sodium (modifié¹⁶, tableau 4) en sections plus petites de 1-2 mm d’épaisseur. Jetez les bords coupés à l’extérieur de la goutte. Transférer immédiatement les sections dans un tube collecteur avec un volume de fixateur plus de 10 fois supérieur au volume des échantillons, car il s’agit d’un fixateur additif (c’est-à-dire que ses molécules sont ajoutées chimiquement aux protéines fixées¹⁶).
   ATTENTION : Les trois fixateurs décrits sont très toxiques. Éviter l’inhalation, surtout lors de leur utilisation sur le terrain. Préparez tous les fixateurs dans une hotte à l’aide de gants. Ne mélangez pas de cacodylate et d’acides, car l’arsenic gazeux peut se former¹⁶.
8. Si les échantillons fixés flottent dans le fixateur, cela indique la présence de gaz dans les tissus végétaux. L’air et les autres gaz empêchent le fixateur de pénétrer dans l’ensemble de l’échantillon². Éliminer le gaz des tissus en les prélevant à nouveau en plus petites parties et en utilisant une pompe à vide (pression de -300 à -400 inHg) jusqu’à ce que tous les échantillons coulent au fond de la solution¹⁷. Soyez prudent car une pression excessive exercée par la pompe peut endommager les échantillons.
9. Après au moins 48 h dans la solution de Karnovsky ou 10% NBF, laver les échantillons dans 0,2 M PB (tableau 3) et les déshydrater avec une série de 10%, 30%, 50% et enfin 70% d’éthanol. Pour les échantillons délicats, déshydrater pendant 30 min à chaque concentration; Pour les échantillons plus gros, déshydrater pendant 1 h ou plus.
   REMARQUE: Une solution d’éthanol à 70% est le milieu idéal pour stocker les échantillons. Les échantillons dans de l’éthanol à 70 % peuvent être conservés à température ambiante pendant des années. Ne stockez pas le matériel végétal pendant de longues périodes dans les fixateurs, car l’élimination des agents fixateurs est une étape essentielle après la fixation².
10. Conserver les échantillons dans du glutaraldéhyde-cacodylate à 4 °C avant de procéder à la postfixation (étape 9.1).

10 % de formol tamponné neutre (FBN)14
Étape 1	ajouter 10 mL de solution de formaldéhyde à 37-40 % dans 80 mL d’eau distillée
Étape 2	ajouter 0,4 g de phosphate de sodium monobasique monohydraté (NaH2PO4· H2O) à la solution
Étape 3	ajouter 0,65 g de phosphate de sodium dibasique, anhydre (Na2HPO4)
Étape 4	porter le volume à 100 mL

Tableau 1 : Recette de formol tamponné neutre à 10 % 14.

Solution de Karnovski (modifiée 15)
Étape 1	dans 20 mL d’eau distillée à 60-70 °C
Étape 2	Ajouter 0,8 g de paraformaldéhyde (pour obtenir 4% p/v), en agitant
Étape 3	ajouter 1 à 4 gouttes de NaOH à 40% et remuer jusqu’à ce que la solution devienne claire
Étape 4	refroidir et ajouter 30 mL de tampon phosphate 0,2 M pH 7,2 (tableau 3)
Étape 5	diluer 25 % de glutaraldéhyde dans 0,1 M PB (pH 7,2) pour obtenir 1 % de glutaraldéhyde (volume final : ~60 mL)
Étape 6	ajouter 1 % de glutaraldéhyde (étape 5) à la solution obtenue à l’étape 4 jusqu’à obtention d’une dose de fixation de 100 mL

Tableau 2 : Recette de la solution de Karnovsky (¹⁵ modifié).

Tampon phosphate 0,2 M (PB) pH 7,2
Étape 1	ajouter 14,196 g de phosphate dibasique de sodium anhydre (Na2HPO4) à 400 mL d’eau distillée
Étape 2	ajouter 13,8 g de phosphate de sodium monobasique monohydraté (NaH2PO4· H2O)
Étape 3	remuer jusqu’à ce que la solution soit claire
Étape 4	régler le volume final à 500 mL avec de l’eau distillée
Étape 5	ajuster le pH à 7,2
Étape 6	pour un PB de 0,1 M, diluer 1:1

Tableau 3 : Recette tampon phosphate 0,2 M.

3% glutaraldéhyde 0,2 M tampon cacodylate de sodium (modifié 16)
Étape 1	Tampon cacodylate 0,2 M : ajouter 4,28 g de trihydrate de cacodylate de sodium dans 100 mL d’eau distillée
Étape 2	ajuster le pH à 7,2
Étape 3	ajouter 12 mL de glutaraldéhyde à 25 % dans 25 mL de la solution à l’étape 2 (tampon cacodylate 0,2 M pH 7,2)
Étape 4	porter le volume à 100 mL avec de l’eau distillée

Tableau 4 : Recette tampon de glutaraldéhyde 0,2 M à 3 % de cacodylate de sodium (¹⁶ modifié).

2. Analyse de surface des organes dans le matériel fixe et non fixe

1. Pour analyser les hyphes superficiels dans les organes, en particulier souterrains, et ceux en contact avec la litière de feuilles, observez le matériel fixe ou frais dans un microscope à dissection (stéréomicroscope) à un grossissement de 7,5x ou plus, selon les échantillons analysés.
   1. Visualisez les échantillons immergés dans le fixateur, l’éthanol à 70% (s’il y est stocké) ou l’eau du robinet dans le cas d’une matière fraîche. Empêchez la lumière directe du microscope à dissection, car elle peut sécher et endommager les échantillons.
   2. Rechercher des zones d’intérêt dans les échantillons, guidés par les hyphes superficiels et les rhizomorphes. Sélectionner des échantillons qui contiennent des zones avec des rhizomorphes superficiels, car ceux-ci peuvent être sectionnés pour visualiser les pelotons et les serpentins d’hyphes dans les cellules corticales des racines et des tiges.
   3. Après la sélection, suivez les étapes 1.6 et 1.9 si les échantillons ne sont pas encore fixés. Si vous le souhaitez, photographiez des échantillons frais à l’aide d’un microscope optique sans fixation, comme décrit à la section 3.
   4. Utilisez la caméra couplée au stéréomicroscope pour recueillir des images à partir de surfaces d’organes, de rhizomorphes et d’autres structures observées. Dans de tels cas, faites en sorte qu’une couleur d’arrière-plan adéquate contraste bien avec le matériau et, si possible, choisissez un matériau de fond avec une surface moins rugueuse (par exemple, du papier).

3. Sections à main levée d’organes végétaux

REMARQUE: Les sections à main levée des organes végétaux peuvent être difficiles, en particulier pour les structures petites et minces. Cependant, ces sections de tissus avec des endophytes fongiques peuvent, dans certains cas, mieux montrer les hyphes et d’autres caractéristiques par rapport aux sections minces.

1. Couper les échantillons frais ou fixes à l’aide d’une lame tranchante, les couper aussi fins que possible et les placer immédiatement dans une petite boîte de Pétri avec de l’eau (si fraîche) ou de l’éthanol à 70% (si fixe). Utilisez un petit pinceau pour manipuler les sections sans les endommager.
2. Pour faciliter la sectionnement de matériaux plus difficiles (c.-à-d. organes petits, minces et flexibles), entourez l’échantillon d’une structure, par exemple du polystyrène ou du pétiole de Cecropia . Sculptez le support pour accueillir l’échantillon et faites une fine section de l’échantillon et du support ensemble.
3. Colorer et monter les échantillons comme décrit à la section 6.

4. Incorporation d’échantillons de plantes dans la résine et sectionnement

1. Déshydrater davantage les échantillons stockés dans de l’éthanol à 70% dans 80%, 96% et 2x dans de l’éthanol à 100%, pendant 30 min à 2 h selon la taille et la composition des échantillons.
2. Utilisez un kit de résine de méthacrylate de glycol (GMA) conformément aux instructions du fabricant. Voir Gerrits et Horobin (1996)¹⁸ pour d’autres considérations. Suivez les étapes d’infiltration et d’incorporation en conséquence.
   ATTENTION: La résine GMA est toxique, elle peut provoquer une réaction allergique et une irritation de la peau, des yeux et des muqueuses. Utilisez les réactifs dans une hotte et utilisez des gants.
3. Utiliser des plateaux de moulage en polyéthylène pour l’encastrement, choisis selon la taille des échantillons (p. ex., 13 mm x 19 mm x 5 mm pour les plus gros échantillons, 6 mm x 8 mm x 5 mm pour les plus petits). Faites attention à l’orientation souhaitée de l’échantillon à l’intérieur du moule et utilisez une aiguille pour aider à l’orientation.
4. Laisser pour polymérisation, de préférence à température ambiante, jusqu’à ce qu’il soit complètement solidifié. Le processus de durcissement prend généralement quelques heures, bien qu’il soit recommandé de démouler les blocs le lendemain. Après polymérisation, détachez soigneusement les blocs de résine des moules et procédez à la fixation des blocs dès que possible pour éviter la courbure des blocs.
5. Poncez la face du bloc de résine qui sera attaché, créant ainsi une surface plane. Collez le bloc de résine sur un cuboïde en bois (2 cm x 2 cm x 3 cm recommandé) avec un adhésif cyanoacrylate liquide de viscosité moyenne (voir le tableau des matériaux). Assurez-vous que la résine est complètement fixée pour éviter de compromettre la section.
6. Effectuer la section dans un microtome rotatif comme décrit ci-dessous.
   ATTENTION : Les lames des couteaux microtome sont très tranchantes et peuvent provoquer des accidents. Assurez-vous de les manipuler en suivant toutes les mesures de sécurité. Avant de vous approcher du couteau (par exemple, pour changer le bloc, pour humidifier la résine), verrouillez le volant grossier et placez le couvercle de sécurité de la lame. Entreposer les lames jetables dans les cas appropriés. Soyez extrêmement prudent lorsque vous remplacez des lames.
   NOTE: Différents types de couteaux (par exemple, jetables ou fixes; verre ou acier) peuvent être utilisés pour sectionner la résine GMA¹⁸. La qualité des sections dépend de la netteté du couteau. Assurez-vous que le couteau est bien attaché et ne peut pas bouger. Les couteaux jetables peuvent avoir besoin d’être changés régulièrement pour obtenir une meilleure section.
   1. Fixez fermement le cuboïde en bois au support de bloc. Ajustez l’orientation du sectionnement à l’aide des vis d’orientation et assurez-vous d’un angle adéquat du couteau à l’aide de l’inclinaison du couteau. Sélectionnez l’épaisseur des sections; utiliser un réglage plus épais pour le rognage et un réglage plus mince pour les sections sélectionnées, car les sections GMA adhèrent mieux à la lame de verre lorsqu’elles sont plus minces; L’épaisseur suggérée pour les tissus végétaux est de 5 à 8 μm.
   2. Avant de commencer, refroidissez la pièce, si nécessaire, car des températures plus élevées aggravent la qualité des sections. Préparez les éléments suivants pour le sectionnement : un bécher avec de l’eau distillée, une plaque chauffante, des pinceaux (au moins deux), une pince à épiler à pointe fine, une pipette Pasteur, des lames de verre, du papier filtre (ou du papier de soie) et un crayon (pour identifier les échantillons à sectionner).
   3. Régler la plaque chauffante à 50 °C et placer le bécher dessus. Faites attention aux différences de chauffage en fonction de la zone de la plaque chauffante (généralement, la zone centrale chauffe plus que les bords; chauffez l’eau au milieu, de préférence).
   4. Choisissez une lame de verre, identifiez-la avec un crayon et pipette l’eau distillée chaude sur toute la surface de la lame. Si nécessaire, utilisez une solution (p. ex., détergent et eau, ou éthanol à 70 %) pour briser la tension entre l’eau et le verre, de sorte que toute la lame soit recouverte de manière égale. Certains types de lames doivent être prénettoyés avec de l’éthanol à 70 % pour obtenir une adhérence adéquate de la section.
   5. Commencez par avancer progressivement la face du bloc de résine vers la lame du couteau. N’essayez pas de sectionner sans avancer le bloc au préalable, sinon l’équipement et le bloc peuvent être endommagés. Si nécessaire, coupez le bloc en utilisant une épaisseur supérieure (10 μm et plus).
   6. Lorsque vous approchez d’une section appropriée, effectuez un mouvement ferme à sens unique avec le volant, de sorte que la section soit faite immédiatement. Gardez un œil sur l’humidité de la résine. Pendant le sectionnement, hydratez régulièrement la face du bloc à couper à l’aide d’un pinceau trempé dans de l’eau distillée s’il y a un problème avec les sections de curling. Enlevez l’excès d’eau avec un papier de soie.
   7. Avec une paire de pincettes à pointe fine, placez la section obtenue dans l’eau au-dessus de la glissière. Au contact de l’eau, la résine GMA s’étire. Si nécessaire, utilisez un pinceau pour déplier et étirer doucement les sections. Utilisez un autre pinceau pour garder constamment la lame exempte de débris de résine. Ne passez pas d’un pinceau à l’autre pour éviter de mouiller la lame.
   8. Après avoir mis en file d’attente toutes les sections souhaitées dans la glissière, séchez la face inférieure de la lame et placez-la au-dessus de la plaque chauffante. Retirez l’excès d’eau du haut de la lame en tamponnant doucement avec un papier filtre (facultatif). Les sections adhèrent lorsque l’eau s’évapore du toboggan. Ne laissez pas les lames trop longtemps pour éviter que les sections ne soient endommagées par une chaleur excessive.
   9. Rangez les lames dans une boîte à lames, à l’abri de la poussière et du soleil, et utilisez-les pour la coloration et d’autres procédures. Les diapositives peuvent être stockées pendant plusieurs années.

5. Congélation d’échantillons de plantes et sectionnement à l’aide d’un cryostat

NOTE: La considération essentielle dans la cryosectionnement des tissus biologiques est de réduire les dommages dus à la formation de cristaux de glace lors de la congélation des échantillons. La cryoprotection se fait généralement par infusation de solutions chimiquement inertes telles que le glycérol ou le saccharose^19,20.

1. Un jour avant la section de l’échantillon, effectuez les étapes suivantes.
   1. Diluer 100 mL de 0,2 M PB (tableau 3) dans 100 mL d’eau distillée pour obtenir 200 mL de 0,1 M PB. Préparer des solutions de saccharose à 10 %, 20 % et 30 % dans 0,1 M PB (p. ex., pour une solution à 10 %, ajouter 2 g de saccharose dans 20 mL de tampon).
   2. Pour les échantillons frais, les laver dans 0,1 M PB pendant 30 min. Pour les échantillons dans un fixateur, les laver dans le même tampon que celui utilisé pour préparer le fixateur pendant 30 min. Pour les échantillons dans de l’éthanol à 70%, hydratez-les dans de l’éthanol à 50% et 30% et lavez dans 0,1 M PB pendant 1 h dans chaque solution.
   3. Incuber les échantillons pendant 2 h dans 10% saccharose, 2 h dans 20% saccharose et 2 h dans 30% saccharose, à température ambiante. Ensuite, incuber pendant une nuit dans 30% de saccharose à 4 °C (ou au moins pendant 3 h; la durée maximale est de 48 h).
2. Le jour du sectionnement, préparer 40% et 50% de saccharose dans 0,1 M PB; Ne préparez pas de solutions de saccharose plus de 12 h à l’avance. Incuber pendant 2 h dans chaque concentration de saccharose, à 4 °C.
3. Pour l’enrobage, dans de petits moules, réaliser une couche de composé OCT (milieu de température de coupe optimale, utilisé pour l’encastrement et la congélation des échantillons) et la conserver à -20 °C pour la congeler. Les moules peuvent être des moules histologiques réguliers, bien que pour faciliter le démoulage des blocs, ceux en papier ou en papier d’aluminium peuvent être fabriqués en utilisant un petit cuboïde comme cadre et ruban adhésif.
4. Une fois que la couche inférieure du composé OCT est congelée dans les moules, travailler à l’intérieur d’une chambre de cryostat (env. -27 °C). Placer les échantillons incubés dans 50% de saccharose dans les moules, dans l’orientation dans laquelle ils seront sectionnés. La face supérieure d’un bloc cuboïde est généralement une meilleure face de sectionnement. Marquez dans le moule où les échantillons sont placés, afin que le bloc puisse être facilement coupé et que l’orientation correcte soit maintenue.
5. Entourer les échantillons dans un composé OCT et faire éclater toute bulle d’air touchant les échantillons. Congelez-les à -20 °C. Les blocs étant complètement congelés, placez-les à l’intérieur de la chambre du cryostat (env. -27 °C). Démoulez chacun seulement avant de les utiliser et faites attention aux marques qui indiquent l’emplacement de l’échantillon à l’intérieur du bloc.
6. Comme le composé OCT est facilement coupé avec une lame, coupez les blocs de manière appropriée avant de les positionner sur les mandrins. Mettez un peu de composé OCT dans le mandrin du cryostat et positionnez le bloc de manière à ce que la face supérieure soit sectionnée. Les faces avec des zones plus petites offrent de meilleures sections. Attendez que le bloc soit bien attaché au mandrin et testez-le avant de commencer à sectionner.
7. Placez fermement le mandrin dans le porte-mandrin. Ajustez l’orientation du sectionnement à l’aide des vis d’orientation. Ajustez l’angle du couteau à l’aide de l’inclinaison du couteau. Sélectionnez l’épaisseur des sections. Les échantillons peuvent être sectionnés plus épais que les sections de résine habituelles. Des sections comprises entre 5 et 20 μm sont obtenues avec succès, les sections plus épaisses étant plus faciles à réaliser (moins de curling et moins de dommages aux structures).
8. Avancez la face du bloc gelé vers la lame du couteau. N’essayez pas de sectionner sans le faire, sinon le bloc peut être détaché du mandrin et endommagé. Si nécessaire, coupez le bloc en utilisant une épaisseur supérieure (10 μm et plus).
9. Lorsque vous approchez d’une section appropriée, placez la plaque antiroulis (c’est-à-dire une plaque transparente qui retiendra la section) au-dessus du couteau et effectuez un mouvement ferme à sens unique avec le volant, de sorte que la section soit faite immédiatement. Des problèmes de curling peuvent être causés si la plaque anti-roulis doit être ajustée (elle est généralement réglable en référence à la lame) ou s’il y a des débris dans la lame. Nettoyez constamment la lame avec un pinceau pour enlever les débris.
10. Utilisez des lames spéciales pour que les sections se fixent facilement, comme des lames silanisées (commerciales ou préparées avec 2% d’aminoalkylsilane dans de l’acétone 21), ou des lames préparées avec 500 μg/mL de poly-L-lysine dans de l’eau distillée 21 ou 0,2% de gélatine (voir détails²¹). Maintenez les lames à température ambiante.
11. Pour coller la section à une glissière, soulevez la plaque antiroulis et faites rapidement toucher la section par la glissière. Comme la glissière est à température ambiante, la section fond immédiatement et adhère à la glissière. Faites attention à tourner la face traitée de la glissière vers la section, qui peut rester au-dessus du couteau ou sur la face interne de la plaque antiroulis. Pour éviter l’enroulement des sections, effectuez cette étape rapidement dès que la plaque est soulevée et veillez à ne pas contorsionner la section.
12. Laissez la lame à l’extérieur de la chambre du cryostat (à température ambiante) si de nouvelles sections doivent y être ajoutées. Après avoir collé toutes les sections souhaitées à la lame, conservez-la à l’intérieur de la chambre du cryostat ou au congélateur (-20 °C ou moins). N’exposez pas les lames à l’humidité. Conservez-les dans une boîte à diapositives et n’oubliez pas d’identifier les diapositives avec un crayon.
    REMARQUE: Les lames et les blocs de PTO peuvent être stockés à -20 °C, mais pas trop longtemps. Pour obtenir de meilleurs résultats, utilisez les diapositives et les blocs en quelques jours.

6. Coloration des sections de plantes et des endophytes pour la microscopie optique

REMARQUE: De nombreux types de taches peuvent être utilisés pour les sections de plantes. Il est difficile de colorer différemment les champignons endophytes et les tissus végétaux. Bien qu’il ne s’agisse pas d’une procédure de coloration, une méthode de marquage des structures de champignons est présentée à la section 7 (fluorescence avec un conjugué agglutinine de germe de blé). Les sections à main levée (expliquées à la section 3), les sections de résine (section 4) et les cryosections (section 5) peuvent être colorées, bien que les colorations à base de phénol et d’alcool soient difficiles pour ces échantillons, car la résine GMA et l’OCT perdent leur adhérence à la lame dans ces cas.

1. Utilisez une ou combinez les méthodes de coloration habituelles suivantes pour les échantillons de plantes.
   1. Toluidine bleu O^22,23, une méthode largement appliquée pour la coloration générale des sections de plantes. Préparer une solution de 0,05% de bleu de toluidine O dans 0,1 M de phosphate (pH 6,8) ou 0,09 M de tampon de citrate (pH 4,5-4,8), selon les espèces et les types de tissus. Incuber les sections de résine GMA pendant 2 à 10 minutes à l’aide d’un pot de coloration à lames ou en plaçant quelques gouttes au-dessus des sections si peu de lames sont tachées. Laver soigneusement avec de l’eau distillée ou un tampon après l’incubation et monter les lames avec de l’eau ou les sécher sur une plaque chauffante pour produire des lames permanentes comme décrit à l’étape 6.3.
   2. Le réactif de Lugol² indique la présence d’amidon. Préparer une solution d’iode à 5 % (_I2) et d’iodure de potassium (KI) à 10 % dans de l’eau distillée. Colorer les sections pendant 2 min, en ajoutant quelques gouttes au-dessus de la glissière, puis laver à l’eau distillée. Ce test histochimique est généralement appliqué sur des lames temporaires.
   3. Soudan III, IV et noir B^24,25 coloration pour différents lipides. Préparer une solution à 0,3% de Soudan (III, IV ou noir B) dans de l’éthanol à 70%, la réchauffer jusqu’à ébullition et laisser refroidir. Utilisez le surnageant, filtrez-le et incuber les sections pendant 15 à 30 minutes dans une boîte de Petri fermée. Lavez soigneusement les sections avec de l’éthanol à 70% et de l’eau distillée. Montez les toboggans avec de l’eau (généralement appliqué uniquement aux toboggans temporaires).
      REMARQUE: Comme le Soudan est un colorant à base d’alcool, il convient mieux aux sections à main levée. Effectuez soigneusement la coloration de la section de résine GMA car ils se détachent généralement de la lame.
2. Pour les lames temporaires, montez les sections dans de l’eau ou de la glycérine et observez par la suite. Scellez le couvercle avec du vernis à ongles pour les conserver un peu plus longtemps.
3. Pour les glissières permanentes, montez les sections avec des résines synthétiques (p. ex., support de montage rapide, voir Tableau des matériaux). Égoutter quelques gouttes du support de montage (il peut déborder du couvercle), placez le couvercle avec précaution pour éviter les bulles et utilisez des pinces à linge pour presser la glissière contre la lamelle de couverture jusqu’à ce qu’elle soit complètement sèche. Enlevez l’excès de support de montage séché avec une lame de rasoir.

7. Application d’un fluorochrome conjugué à l’agglutinine de germe de blé en fluorescence et en microscopie confocale

NOTE: Cette méthode peut être appliquée aux sections à main levée (expliqué dans la section 3), aux sections de résine (section 4) et aux cryosections (section 5). Les cryosections peuvent convenir à des fins de microscopie confocale, car des échantillons plus épais peuvent être fournis par rapport aux sections de résine, mais pas aussi épais que les sections à main levée. Un fluorochrome conjugué à l’agglutinine de germe de blé (WGA, voir Tableau des matériaux) est appliqué à l’imagerie fongique en microscopie à fluorescence²⁶. Un microscope confocal n’est pas essentiel, bien qu’il puisse fournir des images tridimensionnelles claires des structures végétales²⁷.

1. Préparer une solution de 0,2 mg/mL de conjugué WGA-fluorochrome dans 0,1 M PB²⁸ (pH 7,2, vérifier étape 5.1.1 et Tableau 3). Préparer une solution de 1% de Calcofluor White dans 0,1 M PB (pH 7,2). Préparez de petites quantités de ces solutions, car les sections sont directement incubées avec elles.
2. Incuber les sections dans les lames de verre pendant 30 min dans la solution conjuguée WGA-fluorochrome²⁹, en utilisant suffisamment de volume pour couvrir les sections, puis laver dans 0,1 M PB.
3. Incuber les sections dans la solution de calcofluor, en utilisant suffisamment de volume comme support de montage. La solution peut être maintenue pendant la période d’observation.
4. Placez des lames de couverture sur les lames et observez au microscope confocal ou au microscope à fluorescence à l’aide des filtres suivants: TC/GFP (excitation: 470-440, émission: 525-550, pour WGA-fluorochrome dans le tableau des matériaux - paroi cellulaire fongique fluorescente verte sous ce filtre²⁹) et DAPI (excitation: 358, émission: 463, pour Calcofluor White)³⁰.
   NOTE: Des images tridimensionnelles peuvent être obtenues à l’aide de la fonction Z-series dans le microscope confocal²⁷.

8. Microscopie électronique à balayage des organes végétaux

1. Après avoir fixé les échantillons, effectué la déshydratation et stocké dans de l’éthanol à 70 % (section 1), une possibilité consiste à couper des échantillons pour exposer toute surface souhaitée pour l’analyse SEM, si nécessaire (p. ex. tissus internes, structure des ovaires). Utilisez une lame de rasoir tranchante et neuve et faites des coupes avec un mouvement unidirectionnel, en évitant une apparence endommagée de ces zones dans SEM. Si nécessaire, utilisez un stéréomicroscope pour sélectionner les échantillons et considérez la zone des souches métalliques pour déterminer la taille des échantillons.
2. Autres échantillons déshydratés pour le MEB dans une série éthanolique : 80 %, 96 % et 2x dans de l’alcool éthylique absolu (≥99,8 %). Conserver les échantillons petits et délicats pendant 30 minutes à chaque concentration et les échantillons plus grands et plus denses pendant 1 h.
3. Pliez de petites enveloppes en utilisant du papier de soie pour organiser les échantillons pour les prochaines étapes, les échantillons plus grands peuvent être manipulés sans enveloppe. Identifiez les enveloppes avec un crayon en écrivant une lettre ou un chiffre, et tenez un journal de tous les échantillons de chacune. Conservez les échantillons dans de l’éthanol absolu, mais pas longtemps, et passez à l’étape 8.4 dès que possible.
4. Procéder au séchage au point critique (CP). Faire fonctionner un sécheur CP conformément aux procédures d’utilisation normalisées. Placer les échantillons dans de l’éthanol absolu (fluide intermédiaire) dans une chambre de pression. Au point critique de CO₂ (31 °C, 7,3 x 10⁶ Pa), le fluide intermédiaire se dissout dans le fluide de transition (dioxyde de carbone liquide) et les échantillons sont séchés³¹.
5. Après séchage CP, conserver les échantillons dès que possible dans un récipient de dessiccation, par exemple une fiole scellée contenant du gel de silice. L’humidité atmosphérique peut détruire les échantillons s’ils sont réabsorbés³¹.
6. Utilisez des bouts métalliques pour monter les échantillons. Avant de monter, mettez des gants pour manipuler les talons, plongez-les dans l’acétone pendant 5 minutes pour éliminer toute graisse et laissez-les sécher. Utilisez un ruban adhésif conducteur à double face pour fixer les échantillons sur la tige et un stéréomicroscope pour aider à positionner les échantillons, en gardant à l’esprit que la vue d’en haut est la seule perspective possible dans les images SEM.
7. Manipulez les échantillons avec une pince à épiler à pointe fine, en faisant attention car la partie de l’échantillon touchée par la pince à épiler est généralement endommagée, alors essayez de toucher les parties éloignées des zones d’intérêt (par exemple, les zones en contact avec la bande). Maintenir les souches avec les échantillons dans une boîte de Petri scellée avec du gel de silice. Passez à l’étape 8.8 dès que possible.
8. Utilisez une pulvérisation pour déposer une couche de métal, généralement de l’or ou du platine, à la surface des échantillons dans une atmosphère à basse pression d’un gaz inerte, souvent l’argon³¹. Suivez les procédures opérationnelles normalisées lorsque vous utilisez un manteau de pulvérisation. L’épaisseur du revêtement dépend de la topographie des échantillons, généralement entre 15 et 40 nm³².
9. Conservez les souches enrobées dans une boîte de Petri scellée avec du gel de silice, et à condition que le gel de silice retienne l’humidité, les échantillons peuvent être stockés de cette façon pendant des semaines. Utilisez un microscope électronique à balayage pour analyser les échantillons. Les échantillons sous vide sont frappés par un faisceau d’électrons, et l’émission de signaux provenant d’une telle interaction est interprétée comme des images³¹. Pour plus de détails sur l’utilisation d’un microscope électronique à balayage, lire Jeffree et Read (1991)³¹ et Bozzola et Russell (1999)³².
10. Pour réutiliser les tiges, tirez le ruban adhésif et frottez-les avec de la laine métallique. Lavez-les à l’eau du robinet, immergez-les dans de l’éthanol absolu et séchez-les adéquatement, en empêchant l’oxydation du métal constitutif.

9. Microscopie électronique à transmission

1. Préfixer les échantillons avec un tampon glutaraldéhyde-cacodylate comme expliqué aux étapes 1.7 et 1.10. Après 12-24 h de préfixation, laver les échantillons 3x dans un tampon cacodylate 0,2 M (pH 7,25) pendant 10 min. Effectuer la postfixation avec du tétroxyde d’osmium à 1% (OsO₄) dans un tampon cacodylate 0,2 M, pendant 12 h dans l’obscurité, à température ambiante. Laver 3x à l’eau distillée pendant 5 min.
   ATTENTION : Le cacodylate et le tétroxyde d’osmium sont très toxiques et ne doivent pas être inhalés. Utilisez-les dans les hottes, en suivant les fiches de données de sécurité respectives.
2. Déshydrater les échantillons avec de l’éthanol à 30%, 50%, 70% et 96%, 2x à chaque concentration, pendant 10 min. Ensuite, déshydrater 3x dans de l’alcool absolu, pendant 15 min à chaque fois.
3. Infiltrer les échantillons dans des résines acryliques hydrophiles (voir Tableau des matériaux), une fois avec 1:1 résine + éthanol absolu et 3x avec de la résine pure pendant 8-12 h chacun. Procéder à la polymérisation dans des capsules de gélatine à 60 °C jusqu’à solidification complète (12 h maximum¹⁷).
4. Évaluer de près l’orientation des échantillons à l’intérieur du bloc de résine; Coupez la partie supérieure du bloc, avec une lame de rasoir, en formant une forme pyramidale qui concentre l’échantillon dans la zone de sectionnement. Obtenir des sections semi-minces (250-500 nm)³³ dans un ultramicrotome avec un couteau diamant et placer sur des lames de verre dans quelques gouttes d’eau.
5. Conserver les lames sur une plaque chauffante à 60 °C. Colorer les sections avec du bleu de toluidine O comme à l’étape 6.1.1 et laisser sécher complètement. Lavez soigneusement à l’eau du robinet. Évaluez la section obtenue en dessinant quatre quadrants et en sélectionnant le quadrant le plus approprié pour l’analyse.
6. Coupez le bloc de sorte que la forme pyramidale concentre le quadrant choisi sur la face supérieure du bloc. Produire des sections ultraminces (50-100 nm)^33,34. L’épaisseur est évaluée en fonction de la couleur d’interférence des sections: les sections d’environ 70 nm apparaissent argent-or, environ 100 nm apparaissent en or et avec environ 200 nm apparaissent bleues³⁴.
7. Recueillir les sections ultraminces de l’eau à l’aide de grilles en cuivre et procéder à la méthode de coloration de contraste avec de l’acétate d’uranyle et du citrate de plomb, comme décrit ci-dessous.
   1. Préparer une solution de citrate de plomb (tableau 5) et congeler la solution finale dans des tubes à microcentrifugation avec 1 mL de solution dans chacun, en ne décongelant que juste avant utilisation.
   2. Préparer une solution d’acétate d’uranyle : dissoudre 0,625 g d’acétate d’uranyle [UO 2(CH₃COO)₂] dans 25 mL d’eau distillée fraîchement bouillie et refroidie. Conserver dans une fiole foncée au congélateur.
      ATTENTION : Le nitrate de plomb est toxique en cas d’ingestion. 1 N NaOH est très corrosif. L’acétate d’uranyle est radioactif et toxique. Il ne doit pas être ingéré, inhalé ou entrer en contact avec la peau.
   3. Lors de la coloration, placez les deux réactifs préparés dans des seringues séparées de 3 ml avec des unités filtrantes (pores de 0,22 μm, voir le tableau des matériaux). Préparer une boîte de Petri retournée avec un film thermoplastique d’étanchéité dessus (voir le tableau des matériaux) et à l’intérieur d’une boîte plus large, avec des granulés de NaOH sur les bords comme piège pour le CO 2 ³² (voir la figure 2).
   4. Jeter la première goutte et, sur le film, placer une goutte d’acétate d’uranyle et trois gouttes d’eau distillée pour chaque grille tachée. Faites de même avec le citrate de plomb et ajoutez trois gouttes supplémentaires d’eau distillée.
   5. Incuber la grille (avec le côté opaque vers le bas, où se trouvent les sections) dans de l’uranyle pendant 30 min (temps variable). Lavez 3x dans les gouttes d’eau distillée, en séchant la grille à chaque fois doucement avec du papier filtre du côté brillant. Répétez avec la goutte de citrate de plomb (30 min) et lavez-la.
8. Après au moins 4 h, analysez les grilles au microscope électronique à transmission. Dans ce microscope, un faisceau d’électrons traverse les sections sous vide et l’image est projetée sur un écran fluorescent. Pour plus de détails sur l’utilisation d’un microscope électronique à transmission, lire Bozzola et Russell (1999)³².

solution de citrate de plomb (pour la coloration de contraste TEM)
Étape 1	entourer un bécher de papier d’aluminium
Étape 2	dissoudre 0,266 g de nitrate de plomb [Pb(NO3)2] dans 6 mL d’eau distillée récemment bouillie et refroidie
Étape 3	agiter pendant 2 min
Étape 4	ajouter 0,352 g de citrate trisodique [Na3(C6H5O7).2H2O] (la solution doit acquérir un aspect laiteux)
Étape 5	agiter pendant 15 min, sceller le bécher avec du papier d’aluminium et transférer la solution dans un bécher de 10 mL
Étape 6	ajouter 1,6 mL de NaOH 1N et 2,4 mL d’eau distillée (la solution doit être translucide)
Étape 7	si nécessaire, ajuster le pH proche de 12

Tableau 5 : Recette de solution de citrate de plomb.

Figure 2 : Schéma de coloration de contraste avec des solutions de citrate de plomb et d’acétate d’uranyle. (A) Préparez les boîtes de Petri, l’une retournée (au centre) avec un film thermoplastique afin que des gouttes puissent être placées au-dessus, à l’intérieur d’une plus large. Les granulés de NaOH sont des endroits autour du plat central. (B) Les gouttes d’acétate d’uranyle sont placées dans les cercles avec la lettre U, et les gouttes de citrate de plomb dans les cercles marquées L. DW indique des gouttes d’eau distillée. Les grilles sont colorées séquentiellement dans la colonne, de sorte que cinq grilles peuvent être colorées simultanément comme représenté. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

10. Germination symbiotique des graines d’orchidées

1. S’assurer que les solutions et tous les matériaux utilisés dans la germination symbiotique des graines sont stériles pour éviter toute contamination. Commencez par les autoclaver pendant 20 min à 121 °C. Les étapes de germination symbiotique sont résumées à la figure 3.
2. Désinfecter superficiellement les fruits et les graines en les immergeant dans une solution d’hypochlorite de sodium contenant 2% de chlore actif pendant 10-15 min pour les fruits et 7-10 min pour les graines, compte tenu de la rigidité et de l’épaisseur du tégument⁹. Les graines minces et fragiles peuvent être immergées dans une solution d’hypochlorite de sodium dilué 1:1. Ensuite, laver 3x dans de l’eau distillée autoclavée pour éliminer la solution d’hypochlorite.
3. Récupérez les graines en les filtrant dans un tissu sérigraphique et utilisez les graines pour procéder aux tests de germination (de préférence). Si nécessaire, les conserver dans des enveloppes en papier filtre à l’intérieur de flacons en verre avec du gel de silice, à 4 °C, fermer hermétiquement les flacons et les sceller avec un film alimentaire. Transférer quelques gouttes d’eau du dernier lavage sur gélose au dextrose de pomme de terre (PDA, 39 g/L) pour évaluer l’efficacité du processus de lavage.
4. Avant de semer des graines dans le milieu de culture, évaluer leur viabilité au moyen du test au tétrazolium (facultatif) décrit ci-dessous³⁵.
   1. Incuber environ 10 mg de graines dans un tube microcentrifuge contenant 1 mL de saccharose à 10 % dans de l’eau distillée, pendant 24 h à température ambiante (environ 25 °C), à la lumière.
   2. Retirer la solution de saccharose à l’aide d’une micropipette et ajouter 1 mL de solution de tétrazolium à 1 % (chlorure de triphényltétrazolium) dans de l’eau distillée. Incuber à 40 °C dans un thermobloc pendant 24 h dans l’obscurité.
   3. Retirer la solution de tétrazolium à l’aide d’une micropipette et laver les graines à l’eau distillée 2x ou jusqu’à élimination de la solution. Retirez tous les liquides. Si nécessaire, les graines peuvent être conservées au congélateur jusqu’à une semaine (comme à l’étape 10.3) avant d’être analysées.
   4. Remettez les graines en suspension dans de l’eau distillée et analysez-les au microscope optique. Les graines viables acquièrent une couleur rouge clair à foncé, tandis que les graines non viables conservent leur couleur naturelle.
5. Effectuer^{le protocole 9} adapté suivant pour la germination symbiotique des graines d’orchidées.
   1. Incuber les graines sur des disques de papier filtre autoclavés (1-2 cm de diamètre) placés dans des boîtes de Petri avec un milieu de culture en gélose à l’avoine (OMA) (2,5 g/L de flocons d’avoine et 7 g/L d’agar, pH 6).
   2. Au centre de la boîte de Pétri, inoculer un fragment de milieu de culture (environ 1 cm²) contenant du mycélium du champignon isolé choisi pour la procédure de germination. Scellez les boîtes de Petri avec un film alimentaire et incuberez-les dans l’obscurité à environ 25 ° C ou à température ambiante, car il est plus adéquat pour la croissance fongique.
   3. Préparez des plats avec des graines et sans inoculation fongique, comme témoin négatif pour le test de germination.
6. Analyser les résultats de germination chaque semaine, en recueillant des données quantitatives et qualitatives et en photographiant les protocormes et les semis. L’observation des graines et des protocormes doit être effectuée à l’aide d’un stéréomicroscope pour une évaluation plus précise de la germination. Utilisez une source de lumière venant d’en bas, car elle permet un plus grand contraste, ce qui permet de distinguer plus facilement le mycélium fongique des protocormes.
   1. Prélever des échantillons à différents stades de développement et les corriger pour les analyses anatomiques (section 1). Appliquer toutes les analyses d’images décrites précédemment pour étudier les endophytes fongiques dans les graines, les protocormes et les plantules pendant la germination (microscopie optique - sections 4, 5 et 6; confocale et fluorescence - section 7; SEM et TEM - articles 8 et 9).
   2. Générer des résultats quantitatifs suivant la classification des étapes selon le tableau 6. Les étapes décrivent le développement habituel des graines d’orchidées mycohétérotrophes. Recueillir des données chaque semaine et les tableaux avec les dates initiales de chaque étape observée.
   3. De plus, recueillir des données quantitatives estimant le pourcentage et le taux de germination. Comptez au moins 100 graines ou définissez des champs de comptage³⁵. Délimiter trois champs de comptage ou plus par boîte de Pétri, composés de régions fixes avec une superficie normalisée, et évaluer chaque semaine. Calculez les données collectées selon l’équation de l’indice de croissance (IG) :
      
      où N 0 est le nombre de semences comptées au stade₀ , N 1 se réfère au stade₁ , et il suit jusqu’au stade 6 (enregistré comme N₆)³⁶.

Figure 3 : Résumé schématique de la méthodologie de germination symbiotique des semences. Les schémas fournissent des indications sur les étapes détaillées du protocole. Abréviations : OMA = gélose à l’avoine, PDA = gélose au dextrose de pomme de terre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Stade de germination	Description
0	Pas de germination
1	Gonflement de l’embryon
2	Testa rupture
3	Les poils absorbants se développent
4	La projection des tiges se développe
5	Développement d’écailles protectrices (bractées)
6	Les premières racines se développent

Tableau 6 : Description des stades de développement du protocorme appliqués aux analyses périodiques des essais de germination. Modifié à partir des stades décrits dans Otero et ^al.36.

Representative Results

Suivre les étapes essentielles de la fixation des tissus végétaux donne des structures cellulaires aussi proches que possible de l’état vivant, compte tenu de la morphologie, du volume et de l’organisation spatiale des composants cellulaires et des tissus¹⁶. Observer de tels traits dans les échantillons après fixation chimique (Figure 4). La figure 4C-F représente des échantillons correctement fixés en microscopie optique. Suivre les procédures de fixation décrites et se familiariser avec la structure des échantillons permet d’analyser le succès de la fixation.

Figure 4: Analyse superficielle et coupes à partir des racines filiformes de l’orchidée MH Wullschlaegelia aphylla (Sw.) Rchb.f. (A et B) Rhizomorphs dans la surface des racines filiformes. (C et D) Sections à main levée non colorées, montrant des pelotons dans les cellules corticales. (E et F) Coupes minces colorées au bleu de toluidine O. Abréviations : en = endoderme, ep = épiderme, ct = cortex, hy = hyphe, pc = cellule parenchymateuse, pe = éléments phloèmes, pl = peloton, rfl = racine (filiforme), rm = rhizomorphe, vc = cylindre vasculaire, xe = élément xylème. Barres d’échelle: A = 2 mm; B = 500 μm; C et E = 200 μm; D = 100 μm; F = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Notons à la figure 4C,D la régularité des structures et l’absence de zones endommagées dans une section à main levée d’un échantillon fixé à 10 % NBF. Le volume cellulaire est préservé, ressemblant à des tissus vivants. La comparaison avec un organe frais à main levée est également importante pour reconnaître des échantillons bien fixés. Dans la figure 4E,F, des coupes provenant d’échantillons incorporés dans de la résine GMA et fixés à 10% NBF ont été colorées avec du bleu de toluidine O. Notez les structures bien préservées des parois cellulaires, sans distorsions ni zones endommagées, montrant des traits très similaires à ceux d’un échantillon à main levée (Figure 4C,D).

Lors de l’analyse de la surface des organes souterrains, la présence de rhizomorphes indique que les hyphes colonisent les tissus internes. Les rhizomorphes sont des structures végétatives composées d’un agrégat d’hyphes hautement différenciés et formées par quelques espèces de champignons, principalement saprotrophes qui décomposent le bois^37,38. Les rhizomorphes peuvent être facilement reconnus, généralement sous forme de structures sombres ressemblant à des moyens restreints³⁷, comme le montrent les figures 4A, B et 7D. La recherche de ces structures fongiques facilite la sélection des échantillons pour observer le modèle de colonisation fongique dans les organes des plantes. Sur la figure 4C,D, les coupes ont été obtenues dans des zones présentant des rhizomorphes superficiels, tandis que sur la figure 4E, une section du même organe sans sélection d’un tel critère est représentée. Les hyphes individualisés peuvent également être identifiés au microscope disséquant avec une observation perspicace.

Figure 5 : Coupes à main levée de la structure de stockage d’Uleiorchis sp. (A) Coupe au microscope à dissection. (B) Pelotons au microscope optique, concentrés dans une région du cortex de l’organe. (C et D) Détails des hyphes des pelotons analysés. Abréviations : hy = hyphe, pc = cellule parenchymateuse, pl = peloton, s = septa. Barres d’échelle: A = 2 mm; B = 500 μm; C et D = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Comme expliqué précédemment, le sectionnement à main levée peut être préféré au sectionnement mince en fonction de l’objectif. Les méthodes à main levée ou d’autres méthodes permettant d’obtenir des sections plus épaisses (plus de 10 μm d’épaisseur) peuvent mieux montrer les pelotons et fournir des images plus représentatives des modèles fongiques de colonisation (par exemple, la figure 4C, D et la figure 5A, B). Les sections à main levée peuvent également convenir à l’analyse des hyphes en amplification plus élevée, comme le montre la figure 5C, D, bien que les détails soient mieux obtenus dans des sections plus minces, comme dans la figure 7A, à partir d’un échantillon incorporé dans de la résine GMA. Certains détails des structures des cellules végétales sont observés de manière adéquate dans les sections minces, par exemple, la figure 4F. Le montage est également une étape importante, car des images de meilleure qualité peuvent dépendre du support de montage. Les lames de résine GMA peuvent être montées dans de l’eau ou de la glycérine, bien qu’un support de montage commercial (voir Tableau des matériaux) améliore l’image finale car il comble les imperfections du processus de sectionnement. Sur la figure 6C, des imperfections peuvent être vues (pointes de flèches) dans une section de résine GMA, car la glissière a été montée avec de l’eau.

Figure 6 : Coupes de racines fusiformes de W. aphylla colorées à la solution de Lugol. (A) Section à main levée colorée au bleu de toluidine O et Lugol. (B) Teintée uniquement avec du bleu de toluidine O. (C) Coupe mince en résine GMA colorée au lactophénol bleu de coton et Lugol, pointes de flèches: imperfections dues aux irrégularités de la lame. (D) Section à main levée teintée uniquement avec Lugol. Abréviations : cw = paroi cellulaire, pc = cellule parenchymateuse, sg = grains d’amidon, vc = cylindre vasculaire. Barres d’échelle: A = 200 μm; B et C = 100 μm; D = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Le principal avantage de l’utilisation du bleu de toluidine O (résultats plus adéquats en coupes minces) est l’importance des propriétés métachromatiques de cette coloration, ce qui signifie qu’elle acquiert différentes couleurs en fonction du composant cellulaire auquel elle se lie et fonctionne comme une coloration polychromatique adaptée pour différencier différentes compositions de parois cellulaires²³. Dans la figure 4F, les parois cellulaires secondaires dans les éléments du xylème peuvent être facilement identifiées par la couleur claire acquise par la toluidine. Pendant ce temps, les éléments du phloème, composés uniquement de parois cellulaires primaires, sont identifiés par leurs parois cellulaires plus minces et plus sombres. Une autre tache importante, principalement en ce qui concerne les plantes MH, est la solution de Lugol, car les grains d’amidon sont facilement identifiables lorsqu’ils sont colorés par elle. Les sections sont représentées à la figure 6A-D : coupe à main levée colorée au bleu de toluidine O et au Lugol à la figure 6A et uniquement au bleu de toluidine O à la figure 6B ; coupe mince en résine GMA colorée au lactophénol bleu de coton et au Lugol sur la figure 6C ; section à main levée colorée uniquement avec Lugol sur la figure 6D.

L’incubation de sections à main levée (Figure 7C), de résine GMA (Figure 7B) ou OCT avec un conjugué WGA-fluorochrome et du Calcofluor White peut améliorer les structures de la paroi cellulaire fongique et de la paroi cellulaire végétale, respectivement. C’est une méthode importante pour confirmer les hyphes, car le conjugué WGA a une spécificité aux résidus de N-acétylglucosaminyle, présents dans la paroi cellulaire des champignons. La figure 7A montre une section de tige florale colorée avec du bleu de toluidine O, tandis que la figure 7B provient du même organe et confirme que les structures observées à la figure 7A sont des hyphes. Des artefacts par autofluorescence peuvent être vus dans des coupes de résine GMA (pointes de flèches, figure 7B). Ces artefacts sont généralement liés à la concentration de fluorochrome et peuvent être évités en lavant les échantillons plus de fois avec le tampon. Sur la figure 7C, une section à main levée de la racine est montrée, avec des hyphes internes et externes. Le même organe peut être vu par MEB sur la figure 7D, avec une abondance de rhizomorphes et d’hyphes individuels à sa surface. Des micrographies MEB adéquates ont un bon contraste entre les nuances de gris, de sorte que la tridimensionnalité peut être vue et bien interprétée. Choisissez des images représentatives et évitez les images trompeuses (lectures complémentaires: conseils pour choisir des micrographies électroniques³²).

Figure 7 : Coupes de la tige florale et des racines filiformes de W. aphylla et analyse superficielle de la racine filiforme par MEB. (A) Section mince de tige florale en résine GMA, colorée au bleu de toluidine O. (B) Section mince de tige florale en résine GMA incubée avec conjugué WGA-fluorochrome + Calcofluor Blanc, pointes de flèches: artefacts par autofluorescence. (C) Coupe à main levée de racine filiforme incubée avec un conjugué WGA-fluorochrome + Calcofluor White. (D) Micrographie électronique à balayage de la surface de la racine filiforme. Abréviations : cw = paroi cellulaire, hy = hyphes, pc = cellule parenchymateuse, pl = peloton, rfl = racine (filiforme), rm = rhizomorphe. Barres d’échelle : A, C et D = 100 μm; B = 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les fruits de différentes espèces d’orchidées ont été immergés dans de l’hypochlorite de sodium avec 2% de chlore actif pendant 15 min, afin de garantir une désinfection superficielle complète des organes (Figure 8A). Les graines avec des téguments plus rigides comme Vanilla sp. (Figure 8A) et Pogoniopsis schenckii (Figure 9B-D) ont été immergées dans la même solution pendant 10 min (Figure 8C), tandis que les graines plus minces, comme celles de Laelia sp. et Cattleya sp., ont été maintenues pendant 7 min (Figure 9A). Le transfert d’une partie aliquote d’eau du dernier lavage a confirmé l’efficacité du processus de désinfection avant de procéder aux tests de germination, compte tenu des deux durées d’immersion décrites.

Figure 8 : Désinfection superficielle des fruits et des graines de Vanilla panifolia, une espèce d’orchidée photosynthétique. (A) Immersion des fruits dans l’hypochlorite de sodium avec du chlore actif. (B) Fruits sectionnés longitudinalement. (C) Graines filtrées à l’aide d’un tissu sérigraphique après immersion dans de l’hypochlorite de sodium, prêtes à être semées ou stockées dans du gel de silice. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Le semis des graines sur des disques de papier filtre garantit qu’il y a suffisamment d’humidité et d’oxygène pour la germination et le développement de l’embryon (figure 9A-D) sans être complètement submergé sous la couche d’eau superficielle du milieu de culture. Certains isolats fongiques peuvent pousser vigoureusement sur les graines. Le milieu contenant 2 g/L de flocons d’avoine broyés permet un meilleur contrôle de la croissance fongique, améliorant ainsi la visualisation et l’analyse des graines (figure 9B). Après environ 50 à 60 jours d’inoculation d’isolat, le milieu doit être renouvelé, de sorte que le champignon reste actif. Cela peut être fait en transférant les graines dans un nouveau milieu OMA de la même formulation. Les graines peuvent être transférées avec le papier filtre, ce qui facilite leur transfert sans endommager les structures délicates des protocormes, en plus de les maintenir dans leur position d’origine sans compromettre les champs de comptage précédemment établis.

Figure 9 : Protocole de germination symbiotique. (A) Graines disposées sur papier filtre dans un milieu OMA. (B) Boîtes de Petri avec des graines et un champignon inoculé (potentiellement mycorhizien), incubé pendant environ 21 jours. (C et D) Boîtes de germination symbiotique avec différents isolats fongiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La plupart des espèces d’orchidées germent quelques semaines après avoir été infectées par le champignon inoculé ou jusqu’à près d’un mois (figure 10). Les graines qui ne germent pas dans les 3 mois ne germeront probablement pas à moins d’ajuster la méthodologie. Dans de tels cas, considérez des possibilités telles que la dormance des graines ou l’isolat fongique n’étant pas mycorhizien. Certaines espèces ont besoin de protocoles spécifiques pour briser la dormance, d’autres présentent simplement une spécificité élevée à certains partenaires mycorhiziens, différente de ceux choisis pour le test de germination symbiotique (données non publiées).

Figure 10 : Graines de Pogoniopsis schenckii, orchidée achlorophylle et MH, en milieu OMA avec inoculation fongique³⁹ capable de stimuler la germination. (A-D) Graines et protocormes non germés à différents stades de développement. Abréviations : ng = pas de germination, pt = protocorme, ri = tégument rompu, ts = graine turgescente. Barres d’échelle = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dans les premières semaines après l’inoculation de l’isolat, les plats sont évalués, car il faut généralement 7 à 14 jours avant que les hyphes atteignent les graines. Considérez cette période, car il est prépondérant de commencer à enregistrer le développement des embryons. Les changements subtils au cours des étapes de germination ne peuvent être détectés qu’au microscope à dissection, étant donné que les structures sont si minuscules. Certains protocormes d’espèces doivent être analysés au microscope optique pour identifier les poils absorbants et les distinguer des hyphes. L’analyse gastro-intestinale peut fournir des résultats plus vraisemblablement comparables, générant une représentation des données collectées et conférant plus de poids aux valeurs correspondant à des stades de germination plus avancés. Les valeurs finales peuvent être comprises entre zéro et six (ou selon la dernière étape définie). Différents tests statistiques peuvent être appliqués aux analyses gastro-intestinales (p. ex., ANOVA, niveau de signification), en fonction des questions et des demandes du chercheur lors de la réalisation de tests de germination symbiotique.

Discussion

Les analyses d’images en anatomie et morphologie des plantes ont un potentiel important pour atteindre les objectifs et aider à comprendre les relations entre les plantes mycohétérotrophes et leurs endophytes fongiques indispensables, comme le démontrent les études sur les organes souterrains^6,40, les analyses structurelles de la germination symbiotique des graines³⁹ et les structures aériennes et reproductrices ⁴¹ . La botanique structurale, bien qu’elle ait perdu son prestige et son espace au profit d’autres domaines des sciences végétales au cours de la dernière décennie¹, joue toujours un rôle important dans la réponse aux questions et aide à dévoiler des nouveautés et des traits végétaux essentiels liés au développement, à l’écologie, à la physiologie et à l’évolution. Ces méthodes constituent collectivement une base pour les études structurales des plantes, en tenant compte des aspects importants de l’analyse des plantes MH.

Des informations essentielles sont fournies pour collecter soigneusement les plantes MH, sinon les organes souterrains bien développés peuvent être endommagés et ne pas être complètement collectés. Des adaptations remarquables de ces structures⁶ et le contact intime avec des champignons du sol, reliés à des plantes autotrophes⁴² ou à la litière de feuilles en décomposition⁴⁰ sont à prendre en compte lors de la collecte et de la préservation des structures souterraines. Les étapes essentielles de la fixation de l’échantillon doivent être suivies de manière adéquate, en ce qui concerne la préparation correcte des fixateurs et les problèmes de temps, le temps minimum requis entre la collecte et la fixation, et le temps minimum requis dans le fixateur avant de procéder au stockage. L’analyse structurale d’échantillons bien conservés dépend du processus de fixation, et les fixateurs les plus courants et les mieux conservés appliqués pour étudier l’anatomie des plantes et la microscopie électronique sont décrits dans la section des protocoles. D’autres fixateurs^14,16,25 peuvent également être appliqués.

Comme indiqué précédemment, le processus d’utilisation de fixateurs chimiques est décisif et peut être évalué lors de l’obtention d’images d’échantillon. Dans LM, les structures cellulaires doivent être aussi similaires que possible par rapport aux tissus vivants¹⁶. Le volume, la morphologie et la disposition spatiale des composants cellulaires identifiables doivent ressembler autant que possible aux tissus frais (non fixés). En MET, des tissus bien conservés peuvent être mis en évidence lorsque le tonoplaste est visible, avec des contours lisses, et non éloigné du cytoplasme¹⁶. La membrane plasmique ne peut pas être détachée et rétrécie loin de la paroi cellulaire. Les échantillons pour la TEM doivent être prélevés aussi finement que possible et à l’intérieur d’une goutte de fixateur, comme expliqué dans la section sur le protocole. L’utilisation de tampons associés aux agents fixateurs fournit des conditions importantes d’osmolarité et de composition ionique aux échantillons à fixer, évitant autant que possible les modifications de la structure cellulaire et de l’ultrastructure¹⁶. Dans le cas de la MEB, l’une des principales préoccupations concerne les fixateurs isotoniques et leur préparation avec des tampons, de sorte qu’il n’y a pas de changements considérables dans le volume de l’échantillon (gonflement ou retrait)¹⁶.

De nombreuses méthodes d’incorporation différentes pour LM sont disponibles pour obtenir des sections à des fins diverses. En ce qui concerne la coloration et l’incubation des colorants fluorescents, deux méthodologies importantes sont présentées pour analyser les organes des plantes MH. Ceux décrits ci-dessus (sections à main levée, résine GMA et intégration OCT) sont parmi les plus courants et les plus simples, offrant une liberté méthodologique et une adéquation à de nombreux types d’analyse. Le conjugué WGA-fluorochrome a un potentiel considérable dans les études sur les plantes MH, car il est actuellement plus appliqué aux pathogènes fongiques^28,29,30 et peu utilisé avec les endophytes fongiques des plantes MH. Les étapes de base et essentielles pour la microscopie électronique à balayage et à transmission sont détaillées, car ces techniques peuvent grandement contribuer à l’analyse structurelle des plantes. La littérature SEM et TEM est riche, et des lectures complémentaires^32,33,34,43 sont recommandées si d’autres types d’analyses de microscopie électronique doivent être testés.

En ce qui concerne les procédures de germination symbiotique, il est possible de pratiquer l’asepsie du fruit avant la déhiscence, sans qu’il soit nécessaire de désinfecter directement les graines. Cependant, les graines de fruits déjà ouverts ou colonisés par des endophytes (déjà décrites pour l’espèce MH^39,41) doivent être directement désinfectées. Une remarque importante: le temps et les conditions de stockage et les processus d’asepsie peuvent réduire la viabilité des graines de certaines espèces observées lors de la réalisation de ces expériences. Le réactif tétrazolium confère une couleur allant du rouge clair au rouge foncé aux embryons de graines viables. Les embryons de graines non viables conservent leur couleur naturelle. Les graines avec des téguments fortement pigmentés ou des téguments rigides peuvent nécessiter un prétraitement avant l’essai de germination. Il est recommandé d’effectuer une scarification de leur tégument, permettant la visualisation de l’embryon³⁵.

Certains isolats fongiques mycorhiziens potentiels d’orchidées tropicales, par exemple les espèces de Ceratobasidium , ont une croissance vigoureuse et accélérée dans un milieu de culture riche en nutriments. Pendant le traitement, il est possible que les isolats couvrent complètement les graines lorsqu’elles poussent, ce qui rend la collecte de données difficile, voire impossible. Le protocole couramment utilisé contenant 4 g/L de flocons d’avoine broyés⁹ a empêché la collecte de données sur la germination symbiotique de P. schenckii, exigeant une adéquation à 2 g/L de flocons d’avoine^{broyés 39}. L’utilisation d’environ 2,5 g/L de flocons d’avoine pour composer le milieu OMA en germination symbiotique semble être satisfaisante pour limiter la croissance d’isolats fongiques plus vigoureux (données non publiées).

Les méthodes décrites peuvent présenter des limites, dont certaines peuvent être surmontées efficacement en adaptant les procédures ou en appliquant d’autres méthodes. Comme discuté précédemment, l’encastrement GMA n’est efficace que pour la sectionnement jusqu’à 8 μm d’épaisseur. Cependant, l’encastrement OCT fournit différentes sections d’épaisseur, y compris des sections plus épaisses (par exemple, 10-20 μm). La coloration des structures uniquement des champignons dans les tissus végétaux n’est pas facile à effectuer, bien que le fluorochrome WGA soit un fluorochrome conjugué important et efficace qui marque les parois cellulaires fongiques, bien qu’il soit coûteux. D’autres limitations de coûts peuvent survenir dans les méthodes SEM et TEM, car les coûts élevés et le caractère essentiel de l’équipement font que de telles analyses ne sont pas triviales et habituelles pour tous les groupes de recherche. Les tests de germination symbiotique des graines, bien que simples et moins coûteux, nécessitent des champignons mycorhiziens pour inoculer les graines et des procédures minutieuses évitant les contaminations.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	179124	(for SEM stubs mounting)
Agar-agar (AA)	Sigma-Aldrich	A1296	(for seeds germination tests)
Calcofluor White Stain	Sigma-Aldrich	18909	fluorescent dye (detects cellulose)
Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8	Sigma-Aldrich	C2488	(for toluidine blue O staining)
Conductive Double-Sided Carbon Tape	Fisher Scientific	50-285-81	(for SEM)
Confocal Microscope	Zeiss		(any model)
Copper Grids	Sigma-Aldrich	G4776	(for TEM)
Critical-point dryer	Balzers		(any model)
Cryostat	Leica Biosystems		(any model)
Dissecting microscope	Leica Biosystems		(= stereomicroscope, any model)
Entellan	Sigma-Aldrich	107960	rapid mounting medium for microscopy
Ethyl alcohol, pure (≥99.5%)	Sigma-Aldrich	459836	(= ethanol, for dehydration processes)
Formaldehyde solution, 37%	Sigma-Aldrich	252549	(for NBF solution preparation)
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	histological tissue fixative
Gelatin capsules for TEM	Fisher Scientific	50-248-71	(for resin polymerisation in TEM)
Gelatin solution, 2% in H2O	Sigma-Aldrich	G1393	(dilute for slides preparation - OCT adherence)
Glutaraldehyde solution, 25%	Sigma-Aldrich	G6257	(for Karnovsky’s solution preparation)
HistoResin	Leica Biosystems	14702231731	glycol methacrylate (GMA) embedding kit
Iodine	Sigma-Aldrich	207772	(for Lugol solution preparation)
Lead(II) nitrate	Sigma-Aldrich	228621	Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)
Light Microscope	Olympus		(any model)
LR White acrylic resin	Sigma-Aldrich	L9774	hydrophilic acrylic resin for TEM
Lugol solution	Sigma-Aldrich	62650	(for staining)
Metal stubs for specimen mounts	Rave Scientific		(for SEM, different models)
Microtome	Leica Biosystems		manual rotary microtome or other model
Oatmeal agar (OMA)	Millipore	O3506	(for seeds germination tests)
OCT Compound, Tissue-Tek	Sakura Finetek USA	4583	embedding medium for frozen tissues
Osmium tetroxide	Sigma-Aldrich	201030	OsO4 (for TEM postfixation)
Parafilm M	Sigma-Aldrich	P7793	sealing thermoplastic film
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127	(for Karnovsky’s solution preparation)
Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O	Sigma-Aldrich	P8920	(for slides preparation - OCT adherence)
Poly-Prep Slides	Sigma-Aldrich	P0425	poly-L-lysine coated glass slides
Polyethylene Molding Cup Trays	Polysciences	17177A-3	(6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Polyethylene Molding Cup Trays	Polysciences	17177C-3	(13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Potassium iodide	Sigma-Aldrich	221945	(for Lugol solution preparation)
Potato Dextrose Agar (PDA)	Millipore	70139	(for seeds germination tests)
Scanning Electron Microscope	Jeol		(any model)
Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane]	Sigma-Aldrich	A3648	(for slides preparation - OCT adherence)
Silane-Prep Slides	Sigma-Aldrich	S4651	glass slides coated with silane
Silica gel orange, granular	Supelco	10087	(for dessicating processes)
Sodium cacodylate trihydrate	Sigma-Aldrich	C0250	(for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881	NaOH (for Karnovsky’s solution preparation and TEM contrast staining)
Sodium hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	425044	NaClO (for seeds surface disinfection)
Sodium phosphate dibasic, anhydrous	Sigma-Aldrich	71640	Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638	NaH2PO4·H2O (for NBF and PB)
Sputter coater	Balzers		(any model)
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389	C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)
Sudan III	Sigma-Aldrich	S4131	(for staining)
Sudan IV	Sigma-Aldrich	198102	(for staining)
Sudan Black B	Sigma-Aldrich	199664	(for staining)
Syringe			(3 mL, any brand, for TEM contrast staining)
Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 µm	Millipore	SLGV033R	PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)
Tek Bond Super Glue 793	Tek Bond Saint-Gobain	78072720018	liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	T3260	(for staining)
Transmission Electron Microscope	Jeol		(any model)
Triphenyltetrazolium chloride	Sigma-Aldrich	T8877	(for the tetrazolium test in seeds germination)
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S1804	Na3(C6H5O7)·2H2O (for TEM contrast staining)
Ultramicrotome	Leica Biosystems		(any model)
Uranyl acetate	Fisher Scientific	18-607-645	UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)
Vacuum pump			(any model)
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate	TermoFisher Scientific	W11261	fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)