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Biology

Tecniche di microscopia per l'interpretazione della colonizzazione fungina nei tessuti delle piante micoeterotrofiche e della germinazione simbiotica dei semi

Published: May 17, 2022 doi: 10.3791/63777
Automatic Translation
1, 1, 1
1LabPlaM - Mycoheterotrophic Plants Research Lab, Department of Plant Biology, University of Campinas (UNICAMP)

Summary

Questo protocollo mira a fornire procedure dettagliate per la raccolta, la fissazione e il mantenimento di campioni di piante micoeterotrofiche, applicando diverse tecniche di microscopia come la microscopia elettronica a scansione e trasmissione, la microscopia ottica, confocale e a fluorescenza per studiare la colonizzazione fungina nei tessuti delle piante e nei semi germinati con funghi micorrizici.

Abstract

La botanica strutturale è una prospettiva indispensabile per comprendere appieno l'ecologia, la fisiologia, lo sviluppo e l'evoluzione delle piante. Quando si studiano piante micoeterotrofiche (cioè piante che ottengono carbonio dai funghi), aspetti notevoli dei loro adattamenti strutturali, i modelli di colonizzazione dei tessuti da parte dei funghi e la morfoanatomia degli organi sotterranei possono illuminare le loro strategie di sviluppo e le loro relazioni con le ife, la fonte di nutrienti. Un altro ruolo importante dei funghi simbionti è legato alla germinazione dei semi di orchidea; tutte le specie di Orchidaceae sono micoeterotrofiche durante la germinazione e la fase di semina (micoeterotrofia iniziale), anche quelle che fotosintetizzano negli stadi adulti. A causa della mancanza di riserve nutrizionali nei semi di orchidee, i simbionti fungini sono essenziali per fornire substrati e consentire la germinazione. L'analisi delle fasi di germinazione da prospettive strutturali può anche rispondere a domande importanti riguardanti l'interazione dei funghi con i semi. Diverse tecniche di imaging possono essere applicate per svelare gli endofiti dei funghi nei tessuti vegetali, come proposto in questo articolo. Le sezioni a mano libera e sottili degli organi vegetali possono essere colorate e quindi osservate con microscopia ottica. Un fluorocromo coniugato all'agglutinina del germe di grano può essere applicato ai funghi e co-incubato con Calcofluor White per evidenziare le pareti cellulari delle piante in microscopia confocale. Inoltre, le metodologie di scansione e microscopia elettronica a trasmissione sono dettagliate per orchidee micoeterotrofe e vengono esplorate le possibilità di applicare tali protocolli in piante correlate. La germinazione simbiotica dei semi di orchidea (cioè in presenza di funghi micorrizici) è descritta nel protocollo in dettaglio, insieme alle possibilità di preparare le strutture ottenute da diversi stadi di germinazione per analisi con microscopia ottica, confocale ed elettronica.

Introduction

La ricerca strutturale in botanica, che copre la morfologia e l'anatomia delle piante, è fondamentale per comprendere l'intero organismo1,2 e fornisce prospettive indispensabili per integrare e contribuire alla conoscenza riguardante l'ecologia, la fisiologia, lo sviluppo e l'evoluzione delle piante3. I metodi in morfologia e anatomia vegetale comprendono attualmente protocolli, attrezzature e conoscenze sviluppate di recente e più di un secolo fa2. L'esecuzione e l'adattamento continui di metodi classici (ad esempio, microscopia ottica) insieme a tecniche più recenti (ad esempio, microscopia confocale, microtomografia a raggi X) hanno la stessa base essenziale: conoscenze teoriche che consentono lo sviluppo di una metodologia.

Lo strumento principale nell'anatomia e nella morfologia delle piante è l'immagine. Nonostante l'idea errata che tali analisi siano semplici osservazioni, dando spazio a interpretazioni soggettive2, l'analisi e la comprensione delle immagini in quest'area richiede la conoscenza dei metodi applicati (l'attrezzatura, il tipo di analisi, le procedure metodologiche), i componenti cellulari, l'istochimica e il corpo vegetale (organizzazione e funzione dei tessuti, ontogenesi, adattamenti morfologici). L'interpretazione delle immagini ottenute attraverso una varietà di metodi può portare a correlare forma e funzione, decifrare la composizione chimica di una struttura, corroborare nella descrizione dei taxa, comprendere le infezioni da fitopatogeni e altre valutazioni simili.

Quando si studiano piante micoeterotrofe (MH) (cioè piante non fotosintetiche che ottengono carbonio dai funghi micorrizici4,5), aspetti notevoli dei loro adattamenti strutturali, i modelli di colonizzazione dei tessuti da parte dei funghi e la morfoanatomia degli organi sotterranei possono illuminare le loro strategie di sviluppo e le relazioni con le ife, che sono la fonte di nutrienti. Gli organi sotterranei delle piante MH di solito mostrano importanti adattamenti legati alla loro associazione con i funghi del suolo, quindi è essenziale eseguire queste indagini anatomiche e morfologiche6. Gli organi aerei delle specie MH non devono essere ignorati, poiché gli endofiti possono essere presenti anche in questi tessuti, anche se non sono funghi micorrizici (osservazioni personali, non ancora pubblicate).

Oltre alla consolidata essenzialità dell'associazione dei funghi micorrizici con le specie MH durante il loro intero ciclo vitale7, ogni specie di orchidea, anche quelle autotrofe, ha un primo stadio micoeterotrofico obbligato in ambienti naturali. Si verifica perché l'embrione delle orchidee è indifferenziato e manca di un endosperma o di cotiledoni, essendo quindi incapace di svilupparsi e stabilirsi in ambienti naturali senza il supporto nutrizionale di partner fungini 4,8. Considerando che, i protocolli di germinazione simbiotica possono essere applicati non solo alle specie MH ma anche alle orchidee fotosintetizzanti, con l'obiettivo di indagare la specificità orchidea-fungo nella germinazione e nello sviluppo del protocormo, una metodologia ampiamente applicata nelle iniziative per la conservazione delle specie minacciate 9,10,11.

In questo assemblaggio di metodi, descriviamo importanti passaggi coinvolti nella raccolta, fissazione e conservazione di campioni di piante MH per studi anatomici (sezione 1), analisi superficiale e selezione dei campioni (sezione 2), metodi di sezionamento (mano libera: sezione 3, microtomia: sezione 4, criomicrotomia: sezione 5), colorazione e montaggio (sezione 6), fluorescenza e microscopia confocale di endofiti fungini (sezione 7), microscopia elettronica a scansione (sezione 8), e microscopia elettronica a trasmissione (sezione 9). Inoltre, descriviamo un metodo di germinazione simbiotica per i semi di orchidea (MH e autotrofico, sezione 10), poiché i metodi di imaging precedentemente menzionati possono essere applicati con successo per analizzare la colonizzazione fungina di semi, protocormi e piantine nel processo di germinazione.

Figure 1
Figura 1: Riepilogo schematico dei metodi di imaging. Gli schemi forniscono indicazioni sui passaggi del protocollo in cui sono dettagliati. Abbreviazioni: GMA = glicole metacrilato, OCT = composto con temperatura di taglio ottimale, SEM = microscopia elettronica a scansione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Le tecniche di microscopia qui descritte in dettaglio (Figura 1) sono precedute dalle seguenti fasi essenziali: raccolta, fissaggio, disidratazione, incorporamento e sezionamento dei campioni. Poiché le fasi sono variabili (Figura 1) a seconda della tecnica o delle tecniche scelte, è importante pensare in anticipo, considerando i fissativi da preparare e trasportare al sito di raccolta, come i campioni devono essere preparati prima del fissaggio, i processi di disidratazione da utilizzare (sezione 1) e le diverse possibilità di incorporamento e metodi di sezionamento (sezioni 4, 5, e 9). La Figura 1 riassume sequenzialmente tutti i passaggi necessari per ciascuna tecnica di microscopia descritti dettagliatamente di seguito.

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Protocol

1. Raccolta, fissaggio e conservazione dei campioni

NOTA: Le piante completamente MH si trovano di solito nel sottobosco della foresta oscura 12,13, principalmente in aree umide e abbondanti di rifiuti, mentre le piante parzialmente MH possono essere trovate nelle foreste più aperte12,13. Le piante MH di solito hanno organi sotterranei ben sviluppati in una varietà di forme e dimensioni.

  1. Quando raccogli le specie MH, esplora il terreno intorno alla base vegetale, facendo attenzione a non danneggiare gli organi sotterranei ed evita di estrarre le piante da terra per evitare di scollegare gli organi aerei da quelli sotterranei.
  2. Scava attentamente intorno alle strutture aeree usando una cazzuola da giardinaggio mentre esplori gli organi sotterranei come radici, steli, rizomi e organi di conservazione, senza danneggiare queste strutture.
  3. Rimuovere le particelle di terreno per preservare le strutture fragili e lavare delicatamente questi organi con acqua di rubinetto per sciacquare via le particelle di terreno rimanenti prima di fissare i campioni.
  4. Le piante MH associate alla lettiera di foglie richiedono un'attenzione particolare; Raccogliere con cura gli organi collegati al materiale in decomposizione attraverso le loro ife, evitare di estrarre questi organi dalle strutture collegate e raccoglierli con cura poiché queste parti sono molto delicate. Preservare le strutture con tali connessioni e raccogliere anche i rifiuti per l'analisi.
  5. Se si sceglie di analizzare materiale fresco utilizzando tecniche di imaging, mantenere i campioni in sacchetti di plastica chiusi con umidità adeguata, abbastanza acqua che evapora e idrata la pianta, evitando che l'acqua eccessiva venga a contatto con i campioni. Trasportarli immediatamente in laboratorio e analizzare i campioni lo stesso giorno in cui sono stati raccolti, prestando attenzione se i campioni sono ancora conservati durante l'analisi.
  6. Portare i fissativi al sito di raccolta in contenitori ben sigillati. Fissare rapidamente i campioni dopo la raccolta per microscopia ottica (LM) e microscopia elettronica a scansione (SEM) in uno dei seguenti fissativi: formalina tamponata neutra al 10% (NBF14, Tabella 1) o soluzione di Karnovsky (modificata15, Tabella 2). La soluzione di Karnovsky può essere preparata con tampone fosfato 0,2 M15, la cui ricetta è descritta nella Tabella 3.
  7. Per l'analisi mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM), sezionare i campioni con uno spessore di 4-3 mm all'interno di una goccia di tampone cacodilato glutaraldeide-sodico (modificato16, Tabella 4) in sezioni più piccole di 1-2 mm di spessore. Scartare i bordi tagliati all'esterno della goccia. Trasferire immediatamente le sezioni in una provetta di raccolta con un volume di fissativo più di 10 volte maggiore del volume dei campioni, in quanto è un fissativo additivo (cioè, le sue molecole vengono aggiunte chimicamente alle proteine fissate16).
    ATTENZIONE: I tre fissativi descritti sono altamente tossici. Evitare l'inalazione, soprattutto durante il loro uso sul campo. Preparare tutti i fissativi in una cappa aspirante usando i guanti. Non mescolare cacodilato e acidi, poiché si può formare gas arsenico16.
  8. Se i campioni fissi galleggiano nel fissativo, ciò indica la presenza di gas nei tessuti vegetali. L'aria e gli altri gas impediscono al fissativo di penetrare nell'intero campione2. Prelevare il gas dai tessuti ricampionandoli in parti più piccole e utilizzando una pompa per vuoto (pressione da -300 a -400 inHg) fino a quando tutti i campioni affondano sul fondo della soluzione17. Prestare attenzione poiché una pressione eccessiva esercitata dalla pompa può danneggiare i campioni.
  9. Dopo almeno 48 ore nella soluzione di Karnovsky o al 10% di NBF, lavare i campioni in 0,2 M PB (Tabella 3) e disidratarli con una serie di etanolo al 10%, 30%, 50% e infine 70%. Per campioni delicati, disidratare per 30 minuti in ogni concentrazione; Per campioni più grandi, disidratare per 1 ora o più.
    NOTA: Una soluzione di etanolo al 70% è il mezzo ideale per la conservazione dei campioni. I campioni in etanolo al 70% possono essere conservati a temperatura ambiente per anni. Non conservare materiale vegetale per lunghi periodi nei fissativi, poiché la rimozione degli agenti fissanti è un passaggio essenziale dopo la fissazione2.
  10. Conservare i campioni in glutaraldeide-cacodilato a 4 °C prima di procedere alla postfissazione (fase 9.1).
10% formalina tamponata neutra (NBF)14
Passo 1 aggiungere 10 ml di soluzione di formaldeide al 37-40% in 80 ml di acqua distillata
Passo 2 aggiungere 0,4 g di fosfato di sodio monobasico monoidrato (NaH2PO4· H2O) alla soluzione
Passo 3 aggiungere 0,65 g di sodio fosfato bibasico, anidro (Na2HPO4)
Passo 4 portare il volume a 100 mL

Tabella 1: Ricetta di formalina tamponata neutra al 10% 14.

Soluzione di Karnovsky (modificata15)
Passo 1 in 20 mL di acqua distillata a 60-70 °C
Passo 2 aggiungere 0,8 g di paraformaldeide (per ottenere il 4% p/v), mescolando
Passo 3 aggiungere 1-4 gocce di NaOH al 40% e mescolare fino a quando la soluzione diventa limpida
Passo 4 raffreddare e aggiungere 30 ml di tampone fosfato 0,2 M pH 7,2 (Tabella 3)
Passo 5 diluire il 25% di glutaraldeide in 0,1 M PB (pH 7,2) per ottenere l'1% di glutaraldeide (volume finale: ~60 ml)
Passo 6 aggiungere l'1% di glutaraldeide (fase 5) alla soluzione ottenuta al punto 4 fino a ottenere fino a 100 ml di fissativo

Tabella 2: Ricetta della soluzione di Karnovsky (modificata15).

Tampone fosfato 0,2 M (PB) pH 7,2
Passo 1 aggiungere 14,196 g di sodio fosfato bibasico, anidro (Na2HPO4) a 400 mL di acqua distillata
Passo 2 aggiungere 13,8 g di fosfato di sodio monobasico monoidrato (NaH2PO4· H2O)
Passo 3 Mescolare fino a quando la soluzione è limpida
Passo 4 regolare il volume finale a 500 ml con acqua distillata
Passo 5 regolare il pH a 7,2
Passo 6 per un PB da 0,1 M, diluire 1:1

Tabella 3: Ricetta tampone fosfato 0,2 M.

3% glutaraldeide 0,2 M tampone cacodilato di sodio (modificato16)
Passo 1 Tampone cacodilato 0,2 M: aggiungere 4,28 g di cacodilato di sodio triidrato in 100 ml di acqua distillata
Passo 2 regolare il pH a 7,2
Passo 3 aggiungere 12 mL di glutaraldeide al 25% in 25 mL della soluzione nella fase 2 (tampone cacodilato 0,2 M pH 7,2)
Passo 4 portare il volume a 100 ml con acqua distillata

Tabella 4: 3% glutaraldeide 0,2 M di tampone di cacodilato di sodio ricetta (modificata16).

2. Analisi superficiale di organi in materiale fisso e non fisso

  1. Per analizzare le ife superficiali negli organi, soprattutto quelli sotterranei, e quelli a contatto con la lettiera di foglie, osservare materiale fisso o fresco in un microscopio da dissezione (stereomicroscopio) ad un ingrandimento di 7,5x o superiore, a seconda dei campioni analizzati.
    1. Visualizza i campioni immersi nel fissativo, etanolo al 70% (se conservato in esso) o acqua di rubinetto nel caso di materiale fresco. Evitare la luce diretta dal microscopio da dissezione in quanto può asciugare e danneggiare i campioni.
    2. Ricerca delle aree di interesse nei campioni, guidata dalle ife superficiali e dai rizomorfi. Selezionare campioni che contengono aree con rizomorfi superficiali in quanto questi possono essere sezionati per visualizzare pelotoni e bobine ife all'interno delle cellule corticali nelle radici e negli steli.
    3. Dopo la selezione, seguire i passaggi 1.6 e 1.9 se i campioni non sono ancora stati corretti. Se lo si desidera, fotografare campioni freschi utilizzando un microscopio ottico senza fissarli, come descritto nella sezione 3.
    4. Utilizzare la fotocamera accoppiata allo stereomicroscopio per raccogliere immagini dalle superfici degli organi, dai rizomorfi e da altre strutture osservate. In questi casi, disporre un colore di sfondo adeguato per contrastare bene con il materiale e, se possibile, scegliere un materiale di sfondo con una superficie meno ruvida (ad esempio, carta).

3. Sezioni a mano libera di organi vegetali

NOTA: le sezioni a mano libera degli organi vegetali possono essere impegnative, specialmente per le strutture piccole e sottili. Tuttavia, queste sezioni di tessuti con endofiti fungini possono, in alcuni casi, mostrare meglio ife e altre caratteristiche rispetto alle sezioni sottili.

  1. Sezionare campioni freschi o fissi con una lama affilata, tagliandoli il più sottile possibile e ponendoli immediatamente in una piccola capsula di Petri con acqua (se fresca) o etanolo al 70% (se fissa). Utilizzare un piccolo pennello per manipolare le sezioni senza danneggiarle.
  2. Per facilitare il sezionamento di materiali più difficili (cioè organi piccoli, sottili e flessibili), circondare il campione in una struttura, ad esempio polistirene o cecropia picciolo. Intagliare il supporto per ospitare il campione e creare una sezione sottile del campione e del supporto del tutto.
  3. Colorare e montare i campioni come descritto nella sezione 6.

4. Incorporazione di campioni di piante in resina e sezionamento

  1. Disidratare ulteriormente i campioni conservati in etanolo al 70% in 80%, 96% e 2x in etanolo al 100%, per 30 minuti a 2 ore a seconda delle dimensioni e della composizione dei campioni.
  2. Utilizzare un kit di resina glicole metacrilato (GMA) secondo le istruzioni del produttore. Controllare Gerrits e Horobin (1996)18 per ulteriori considerazioni. Seguire di conseguenza i passaggi di infiltrazione e incorporamento.
    ATTENZIONE: La resina GMA è tossica, può causare reazioni allergiche e irritazione della pelle, degli occhi e delle mucose. Utilizzare i reagenti in una cappa aspirante e utilizzare i guanti.
  3. Utilizzare vassoi di stampaggio in polietilene per l'incorporamento, selezionati in base alle dimensioni dei campioni (ad esempio, 13 mm x 19 mm x 5 mm per campioni più grandi, 6 mm x 8 mm x 5 mm per quelli più piccoli). Prestare attenzione all'orientamento del campione desiderato all'interno dello stampo e utilizzare un ago per orientarsi.
  4. Lasciare per la polimerizzazione, preferibilmente a temperatura ambiente, fino a completa solidificazione. Il processo di indurimento richiede solitamente alcune ore, anche se si consiglia di sformare i blocchi il giorno seguente. Dopo la polimerizzazione, staccare con cura i blocchi di resina dagli stampi e procedere ad attaccare i blocchi il prima possibile per evitare la curvatura dei blocchi.
  5. Carteggiare la faccia del blocco di resina che verrà attaccato, creando una superficie piana. Incollare il blocco di resina su un cuboide di legno (consigliato 2 cm x 2 cm x 3 cm) con un adesivo cianoacrilato liquido di media viscosità (vedi Tabella dei materiali). Assicurarsi che la resina sia completamente attaccata per evitare di compromettere il sezionamento.
  6. Eseguire il sezionamento in un microtomo rotante come descritto di seguito.
    ATTENZIONE: Le lame dei coltelli microtomo sono molto affilate e possono causare incidenti. Assicurati di gestirli seguendo tutte le misure di sicurezza. Prima di avvicinarsi al coltello (ad esempio, per cambiare il blocco, per inumidire la resina), bloccare il volantino grossolano e posizionare il coperchio di sicurezza della lama. Conservare le lame monouso in casi appropriati. Prestare estrema attenzione quando si sostituiscono le lame.
    NOTA: Diversi tipi di coltelli (ad esempio, monouso o fissi; vetro o acciaio) possono essere utilizzati per la sezione della resina GMA18. La qualità delle sezioni dipende da quanto è affilato il coltello. Assicurati che il coltello sia ben attaccato e non possa muoversi. Potrebbe essere necessario cambiare regolarmente i coltelli usa e getta per ottenere un migliore sezionamento.
    1. Attaccare saldamente il cuboide di legno al supporto del blocco. Regolare l'orientamento del sezionamento utilizzando le viti di orientamento e garantire un angolo adeguato del coltello utilizzando l'inclinazione del coltello. Selezionare lo spessore delle sezioni; utilizzare un'impostazione più spessa per il taglio e un'impostazione più sottile per le sezioni selezionate, poiché le sezioni GMA aderiscono in modo più appropriato al vetrino quando sono più sottili; Lo spessore suggerito per i tessuti vegetali è 5-8 μm.
    2. Prima di iniziare, raffreddare la stanza, se necessario, poiché temperature più elevate peggiorano la qualità delle sezioni. Preparare quanto segue per il sezionamento: un becher con acqua distillata, una piastra calda, pennelli (almeno due), pinzette a punta fine, una pipetta Pasteur, vetrini, carta da filtro (o carta velina) e una matita (per identificare i campioni da sezionare).
    3. Regolare la piastra riscaldante a 50 °C e posizionare il becher su di essa. Prestare attenzione alle differenze di riscaldamento a seconda dell'area della piastra riscaldante (di solito, l'area centrale riscalda più dei bordi; riscaldare l'acqua nel mezzo, preferibilmente).
    4. Scegli un vetrino, identificalo con una matita e pipetta l'acqua distillata calda su tutta la superficie del vetrino. Se necessario, utilizzare una soluzione (ad esempio, detergente e acqua, o etanolo al 70%) per rompere la tensione tra l'acqua e il vetro, in modo che l'intero vetrino sia ugualmente coperto. Alcuni tipi di vetrini devono essere pre-puliti con etanolo al 70% per ottenere un'adeguata aderenza alla sezione.
    5. Inizia facendo avanzare gradualmente la faccia del blocco di resina verso la lama del coltello. Non provare a sezionare senza prima far avanzare il blocco, altrimenti l'attrezzatura e il blocco potrebbero essere danneggiati. Se necessario, tagliare il blocco utilizzando uno spessore maggiore (10 μm e oltre).
    6. Quando ci si avvicina a una sezione adatta, fare un movimento deciso a senso unico con il volantino, in modo che la sezione sia fatta contemporaneamente. Tenere sotto controllo l'umidità della resina. Durante il sezionamento, idratare regolarmente la faccia del blocco da tagliare usando un pennello immerso in acqua distillata se c'è un problema con le sezioni di arricciatura. Rimuovere l'acqua in eccesso con una carta velina.
    7. Con un paio di pinzette a punta fine, posizionare la sezione ottenuta nell'acqua sopra il vetrino. A contatto con l'acqua, la resina GMA si allunga. Se necessario, utilizzare un pennello per aprire delicatamente e allungare le sezioni. Utilizzare un altro pennello per mantenere costantemente la lama libera da detriti di resina. Non passare da un pennello all'altro per evitare di bagnare la lama.
    8. Dopo aver messo in coda tutte le sezioni desiderate nella diapositiva, asciugare la faccia inferiore della diapositiva e posizionarla sopra la piastra riscaldante. Rimuovere l'acqua in eccesso dalla parte superiore del vetrino tamponando delicatamente con una carta da filtro (opzionale). Le sezioni aderiranno quando l'acqua evapora dallo scivolo. Non lasciare le guide troppo a lungo per evitare che le sezioni vengano danneggiate dal calore eccessivo.
    9. Conservare i vetrini in una scatola di scorrimento, lontano dalla polvere e dal sole, e usarli per la colorazione e altre procedure. Le diapositive possono essere conservate per diversi anni.

5. Congelamento di campioni di piante e sezionamento con criostato

NOTA: La considerazione essenziale nella criosezione del tessuto biologico è quella di ridurre i danni dovuti alla formazione di cristalli di ghiaccio durante il congelamento dei campioni. La crioprotezione viene solitamente eseguita infondendo soluzioni chimicamente inerti come glicerolo o saccarosio 19,20.

  1. Un giorno prima del sezionamento del campione, attenersi alla seguente procedura.
    1. Diluire 100 mL di 0,2 M PB (Tabella 3) in 100 mL di acqua distillata per ottenere 200 mL di 0,1 M PB. Preparare soluzioni di saccarosio al 10%, 20% e 30% in 0,1 M PB (ad esempio, per una soluzione al 10%, aggiungere 2 g di saccarosio in 20 ml di tampone).
    2. Per i campioni freschi, lavarli in 0,1 M PB per 30 minuti. Per i campioni in un fissativo, lavarli nello stesso tampone utilizzato per preparare il fissativo per 30 minuti. Per i campioni in etanolo al 70%, idratarli in etanolo al 50% e al 30% e lavare in 0,1 M PB per 1 ora in ciascuna soluzione.
    3. Incubare i campioni per 2 ore in 10% di saccarosio, 2 ore in 20% di saccarosio e 2 ore in 30% di saccarosio, a temperatura ambiente. Successivamente, incubare per una notte in saccarosio al 30% a 4 °C (o almeno per 3 ore; il tempo massimo è di 48 ore).
  2. Il giorno del sezionamento, preparare il 40% e il 50% di saccarosio in 0,1 M PB; Non preparare soluzioni di saccarosio con più di 12 ore di anticipo. Incubare per 2 ore in ciascuna concentrazione di saccarosio, a 4 °C.
  3. Per l'incorporazione, in piccoli stampi, fare uno strato di composto OCT (mezzo di temperatura di taglio ottimale, utilizzato per l'incorporazione e il congelamento dei campioni) e mantenerlo a -20 °C per congelare. Gli stampi possono essere stampi istologici regolari, anche se per facilitare lo sformatura dei blocchi, quelli di carta o carta stagnola possono essere realizzati utilizzando un piccolo cuboide come cornice e nastro adesivo.
  4. Dopo che lo strato inferiore del composto OCT è congelato negli stampi, lavorare all'interno di una camera di criostato (ca. -27 °C). Posizionare i campioni incubati al 50% di saccarosio negli stampi, nell'orientamento in cui verranno sezionati. La faccia superiore di un blocco cuboide è di solito una faccia migliore del sezionamento. Segnare nello stampo dove sono posizionati i campioni, in modo che il blocco possa essere facilmente tagliato e mantenuto l'orientamento corretto.
  5. Circondare i campioni nel composto OCT e far scoppiare qualsiasi bolla d'aria che tocca i campioni. Congelarli a -20 °C. Con i blocchi completamente congelati, posizionarli all'interno della camera del criostato (ca. -27 °C). Sformare ciascuno solo prima dell'uso e prestare attenzione ai segni che indicano la posizione del campione all'interno del blocco.
  6. Poiché il composto OCT è facilmente tagliabile con una lama, tagliare opportunamente i blocchi prima di posizionarli sui mandrini. Inserire un composto OCT nel mandrino del criostato e posizionare il blocco in modo che la faccia superiore sia sezionata. Le facce con aree più piccole forniscono sezioni migliori. Attendere che il blocco sia ben attaccato al mandrino e testarlo prima di iniziare la sezione.
  7. Posizionare saldamente il mandrino nel supporto del mandrino. Regolate l'orientamento del sezionamento utilizzando le viti di orientamento. Regolare l'angolo del coltello usando l'inclinazione del coltello. Selezionate lo spessore delle sezioni. I campioni possono essere sezionati più spessi delle normali sezioni di resina. Le sezioni in un intervallo compreso tra 5-20 μm sono ottenute con successo, con sezioni più spesse più facili da realizzare (meno arricciature e meno danni alle strutture).
  8. Avanzare la faccia del blocco congelato verso la lama del coltello. Non provare a sezionare senza farlo, altrimenti il blocco può essere staccato dal mandrino e danneggiato. Se necessario, tagliare il blocco utilizzando uno spessore maggiore (10 μm e oltre).
  9. Quando ci si avvicina a una sezione adatta, posizionare la piastra antirollio (cioè una piastra trasparente che manterrà la sezione) sopra il coltello e fare un movimento deciso a senso unico con il volantino, in modo che la sezione sia fatta contemporaneamente. I problemi di arricciatura possono essere causati se la piastra antirollio deve essere regolata (di solito è regolabile in riferimento alla lama) o se ci sono detriti nella lama. Pulire costantemente la lama con un pennello per rimuovere i detriti.
  10. Utilizzare vetrini speciali in modo che le sezioni si attacchino facilmente, come vetrini silanizzati (commerciali o preparati con aminoalchilsilano al 2% in acetone 21), o vetrini preparati con 500 μg/ml di poli-L-lisina in acqua distillata 21 o gelatina allo 0,2% (vedi dettagli21). Mantenere i vetrini a temperatura ambiente.
  11. Per far aderire la sezione a una slitta, sollevare la piastra antirollio e far toccare rapidamente la sezione alla slitta. Poiché il vetrino è a temperatura ambiente, la sezione si scioglie immediatamente e aderisce al vetrino. Prestare attenzione a ruotare la faccia trattata della diapositiva verso la sezione, che potrebbe rimanere sopra il coltello o sulla faccia interna della piastra antirollio. Per evitare l'arricciamento delle sezioni, eseguire rapidamente questo passaggio non appena la piastra viene sollevata e fare attenzione a non contorcere la sezione.
  12. Lasciare il vetrino fuori dalla camera del criostato (a temperatura ambiente) se si devono aggiungere nuove sezioni. Dopo aver fatto aderire tutte le sezioni desiderate al vetrino, conservarlo all'interno della camera del criostato o nel congelatore (-20 °C o inferiore). Non esporre i vetrini all'umidità. Tienili in una casella di diapositive e ricorda di identificare le diapositive con una matita.
    NOTA: i vetrini e i blocchi di OCT possono essere conservati a -20 °C, anche se non troppo a lungo. Per ottenere risultati migliori, utilizzare le diapositive e i blocchi entro pochi giorni.

6. Colorazione di sezioni vegetali ed endofiti per microscopia ottica

NOTA: Molti tipi di macchie possono essere utilizzati per sezioni di piante. È difficile colorare in modo differenziale i funghi endofiti e i tessuti vegetali. Sebbene non sia una procedura di colorazione, un metodo per marcare le strutture dei funghi è presentato nella sezione 7 (fluorescenza con un coniugato di agglutinina del germe di grano). Le sezioni a mano libera (spiegate nella sezione 3), le sezioni di resina (sezione 4) e le criosezioni (sezione 5) possono essere colorate, sebbene le macchie a base di fenolo e alcol siano difficili per questi campioni poiché la resina GMA e l'OCT perdono aderenza al vetrino in questi casi.

  1. Utilizzare uno o combinare i seguenti metodi di colorazione usuali per i campioni di piante.
    1. Blu di toluidina O22,23, un metodo ampiamente applicato per la colorazione generale delle sezioni vegetali. Preparare una soluzione di blu di toluidina O allo 0,05% in fosfato 0,1 M (pH 6,8) o tampone citrato 0,09 M (pH 4,5-4,8), a seconda della specie e dei tipi di tessuto. Incubare le sezioni di resina GMA per 2-10 minuti utilizzando un barattolo colorante per vetrini o posizionando alcune gocce sopra le sezioni se pochi vetrini sono macchiati. Lavare accuratamente con acqua distillata o tampone dopo l'incubazione e montare i vetrini con acqua o asciugarli su una piastra riscaldante per produrre vetrini permanenti come descritto al punto 6.3.
    2. Il reagente Lugol2 indica la presenza di amido. Preparare una soluzione di iodio al 5% (I2) e ioduro di potassio (KI) al 10% in acqua distillata. Colorare le sezioni per 2 minuti, aggiungendo alcune gocce sopra il vetrino, quindi lavare con acqua distillata. Questo test istochimico viene solitamente applicato ai vetrini temporanei.
    3. Sudan III, IV e colorazione nera B24,25 per diversi lipidi. Preparare una soluzione di Sudan allo 0,3% (III, IV o B nero) in etanolo al 70%, riscaldarla fino all'ebollizione e lasciare raffreddare. Utilizzare il surnatante, filtrarlo e incubare le sezioni per 15-30 minuti in una capsula di Petri chiusa. Lavare accuratamente le sezioni con etanolo al 70% e acqua distillata. Montare i vetrini con acqua (di solito applicata solo alle diapositive temporanee).
      NOTA: Poiché il Sudan è un colorante a base alcolica, è più adatto per le sezioni a mano libera. Condurre accuratamente la colorazione della sezione resina GMA poiché di solito si staccano dal vetrino.
  2. Per le diapositive temporanee, montare le sezioni in acqua o glicerina e osservare successivamente. Sigillare la copertina con lo smalto per unghie per conservarle un po 'più a lungo.
  3. Per le guide permanenti, montare le sezioni con resine sintetiche (ad esempio, supporto di montaggio rapido, vedere Tabella dei materiali). Gocciolare alcune gocce del supporto di montaggio (può traboccare il coprivetrino), mettere il coprislip con attenzione per evitare bolle e utilizzare mollette per premere il vetrino contro il coprislip fino a completa asciugatura. Rimuovere l'eccesso di mezzo di montaggio asciutto con una lama di rasoio.

7. Applicazione di un fluorocromo coniugato all'agglutinina del germe di grano in fluorescenza e microscopia confocale

NOTA: Questo metodo può essere applicato a sezioni a mano libera (spiegate nella sezione 3), sezioni di resina (sezione 4) e criosezioni (sezione 5). Le criosezioni possono essere adeguate per scopi di microscopia confocale, poiché possono essere forniti campioni più spessi rispetto alle sezioni di resina, ma non così spessi come quelli a mano libera. Un fluorocromo coniugato all'agglutinina del germe di grano (WGA, vedi Tabella dei materiali) viene applicato all'imaging fungino nella microscopia a fluorescenza26. Un microscopio confocale non è essenziale, sebbene possa fornire chiare immagini tridimensionali delle strutture vegetali27.

  1. Preparare una soluzione di 0,2 mg/mL WGA-fluorocromo coniugato in 0,1 M PB28 (pH 7,2, controllare il punto 5.1.1 e la Tabella 3). Preparare una soluzione di Calcofluor White all'1% in 0,1 M PB (pH 7,2). Preparare piccole quantità di queste soluzioni, poiché le sezioni vengono direttamente incubate con esse.
  2. Incubare le sezioni nei vetrini per 30 minuti nella soluzione coniugata WGA-fluorocromo29, utilizzando un volume sufficiente a coprire le sezioni, quindi lavare in 0,1 M PB.
  3. Incubare le sezioni nella soluzione di calcofluor, utilizzando un volume sufficiente come mezzo di montaggio. La soluzione può essere mantenuta durante il periodo di osservazione.
  4. Mettere dei vetrini sui vetrini e osservare in un microscopio confocale o in un microscopio a luce a fluorescenza usando i seguenti filtri: TC / GFP (eccitazione: 470-440, emissione: 525-550, per WGA-fluorocromo nella tabella dei materiali - la parete cellulare fungina fluoresce verde sotto questo filtro29) e DAPI (eccitazione: 358, emissione: 463, per Calcofluor White) 30.
    NOTA: Le immagini tridimensionali possono essere ottenute utilizzando la funzione serie Z nel microscopio confocale27.

8. Microscopia elettronica a scansione di organi vegetali

  1. Dopo aver fissato i campioni, eseguito la disidratazione e conservato in etanolo al 70% (sezione 1), una possibilità è quella di tagliare i campioni per esporre qualsiasi superficie desiderata per l'analisi SEM, se necessario (ad esempio, tessuti interni, struttura ovarica). Utilizzare una lama di rasoio affilata e nuova ed effettuare tagli con un movimento unidirezionale, evitando un aspetto danneggiato di queste aree in SEM. Se necessario, utilizzare uno stereomicroscopio per selezionare i campioni e considerare l'area degli stub metallici per determinare le dimensioni del campione.
  2. Ulteriori campioni disidratati per SEM in una serie etanolica: 80%, 96% e 2 volte in alcool etilico assoluto (≥99,8%). Mantenere campioni piccoli e delicati per 30 minuti in ogni concentrazione e campioni più grandi e più densi per 1 ora.
  3. Piegare piccole buste usando carta velina per organizzare i campioni per i passaggi successivi, i campioni più grandi possono essere gestiti senza busta. Identifica le buste con una matita scrivendo una lettera o un numero e tieni un registro di tutti i campioni in ciascuna. Conservare i campioni in etanolo assoluto, anche se non a lungo, e procedere al passaggio 8.4 il prima possibile.
  4. Procedere per l'asciugatura del punto critico (CP). Utilizzare un essiccatore CP secondo le procedure operative standard. Posizionare i campioni in etanolo assoluto (fluido intermedio) in una camera a pressione. Nel punto critico di CO2 (31 °C, 7,3 x 106 Pa) il fluido intermedio si dissolve nel fluido di transizione (anidride carbonica liquida) e i campioni vengono essiccati31.
  5. Dopo l'essiccazione CP, conservare i campioni il prima possibile in un contenitore di essiccazione, ad esempio un pallone sigillato contenente gel di silice. L'umidità atmosferica può distruggere i campioni se riassorbita31.
  6. Utilizzare mozziconi metallici per montare i campioni. Prima di montare, indossare i guanti per manipolare i mozziconi, immergerli nell'acetone per 5 minuti per eliminare il grasso e lasciarli asciugare. Utilizzare un nastro biadesivo conduttivo in carbonio per fissare i campioni sul tronco e uno stereomicroscopio per aiutare a posizionare i campioni, tenendo presente che la vista dall'alto è l'unica prospettiva possibile nelle immagini SEM.
  7. Manipolare i campioni con pinzette a punta fine, facendo attenzione poiché la parte del campione toccata dalle pinzette è solitamente danneggiata, quindi prova a toccare le parti posizionate lontano dalle aree di interesse (ad esempio, le aree a contatto con il nastro). Mantenere i mozziconi con campioni in una capsula di Petri sigillata con gel di silice. Procedere al passaggio 8.8 il prima possibile.
  8. Utilizzare uno sputter coater per depositare uno strato di metallo, di solito oro o platino, sulla superficie dei campioni in un'atmosfera a bassa pressione di un gas inerte, spesso argon31. Seguire le procedure operative standard quando si utilizza un rivestimento sputter. Lo spessore del rivestimento dipende dalla topografia dei campioni, di solito tra 15-40 nm32.
  9. Mantenere i mozziconi rivestiti in una capsula di Petri sigillata con gel di silice e, a condizione che il gel di silice trattenga l'umidità, i campioni possono essere conservati in questo modo per settimane. Utilizzare un microscopio elettronico a scansione per analizzare i campioni. I campioni nel vuoto sono colpiti da un fascio di elettroni e l'emissione di segnali da tale interazione è interpretata come immagini31. Per i dettagli sul funzionamento di un microscopio elettronico a scansione, leggere Jeffree e Read (1991)31 e Bozzola e Russell (1999)32.
  10. Per riutilizzare i mozziconi, tirare il nastro adesivo e strofinarli con lana metallica. Lavare in acqua di rubinetto, immergerli in etanolo assoluto e asciugarli adeguatamente, evitando l'ossidazione del metallo costituente.

9. Microscopia elettronica a trasmissione

  1. Campioni di prefisso con tampone glutaraldeide-cacodilato come spiegato nei punti 1.7 e 1.10. Dopo 12-24 ore di prefissazione, lavare i campioni 3 volte in tampone cacodilato 0,2 M (pH 7,25) per 10 minuti. Eseguire la postfissazione con tetrossido di osmio all'1% (OsO4) in tampone cacodilato da 0,2 M, per 12 ore al buio, a temperatura ambiente. Lavare 3 volte con acqua distillata per 5 min.
    ATTENZIONE: Il cacodilato e il tetrossido di osmio sono altamente tossici e non devono essere inalati. Utilizzarli nelle cappe aspiranti, seguendo le rispettive schede di sicurezza.
  2. Disidratare i campioni con etanolo al 30%, 50%, 70% e 96%, 2x in ciascuna concentrazione, per 10 minuti. Quindi, disidratare 3 volte in alcool assoluto, per 15 minuti ogni volta.
  3. Infiltrare i campioni in resine acriliche idrofile (vedi Tabella dei materiali), una volta con resina 1:1 + etanolo assoluto e 3x con resina pura per 8-12 ore ciascuna. Condurre la polimerizzazione in capsule di gelatina a 60 °C fino a completa solidificazione (massimo 12 ore17).
  4. Valutare attentamente l'orientamento dei campioni all'interno del blocco di resina; Tagliare la parte superiore del blocco, con una lama di rasoio, creando una forma piramidale che concentra il campione nella zona di sezionamento. Ricavare sezioni semisottili (250-500 nm)33 in un ultramicrotomo con un coltello diamantato e disporre su vetrini in poche gocce d'acqua.
  5. Conservare i vetrini su una piastra riscaldante a 60 °C. Colorare le sezioni con toluidina blu O come al punto 6.1.1 e lasciare asciugare completamente la macchia. Lavare accuratamente con acqua di rubinetto. Valutare la sezione ottenuta disegnando quattro quadranti e selezionando il quadrante più adatto per l'analisi.
  6. Taglia il blocco in modo che la forma piramidale concentri il quadrante scelto sulla faccia superiore del blocco. Produrre sezioni ultrasottili (50-100 nm)33,34. Lo spessore viene valutato in base al colore di interferenza delle sezioni: le sezioni con circa 70 nm appaiono argento-oro, con circa 100 nm appaiono oro, e con circa 200 nm appaiono blu34.
  7. Raccogliere le sezioni ultrasottili dall'acqua utilizzando griglie di rame e procedere al metodo di colorazione a contrasto con acetato di uranile e citrato di piombo, come descritto di seguito.
    1. Preparare una soluzione di citrato di piombo (Tabella 5) e congelare la soluzione finale in provette da microcentrifuga con 1 mL di soluzione in ciascuna, scongelandola solo subito prima dell'uso.
    2. Preparare una soluzione di acetato di uranile: sciogliere 0,625 g di acetato di uranile [UO 2(CH3COO)2] in 25 ml di acqua distillata recentemente bollita e raffreddata. Conservare in un matraccio scuro nel congelatore.
      ATTENZIONE: Il nitrato di piombo è tossico se ingerito. 1 N NaOH è altamente corrosivo. L'acetato di uranile è radioattivo e tossico. Non deve essere ingerito, inalato o venire a contatto con la pelle.
    3. Durante la colorazione, mettere entrambi i reagenti preparati in siringhe separate da 3 ml con unità filtranti (poro 0,22 μm, vedere Tabella dei materiali). Preparare una capsula di Petri capovolta con una pellicola termoplastica sigillante sopra di essa (vedi Tabella dei materiali) e all'interno di una capsula più ampia, con pellet di NaOH sui bordi come trappola per CO 2 32 (vedi Figura 2).
    4. Scartare la prima goccia e sopra il film posizionare una goccia di acetato di uranile e tre gocce di acqua distillata per ogni griglia macchiata. Fai lo stesso con il citrato di piombo e aggiungi altre tre gocce di acqua distillata.
    5. Incubare la griglia (con il lato opaco verso il basso, dove si trovano le sezioni) in uranile per 30 minuti (tempo variabile). Lavare 3 volte nelle gocce d'acqua distillata, asciugando delicatamente la griglia ogni volta con carta da filtro sul lato brillante. Ripetere con la goccia di citrato di piombo (30 min) e lavare.
  8. Dopo almeno 4 ore, analizzare le griglie in un microscopio elettronico a trasmissione. In questo microscopio, un fascio di elettroni passa attraverso le sezioni nel vuoto e l'immagine viene proiettata su uno schermo fluorescente. Per i dettagli sul funzionamento di un microscopio elettronico a trasmissione, leggere Bozzola e Russell (1999)32.
soluzione di citrato di piombo (per colorazione con contrasto TEM)
Passo 1 Circondare un becher con carta stagnola
Passo 2 sciogliere 0,266 g di nitrato di piombo [Pb(NO3)2] in 6 mL di acqua distillata recentemente bollita e raffreddata
Passo 3 agitare per 2 min
Passo 4 aggiungere 0,352 g di citrato trisodico [Na3(C6H5O7).2H2O] (la soluzione deve assumere un aspetto lattiginoso)
Passo 5 agitare per 15 minuti, sigillare il becher con carta stagnola e trasferire la soluzione in un becher da 10 mL
Passo 6 aggiungere 1,6 mL di 1N NaOH e 2,4 mL di acqua distillata (la soluzione deve essere traslucida)
Passo 7 se necessario, regolare il pH vicino a 12

Tabella 5: Ricetta della soluzione di citrato di piombo.

Figure 2
Figura 2: Schema di colorazione a contrasto con soluzioni di citrato di piombo e acetato di uranile . (A) Preparare le piastre di Petri, una capovolta (al centro) con pellicola termoplastica in modo che le gocce possano essere posizionate sopra di esso, all'interno di una più ampia. I pellet NaOH sono posti intorno al piatto centrale. (B) Le gocce di acetato di uranile sono poste nei cerchi con la lettera U, e le gocce di citrato di piombo nei cerchi contrassegnati con L. DW indicano gocce di acqua distillata. Le griglie sono colorate in sequenza nella colonna, quindi cinque griglie possono essere colorate contemporaneamente come rappresentate. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

10. Germinazione simbiotica dei semi di orchidea

  1. Assicurarsi che le soluzioni e tutti i materiali utilizzati nella germinazione simbiotica dei semi siano sterili per evitare la contaminazione. Iniziare con l'autoclave per 20 minuti a 121 °C. Le fasi di germinazione simbiotica sono riassunte nella Figura 3.
  2. Disinfettare superficialmente frutti e semi immergendoli in una soluzione di ipoclorito di sodio contenente il 2% di cloro attivo per 10-15 minuti per i frutti e 7-10 minuti per i semi, considerando la rigidità e lo spessore del rivestimento del seme9. I semi sottili e fragili possono essere immersi in una soluzione di ipoclorito di sodio diluito 1: 1. Successivamente, lavare 3 volte in acqua distillata autoclavata per rimuovere la soluzione di ipoclorito.
  3. Recuperare i semi filtrando in tessuto serigrafico e utilizzare i semi per procedere con i test di germinazione (preferibilmente). Se necessario, conservarli in buste di carta da filtro all'interno di palloni di vetro con gel di silice, a 4 °C, chiudere ermeticamente i palloni e sigillarli con pellicola trasparente. Trasferire alcune gocce d'acqua dall'ultimo lavaggio all'agar destrosio di patate (PDA, 39 g/L), per valutare l'efficacia del processo di lavaggio.
  4. Prima di seminare i semi nel terreno di coltura, valutarne la vitalità attraverso il test del tetrazolio (facoltativo) come descritto di seguito35.
    1. Incubare circa 10 mg di semi in una provetta da microcentrifuga con 1 mL di saccarosio al 10% in acqua distillata, per 24 ore a temperatura ambiente (ca. 25 °C), in luce.
    2. Rimuovere la soluzione di saccarosio con una micropipetta e aggiungere 1 mL di soluzione di tetrazolio all'1% (trifeniltetrazolio cloruro) in acqua distillata. Incubare a 40 °C in un blocco termico per 24 ore al buio.
    3. Rimuovere la soluzione di tetrazolio con una micropipetta e lavare i semi con acqua distillata 2x o fino a quando la soluzione non viene rimossa. Rimuovere tutti i liquidi. Se necessario, i semi possono essere conservati nel congelatore per un massimo di una settimana (come nel passaggio 10.3) prima di essere analizzati.
    4. Risospendere i semi in acqua distillata e analizzarli al microscopio ottico. I semi vitali acquisiscono un colore da rosso chiaro a rosso scuro, mentre i semi non vitali mantengono il loro colore naturale.
  5. Eseguire il seguente protocollo adattato9 per la germinazione simbiotica dei semi di orchidea.
    1. Incubare i semi su dischi di carta da filtro autoclavati (1-2 cm di diametro) posti in piastre di Petri con terreno di coltura di farina d'avena agar (OMA) (2,5 g / L di fiocchi d'avena e 7 g / L di agar, pH 6).
    2. Al centro della capsula di Petri, inoculare un frammento di terreno di coltura (ca. 1 cm2) contenente micelio dal fungo isolato scelto per la procedura di germinazione. Sigillare le piastre di Petri con pellicola trasparente e incubarle al buio a circa 25 °C o a temperatura ambiente, poiché è più adatto alla crescita fungina.
    3. Preparare alcuni piatti con semi e senza inoculazione fungina, come controllo negativo per il test di germinazione.
  6. Analizzare settimanalmente i risultati della germinazione, raccogliendo dati quantitativi e qualitativi e fotografando protocormi e piantine. L'osservazione di semi e protocormi dovrebbe essere eseguita utilizzando uno stereomicroscopio per una valutazione più accurata della germinazione. Utilizzare una fonte di luce proveniente dal basso, in quanto consente un maggiore contrasto, rendendo possibile discriminare più facilmente il micelio fungino dai protocormi.
    1. Raccogliere campioni in diversi stadi di sviluppo e fissare per analisi anatomiche (sezione 1). Applicare tutte le analisi delle immagini precedentemente descritte per studiare gli endofiti fungini in semi, protocormi e piantine durante la germinazione (microscopia ottica - sezioni 4, 5 e 6; confocale e fluorescenza - sezione 7; SEM e TEM - sezioni 8 e 9).
    2. Generare risultati quantitativi seguendo la classificazione delle fasi secondo la tabella 6. Le fasi descrivono il solito sviluppo dei semi delle orchidee micoeterotrofiche. Raccogli dati settimanalmente e tabella con le date iniziali di ogni fase osservata.
    3. Inoltre, raccogliere dati quantitativi stimando la percentuale e il tasso di germinazione. Conta almeno 100 semi o definisci i campi di conteggio35. Delimitare tre o più campi di conteggio per capsula di Petri, costituiti da regioni fisse con un'area standardizzata, e valutare settimanalmente. Calcola i dati raccolti in base all'equazione dell'indice di crescita (IG):
      Equation 1
      dove N 0 è il numero di semi contati nella fase0 , N 1 si riferisce alla fase1 e segue fino alla fase 6 (registrata come N6)36.

Figure 3
Figura 3: Riassunto schematico della metodologia della germinazione simbiotica dei semi. Gli schemi forniscono indicazioni sui passaggi dettagliati del protocollo. Abbreviazioni: OMA = agar farina d'avena, PDA = agar destrosio di patate. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Fase di germinazione Descrizione
0 Nessuna germinazione
1 Gonfiore dell'embrione
2 Rottura della testa
3 I peli assorbenti si sviluppano
4 Si sviluppa la proiezione dello stelo
5 Sviluppo di scaglie protettive (brattee)
6 Le prime radici si sviluppano

Tabella 6: Descrizione degli stadi di sviluppo del protocormo applicati alle analisi periodiche dei test di germinazione. Modificato dagli stadi descritti in Otero et al.36.

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Representative Results

Seguendo le fasi essenziali di fissaggio del tessuto vegetale si ottengono strutture cellulari il più possibile simili allo stato vivente, considerando la morfologia, il volume e l'organizzazione spaziale dei componenti cellulari e dei tessuti16. Osservare tali tratti nei campioni dopo la fissazione chimica (Figura 4). La figura 4C-F rappresenta campioni adeguatamente fissati al microscopio ottico. Seguire le procedure di fissazione descritte e acquisire familiarità con la struttura dei campioni aiuta ad analizzare il successo della fissazione.

Figure 4
Figura 4: Analisi superficiale e sezioni da radici filiformi dell'orchidea MH Wullschlaegelia aphylla (Sw.) Rchb.f. (A e B) Rizomorfi nella superficie delle radici filiformi. (C e D) Sezioni a mano libera non macchiate, evincing pelotons in celle corticali. (E e F) Sezioni sottili colorate con blu toluidina O. Abbreviazioni: en = endoderma, ep = epidermide, ct = corteccia, hy = ifa, pc = cellula parenchimatosa, pe = elementi floematici, pl = peloton, rfl = radice (filiforme), rm = rizomorfo, vc = cilindro vascolare, xe = elemento xilematico. Barre della scala: A = 2 mm; B = 500 μm; C ed E = 200 μm; D = 100 μm; F = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Si noti nella figura 4C,D la regolarità delle strutture e l'assenza di aree danneggiate in una sezione a mano libera di un campione fissato dal 10% di NBF. Il volume cellulare è conservato, simile ai tessuti viventi. Il confronto con un organo fresco sezionato a mano libera è anche importante per riconoscere campioni ben fissati. Nella Figura 4E,F, sezioni di campioni incorporati in resina GMA e fissati al 10% di NBF sono state colorate con blu di toluidina O. Si notino le strutture ben conservate delle pareti cellulari, senza distorsioni o aree danneggiate, che mostrano tratti molto simili a quelli di un campione sezionato a mano libera (Figura 4C,D).

Quando si analizza la superficie degli organi sotterranei, la presenza di rizomorfi indica ife che colonizzano i tessuti interni. I rizomorfi sono strutture vegetative composte da un aggregato di ife altamente differenziate e formate da poche specie di funghi, prevalentemente saprotrofi che decompongono il legno37,38. I rizomorfi possono essere facilmente riconosciuti, di solito come strutture scure simili a stringhedi scarpe 37, viste in Figura 4A, B e Figura 7D. La ricerca di queste strutture fungine facilita la selezione del campione per osservare il modello di colonizzazione fungina negli organi vegetali. Nella Figura 4C,D, le sezioni sono state ottenute in aree con rizomorfi superficiali, mentre nella Figura 4E, è mostrata una sezione dello stesso organo senza selezione di tale criterio. Le ife individualizzate possono anche essere identificate al microscopio da dissezione con un'osservazione percettiva.

Figure 5
Figura 5: Sezioni a mano libera della struttura di stoccaggio di Uleiorchis sp. (A) Sezione al microscopio da dissezione. (B) Pelotons al microscopio ottico, concentrati in una regione della corteccia dell'organo. (C e D) Dettagli delle ife dei gruppi analizzati. Abbreviazioni: hy = hype, pc = cellula parenchimatosa, pl = peloton, s = setti. Barre della scala: A = 2 mm; B = 500 μm; C e D = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Come spiegato in precedenza, il sezionamento a mano libera può essere preferito rispetto al sezionamento sottile a seconda dello scopo. A mano libera o altri metodi per ottenere sezioni più spesse (più di 10 μm di spessore) possono mostrare meglio i pelotoni e fornire immagini più rappresentative dei modelli fungini di colonizzazione (ad esempio, Figura 4C, D e Figura 5A, B). Le sezioni a mano libera possono anche essere adatte per l'analisi delle ife in amplificazione più elevata, come dimostrato nella Figura 5C,D, sebbene i dettagli siano meglio raggiunti in sezioni più sottili, come nella Figura 7A, da un campione incorporato nella resina GMA. Alcuni dettagli delle strutture cellulari vegetali sono adeguatamente osservati in sezioni sottili, ad esempio la Figura 4F. Anche il montaggio è un passo importante, poiché immagini di qualità migliore possono dipendere dal supporto di montaggio. Le guide in resina GMA possono essere montate in acqua o glicerina, anche se un mezzo di montaggio commerciale (vedi Tabella dei materiali) migliorerà l'immagine finale in quanto riempie le imperfezioni del processo di sezionamento. Nella Figura 6C, le imperfezioni possono essere viste (punte di freccia) in una sezione di resina GMA, poiché la slitta è stata montata con acqua.

Figure 6
Figura 6: Sezioni di radici fusiformi di W. aphylla colorate con soluzione di Lugol. (A) Sezione a mano libera colorata con blu toluidina O e Lugol. (B) Colorato unicamente con blu toluidina O. (C) Sezione sottile in resina GMA tinta con blu di cotone lattofenolo e Lugol, punte di freccia: imperfezioni dovute a irregolarità della lama. (D) Sezione a mano libera macchiata solo con Lugol. Abbreviazioni: cw = parete cellulare, pc = cellula parenchimatosa, sg = grani di amido, vc = cilindro vascolare. Barre della scala: A = 200 μm; B e C = 100 μm; D = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Il principale vantaggio nell'utilizzo del blu di toluidina O (risultati più adeguati in sezioni sottili) sono le importanti proprietà metacromatiche di questa colorazione, il che significa che acquisisce colori diversi a seconda della componente cellulare a cui si lega e funziona come una colorazione policromatica adatta a differenziare diverse composizioni di pareti cellulari23. Nella Figura 4F, le pareti cellulari secondarie negli elementi xilematici possono essere facilmente identificate dal colore chiaro acquisito dalla toluidina. Nel frattempo gli elementi floematici, composti solo da pareti cellulari primarie, sono identificati dalle loro pareti cellulari più sottili e più scure. Un'altra macchia importante, considerando principalmente le piante MH, è la soluzione di Lugol, poiché i grani di amido sono facilmente identificabili quando vengono colorati da esso. Le sezioni sono rappresentate nella figura 6A-D: sezione a mano libera colorata con blu toluidina O e Lugol nella figura 6A e solo blu toluidina O nella figura 6B; sezione sottile in resina GMA tinta con lattofenolo cotone blu e Lugol in Figura 6C; sezione a mano libera colorata solo con Lugol nella Figura 6D.

L'incubazione di sezioni a mano libera (Figura 7C), resina GMA (Figura 7B) o OCT con coniugato WGA-fluorocromo e Calcofluor White può migliorare rispettivamente le strutture della parete cellulare fungina e della parete cellulare vegetale. È un metodo importante per confermare le ife, poiché il coniugato WGA ha specificità per i residui di N-acetilglucosaminil, presenti nella parete cellulare dei funghi. La Figura 7A mostra una sezione di stelo floreale colorata con blu di toluidina O, mentre la Figura 7B proviene dallo stesso organo e conferma che le strutture viste nella Figura 7A sono ife. Gli artefatti per autofluorescenza possono essere visti nelle sezioni di resina GMA (punte di freccia, Figura 7B). Questi artefatti sono solitamente correlati alla concentrazione di fluorocromo e possono essere evitati lavando i campioni più volte con il tampone. Nella Figura 7C, viene mostrata una sezione a mano libera della radice, con ife interne ed esterne. Lo stesso organo può essere visto da SEM nella Figura 7D, con un'abbondanza di rizomorfi e singole ife sulla sua superficie. Micrografie SEM adeguate hanno un buon contrasto tra le sfumature di grigio, quindi la tridimensionalità può essere vista e ben interpretata. Scegli immagini rappresentative ed evita quelle fuorvianti (ulteriori letture: suggerimenti per la scelta delle micrografie elettroniche32).

Figure 7
Figura 7: Sezioni del fusto floreale e delle radici filiformi di W. aphylla e analisi superficiale della radice filiforme mediante SEM. (A) Sezione sottile di stelo floreale in resina GMA, colorata con blu toluidina O. (B) Sezione sottile di stelo floreale in resina GMA incubata con coniugato WGA-fluorocromo + Calcofluor White, punte di freccia: artefatti per autofluorescenza. (C) Sezione a mano libera di radice filiforme incubata con WGA-fluorocromo coniugato + Calcofluor White. (D) Micrografia elettronica a scansione della superficie della radice filiforme. Abbreviazioni: cw = parete cellulare, hy = ife, pc = cellula parenchimatosa, pl = peloton, rfl = radice (filiforme), rm = rizomorfo. Barre della scala: A, C e D = 100 μm; B = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

I frutti di diverse specie di orchidee sono stati immersi in ipoclorito di sodio con il 2% di cloro attivo per 15 minuti, per garantire la completa disinfezione superficiale degli organi (Figura 8A). I semi con strati di semi più rigidi come quelli di Vanilla sp. (Figura 8A) e Pogoniopsis schenckii (Figura 9B-D) sono stati immersi nella stessa soluzione per 10 minuti (Figura 8C), mentre quelli più sottili, come da Laelia sp. e Cattleya sp., sono stati mantenuti per 7 minuti (Figura 9A). Il trasferimento di un'aliquota di acqua dall'ultimo lavaggio ha confermato l'efficacia del processo di disinfezione prima di procedere ai test di germinazione, considerando entrambe le durate di immersione descritte.

Figure 8
Figura 8: Disinfezione superficiale di frutti e semi di Vanilla panifolia, una specie di orchidea fotosintetica . (A) Immersione della frutta in ipoclorito di sodio con cloro attivo. (B) Frutta sezionata longitudinalmente. (C) Semi filtrati con tessuto serigrafico dopo immersione in ipoclorito di sodio, pronti per essere seminati o conservati in gel di silice. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

La semina dei semi su dischi di carta da filtro assicura che ci sia abbastanza umidità e ossigeno per la germinazione e lo sviluppo dell'embrione (Figura 9A-D) senza essere completamente immersi sotto lo strato superficiale di acqua dal terreno di coltura. Alcuni isolati fungini possono crescere vigorosamente sopra i semi. Il terreno contenente 2 g/L di fiocchi d'avena tritati fornisce un migliore controllo della crescita fungina, migliorando la visualizzazione e l'analisi dei semi (Figura 9B). Dopo circa 50-60 giorni di inoculazione isolata, il terreno deve essere rinnovato, in modo che il fungo rimanga attivo. Questo può essere fatto trasferendo i semi su un nuovo mezzo OMA della stessa formulazione. I semi possono essere trasferiti con la carta da filtro, facilitandone il trasferimento senza danneggiare le delicate strutture dei protocormi, oltre a mantenerli nella posizione originale senza compromettere i campi di conteggio precedentemente stabiliti.

Figure 9
Figura 9: Protocollo di germinazione simbiotica . (A) Semi disposti su carta da filtro in mezzo OMA. (B) Piastre di Petri con semi e un fungo inoculato (potenzialmente micorrizico), incubate per circa 21 giorni. (C e D) Piatti di germinazione simbiotica con diversi isolati fungini. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

La maggior parte delle specie di orchidee germina entro alcune settimane dopo essere stata infettata dal fungo inoculato o fino a quasi più di un mese (Figura 10). I semi che non germinano entro 3 mesi probabilmente non germoglieranno a meno che non modifichino la metodologia. In questi casi, considerare possibilità come la dormienza dei semi o l'isolato fungino che non è micorrizico. Alcune specie hanno bisogno di protocolli specifici per rompere la dormienza, altre presentano semplicemente un'elevata specificità a determinati partner micorrizici, diversi da quelli scelti per il test di germinazione simbiotica (dati non pubblicati).

Figure 10
Figura 10: Semi di Pogoniopsis schenckii, un'orchidea aclorofilliana e MH, in mezzo OMA con inoculato fungino39 in grado di stimolare la germinazione. (A-D) Semi e protocormi non germinati in diversi stadi di sviluppo. Abbreviazioni: ng = nessuna germinazione, pt = protocormo, ri = tegumento rotto, ts = seme turgido. Barre di scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Nelle prime settimane dopo l'inoculazione dell'isolato, i piatti vengono valutati, poiché di solito ci vogliono 7-14 giorni prima che le ife raggiungano i semi. Considera questo periodo, poiché è preponderante iniziare a registrare lo sviluppo degli embrioni. I sottili cambiamenti durante le fasi di germinazione possono essere rilevati solo al microscopio da dissezione, considerando che le strutture sono così piccole. Alcuni protocormi di specie devono essere analizzati al microscopio ottico per identificare i peli assorbenti e distinguerli dalle ife. L'analisi GI può fornire risultati più plausibilmente comparabili, generando una rappresentazione dei dati raccolti e conferendo più peso ai valori corrispondenti a fasi di germinazione più avanzate. I valori finali possono variare tra zero e sei (o in base all'ultimo stadio definito). Diversi test statistici possono essere applicati alle analisi GI (ad esempio, ANOVA, livello di significatività), a seconda delle domande e delle richieste del ricercatore durante l'esecuzione di test di germinazione simbiotica.

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Discussion

Le analisi delle immagini nell'anatomia e morfologia delle piante hanno un importante potenziale per raggiungere gli obiettivi e aiutare a comprendere le relazioni tra le piante micoeterotrofe e i loro indispensabili endofiti fungini, come dimostrato dagli studi sugli organi sotterranei6,40, dalle analisi strutturali della germinazione simbiotica dei semi39 e dalle strutture aeree e riproduttive 41 . La botanica strutturale, nonostante abbia perso il suo prestigio e spazio in altre aree delle scienze vegetali nell'ultimo decennio1, è ancora prominente nel rispondere alle domande e aiutare a svelare novità e tratti essenziali delle piante legati allo sviluppo, all'ecologia, alla fisiologia e all'evoluzione. Questi metodi sono collettivamente una base per studi strutturali delle piante, considerando aspetti importanti dell'analisi delle piante MH.

Vengono fornite informazioni essenziali per raccogliere con cura le piante MH, altrimenti gli organi sotterranei ben sviluppati possono essere danneggiati e non completamente raccolti. Notevoli adattamenti di queste strutture6 e l'intimo contatto con funghi del suolo, collegati a piante autotrofe42 o lettiera fogliare in decomposizione40 sono da considerare quando si raccolgono e si conservano le strutture sotterranee. Le fasi essenziali della fissazione del campione devono essere adeguatamente seguite, per quanto riguarda la corretta preparazione dei fissativi e le questioni temporali, il tempo minimo richiesto tra la raccolta e il fissaggio e il tempo minimo richiesto nel fissativo prima di procedere allo stoccaggio. L'analisi strutturale di campioni ben conservati dipende dal processo di fissazione e i fissativi più comuni e meglio conservati applicati per studiare l'anatomia vegetale e la microscopia elettronica sono descritti nella sezione protocolli. Possono essere applicati anche altri fissativi14,16,25.

Come affermato in precedenza, il processo di utilizzo dei fissativi chimici è decisivo e può essere valutato quando si ottengono immagini campione. In LM, le strutture cellulari dovrebbero essere il più simili possibile rispetto ai tessuti viventi16. Il volume, la morfologia e la disposizione spaziale dei componenti cellulari identificabili dovrebbero assomigliare il più possibile ai tessuti freschi (non fissi). Nella TEM, i tessuti ben conservati possono essere evidenziati quando il tonoplasto è visibile, con contorni lisci e non allontanati dal citoplasma16. La membrana plasmatica non può essere staccata e ridotta dalla parete cellulare. I campioni per TEM devono essere raccolti il più sottile possibile e all'interno di una goccia di fissativo, come spiegato nella sezione protocollo. L'uso di tamponi associati ad agenti fissanti fornisce importanti condizioni di osmolarità e composizione ionica ai campioni da fissare, evitando il maggior numero possibile di cambiamenti nella struttura cellulare e nell'ultrastruttura16. Nella SEM, una delle principali preoccupazioni riguarda i fissativi isotonici e la loro preparazione con tamponi, quindi non ci sono cambiamenti considerevoli nel volume del campione (gonfiore o restringimento)16.

Sono disponibili molti metodi di incorporamento diversi per LM per ottenere sezioni per vari scopi. Considerando la colorazione e l'incubazione di coloranti fluorescenti, vengono presentate due importanti metodologie per analizzare gli organi delle piante MH. Quelli sopra descritti (sezioni a mano libera, resina GMA e incorporazione OCT) sono tra i più comuni e semplici, fornendo libertà metodologica e idoneità a molti tipi di analisi. Il coniugato WGA-fluorocromo ha un notevole potenziale negli studi sulle piante MH, in quanto è attualmente più applicato ai patogeni fungini28,29,30 e scarsamente utilizzato con le piante MH endofite fungine. I passaggi fondamentali ed essenziali per la microscopia elettronica a scansione e trasmissione sono dettagliati, in quanto queste tecniche possono contribuire notevolmente all'analisi strutturale delle piante. La letteratura SEM e TEM è ricca e ulteriori letture32,33,34,43 sono raccomandate se devono essere testati altri tipi di analisi al microscopio elettronico.

Per quanto riguarda le procedure di germinazione simbiotica, è possibile condurre l'asepsi della frutta prima della deiscenza, senza la necessità di disinfettare direttamente i semi. Tuttavia, i semi di frutti già aperti o colonizzati da endofiti (già descritti per le specie MH39,41) devono essere direttamente disinfettati. Un'osservazione importante: il tempo e le condizioni dei processi di conservazione e asepsi possono ridurre la vitalità dei semi di alcune specie, come osservato durante l'esecuzione di questi esperimenti. Il reagente Tetrazolium conferisce un colore che va dal rosso chiaro al rosso scuro agli embrioni da semi vitali. Gli embrioni di semi non vitali rimangono con il loro colore naturale. I semi con tegumenti fortemente pigmentati o strati rigidi possono aver bisogno di un pre-trattamento prima del test di germinazione. Si raccomanda di eseguire la scarificazione del loro tegumento, consentendo la visualizzazione dell'embrione35.

Alcuni potenziali isolati fungini micorrizici di orchidee tropicali, ad esempio le specie Ceratobasidium , hanno una crescita vigorosa e accelerata in un terreno di coltura ricco di sostanze nutritive. Durante il trattamento, è possibile che gli isolati coprano completamente i semi quando crescono, rendendo difficile o addirittura impossibile la raccolta dei dati. Il protocollo comunemente usato contenente 4 g/L di fiocchi d'avena tritati9 ha impedito la raccolta di dati nella germinazione simbiotica di P. schenckii, richiedendo un'equazione a 2 g/L di fiocchi d'avena tritati39. L'utilizzo di circa 2,5 g/L di fiocchi d'avena per comporre il mezzo OMA nella germinazione simbiotica sembra essere soddisfacente nel limitare la crescita di isolati fungini più vigorosi (dati non pubblicati).

I metodi descritti possono comportare dei limiti, alcuni dei quali possono essere efficacemente superati adattando le procedure o applicando altri metodi. Come discusso in precedenza, l'incorporamento GMA è efficace solo per sezionare fino a 8 μm di spessore. Tuttavia, l'incorporamento OCT fornisce sezioni di spessore diverso, comprese quelle più spesse (ad esempio, 10-20 μm). La colorazione delle sole strutture fungine nei tessuti vegetali non è facilmente condotta, sebbene il fluorocromo WGA sia un fluorocromo coniugato importante ed efficace che segna le pareti cellulari fungine, sebbene sia costoso. Altre limitazioni di costo possono sorgere nei metodi SEM e TEM, poiché i costi elevati e l'essenzialità delle apparecchiature rendono tali analisi non banali e usuali per ogni gruppo di ricerca. I test di germinazione simbiotica dei semi, sebbene semplici e meno costosi, richiedono funghi micorrizici per inoculare i semi e procedure attente evitando contaminazioni.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano i finanziamenti di FAEPEX e FAPESP (2015/26479-6). MPP ringrazia Capes per la sua borsa di studio di master (processo 88887.600591/2021-00) e CNPq. JLSM ringrazia CNPq per le sovvenzioni di produttività (303664/2020-7). Gli autori ringraziano anche l'accesso alle attrezzature e all'assistenza fornita da LME (Laboratorio di Microscopia Elettronica - IB/Unicamp), INFABiC (Istituto Nazionale di Scienza e Tecnologia sulla Fotonica Applicata alla Biologia Cellulare - Unicamp), e LaBiVasc (Laboratorio di Biologia Vascolare - DBEF/IB/Unicamp); LAMEB (UFSC) e Eliana de Medeiros Oliveira (UFSC) per i contributi al protocollo di crioprotezione; LME per contributi al protocollo TEM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma-Aldrich 179124 (for SEM stubs mounting)
Agar-agar (AA) Sigma-Aldrich A1296 (for seeds germination tests)
Calcofluor White Stain Sigma-Aldrich 18909 fluorescent dye (detects cellulose)
Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8 Sigma-Aldrich C2488 (for toluidine blue O staining)
Conductive Double-Sided Carbon Tape Fisher Scientific 50-285-81 (for SEM)
Confocal Microscope Zeiss (any model)
Copper Grids Sigma-Aldrich G4776 (for TEM)
Critical-point dryer Balzers (any model)
Cryostat Leica Biosystems (any model)
Dissecting microscope Leica Biosystems (= stereomicroscope, any model)
Entellan Sigma-Aldrich 107960 rapid mounting medium for microscopy
Ethyl alcohol, pure (≥99.5%) Sigma-Aldrich 459836 (= ethanol, for dehydration processes)
Formaldehyde solution, 37% Sigma-Aldrich 252549 (for NBF solution preparation)
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128 histological tissue fixative
Gelatin capsules for TEM Fisher Scientific 50-248-71 (for resin polymerisation in TEM)
Gelatin solution, 2% in H2O Sigma-Aldrich G1393 (dilute for slides preparation - OCT adherence)
Glutaraldehyde solution, 25% Sigma-Aldrich G6257 (for Karnovsky’s solution preparation)
HistoResin Leica Biosystems 14702231731 glycol methacrylate (GMA) embedding kit
Iodine Sigma-Aldrich 207772 (for Lugol solution preparation)
Lead(II) nitrate Sigma-Aldrich 228621 Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)
Light Microscope Olympus (any model)
LR White acrylic resin Sigma-Aldrich L9774 hydrophilic acrylic resin for TEM
Lugol solution Sigma-Aldrich 62650 (for staining)
Metal stubs for specimen mounts Rave Scientific (for SEM, different models)
Microtome Leica Biosystems manual rotary microtome or other model
Oatmeal agar (OMA) Millipore O3506 (for seeds germination tests)
OCT Compound, Tissue-Tek Sakura Finetek USA 4583 embedding medium for frozen tissues
Osmium tetroxide Sigma-Aldrich 201030 OsO4 (for TEM postfixation)
Parafilm M Sigma-Aldrich P7793 sealing thermoplastic film
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 (for Karnovsky’s solution preparation)
Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O Sigma-Aldrich P8920 (for slides preparation - OCT adherence)
Poly-Prep Slides Sigma-Aldrich P0425 poly-L-lysine coated glass slides
Polyethylene Molding Cup Trays Polysciences 17177A-3 (6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Polyethylene Molding Cup Trays Polysciences 17177C-3 (13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Potassium iodide Sigma-Aldrich 221945 (for Lugol solution preparation)
Potato Dextrose Agar (PDA) Millipore 70139 (for seeds germination tests)
Scanning Electron Microscope Jeol (any model)
Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane] Sigma-Aldrich A3648 (for slides preparation - OCT adherence)
Silane-Prep Slides Sigma-Aldrich S4651 glass slides coated with silane
Silica gel orange, granular Supelco 10087 (for dessicating processes)
Sodium cacodylate trihydrate Sigma-Aldrich C0250 (for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881 NaOH (for Karnovsky’s solution preparation and TEM contrast staining)
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 425044 NaClO (for seeds surface disinfection)
Sodium phosphate dibasic, anhydrous Sigma-Aldrich 71640 Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich S9638 NaH2PO4·H2O (for NBF and PB)
Sputter coater Balzers (any model)
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)
Sudan III Sigma-Aldrich S4131 (for staining)
Sudan IV Sigma-Aldrich 198102 (for staining)
Sudan Black B Sigma-Aldrich 199664 (for staining)
Syringe (3 mL, any brand, for TEM contrast staining)
Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 µm Millipore SLGV033R PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)
Tek Bond Super Glue 793 Tek Bond Saint-Gobain 78072720018 liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity
Toluidine Blue O Sigma-Aldrich T3260 (for staining)
Transmission Electron Microscope Jeol (any model)
Triphenyltetrazolium chloride Sigma-Aldrich T8877 (for the tetrazolium test in seeds germination)
Trisodium citrate dihydrate Sigma-Aldrich S1804 Na3(C6H5O7)·2H2O (for TEM contrast staining)
Ultramicrotome Leica Biosystems (any model)
Uranyl acetate Fisher Scientific 18-607-645 UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)
Vacuum pump (any model)
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate TermoFisher Scientific W11261 fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)

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