Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Mikroskopi teknikker for tolkning av soppkolonisering i mykoheterotrofe plantevev og symbiotisk spiring av frø

Published: May 17, 2022 doi: 10.3791/63777
Automatic Translation
1, 1, 1
1LabPlaM - Mycoheterotrophic Plants Research Lab, Department of Plant Biology, University of Campinas (UNICAMP)

Summary

Denne protokollen tar sikte på å gi detaljerte prosedyrer for innsamling, fiksering og vedlikehold av mykoheterotrofe planteprøver, ved å bruke forskjellige mikroskopiteknikker som skanning og transmisjonselektronmikroskopi, lys, konfokal og fluorescensmikroskopi for å studere soppkolonisering i plantevev og frø spiret med mykorrhizal sopp.

Abstract

Strukturell botanikk er et uunnværlig perspektiv for å forstå økologi, fysiologi, utvikling og evolusjon av planter fullt ut. Når man forsker på mykoheterotrofe planter (dvs. planter som får karbon fra sopp), kan bemerkelsesverdige aspekter av deres strukturelle tilpasninger, mønstrene for vevkolonisering av sopp og morfoanatomien til underjordiske organer opplyse deres utviklingsstrategier og deres forhold til hyfer, kilden til næringsstoffer. En annen viktig rolle for symbiotiske sopp er relatert til spiring av orkidéfrø; alle Orchidaceae-arter er mykoheterotrofe under spiring og frøplantestadium (innledende mykoheterotrofi), selv de som fotosyntetiserer i voksne stadier. På grunn av mangel på næringsreserver i orkidéfrø, er soppsymbionter avgjørende for å gi substrater og muliggjøre spiring. Å analysere spiringsstadier ved strukturelle perspektiver kan også svare på viktige spørsmål angående soppens interaksjon med frøene. Ulike bildebehandlingsteknikker kan brukes til å avdekke soppendofytter i plantevev, som foreslått i denne artikkelen. Frihånd og tynne deler av planteorganer kan farges og deretter observeres ved hjelp av lysmikroskopi. En fluorokrom konjugert til hvetekimagglutinin kan påføres sopp og inkuberes med Calcofluor White for å markere plantecellevegger i konfokalmikroskopi. I tillegg er metodene for skanning og transmisjonselektronmikroskopi detaljert for mykoheterotrofe orkideer, og mulighetene for å anvende slike protokoller i relaterte planter blir utforsket. Symbiotisk spiring av orkidéfrø (dvs. i nærvær av mykorrhizal sopp) er beskrevet i protokollen i detalj, sammen med muligheter for å forberede strukturer oppnådd fra forskjellige stadier av spiring for analyser med lys, konfokal og elektronmikroskopi.

Introduction

Strukturforskning i botanikk, som dekker plantemorfologi og anatomi, er grunnleggende for å forstå hele organismen1,2, og gir uunnværlige perspektiver for å integrere og bidra til kunnskap om økologi, fysiologi, utvikling og evolusjon av planter3. Metoder i plantemorfologi og anatomi omfatter i dag protokoller, utstyr og kunnskap utviklet nylig så vel som for mer enn et århundre siden2. Den kontinuerlige utførelsen og tilpasningen av klassiske metoder (f.eks. Lysmikroskopi) sammen med nyere teknikker (f.eks. Konfokalmikroskopi, røntgenmikrotomografi) har samme viktige grunnlag: teoretisk kunnskap som muliggjør utvikling av en metodikk.

Hovedverktøyet i planteanatomi og morfologi er bildet. Til tross for misforståelsen om at slike analyser er enkle observasjoner, gir plass til subjektive tolkninger2, krever analyse og forståelse av bilder på dette området kunnskap om metodene som brukes (utstyret, type analyse, metodologiske prosedyrer), cellekomponenter, histokjemi og plantekroppen (vevsorganisasjon og funksjon, ontogeni, morfologiske tilpasninger). Tolkning av bildene oppnådd ved hjelp av en rekke metoder kan føre til korrelerende form og funksjon, dechiffrere den kjemiske sammensetningen av en struktur, bekrefte i å beskrive taxa, forstå infeksjoner av fytopatogener og andre slike vurderinger.

Når man forsker på mykoheterotrofe (MH) planter (dvs. ikke-fotosyntetiske planter som får karbon fra mykorrhizal sopp4,5), kan bemerkelsesverdige aspekter av deres strukturelle tilpasninger, mønstrene for vevkolonisering av sopp og morfoanatomi av underjordiske organer opplyse deres utviklingsstrategier og forhold til hyfer, som er kilden til næringsstoffer. De underjordiske organene til MH-planter viser vanligvis viktige tilpasninger knyttet til deres tilknytning til jordsvamp, derfor er det viktig å utføre disse anatomiske og morfologiske undersøkelsene6. MH-arters luftorganer bør ikke ignoreres, da endofytter også kan være tilstede i disse vevene, selv om de ikke er mykorrhizale sopp (personlige observasjoner, ikke publisert ennå).

I tillegg til den veletablerte essensen av mykorrhizal soppforening med MH-arter i løpet av hele livssyklusen7, har hver orkidéart, selv de autotrofe, et innledende obligatorisk mykoheterotrofisk stadium i naturlige miljøer. Det oppstår fordi orkideenes embryo er utifferentiert og mangler endosperm eller cotyledoner, og dermed ikke er i stand til å utvikle og etablere seg i naturlige miljøer uten næringsstøtte fra sopppartnere 4,8. Tatt i betraktning at symbiotiske spiringsprotokoller kan brukes ikke bare på MH-arter, men også på fotosyntetiserende orkideer, med sikte på å undersøke orkidé-soppspesifisitet i spiring og protocormutvikling, en enormt anvendt metodikk i initiativer for bevaring av truede arter 9,10,11.

I denne metodesamlingen beskriver vi viktige trinn involvert i innsamling, fiksering og lagring av MH-planteprøver for anatomiske studier (seksjon 1), overflateanalyse og prøvevalg (seksjon 2), seksjoneringsmetoder (frihånd: seksjon 3, mikrotomi: seksjon 4, kryomikrotomi: seksjon 5), farging og montering (seksjon 6), fluorescens og konfokal mikroskopi av soppendofytter (seksjon 7), skanning elektronmikroskopi (seksjon 8), og transmisjonselektronmikroskopi (pkt. 9). I tillegg beskriver vi en symbiotisk spiringsmetode for orkidéfrø (MH og autotrofisk, seksjon 10), da de tidligere nevnte avbildningsmetodene med hell kan brukes til å analysere soppkolonisering av frø, protokormer og frøplanter i spiringsprosessen.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk oppsummering av bildemetoder. Skjemaene gir indikasjoner på protokolltrinn der de er detaljerte. Forkortelser: GMA = glykolmetakrylat, OCT = optimal skjæretemperaturforbindelse, SEM = skanningelektronmikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Mikroskopiteknikkene beskrevet her i detalj (figur 1) innledes av følgende viktige trinn: innsamling, festing, dehydrering, innebygging og seksjonering av prøver. Siden trinnene er variable (figur 1) avhengig av valgt(e) teknikk(er), er det viktig å tenke fremover, med tanke på fikseringsmidlene som skal klargjøres og transporteres til innsamlingsstedet, hvordan prøvene må klargjøres før fiksering, dehydreringsprosessene som skal brukes (avsnitt 1), og ulike innbyggingsmuligheter og snittingsmetoder (§§ 4, 5, og 9). Figur 1 oppsummerer sekvensielt alle trinnene som kreves for hver mikroskopiteknikk grundig beskrevet nedenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Innsamling, fiksering og vedlikehold av prøver

MERK: Fullt MH-planter kan vanligvis finnes i den mørke skogen under 12,13, hovedsakelig i fuktige og søppelrike områder, mens delvis MH-planter finnes i mer åpne skoger 12,13. MH-planter har vanligvis velutviklede underjordiske organer i en rekke former og størrelser.

  1. Når du samler MH-arter, utforsk jorda rundt plantebasen, pass på at du ikke skader underjordiske organer, og unngå å trekke plantene fra bakken for å forhindre at luftorganene kobles fra de underjordiske.
  2. Grav forsiktig rundt luftstrukturer ved hjelp av en hagesparkel mens du utforsker de underjordiske organene som røtter, stengler, rhizomer og lagringsorganer, uten å skade disse strukturene.
  3. Fjern jordpartikler for å bevare skjøre strukturer, og vask disse organene forsiktig med vann fra springen for å skylle av de resterende jordpartiklene før du fikser prøvene.
  4. MH-planter assosiert med bladkull krever ekstra oppmerksomhet; Samle forsiktig organer som er koblet til det nedbrytende materialet gjennom hyfer, unngå å trekke disse organene fra de tilkoblede strukturene, og samle dem forsiktig, da disse delene er svært delikate. Bevar strukturer med slike forbindelser og samle søppel også for analyse.
  5. Hvis du velger å analysere ferskt materiale ved hjelp av bildebehandlingsteknikker, må du opprettholde prøvene i lukkede plastposer med tilstrekkelig fuktighet, nok vann som fordamper og fukter planten, og forhindrer at overdreven vann kommer i kontakt med prøvene. Transport dem til laboratoriet umiddelbart og analyser prøvene samme dag de ble samlet inn, mens du betaler oppmerksomhet om prøvene fortsatt er bevart når de analyserer dem.
  6. Bær fikseringsmidler til oppsamlingsstedet i godt forseglede beholdere. Fiks prøver raskt etter innsamling for lysmikroskopi (LM) og skanning elektronmikroskopi (SEM) i et av følgende fiksativer: 10% nøytral bufret formalin (NBF14, tabell 1) eller Karnovskys løsning (modifisert15, tabell 2). Karnovskys løsning kan fremstilles med 0,2 M fosfatbuffer15, hvis oppskrift er beskrevet i tabell 3.
  7. For analyse ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM), seksjon prøvene med en tykkelse på 4-3 mm inne i en dråpe glutaraldehyd-natriumkakodylatbuffer (modifisert16, tabell 4) i mindre seksjoner med 1-2 mm tykkelse. Kast kantene som er kuttet utenfor dråpen. Overfør umiddelbart seksjonene til et oppsamlingsrør med et fikseringsvolum som er mer enn 10 ganger større enn volumet av prøvene, da det er et additivt fikseringsmiddel (dvs. dets molekyler blir kjemisk tilsatt til proteinene fast16).
    FORSIKTIG: De tre beskrevne fikseringsmidlene er svært giftige. Unngå innånding, spesielt under bruk i feltet. Forbered alle fikseringsmidlene i en avtrekkshette ved hjelp av hansker. Ikke bland kakodilat og syrer, da arsengass kan dannes16.
  8. Hvis de faste prøvene flyter i fikseringsmiddelet, indikerer dette tilstedeværelsen av gass i plantevev. Luft og andre gasser hindrer fikseringsmiddelet i å trenge inn i hele prøven2. Fjern gass fra vev ved å ta dem på nytt i mindre deler og bruke en vakuumpumpe (-300 til -400 inHg trykk) til alle prøvene synker til bunnen av løsningen17. Vær forsiktig da for høyt trykk som utøves av pumpen kan skade prøver.
  9. Etter minst 48 timer i Karnovskys løsning eller 10% NBF, vask prøvene i 0,2 M PB (tabell 3) og dehydrer dem med en serie på 10%, 30%, 50% og til slutt 70% etanol. For delikate prøver, dehydrer i 30 minutter i hver konsentrasjon; for større prøver, dehydrer i 1 time eller lenger.
    MERK: En 70% etanolløsning er det ideelle mediet for lagring av prøver. Prøver i 70% etanol kan lagres ved romtemperatur i årevis. Ikke oppbevar plantemateriale i lange perioder i fikseringsmidlene, da fjerning av festemidler er et viktig trinn etter fiksering2.
  10. Oppbevar prøver i glutaraldehyd-kakodilat ved 4 °C før du går videre til postfiksering (trinn 9.1).
10 % nøytralt bufret formalin (NBF)14
Trinn 1 tilsett 10 ml 37-40% formaldehydoppløsning i 80 ml destillert vann
Trinn 2 tilsett 0,4 g natriumfosfatmonobasisk monohydrat (NaH2PO4· H2O) til løsningen
Trinn 3 tilsett 0,65 g natriumfosfat dibasisk, vannfri (Na2HPO4)
Trinn 4 utgjør volumet til 100 ml

Tabell 1: 10% nøytral bufret formalin oppskrift 14.

Karnovskys løsning (endret15)
Trinn 1 i 20 ml destillert vann ved 60-70 °C
Trinn 2 Tilsett 0,8 g paraformaldehyd (for å oppnå 4 % W/V), omrøring
Trinn 3 tilsett 1-4 dråper 40% NaOH og rør til løsningen blir klar
Trinn 4 avkjøl den og tilsett 30 ml 0,2 M fosfatbuffer pH 7,2 (tabell 3)
Trinn 5 fortynn 25 % glutaraldehyd i 0,1 M PB (pH 7,2) for å oppnå 1 % glutaraldehyd (endelig volum: ~60 ml)
Trinn 6 tilsett 1% glutaraldehyd (trinn 5) til oppløsningen oppnådd i trinn 4 til den utgjør opptil 100 ml fiksativ

Tabell 2: Karnovskys løsningsoppskrift (modifisert15).

0,2 M fosfatbuffer (PB) pH 7,2
Trinn 1 tilsett 14,196 g natriumfosfatdibasisk, vannfritt (Na2HPO4) til 400 ml destillert vann
Trinn 2 tilsett 13,8 g natriumfosfatmonobasisk monohydrat (NaH2PO4· H2O)
Trinn 3 Rør til oppløsningen er klar
Trinn 4 juster det endelige volumet til 500 ml med destillert vann
Trinn 5 juster pH til 7,2
Trinn 6 for en 0,1 M PB, fortynn 1:1

Tabell 3: 0,2 M fosfatbufferoppskrift.

3 % glutaraldehyd 0,2 M natriumkakodylatbuffer (modifisert16)
Trinn 1 0,2 M kakodylatbuffer: tilsett 4,28 g natriumkakodylattrihydrat i 100 ml destillert vann
Trinn 2 juster pH til 7,2
Trinn 3 tilsett 12 ml 25 % glutaraldehyd i 25 ml av oppløsningen i trinn 2 (0,2 M kakodylatbuffer pH 7,2)
Trinn 4 utgjør volumet til 100 ml med destillert vann

Tabell 4: 3% glutaraldehyd 0,2 M natriumkakodylatbufferoppskrift (modifisert16).

2. Overflateanalyse av organer i fast og ikke-fast materiale

  1. For å analysere overfladiske hyfer i organer, spesielt underjordiske, og de som er i kontakt med bladkull, observere fast eller friskt materiale i et dissekeringsmikroskop (stereomikroskop) ved en forstørrelse på 7,5x eller høyere, avhengig av prøvene som analyseres.
    1. Visualiser prøvene nedsenket i fikseringsmiddelet, 70% etanol (hvis lagret i det), eller vann fra springen når det gjelder ferskt materiale. Forhindre direkte lys fra dissekeringsmikroskopet, da det kan tørke og skade prøver.
    2. Søk etter områder av interesse i prøvene, styrt av overfladiske hyfer og rhizomorphs. Velg prøver som inneholder områder med overfladiske rhizomorfer, da disse kan seksjoneres for å visualisere pelotoner og hyferspoler i kortikale celler i røtter og stengler.
    3. Etter valget følger du trinn 1.6 og 1.9 hvis prøvene ennå ikke er løst. Om ønskelig, fotografer ferske prøver ved hjelp av et lysmikroskop uten festing, som beskrevet i avsnitt 3.
    4. Bruk kameraet koblet til stereomikroskopet for å samle bilder fra organoverflater, rhizomorfer og andre observerte strukturer. I slike tilfeller må du sørge for at en tilstrekkelig bakgrunnsfarge står i god kontrast til materialet, og velg om mulig et bakgrunnsmateriale med en mindre ru overflate (f.eks. papir).

3. Frihåndsseksjoner av planteorganer

MERK: Frihåndsseksjoner av planteorganer kan være utfordrende, spesielt for små og tynne strukturer. Imidlertid kan disse delene av vev med soppendofytter i noen tilfeller bedre vise hyfer og andre funksjoner i forhold til tynne seksjoner.

  1. Del friske eller faste prøver med et skarpt blad, skjær dem så tynne som mulig og legg dem umiddelbart i en liten petriskål med vann (hvis fersk) eller 70% etanol (hvis den er fast). Bruk en liten pensel til å manipulere seksjonene uten å skade dem.
  2. For å lette seksjonering av mer utfordrende materialer (dvs. små, tynne, fleksible organer), omgir prøven i en struktur, for eksempel polystyren eller Cecropia petiole. Skjær støtten for å imøtekomme prøven og lag en tynn del av prøven og støtten helt.
  3. Flekke og montere prøvene som beskrevet i avsnitt 6.

4. Embedding planteprøver i harpiks og seksjonering

  1. Dehydrer videre prøvene lagret i 70% etanol i 80%, 96% og 2x i 100% etanol, i 30 minutter til 2 timer, avhengig av prøvenes størrelse og sammensetning.
  2. Bruk et glykolmetakrylat (GMA) harpikssett i henhold til produsentens instruksjoner. Sjekk Gerrits og Horobin (1996)18 for nærmere vurderinger. Følg infiltrasjons- og innebyggingstrinnene deretter.
    FORSIKTIG: GMA-harpiks er giftig, det kan forårsake allergisk reaksjon og hud-, øye- og slimhinneirritasjon. Bruk reagensene i en avtrekksvifte og bruk hansker.
  3. Bruk polyetylenstøpebrett for innebygging, valgt etter prøvestørrelse (f.eks. 13 mm x 19 mm x 5 mm for større prøver, 6 mm x 8 mm x 5 mm for mindre). Vær oppmerksom på ønsket prøveretning inne i formen, og bruk en nål for å orientere deg.
  4. La det være polymerisasjon, helst ved romtemperatur, til det er helt størknet. Herdingsprosessen tar vanligvis noen timer, selv om det anbefales å fjerne blokkene dagen etter. Etter polymerisering, løsne harpiksblokkene forsiktig fra formene og fortsett å feste blokkene så snart som mulig for å unngå blokkkurving.
  5. Sand ansiktet på harpiksblokken som skal festes, og skape en flat overflate. Lim harpiksblokken på en trekuboid (2 cm x 2 cm x 3 cm anbefales) med et flytende cyanoakrylatlim av middels viskositet (se materialtabell). Forsikre deg om at harpiksen er helt festet for å unngå å kompromittere seksjonering.
  6. Utfør seksjonering i et roterende mikrotom som beskrevet nedenfor.
    FORSIKTIG: Bladene på mikrotomkniver er veldig skarpe og kan forårsake ulykker. Sørg for å håndtere dem etter alle sikkerhetstiltak. Før du nærmer deg kniven (f.eks. for å bytte blokk, for å fukte harpiksen), lås det grove håndhjulet og plasser bladets sikkerhetsdeksel på. Oppbevar engangsblader i passende tilfeller. Vær ekstremt forsiktig når du bytter kniver.
    MERK: Ulike typer kniver (f.eks. engangs eller fast, glass eller stål) kan brukes til å seksjonere GMA-harpiks18. Kvaliteten på seksjonene avhenger av hvor skarp kniven er. Pass på at kniven er godt festet og ikke kan bevege seg. Engangskniver må kanskje endres regelmessig for å oppnå bedre seksjonering.
    1. Fest trekuben godt til blokkholderen. Juster retningen på seksjonering ved hjelp av orienteringsskruene og sørg for en tilstrekkelig vinkel på kniven ved hjelp av knivhellingen. Velg tykkelsen på seksjonene; bruk en tykkere innstilling for trimming og en tynnere innstilling for utvalgte seksjoner, da GMA-seksjoner fester seg mer hensiktsmessig til glassglasset når det er tynnere; Foreslått tykkelse for plantevev er 5-8 μm.
    2. Før du starter, avkjøl rommet, om nødvendig, da høyere temperaturer forverrer kvaliteten på seksjonene. Forbered følgende for seksjonering: et beger med destillert vann, en kokeplate, pensler (minst to), finpunktpincett, en Pasteur-pipette, glassglass, filterpapir (eller silkepapir) og en blyant (for å identifisere prøvene som blir seksjonert).
    3. Juster kokeplaten til 50 °C og plasser begeret på den. Vær oppmerksom på forskjeller i oppvarming avhengig av varmeplatens område (vanligvis varmer midtområdet mer enn kantene, varme vannet i midten, helst).
    4. Velg et glassglass, identifiser det med en blyant, og pipette det varme destillerte vannet over hele lysbildeoverflaten. Bruk om nødvendig en løsning (f.eks. vaskemiddel og vann, eller 70% etanol) for å bryte spenningen mellom vannet og glasset, slik at hele lysbildet er like dekket. Noen lysbildetyper må forrenses med 70% etanol for å oppnå tilstrekkelig seksjonsetterlevelse.
    5. Begynn med å gradvis fremme ansiktet på harpiksblokken mot knivbladet. Ikke prøv seksjonering uten å fremme blokken først, ellers kan utstyret og blokken bli skadet. Trim om nødvendig blokken med en høyere tykkelse (10 μm og over).
    6. Når du nærmer deg en passende seksjon, gjør du en fast enveisbevegelse med håndhjulet, slik at seksjonen blir laget på en gang. Hold en sjekk på harpiksfuktigheten. Under seksjonering fukter du regelmessig ansiktet på blokken som kuttes med en pensel dyppet i destillert vann hvis det er et problem med krølleseksjoner. Fjern overflødig vann med et silkepapir.
    7. Med en fin punktpinsett plasserer du den oppnådde delen i vannet over lysbildet. Ved å komme i kontakt med vann, strekker GMA-harpiksen seg. Bruk om nødvendig en pensel til å brette ut og strekke seksjonene forsiktig. Bruk en annen pensel for å holde bladet fritt for harpiksrester. Ikke bytt mellom penslene for å unngå fukting av bladet.
    8. Etter å ha lagt alle de ønskede delene i lysbildet i kø, tørk den nederste siden av lysbildet og legg den over kokeplaten. Fjern overflødig vann fra toppen av lysbildet ved å forsiktig dabbe med et filterpapir (valgfritt). Seksjonene vil feste seg når vannet fordamper fra lysbildet. Ikke la lysbildene være for lange for å forhindre at seksjonene blir skadet av overdreven varme.
    9. Oppbevar lysbildene i en lysbildeboks, vekk fra støv og sol, og bruk dem til flekker og andre prosedyrer. Lysbildene kan lagres i flere år.

5. Frysing av planteprøver og seksjonering med kryostat

MERK: Det essensielle hensynet ved kryoseksjonering av biologisk vev er å redusere skade på grunn av iskrystalldannelse ved frysing av prøver. Kryobeskyttelse gjøres vanligvis ved å infisere kjemisk inerte løsninger som glyserol eller sukrose19,20.

  1. En dag før prøveseksjonering utfører du følgende trinn.
    1. Fortynn 100 ml 0,2 M PB (tabell 3) i 100 ml destillert vann for å oppnå 200 ml 0,1 M PB. Forbered 10%, 20% og 30% sukroseløsninger i 0,1 M PB (f.eks. for en 10% løsning, tilsett 2 g sukrose i 20 ml buffer).
    2. For ferske prøver, vask dem i 0,1 M PB i 30 minutter. For prøver i et fikseringsmiddel, vask dem i samme buffer som brukes til å forberede fikseringsmiddelet i 30 minutter. For prøver i 70% etanol, hydrater dem i 50% og 30% etanol og vask i 0,1 M PB i 1 time i hver løsning.
    3. Inkuber prøvene i 2 timer i 10% sukrose, 2 timer i 20% sukrose og 2 timer i 30% sukrose, ved romtemperatur. Deretter inkuberer du over natten i 30% sukrose ved 4 ° C (eller i det minste i 3 timer, maksimal tid er 48 timer).
  2. På dagen for seksjonering, tilbered 40% og 50% sukrose i 0,1 M PB; Ikke lag sukroseløsninger mer enn 12 timer på forhånd. Inkuber i 2 timer i hver sukrosekonsentrasjon, ved 4 °C.
  3. For innebygging, i små former, lag et lag med OCT-forbindelse (optimalt skjæretemperaturmedium, brukt til innebygging og frysing av prøvene) og hold det ved -20 ° C for å fryse. Formene kan være vanlige histologiske former, men for å lette unmolding blokkene, kan papir eller tinfoil gjøres ved hjelp av en liten kuboid som ramme og tape.
  4. Etter at det nederste laget av OCT-forbindelsen er frosset i formene, arbeid inne i et kryostatkammer (ca. -27 °C). Plasser prøvene inkubert i 50% sukrose i formene, i retningen der de skal seksjoneres. Oversiden av en kuboid blokk er vanligvis et bedre ansikt av seksjonering. Merk i formen der prøvene er plassert, slik at blokken enkelt kan trimmes, og riktig retning opprettholdes.
  5. Omgi prøvene i OCT-forbindelse og spreng enhver luftboble som berører prøvene. Frys dem ned ved -20 °C. Når blokkene er helt frosne, plasserer du dem inne i kryostatkammeret (ca. -27 °C). Unmold hver enkelt bare før du bruker og ta hensyn til merkene som indikerer prøveplassering inne i blokken.
  6. Siden OCT-forbindelsen enkelt kuttes med et blad, må du trimme blokkene riktig før du plasserer dem på chuckene. Sett litt OCT-forbindelse i kryostatchucken og plasser blokken slik at oversiden er seksjonert. Ansikter med mindre områder gir bedre seksjoner. Vent til blokken er godt festet til chucken og test den før du begynner å seksjonere.
  7. Plasser chucken godt i chuckholderen. Juster retningen på seksjoneringen ved hjelp av retningsskruene. Juster vinkelen på kniven ved hjelp av knivhellingen. Velg tykkelsen på seksjonene. Prøvene kan seksjoneres tykkere enn vanlige harpiksseksjoner. Seksjoner i et område mellom 5-20 μm er vellykket oppnådd, med tykkere seksjoner som er lettere å lage (mindre krølling og mindre skade på strukturer).
  8. Forskjøv ansiktet på den frosne blokken mot knivbladet. Ikke prøv seksjonering uten å gjøre det, ellers kan blokken løsnes fra chucken og skades. Trim om nødvendig blokken med en høyere tykkelse (10 μm og over).
  9. Når du nærmer deg en passende seksjon, plasser antirullplaten (dvs. en gjennomsiktig plate som vil beholde seksjonen) over kniven og gjør en fast enveisbevegelse med håndhjulet, slik at seksjonen blir laget med en gang. Krølleproblemer kan forårsakes hvis antirullplaten må justeres (den er vanligvis justerbar i forhold til bladet) eller hvis det er rusk i bladet. Rengjør bladet hele tiden med en pensel for å fjerne rusk.
  10. Bruk spesielle lysbilder slik at seksjonene festes enkelt, som silaniserte lysbilder (kommersielle eller tilberedte med 2% aminoalkylsilan i aceton 21), eller lysbilder tilberedt med 500 μg / ml poly-L-lysin i destillert vann 21 eller 0,2% gelatin (se detaljer21). Hold lysbildene ved romtemperatur.
  11. Hvis du vil feste inndelingen til et lysbilde, løfter du antirullplaten og får lysbildet raskt til å berøre inndelingen. Siden lysbildet er romtemperert, smelter seksjonen umiddelbart og fester seg til lysbildet. Vær oppmerksom på å vri det behandlede ansiktet på lysbildet til seksjonen, som kan forbli over kniven eller på innsiden av antirullplaten. For å unngå krølling av seksjoner, utfør dette trinnet raskt så snart platen er løftet og vær forsiktig så du ikke forvrenger seksjonen.
  12. La lysbildet stå utenfor kryostatkammeret (ved romtemperatur) hvis nye seksjoner skal legges til det. Etter å ha festet alle de ønskede delene til lysbildet, hold det inne i kryostatkammeret eller i fryseren (-20 ° C eller under). Ikke utsett lysbildene for fuktighet. Oppbevar dem i en lysbildeboks, og husk å identifisere lysbildene med en blyant.
    MERK: Lysbilder og blokker med OCT kan lagres ved -20 °C, men ikke for lenge. For å oppnå bedre resultater, bruk lysbildene og blokkene i løpet av få dager.

6. Farging av planteseksjoner og endofytter for lysmikroskopi

MERK: Mange typer flekker kan brukes til planteseksjoner. Det er utfordrende å skille endofytiske sopp og plantevev differensielt. Selv om det ikke er en fargeprosedyre, presenteres en metode for merking av soppstrukturer i avsnitt 7 (fluorescens med hvetekimagglutinininkonjugat). Frihåndsseksjoner (forklart i avsnitt 3), harpiksseksjoner (avsnitt 4) og kryoseksjoner (avsnitt 5) kan farges, selv om fenol og alkoholbaserte flekker er utfordrende for disse prøvene, da GMA-harpiks og OCT mister overholdelse av lysbildet i disse tilfellene.

  1. Bruk en eller kombiner følgende vanlige fargemetoder for planteprøver.
    1. Toluidinblå O22,23, en mye anvendt metode for generell farging av planteseksjoner. Klargjør en oppløsning av 0,05% toluidinblå O i 0,1 Mfosfat (pH 6,8) eller 0,09 M sitratbuffer (pH 4,5-4,8), avhengig av art og vevstyper. Inkuber GMA-harpiksseksjoner i 2-10 minutter ved hjelp av en lysbildefargingskrukke eller ved å plassere noen dråper over seksjonene hvis få lysbilder er farget. Vask forsiktig med destillert vann eller buffer etter inkubering og monter lysbildene med vann eller tørk dem på en kokeplate for å produsere permanente lysbilder som beskrevet i trinn 6.3.
    2. Lugol reagens2 indikerer tilstedeværelse av stivelse. Forbered en 5% jod (I2) og 10% kaliumjodid (KI) løsning i destillert vann. Flekkseksjoner i 2 minutter, ved å legge noen dråper over lysbildet, og vask deretter med destillert vann. Denne histokjemiske testen brukes vanligvis på midlertidige lysbilder.
    3. Sudan III, IV og svart B24,25 flekk for forskjellige lipider. Forbered en løsning på 0,3% Sudan (III, IV eller svart B) i 70% etanol, varm den til koking, og la avkjøles. Bruk supernatanten, filtrer den og rug seksjoner i 15-30 minutter i en lukket petriskål. Vask seksjonene forsiktig med 70% etanol og destillert vann. Monter lysbildene med vann (brukes vanligvis bare på midlertidige lysbilder).
      MERK: Siden Sudan er et alkoholbasert fargestoff, er det mer egnet for frihåndsseksjoner. Utfør GMA-harpiksseksjonsfarging forsiktig da de vanligvis løsner fra lysbildet.
  2. For midlertidige lysbilder, monter seksjonene i vann eller glyserin og observer deretter. Forsegl dekselet med neglelakk for å bevare dem litt lenger.
  3. For permanente lysbilder, monter seksjonene med syntetiske harpikser (f.eks. hurtigmonteringsmedium, se materialtabell). Drypp noen dråper av monteringsmediet (det kan renne over dekselet), sett dekselet forsiktig for å unngå bobler, og bruk klespinner til å trykke lysbildet mot dekselet til det er helt tørt. Fjern overskuddet av tørket monteringsmedium med et barberblad.

7. Påføring av et fluorokrom konjugert til hvetekimagglutinin i fluorescens og konfokal mikroskopi

MERK: Denne metoden kan brukes på frihåndsseksjoner (forklart i avsnitt 3), harpiksseksjoner (avsnitt 4) og kryoseksjoner (avsnitt 5). Kryoseksjoner kan være tilstrekkelig for konfokale mikroskopiformål, da tykkere prøver kan leveres sammenlignet med harpiksseksjoner, men ikke så tykke som frihånd. En fluorokrom konjugert til hvetekimagglutinin (WGA, se Materialtabell) påføres soppavbildning i fluorescensmikroskopi26. Et konfokalt mikroskop er ikke avgjørende, selv om det kan gi klare tredimensjonale bilder av plantestrukturer27.

  1. Klargjør en oppløsning med 0,2 mg/ml WGA-fluorokrom konjugat i 0,1 M PB28 (pH 7,2, kontroller trinn 5.1.1 og tabell 3). Forbered en løsning av 1% Calcofluor White i 0,1 M PB (pH 7,2). Forbered små mengder av disse løsningene, da seksjonene inkuberes direkte med dem.
  2. Inkuber seksjonene i glassglassene i 30 minutter i WGA-fluorokrom konjugatløsning29, bruk nok volum til å dekke seksjonene, vask deretter i 0,1 M PB.
  3. Inkuber seksjonene i kalkofluoroppløsningen, bruk nok volum som monteringsmedium. Løsningen kan opprettholdes i observasjonsperioden.
  4. Sett deksler på lysbildene og observer i et konfokalt mikroskop eller et fluorescenslysmikroskop ved hjelp av følgende filtre: TC / GFP (eksitasjon: 470-440, utslipp: 525-550, for WGA-fluorokrom i materialtabellen - soppcelleveggfluorescer grønt under dette filteret29) og DAPI (eksitasjon: 358, utslipp: 463, for Calcofluor White) 30.
    MERK: Tredimensjonale bilder kan fås ved hjelp av Z-seriefunksjonen i det konfokale mikroskopet27.

8. Skanning elektronmikroskopi av planteorganer

  1. Etter fiksering av prøver, utførelse av dehydrering og lagring i 70% etanol (avsnitt 1), er en mulighet å kutte prøver for å eksponere ønsket overflate for SEM-analyse, om nødvendig (f.eks. Internt vev, eggstokkstruktur). Bruk et skarpt og nytt barberblad og gjør kutt med en enveisbevegelse, og unngå et skadet utseende av disse områdene i SEM. Bruk om nødvendig et stereomikroskop for å velge prøvene og vurder metallstubbområdet for å bestemme prøvestørrelser.
  2. Ytterligere dehydreringsprøver for SEM i en etanolisk serie: 80%, 96% og 2x i absolutt etylalkohol (≥99,8%). Oppretthold små og delikate prøver i 30 minutter i hver konsentrasjon og større og tettere prøver i 1 time.
  3. Brett små konvolutter ved hjelp av silkepapir for å organisere prøver for de neste trinnene, større prøver kan håndteres uten konvolutt. Identifiser konvoluttene med blyant ved å skrive et brev eller et tall, og hold en logg over alle prøvene i hver enkelt. Hold prøvene i absolutt etanol, men ikke for lenge, og fortsett til trinn 8.4 så snart som mulig.
  4. Fortsett for tørking av kritisk punkt (CP). Bruk en CP-tørketrommel i henhold til standard driftsprosedyrer. Plasser prøver i absolutt etanol (mellomvæske) i et trykkammer. Ved CO2 kritisk punkt (31 °C, 7,3 x 106 Pa) oppløses mellomvæsken i overgangsvæsken (flytende karbondioksid), og prøvene tørkes31.
  5. Etter CP-tørking, oppbevar prøver så snart som mulig i en uttørkingsbeholder, for eksempel en forseglet kolbe som inneholder silikagel. Atmosfærisk fuktighet kan ødelegge prøvene hvis de reabsorberes31.
  6. Bruk metallstubber til å montere prøvene. Før montering, legg hansker på for å manipulere stubbene, senk dem i aceton i 5 minutter for å eliminere fett, og la dem tørke. Bruk et ledende dobbeltsidig karbontape for å fikse prøver på stubben, og et stereomikroskop for å hjelpe til med å plassere prøver, og husk at synet ovenfra er det eneste mulige perspektivet i SEM-bilder.
  7. Manipuler prøver med finpunktpincett, vær forsiktig da prøvedelen som berøres av pinsetten vanligvis er skadet, så prøv å berøre deler som er plassert vekk fra interesseområdene (f.eks. områder i kontakt med båndet). Oppretthold stubbene med prøver i en forseglet petriskål med silikagel. Fortsett til trinn 8.8 så snart som mulig.
  8. Bruk en sputter coater for å deponere et lag av metall, vanligvis gull eller platina, på overflaten av prøvene i en lavtrykksatmosfære av en inert gass, ofte argon31. Følg standard driftsprosedyrer når du bruker en sputter coater. Beleggtykkelsen avhenger av topografien til prøvene, vanligvis mellom 15-40 nm32.
  9. Oppretthold de belagte stubbene i en forseglet petriskål med silikagel, og forutsatt at silikagelen holder på fuktighet, kan prøvene lagres på denne måten i flere uker. Bruk et skanneelektronmikroskop for å analysere prøvene. Prøvene i vacuo blir truffet av en stråle av elektroner, og utslipp av signaler fra slik interaksjon tolkes som bilder31. For detaljer om drift av et skanningelektronmikroskop, les Jeffree and Read (1991) 31 og Bozzola og Russell (1999) 32.
  10. For å gjenbruke stubbene, trekk limbåndet og skrubb dem med trådull. Vask i vann fra springen, senk i absolutt etanol, og tørk dem tilstrekkelig, og forhindre oksidasjon av metallbestanddelen.

9. Transmisjonselektronmikroskopi

  1. Prefiksprøver med glutaraldehyd-kakodylatbuffer som forklart i trinn 1.7 og 1.10. Etter 12-24 timers prefiks, vask prøvene 3x i 0,2 M kakodylatbuffer (pH 7,25) i 10 minutter. Utfør postfiksering med 1% osmiumtetroksid (OsO4) i 0,2 M kakodylatbuffer, i 12 timer i mørket, ved romtemperatur. Vask 3x med destillert vann i 5 min.
    FORSIKTIG: Cacodylate og osmiumtetroksid er svært giftige og bør ikke inhaleres. Bruk dem i avtrekksvifter, etter de respektive sikkerhetsdatabladene.
  2. Dehydrer prøvene med 30%, 50%, 70% og 96% etanol, 2x i hver konsentrasjon, i 10 minutter. Deretter dehydrerer du 3x i absolutt alkohol, i 15 minutter hver gang.
  3. Infiltrer prøvene i hydrofile akrylharpikser (se materialtabell), en gang med 1: 1 harpiks + absolutt etanol og 3x med ren harpiks i 8-12 timer hver. Utfør polymerisasjon i gelatinkapsler ved 60 °C til den er fullstendig størknet (maksimalt17 timer).
  4. Nøye vurdere orienteringen av prøver inne i harpiksblokken; Klipp den øverste delen av blokken, med et barberblad, og lag en pyramideform som konsentrerer prøven i seksjoneringsområdet. Få semitynne seksjoner (250-500 nm)33 i en ultramikrotom med en diamantkniv og legg på glassglass i noen dråper vann.
  5. Oppbevar lysbildene på en kokeplate ved 60 °C. Flekker seksjonene med toluidinblå O som i trinn 6.1.1 og la flekken tørke helt. Vask forsiktig med vann fra springen. Evaluer den oppnådde delen ved å tegne fire kvadranter og velge den mest passende kvadranten for analyse.
  6. Trim blokken slik at pyramideformen konsentrerer den valgte kvadranten på blokkens øvre ansikt. Produser ultratynne seksjoner (50-100 nm)33,34. Tykkelsen vurderes i henhold til interferensfargen til seksjonene: seksjoner med ca. 70 nm vises sølvgull, med ca. 100 nm vises gull, og med ca. 200 nm vises blå34.
  7. Samle de ultratynne seksjonene fra vann ved hjelp av kobbergitter og fortsett til kontrastfargingsmetoden med uranylacetat og blycitrat, som beskrevet nedenfor.
    1. Klargjør en blysitratløsning (tabell 5) og frys den endelige løsningen i mikrosentrifugerør med 1 ml oppløsning i hver, bare tining rett før bruk.
    2. Forbered en uranylacetatløsning: oppløs 0,625 g uranylacetat [UO 2 (CH3COO)2] i 25 ml nylig kokt og avkjølt destillert vann. Oppbevares i en mørk kolbe i fryseren.
      FORSIKTIG: Blynitrat er giftig ved inntak. 1 N NaOH er svært etsende. Uranylacetat er radioaktivt og giftig. Det må ikke inntas, inhaleres eller komme i kontakt med huden.
    3. Ved farging, legg begge tilberedte reagenser i separate 3 ml sprøyter med filterenheter (0,22 μm pore, se materialtabell). Forbered en petriskål vendt opp ned med en forseglende termoplastfilm over den (se Materialtabell) og inne i en bredere tallerken, med NaOH-pellets i kantene som en felle for CO 2 32 (se figur 2).
    4. Kast den første dråpen, og legg over filmen en dråpe uranylacetat og tre dråper destillert vann for hvert rutenett som er farget. Gjør det samme med blycitrat og tilsett tre dråper destillert vann.
    5. Inkuber rutenettet (med den ugjennomsiktige siden nedover, hvor seksjonene er) i uranyl i 30 minutter (variabel tid). Vask 3x i destillerte vanndråper, tørk rutenettet hver gang forsiktig med filterpapir på den strålende siden. Gjenta med blysitratfallet (30 min) og vask det.
  8. Etter minst 4 timer, analyser rutenettene i et transmisjonselektronmikroskop. I dette mikroskopet passerer en stråle av elektroner gjennom seksjonene i vacuo og bildet projiseres på en fluorescerende skjerm. For detaljer om drift av et transmisjonselektronmikroskop, les Bozzola og Russell (1999) 32.
blysitratløsning (for TEM-kontrastfarging)
Trinn 1 Omgi et beger med tinfoil
Trinn 2 oppløs 0,266 g blynitrat [Pb(NO3)2] i 6 ml nylig kokt og avkjølt destillert vann
Trinn 3 Agiter i 2 min
Trinn 4 tilsett 0,352 g trinatriumsitrat [Na3(C6H5O7).2H2O] (oppløsningen må få et melkeaktig utseende)
Trinn 5 rør i 15 min, forsegle begeret med tinfoil og overfør løsningen til et 10 ml beger
Trinn 6 tilsett 1,6 ml 1N NaOH og 2,4 ml destillert vann (oppløsningen må være gjennomskinnelig)
Trinn 7 Juster om nødvendig pH-verdien nær 12

Tabell 5: Oppskrift på blysitratløsning.

Figure 2
Figur 2: Kontrastfargingsskjema med blysitrat og uranylacetatløsninger . (A) Tilbered petriskålene, en vendt opp ned (i midten) med termoplastisk film slik at dråper kan plasseres over den, inne i en bredere. NaOH-pellets er steder rundt sentralretten. (B) Uranylacetatdråper plasseres i sirklene med bokstaven U, og blysitratdråper i sirklene merket L. DW indikerer dråper destillert vann. Rutenettene er farget sekvensielt i kolonnen, slik at fem rutenett kan farges samtidig som representert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

10. Symbiotisk spiring av orkidéfrø

  1. Sørg for at løsningene og alle materialene som brukes i symbiotisk spiring av frø er sterile for å unngå forurensning. Start med å autoklavere dem i 20 minutter ved 121 °C. De symbiotiske spiringstrinnene er oppsummert i figur 3.
  2. Desinfiser overfladisk frukt og frø ved å nedsenke dem i natriumhypoklorittoppløsning som inneholder 2% aktivt klor i 10-15 minutter for frukt og 7-10 minutter for frø, med tanke på stivhet og tykkelse av frøbelegg9. Slanke og skjøre frø kan nedsenkes i en 1: 1 fortynnet natriumhypoklorittløsning. Etterpå vaskes 3x i autoklavert destillert vann for å fjerne hypoklorittoppløsningen.
  3. Recuperate frøene ved å filtrere i serigrafisk stoff og bruk frøene til å fortsette med spiringstester (helst). Oppbevar dem om nødvendig i filterpapirkonvolutter inne i glassflasker med silikagel, ved 4 °C, lukk kolbene hermetisk og forsegl dem med klamfilm. Overfør noen dråper vann fra siste vask til potetdekstroseagar (PDA, 39 g / L), for å evaluere effektiviteten av vaskeprosessen.
  4. Før såing frø i kulturmediet, vurder deres levedyktighet gjennom tetrazoliumtesten (valgfritt) som beskrevet nedenfor35.
    1. Inkuber ca. 10 mg frø i et mikrosentrifugerør med 1 ml 10% sukrose i destillert vann, i 24 timer ved romtemperatur (ca. 25 ° C), i lys.
    2. Fjern sukroseoppløsningen med en mikropipette og tilsett 1 ml 1% tetrazoliumoppløsning (trifenyltetrazoliumklorid) i destillert vann. Inkuber ved 40 °C i en termoblokk i 24 timer i mørket.
    3. Fjern tetrazoliumoppløsningen med en mikropipette og vask frøene med destillert vann 2x eller til løsningen er fjernet. Fjern alle væsker. Om nødvendig kan frøene lagres i fryseren i opptil en uke (som i trinn 10.3) før de analyseres.
    4. Resuspend frøene i destillert vann og analyser dem under et lysmikroskop. Levedyktige frø får lys til mørk rød farge, mens ikke-levedyktige frø beholder sin naturlige farge.
  5. Utfør følgende tilpassede9-protokoll for symbiotisk spiring av orkidéfrø.
    1. Inkuber frøene over autoklaverte filterpapirskiver (1-2 cm i diameter) plassert i petriskåler med havregrynagar (OMA) kulturmedium (2,5 g/l havregryn og 7 g/l agar, pH 6).
    2. I midten av petriskålen inokulerer du et fragment av kulturmedium (ca. 1 cm2) som inneholder mycelium fra den valgte isolerte soppen for spiringsprosedyre. Forsegl petriskålene med klamfilm og rug dem i mørket ved rundt 25 °C eller romtemperatur, da det er mer tilstrekkelig for soppvekst.
    3. Forbered noen retter med frø og uten soppinokulasjon, som en negativ kontroll for spiringstesten.
  6. Analyser spiringsresultatene ukentlig, ved å samle kvantitative og kvalitative data og fotografere protokormer og frøplanter. Observasjonen av frø og protokormer bør utføres ved hjelp av et stereomikroskop for en mer nøyaktig vurdering av spiring. Bruk en lyskilde som kommer nedenfra, da det gir større kontrast, noe som gjør det mulig å diskriminere soppmyceliet fra protokormer lettere.
    1. Samle prøver i ulike utviklingsstadier og fiks for anatomiske analyser (avsnitt 1). Påfør alle bildeanalysene som tidligere er beskrevet for å undersøke soppendofytter i frø, protokormer og frøplanter under spiring (lysmikroskopi - avsnitt 4, 5 og 6; konfokal og fluorescens - seksjon 7; SEM og TEM - avsnitt 8 og 9).
    2. Generere kvantitative resultater etter klassifisering av stadier i henhold til tabell 6. Stadiene beskriver den vanlige utviklingen av frø fra mykoheterotrofe orkideer. Samle inn data ukentlig og tabell med de første datoene for hvert observerte stadium.
    3. I tillegg samler kvantitative data som estimerer spiringsprosent og hastighet. Tell minst 100 frø eller definer tellefelt35. Avgrens tre eller flere tellefelt per petriskål, bestående av faste regioner med et standardisert område, og evaluer ukentlig. Beregn innsamlede data i henhold til vekstindeksen (GI) ligningen:
      Equation 1
      hvor N 0 er antall talte frø i trinn0 , N 1 refererer til trinn1 , og det følger til trinn 6 (registrert som N6)36.

Figure 3
Figur 3: Skjematisk oppsummering av symbiotisk spiring av frømetodikk. Skjemaene gir indikasjoner på detaljerte trinn i protokollen. Forkortelser: OMA = havregryn agar, PDA = potet dextrose agar. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Spiringsstadium Beskrivelse
0 Ingen spiring
1 Hevelse i embryoet
2 Testa brudd
3 Absorberende hår utvikler seg
4 Stem-projeksjon utvikler seg
5 Beskytte skalaer (bracts) utvikle
6 Første røtter utvikler seg

Tabell 6: Beskrivelse av protocorm utviklingsstadier anvendt på periodiske analyser av spiringstester. Modifisert fra stadier beskrevet i Otero et al.36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter de essensielle stadiene av å fikse plantevev gir cellulære strukturer så lik levende tilstand som mulig, med tanke på morfologi, volum og romlig organisering av cellulære komponenter og vev16. Observer slike egenskaper i prøvene etter kjemisk fiksering (figur 4). Figur 4C-F representerer tilstrekkelig faste prøver under lysmikroskopi. Å følge fikseringsprosedyrene som er beskrevet og skaffe seg kjennskap til prøvestrukturen, hjelper deg med å analysere fikseringssuksess.

Figure 4
Figur 4: Overfladisk analyse og snitt fra filiforme røtter av MH-orkidéen Wullschlaegelia aphylla (Sw.) Rchb.f. (A og B) Rhizomorfer i filiform rotoverflate. (C og D) Frihåndsseksjoner som ikke er farget, viser pelotoner i kortikale celler. (E og F) Tynne seksjoner farget med toluidinblå O. Forkortelser: en = endodermis, ep = epidermis, ct = cortex, hy = hypha, pc = parenkymatøs celle, pe = floemelementer, pl = peloton, rfl = rot (filiform), rm = rhizomorph, vc = vaskulær sylinder, xe = xylemelement. Skala barer: A = 2 mm; B = 500 μm; C og E = 200 μm; D = 100 μm; F = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Merk i figur 4C, D regelmessigheten av strukturer og fravær av skadede områder i en frihåndsseksjon av en prøve fastsatt med 10% NBF. Det cellulære volumet er bevart, som ligner levende vev. Sammenligning med et frihåndsseksjonert friskt organ er også viktig for å gjenkjenne godt fikserte prøver. I figur 4E, F ble seksjoner fra prøver innebygd i GMA-harpiks og festet med 10% NBF farget med toluidinblå O. Legg merke til de godt bevarte strukturer av cellevegger, uten forvrengninger eller skadede områder, som viser svært like egenskaper som i en frihåndsseksjonert prøve (figur 4C, D).

Når man analyserer overflaten av underjordiske organer, indikerer tilstedeværelsen av rhizomorphs hyfer som koloniserer indre vev. Rhizomorfer er vegetative strukturer sammensatt av et aggregat av svært differensierte hyfer og dannet av noen få sopparter, hovedsakelig saprotrofiske som bryter ned tre37,38. Rhizomorfene kan lett gjenkjennes, vanligvis som mørke shoestring-lignende strukturer37, sett i figur 4A, B og figur 7D. Å søke etter disse soppstrukturene letter prøvevalg for å observere mønsteret av soppkolonisering i planteorganer. I figur 4C,D ble seksjonene oppnådd i områder med overfladiske rhizomorfer, mens i figur 4E er det vist en seksjon av samme organ uten seleksjon av et slikt criterium. Individualiserte hyfer kan også identifiseres under et dissekeringsmikroskop med en perceptiv observasjon.

Figure 5
Figur 5: Frihåndsseksjoner av Uleiorchis sp. lagringsstruktur . (A) Seksjon under et dissekeringsmikroskop. (B) Pelotoner under et lysmikroskop, konsentrert i en region av organets cortex. (C og D) Hyfer detaljer om pelotonene som er analysert. Forkortelser: hy = hypha, pc = parenkymatøs celle, pl = peloton, s = septa. Skala barer: A = 2 mm; B = 500 μm; C og D = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Som tidligere forklart, kan frihåndsseksjonering foretrekkes i forhold til tynn seksjonering avhengig av målet. Frihånd eller andre metoder for å oppnå tykkere seksjoner (mer enn 10 μm tykke) kan bedre vise pelotoner og gi mer representative bilder av soppmønstre av kolonisering (for eksempel figur 4C, D og figur 5A, B). Frihåndsseksjoner kan også være egnet for hyferanalyse ved høyere forsterkning, som vist i figur 5C, D, selv om detaljer oppnås bedre i tynnere seksjoner, som i figur 7A, fra en prøve innebygd i GMA-harpiks. Noen detaljer om plantecellestrukturer er tilstrekkelig observert i tynne seksjoner, for eksempel figur 4F. Montering er også et viktig skritt, da bilder av bedre kvalitet kan avhenge av monteringsmediet. GMA harpiks lysbilder kan monteres i vann eller glyserin, selv om et kommersielt monteringsmedium (se Materialtabell) vil forbedre det endelige bildet da det fyller ufullkommenheter fra seksjoneringsprosessen. I figur 6C kan ufullkommenheter ses (pilspisser) i en GMA-harpiksseksjon, da lysbildet ble montert med vann.

Figure 6
Figur 6: Seksjoner av fusiforme røtter av W. aphylla farget med Lugol-oppløsning . (A) Frihåndsseksjon farget med toluidinblå O og Lugol. (B) Farget bare med toluidinblå O. (C) Tynt snitt i GMA-harpiks farget med laktofenol bomullsblå og Lugol, pilspisser: ufullkommenheter fra bladuregelmessigheter. (D) Frihåndsseksjon farget bare med Lugol. Forkortelser: cw = cellevegg, pc = parenkymatøs celle, sg = stivelseskorn, vc = vaskulær sylinder. Skala barer: A = 200 μm; B og C = 100 μm; D = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Hovedfordelen ved bruk av toluidinblå O (mer tilstrekkelige resultater i tynne seksjoner) er de viktige metakromatiske egenskapene til denne flekken, noe som betyr at den får forskjellige farger avhengig av den cellulære komponenten den binder seg til og fungerer som en polykromatisk flekk egnet til å skille forskjellige sammensetninger av cellevegger23. I figur 4F kan sekundære cellevegger i xylemelementer lett identifiseres ved den lyse fargen toluidin oppnår. I mellomtiden er floemelementer, som bare består av primære cellevegger, identifisert av deres tynnere og mørkere cellevegger. En annen viktig flekk, hovedsakelig med tanke på MH-planter, er Lugol-løsningen, da stivelseskorn lett identifiseres når de farges av den. Seksjoner er representert i figur 6A-D: frihåndsseksjon farget med toluidinblå O og Lugol i figur 6A og bare toluidinblå O i figur 6B; tynn seksjon i GMA-harpiks farget med laktofenol bomullsblå og Lugol i figur 6C; frihåndsseksjon farget bare med Lugol i figur 6D.

Inkubasjon av frihånd (figur 7C), GMA-harpiks (figur 7B) eller OCT-seksjoner med WGA-fluorokromkonjugat og Calcofluor White kan forbedre strukturene i henholdsvis soppcelleveggen og plantecelleveggen. Det er en viktig metode for å bekrefte hyfer, da WGA-konjugat har spesifisitet til N-acetylglukosaminylrester, tilstede i celleveggen av sopp. Figur 7A viser en del av blomsterstammen farget med toluidinblå O, mens figur 7B er fra samme organ og bekrefter at strukturene sett i figur 7A er hyfer. Artefakter ved autofluorescens kan ses i GMA-harpiksseksjoner (pilspisser, figur 7B). Disse artefaktene er vanligvis relatert til fluorokromkonsentrasjon og kan unngås ved å vaske prøvene flere ganger med bufferen. I figur 7C vises en frihåndsdel av roten, med interne og eksterne hyfer. Det samme organet kan ses ved SEM i figur 7D, med en overflod av rhizomorfer og individuelle hyfer på overflaten. Tilstrekkelige SEM-mikrografer har god kontrast mellom gråtoner, slik at tredimensjonalitet kan sees og tolkes godt. Velg representative bilder og unngå misvisende bilder (videre lesning: tips for valg av elektronmikrografi32).

Figure 7
Figur 7: Seksjoner fra blomsterstammen og filiforme røtter av W. aphylla og overfladisk analyse av filiformrot ved SEM. (A) Tynn seksjon av blomsterstamme i GMA-harpiks, farget med toluidinblå O. (B) Tynn seksjon av blomsterstamme i GMA-harpiks inkubert med WGA-fluorokromkonjugat + Calcofluor White, pilspisser: artefakter ved autofluorescens. (C) Frihåndsseksjon av filiform rot inkubert med WGA-fluorokrom konjugat + Calcofluor White. (D) Skanning elektronmikrografi av filiform rotoverflaten. Forkortelser: cw = cellevegg, hy = hyfer, pc = parenkymatøs celle, pl = peloton, rfl = rot (filiform), rm = rhizomorph. Skala barer: A, C og D = 100 μm; B = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Frukt fra forskjellige orkidéarter ble nedsenket i natriumhypokloritt med 2% aktivt klor i 15 minutter, for å sikre fullstendig overfladisk desinfeksjon av organene (figur 8A). Frø med stivere frøbelegg fra Vanilla sp. (figur 8A) og Pogoniopsis schenckii (figur 9B-D) ble nedsenket i samme løsning i 10 minutter (figur 8C), mens slankere, fra Laelia sp. og Cattleya sp., ble opprettholdt i 7 minutter (figur 9A). Overføring av en aliquot av vann fra den siste vasken bekreftet effektiviteten av desinfeksjonsprosessen før du går videre til spiringstestene, med tanke på begge varighetene av nedsenking som er beskrevet.

Figure 8
Figur 8: Overfladisk desinfeksjon av frukt og frø av Vanilla panifolia, en fotosyntetisk orkidéart . (A) Frukt nedsenking i natriumhypokloritt med aktivt klor. (B) Frukt langsgående seksjonert. (C) Frø filtrert med serigrafisk stoff etter nedsenking i natriumhypokloritt, klar til å bli sådd eller lagret i silikagel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Såing av frøene over filterpapirskiver sikrer at det er nok fuktighet og oksygen til spiring og embryoutvikling (figur 9A-D) uten å være helt nedsenket under det overfladiske vannlaget fra kulturmediet. Noen soppisolater kan vokse kraftig over frøene. Mediet som inneholder 2 g/l knuste havregryn gir bedre kontroll over soppveksten, og forbedrer visualiseringen og analysen av frø (figur 9B). Etter ca. 50-60 dager med isolatinokulasjon må mediet fornyes, slik at soppen forblir aktiv. Dette kan gjøres ved å overføre frøene til et nytt OMA-medium med samme formulering. Frøene kan overføres med filterpapiret, noe som letter overføringen uten å skade protocorms delikate strukturer, i tillegg til å holde dem i den opprinnelige posisjonen uten å kompromittere tellefeltene som tidligere er etablert.

Figure 9
Figur 9: Protokoll for symbiotisk spiring . (A) Frø arrangert over filterpapir i OMA-medium. (B) Petriskåler med frø og en inokulert sopp (potensielt mykorrhizal), ruges i ca. 21 dager. (C og D) Symbiotiske spiringsretter med forskjellige soppisolater. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

De fleste orkidéarter spirer i løpet av noen uker etter å ha blitt smittet av den inokulerte soppen eller til nesten mer enn en måned (figur 10). Frø som ikke spirer innen 3 måneder vil sannsynligvis ikke spire med mindre metodikken justeres. I slike tilfeller bør du vurdere muligheter som frø dvale eller soppisolatet som ikke er mykorrhizal. Noen arter trenger spesifikke protokoller for å bryte dvale, andre presenterer ganske enkelt en høy spesifisitet til visse mykorrhizalpartnere, forskjellig fra de som er valgt for den symbiotiske spiringstesten (data ikke publisert).

Figure 10
Figur 10: Pogoniopsis schenckii frø, en achlorophyllous og MH orkidé, i OMA medium med sopp inokulere39 i stand til å stimulere spiring. (A-D) Ikke spirede frø og protokormer i ulike utviklingsstadier. Forkortelser: ng = ingen spiring, pt = protokorm, ri = sprukket integument, ts = turgidfrø. Skala barer = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

I de første ukene etter inokulering av isolatet evalueres oppvasken, da det vanligvis tar 7-14 dager til hyferen oppnår frøene. Tenk på denne perioden, da det er overveiende å begynne å registrere utviklingen av embryoene. De subtile endringene under spiringsstadier kan bare oppdages under et dissekeringsmikroskop, med tanke på at strukturene er så små. Noen arter protocorms må analyseres under et lysmikroskop for å identifisere absorberende hår og fortelle dem bortsett fra hyfer. GI-analyse kan gi mer plausibelt sammenlignbare resultater, generere en representasjon av innsamlede data og gi mer vekt til verdier som tilsvarer mer avanserte spiringsstadier. De endelige verdiene kan variere mellom null og seks (eller i henhold til det siste trinnet som er definert). Ulike statistiske tester kan brukes på GI-analyser (f.eks. ANOVA, signifikansnivå), avhengig av forskerens spørsmål og krav når man utfører symbiotiske spiringstester.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bildeanalyser i planteanatomi og morfologi har et viktig potensial for å oppfylle mål og bidra til å forstå forholdet mellom mykoheterotrofe planter og deres uunnværlige soppendofytter, som demonstrert ved studier av underjordiske organer 6,40, strukturelle analyser av symbiotisk spiring av frø39, og luft- og reproduktive strukturer 41 . Strukturell botanikk, til tross for å ha mistet sin prestisje og plass til andre områder av plantevitenskap i det siste tiåret1, er fortsatt fremtredende i å svare på spørsmål og bidra til å avsløre nyheter og viktige planteegenskaper knyttet til utvikling, økologi, fysiologi og evolusjon. Disse metodene er samlet grunnlag for strukturelle studier av planter, og vurderer viktige aspekter ved MH-planteanalyse.

Viktig informasjon er gitt for å nøye samle MH-planter, ellers kan de velutviklede underjordiske organene bli skadet og ikke fullstendig samlet. Bemerkelsesverdige tilpasninger av disse strukturene6 og den intime kontakten med sopp fra jord, koblet til autotrofe planter42 eller nedbrytende bladkull40, skal vurderes når man samler og bevarer de underjordiske strukturer. De essensielle trinnene for prøvefiksering må følges tilstrekkelig, med hensyn til riktig klargjøring av fikseringsmidler og tidsproblemer, minimumstid som kreves mellom innsamling og fiksering, og minimumstid som kreves i fikseringsmiddelet før du går videre til lagring. Strukturell analyse av godt bevarte prøver avhenger av fikseringsprosessen, og de vanligste og best bevarende fiksativene som brukes til å studere planteanatomi og elektronmikroskopi er beskrevet i protokolldelen. Andre fikseringsmidler14,16,25 kan også brukes.

Som tidligere nevnt er prosessen med å bruke kjemiske fikseringsmidler avgjørende og kan evalueres ved innsamling av prøvebilder. I LM bør cellulære strukturer være så like som mulig i forhold til levende vev16. Volumet, morfologien og romlig disposisjon av identifiserbare cellulære komponenter skal ligne så mye som mulig på det friske vevet (ikke-fast). I TEM kan godt bevarte vev vises når tonoplasten er synlig, med glatte konturer, og ikke trekkes bort fra cytoplasma16. Plasmamembranen kan ikke løsnes og krympes bort fra celleveggen. Prøver for TEM må samles så tynt som mulig og inne i en dråpe fikseringsmiddel, som forklart i protokolldelen. Bruken av buffere assosiert med fikseringsmidler gir viktige forhold for osmolaritet og ionisk sammensetning til prøvene som festes, og unngår så mange endringer som mulig i cellulær struktur og ultrastruktur16. I SEM er en stor bekymring med isotoniske fikseringsmidler og forbereder dem med buffere, så det er ingen vesentlige endringer i prøvevolum (hevelse eller krymping)16.

Mange forskjellige innebyggingsmetoder for LM er tilgjengelige for å skaffe seksjoner til forskjellige formål. Med tanke på farging og fluorescerende fargestoffer inkubasjon, presenteres to viktige metoder for å analysere MH-planters organer. De som er beskrevet ovenfor (frihåndsseksjoner, GMA-harpiks og OCT-innebygging) er blant de vanligste og enkleste, og gir metodologisk frihet og egnethet til mange typer analyser. Konjugatet WGA-fluorokrom har betydelig potensial i MH-plantestudier, da det for tiden er mer brukt på sopppatogener28,29,30 og knapt brukt med MH-planter soppendofytter. De grunnleggende og essensielle trinnene for skanning og transmisjonselektronmikroskopi er detaljerte, da disse teknikkene i stor grad kan bidra til strukturell analyse av planter. SEM- og TEM-litteraturen er rik, og videre lesning 32,33,34,43 anbefales dersom andre typer elektronmikroskopianalyser skal testes.

Når det gjelder symbiotiske spiringsprosedyrer, er det mulig å gjennomføre fruktasepsis før dehiscens, uten at det er nødvendig å desinfisere frøene direkte. Imidlertid må frø fra frukt som allerede er åpen eller kolonisert av endofytter (allerede beskrevet for MH-arter39,41) desinfiseres direkte. En viktig bemerkning: Tid og betingelser for lagring og asepsis prosesser kan redusere levedyktigheten til frøene fra enkelte arter som observert under utførelsen av disse forsøkene. Tetrazoliumreagens gir en farge som spenner fra lys til mørk rød til embryoer fra levedyktige frø. Embryoer fra ikke-levedyktige frø forblir med sin naturlige farge. Frø med tungt pigmenterte teguments eller stive frøbelegg kan trenge en forbehandling før spiringstesten. Det anbefales å utføre scarification av deres tegument, slik at visualisering av embryoet35.

Noen potensielle mykorrhizale soppisolater fra tropiske orkideer, for eksempel Ceratobasidium-arter , har en kraftig og akselerert vekst i et næringsrikt kulturmedium. Under behandlingen er det mulig at isolatene helt dekker frøene når de vokser, noe som gjør datainnsamling vanskelig eller umulig. Den vanlige protokollen som inneholder 4 g / L knust havregryn9 forhindret datainnsamling i symbiotisk spiring av P. schenckii, og krevde en adequation til 2 g / L knust havregryn39. Bruk av ca. 2,5 g/l havregryn for å komponere OMA-medium ved symbiotisk spiring synes å være tilfredsstillende for å begrense veksten av kraftigere soppisolater (upubliserte data).

Begrensninger kan oppstå fra metodene som er beskrevet, hvorav noen effektivt kan overvinnes ved å tilpasse prosedyrene eller anvende andre metoder. Som diskutert tidligere, er GMA-innebygging bare effektiv for seksjonering opp til 8 μm tykk. OCT-innebygging gir imidlertid forskjellige tykkelsesseksjoner, inkludert tykkere (f.eks. 10-20 μm). Farging av bare soppstrukturer i plantevev er ikke lett utført, selv om WGA-fluorokrom er et viktig og effektivt konjugatfluorokrom som markerer soppcellevegger, selv om det er dyrt. Andre kostnadsbegrensninger kan oppstå i SEM- og TEM-metoder, da de høye kostnadene og essensialiteten til utstyr gjør slike analyser ikke trivielle og vanlige for alle forskningsgrupper. Den symbiotiske spiring av frøtester, selv om det er enkelt og billigere, krever mykorrhizal sopp for å inokulere frøene og forsiktige prosedyrer for å unngå forurensninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker finansiering fra FAEPEX og FAPESP (2015/26479-6). MPP takker Capes for hans mastergradsstipend (prosess 88887.600591/2021-00) og CNPq. JLSM takker CNPq for produktivitetstilskudd (303664/2020-7). Forfatterne takker også tilgangen til utstyr og assistanse fra LME (Laboratory of Electron Microscopy - IB / Unicamp), INFABiC (National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology - Unicamp) og LaBiVasc (Laboratory of Vascular Biology - DBEF / IB / Unicamp); LAMEB (UFSC) og Eliana de Medeiros Oliveira (UFSC) for bidrag til kryobeskyttelsesprotokollen; LME for bidrag til TEM-protokollen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma-Aldrich 179124 (for SEM stubs mounting)
Agar-agar (AA) Sigma-Aldrich A1296 (for seeds germination tests)
Calcofluor White Stain Sigma-Aldrich 18909 fluorescent dye (detects cellulose)
Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8 Sigma-Aldrich C2488 (for toluidine blue O staining)
Conductive Double-Sided Carbon Tape Fisher Scientific 50-285-81 (for SEM)
Confocal Microscope Zeiss (any model)
Copper Grids Sigma-Aldrich G4776 (for TEM)
Critical-point dryer Balzers (any model)
Cryostat Leica Biosystems (any model)
Dissecting microscope Leica Biosystems (= stereomicroscope, any model)
Entellan Sigma-Aldrich 107960 rapid mounting medium for microscopy
Ethyl alcohol, pure (≥99.5%) Sigma-Aldrich 459836 (= ethanol, for dehydration processes)
Formaldehyde solution, 37% Sigma-Aldrich 252549 (for NBF solution preparation)
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128 histological tissue fixative
Gelatin capsules for TEM Fisher Scientific 50-248-71 (for resin polymerisation in TEM)
Gelatin solution, 2% in H2O Sigma-Aldrich G1393 (dilute for slides preparation - OCT adherence)
Glutaraldehyde solution, 25% Sigma-Aldrich G6257 (for Karnovsky’s solution preparation)
HistoResin Leica Biosystems 14702231731 glycol methacrylate (GMA) embedding kit
Iodine Sigma-Aldrich 207772 (for Lugol solution preparation)
Lead(II) nitrate Sigma-Aldrich 228621 Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)
Light Microscope Olympus (any model)
LR White acrylic resin Sigma-Aldrich L9774 hydrophilic acrylic resin for TEM
Lugol solution Sigma-Aldrich 62650 (for staining)
Metal stubs for specimen mounts Rave Scientific (for SEM, different models)
Microtome Leica Biosystems manual rotary microtome or other model
Oatmeal agar (OMA) Millipore O3506 (for seeds germination tests)
OCT Compound, Tissue-Tek Sakura Finetek USA 4583 embedding medium for frozen tissues
Osmium tetroxide Sigma-Aldrich 201030 OsO4 (for TEM postfixation)
Parafilm M Sigma-Aldrich P7793 sealing thermoplastic film
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 (for Karnovsky’s solution preparation)
Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O Sigma-Aldrich P8920 (for slides preparation - OCT adherence)
Poly-Prep Slides Sigma-Aldrich P0425 poly-L-lysine coated glass slides
Polyethylene Molding Cup Trays Polysciences 17177A-3 (6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Polyethylene Molding Cup Trays Polysciences 17177C-3 (13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Potassium iodide Sigma-Aldrich 221945 (for Lugol solution preparation)
Potato Dextrose Agar (PDA) Millipore 70139 (for seeds germination tests)
Scanning Electron Microscope Jeol (any model)
Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane] Sigma-Aldrich A3648 (for slides preparation - OCT adherence)
Silane-Prep Slides Sigma-Aldrich S4651 glass slides coated with silane
Silica gel orange, granular Supelco 10087 (for dessicating processes)
Sodium cacodylate trihydrate Sigma-Aldrich C0250 (for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881 NaOH (for Karnovsky’s solution preparation and TEM contrast staining)
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 425044 NaClO (for seeds surface disinfection)
Sodium phosphate dibasic, anhydrous Sigma-Aldrich 71640 Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich S9638 NaH2PO4·H2O (for NBF and PB)
Sputter coater Balzers (any model)
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)
Sudan III Sigma-Aldrich S4131 (for staining)
Sudan IV Sigma-Aldrich 198102 (for staining)
Sudan Black B Sigma-Aldrich 199664 (for staining)
Syringe (3 mL, any brand, for TEM contrast staining)
Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 µm Millipore SLGV033R PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)
Tek Bond Super Glue 793 Tek Bond Saint-Gobain 78072720018 liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity
Toluidine Blue O Sigma-Aldrich T3260 (for staining)
Transmission Electron Microscope Jeol (any model)
Triphenyltetrazolium chloride Sigma-Aldrich T8877 (for the tetrazolium test in seeds germination)
Trisodium citrate dihydrate Sigma-Aldrich S1804 Na3(C6H5O7)·2H2O (for TEM contrast staining)
Ultramicrotome Leica Biosystems (any model)
Uranyl acetate Fisher Scientific 18-607-645 UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)
Vacuum pump (any model)
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate TermoFisher Scientific W11261 fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Evert, R. F. Esau’s Plant Anatomy: Meristems, Cells, and Tissues of the Plant Body: Their Structure, Function, and Development. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ, USA. (2006).
  2. Yeung, E. C. T., Stasolla, C., Sumner, M. J., Huang, B. Q. Plant Microtechniques and Protocols. , Springer International Publishing. Cham, Switzerland. (2015).
  3. Sokoloff, D. D., Jura-Morawiec, J., Zoric, L., Fay, M. F. Plant anatomy: at the heart of modern botany. Botanical Journal of the Linnean Society. 195 (3), 249-253 (2021).
  4. Leake, J. R. The biology of myco-heterotrophic (‘saprophytic’) plants. New Phytologist. 127 (2), 171-216 (1994).
  5. Bidartondo, M. I. The evolutionary ecology of myco-heterotrophy. New Phytologist. 167 (2), 335-352 (2005).
  6. Imhof, S., Massicotte, H. B., Melville, L. H., Peterson, R. L. Subterranean morphology and mycorrhizal structures. Mycoheterotrophy. , Springer. New York, NY. 157-214 (2013).
  7. Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style. Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).
  8. Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jersáková, J., Těšitelová, T. Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements. Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).
  9. Zettler, L. W. Terrestrial orchid conservation by symbiotic seed germination: techniques and perspectives. Selbyana. 18 (2), 188-194 (1997).
  10. Stewart, S. L., Kane, M. E. Symbiotic seed germination and evidence for in vitro mycobiont specificity in Spiranthes brevilabris (Orchidaceae) and its implications for species-level conservation. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. 43 (3), 178-186 (2007).
  11. Zhao, D. -K., et al. Orchid reintroduction based on seed germination-promoting mycorrhizal fungi derived from protocorms or seedlings. Frontiers in Plant Science. 12, 701152 (2021).
  12. Selosse, M. A., Roy, M. Green plants that feed on fungi: facts and questions about mixotrophy. Trends in Plant Science. 14 (2), 64-70 (2009).
  13. Merckx, V. S. F. T., Mennes, C. B., Peay, K. G., Geml, J. Evolution and diversification. Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , Springer. New York, NY. 215-244 (2013).
  14. Boon, M. E., Drijver, J. Routine Cytological Staining Techniques: Theoretical Background and Practice. Macmillan International Higher Education. , Hampshire, UK. (1986).
  15. Karnovsky, M. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27 (2), 137-138 (1964).
  16. Hayat, M. Fixation for Electron Microscopy. , Academic Press. New York, USA. (1981).
  17. Roland, J. C., Vian, B. General preparation and staining of thin sections. Electron Microscopy of Plant Cells. 1, 675 (1991).
  18. Gerrits, P. O., Horobin, R. W. Glycol methacrylate embedding for light microscopy: basic principles and trouble-shooting. Journal of Histotechnology. 19 (4), 297-311 (1996).
  19. Zhang, Z., Niu, L., Chen, X., Xu, X., Ru, Z. Improvement of plant cryosection. Frontiers in Biology. 7 (4), 374-377 (2012).
  20. BeneŠ, K. On the media improving freeze-sectioning of plant material. Biologia Plantarum. 15 (1), 50-56 (1973).
  21. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Preparation of slides and coverslips for microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), (2008).
  22. Sakai, W. S. Simple method for differential staining of paraffin embedded plant material using toluidine blue O. Stain Technology. 48 (5), 247-249 (1973).
  23. O’Brien, T., Feder, N., McCully, M. E. Polychromatic staining of plant cell walls by toluidine blue O. Protoplasma. 59 (2), 368-373 (1964).
  24. Ventrella, M. C., Almeida, A. L., Nery, L. A., Coelho, V. P. deM. Métodos Histoquímicos Aplicados às Sementes. Universidade Federal de Viçosa. , Viçosa, Brazil. (2013).
  25. Pearse, A. G. E. Histochemistry, Theoretical and Applied. , J & A Churchill. London, UK. (1960).
  26. Andrade-Linares, D. R., Franken, P. Fungal endophytes in plant roots: taxonomy, colonization patterns, and functions. Symbiotic Endophytes. , Springer. Berlin. 311-334 (2013).
  27. Wymer, C. L., Beven, A. F., Boudonck, K., Lloyd, C. W. Confocal microscopy of plant cells. Confocal Microscopy Methods and Protocols. , Humana Press. Totowa. 103-130 (1999).
  28. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. Manual de Técnicas Aplicadas à Histopatologia Vegetal. FEALQ. , Piracicaba, Brazil. (2021).
  29. Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera. European Journal of Plant Pathology. 154 (4), 1185-1193 (2019).
  30. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum. Frontiers in Plant Science. 9, 698 (2018).
  31. Jeffree, C. E., Read, N. D. Ambient-and low-temperature scanning electron microscopy. Electron Microscopy of Plant Cells. , 313-413 (1991).
  32. Bozzola, J. J., Russell, L. D. Electron Microscopy: Principles and Techniques for Biologists. , Jones & Bartlett Learning. Sudbury, MA, USA. (1999).
  33. Murray, S. Basic transmission and scanning electron microscopy. Introduction to electron Microscopy for Biologists. , Academic Press. 3-18 (2008).
  34. Tanaka, M. Glossary of TEM terms. , Available from: https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/ (2021).
  35. Seaton, P. T., et al. Orchid seed and pollen: a toolkit for long-term storage, viability assessment and conservation. Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses—Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 71-98 (2018).
  36. Otero, J. T., Ackerman, J. D., Bayman, P. Differences in mycorrhizal preferences between two tropical orchids. Molecular Ecology. 13 (8), 2393-2404 (2004).
  37. Koch, R. A., et al. Marasmioid rhizomorphs in bird nests: Species diversity, functional specificity, and new species from the tropics. Mycologia. 112 (6), 1086-1103 (2020).
  38. Webster, J., Weber, R. Introduction to Fungi. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
  39. Sisti, L. S., et al. The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn. Frontiers in Plant Science. 10, 1589 (2019).
  40. Martos, F., et al. Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids. New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).
  41. Alves, M. F., et al. Reproductive development and genetic structure of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn. BMC Plant Biology. 21 (1), 332 (2021).
  42. Merckx, V. S. F. T. Mycoheterotrophy: an introduction. Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , 1-17 (2013).
  43. Hall, J. L., Hawes, C. Electron Microscopy of Plant Cells. , Academic Press. Cambridge, UK. (1991).

Tags

Biologi utgave 183 kryoseksjoner endofytiske sopp lysmikroskopi mikrotomi mykoheterotrofe planter planteanatomi skanning elektronmikroskopi frøspiring fargeteknikker symbiotisk spiring transmisjonselektronmikroskopi hvetekimagglutinininkonjugat
Mikroskopi teknikker for tolkning av soppkolonisering i mykoheterotrofe plantevev og symbiotisk spiring av frø
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pena-Passos, M., Sisti, L. S.,… More

Pena-Passos, M., Sisti, L. S., Mayer, J. L. S. Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds. J. Vis. Exp. (183), e63777, doi:10.3791/63777 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter