Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

माइकोहेटरोट्रॉफिक पौधों के ऊतकों और बीजों के सहजीवी अंकुरण में फंगल उपनिवेशीकरण की व्याख्या के लिए माइक्रोस्कोपी तकनीक

Published: May 17, 2022 doi: 10.3791/63777
Automatic Translation
1, 1, 1
1LabPlaM - Mycoheterotrophic Plants Research Lab, Department of Plant Biology, University of Campinas (UNICAMP)

Summary

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य माइकोहेटरोट्रॉफिक पौधों के नमूनों को इकट्ठा करने, ठीक करने और बनाए रखने के लिए विस्तृत प्रक्रियाएं प्रदान करना है, विभिन्न माइक्रोस्कोपी तकनीकों जैसे स्कैनिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, प्रकाश, कंफोकल और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी को लागू करना ताकि माइकोराइजल कवक के साथ अंकुरित पौधों के ऊतकों और बीजों में कवक उपनिवेशीकरण का अध्ययन किया जा सके।

Abstract

संरचनात्मक वनस्पति विज्ञान पौधों की पारिस्थितिकी, शरीर विज्ञान, विकास और विकास को पूरी तरह से समझने के लिए एक अनिवार्य परिप्रेक्ष्य है। माइकोहेटरोट्रॉफिक पौधों (यानी, पौधे जो कवक से कार्बन प्राप्त करते हैं) पर शोध करते समय, उनके संरचनात्मक अनुकूलन के उल्लेखनीय पहलू, कवक द्वारा ऊतक उपनिवेशीकरण के पैटर्न, और भूमिगत अंगों की मॉर्फोनाटॉमी उनकी विकास रणनीतियों और पोषक तत्वों के स्रोत हाइप के साथ उनके संबंधों को प्रबुद्ध कर सकती है। सहजीवी कवक की एक और महत्वपूर्ण भूमिका ऑर्किड बीज के अंकुरण से संबंधित है; सभी ऑर्किडेसी प्रजातियां अंकुरण और अंकुरण चरण (प्रारंभिक माइकोहेटेरोट्रॉफी) के दौरान माइकोहेटरोट्रॉफिक हैं, यहां तक कि वे भी जो वयस्क चरणों में प्रकाश संश्लेषण करते हैं। ऑर्किड बीजों में पोषण भंडार की कमी के कारण, सब्सट्रेट प्रदान करने और अंकुरण को सक्षम करने के लिए फंगल सहजीवन आवश्यक हैं। संरचनात्मक दृष्टिकोण से अंकुरण चरणों का विश्लेषण भी बीज के साथ कवक बातचीत के बारे में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब दे सकता है। पौधे के ऊतकों में कवक एंडोफाइट्स का अनावरण करने के लिए विभिन्न इमेजिंग तकनीकों को लागू किया जा सकता है, जैसा कि इस लेख में प्रस्तावित है। पौधे के अंगों के फ्रीहैंड और पतले वर्गों को दाग दिया जा सकता है और फिर प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके देखा जा सकता है। गेहूं के रोगाणु एग्लूटिनिन के लिए संयुग्मित एक फ्लोरोक्रोम को कवक पर लागू किया जा सकता है और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी में पौधे की कोशिका की दीवारों को उजागर करने के लिए कैल्कोफ्लोर व्हाइट के साथ सह-ऊष्मायन किया जा सकता है। इसके अलावा, स्कैनिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की पद्धतियों को माइकोहेटरोट्रॉफिक ऑर्किड के लिए विस्तृत किया गया है, और संबंधित पौधों में इस तरह के प्रोटोकॉल को लागू करने की संभावनाओं का पता लगाया गया है। आर्किड बीजों के सहजीवी अंकुरण (यानी, माइकोराइजल कवक की उपस्थिति में) को प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णित किया गया है, साथ ही प्रकाश, कॉन्फोकल और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ विश्लेषण के लिए अंकुरण के विभिन्न चरणों से प्राप्त संरचनाओं को तैयार करने की संभावनाओं के साथ।

Introduction

वनस्पति विज्ञान में संरचनात्मक अनुसंधान, पौधे की आकृति विज्ञान और शरीर रचना विज्ञान को कवर करते हुए, पूरे जीव 1,2 को समझने में बुनियादी है, और पौधों के पारिस्थितिकी, शरीर विज्ञान, विकास और विकास के बारे में ज्ञान को एकीकृत करने और योगदान करने के लिए अपरिहार्य दृष्टिकोण प्रदान करताहै 3. पौधे की आकृति विज्ञान और शरीर रचना विज्ञान में विधियों में वर्तमान में प्रोटोकॉल, उपकरण और ज्ञान शामिल हैं जो हाल ही में विकसित हुए हैं और साथ ही एक सदी से अधिक समय पहले2. शास्त्रीय तरीकों (जैसे, प्रकाश माइक्रोस्कोपी) के निरंतर निष्पादन और अनुकूलन के साथ-साथ हाल की तकनीकों (जैसे, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी, एक्स-रे माइक्रोटोमोग्राफी) का एक ही आवश्यक आधार है: सैद्धांतिक ज्ञान एक पद्धति के विकास को सक्षम करता है।

पौधे शरीर रचना विज्ञान और आकृति विज्ञान में मुख्य उपकरण छवि है। गलत धारणा के बावजूद कि इस तरह के विश्लेषण सरल टिप्पणियां हैं, व्यक्तिपरक व्याख्याओंको जगह देते हैं 2, इस क्षेत्र में छवियों का विश्लेषण और समझने के लिए लागू विधियों (उपकरण, विश्लेषण के प्रकार, पद्धतिगत प्रक्रियाओं), सेल घटकों, हिस्टोकेमिस्ट्री और पौधे के शरीर (ऊतक संगठन और कार्य, ऑन्टोजेनी, रूपात्मक अनुकूलन) के ज्ञान की आवश्यकता होती है। विभिन्न तरीकों से प्राप्त छवियों की व्याख्या करने से रूप और कार्य को सहसंबंधित किया जा सकता है, एक संरचना की रासायनिक संरचना को समझना, कर का वर्णन करने में पुष्टि करना, फाइटोपैथोजेन द्वारा संक्रमण को समझना और इस तरह के अन्य आकलन।

माइकोहेटरोट्रॉफिक (एमएच) पौधों (यानी, गैर-प्रकाश संश्लेषक पौधे जो माइकोराइजल कवक 4,5 से कार्बन प्राप्त करते हैं) पर शोध करते समय, उनके संरचनात्मक अनुकूलन के उल्लेखनीय पहलू, कवक द्वारा ऊतक उपनिवेशीकरण के पैटर्न, और भूमिगत अंगों की मॉर्फोएनाटॉमी उनकी विकास रणनीतियों और हाइप के साथ संबंधों को प्रबुद्ध कर सकती है, जो पोषक तत्वों का स्रोत हैं। एमएच पौधों के भूमिगत अंग आमतौर पर मिट्टी के कवक के साथ उनके सहयोग से संबंधित महत्वपूर्ण अनुकूलन दिखाते हैं, इसलिए इन शारीरिक और रूपात्मक जांच करना आवश्यक है6. एमएच प्रजातियों के हवाई अंगों को नजरअंदाज नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि एंडोफाइट्स इन ऊतकों में भी मौजूद हो सकते हैं, भले ही वे माइकोराइजल कवक (व्यक्तिगत टिप्पणियां, अभी तक प्रकाशित नहीं हुई हैं)।

अपने पूरे जीवन चक्र 7 के दौरान एमएच प्रजातियों के साथ माइकोराइजल कवक सहयोग की अच्छी तरह से स्थापित अनिवार्यताके अलावा, प्रत्येक ऑर्किड प्रजातियों, यहां तक कि ऑटोट्रॉफिक वाले, प्राकृतिक वातावरण में एक प्रारंभिक बाध्यकारी माइकोहेटेरोट्रोफिक चरण है। ऐसा इसलिए होता है क्योंकि ऑर्किड का भ्रूण उदासीन होता है और इसमें एंडोस्पर्म या कोटिलेडोन की कमी होती है, इस प्रकार फंगल भागीदारों 4,8 के पोषण संबंधी समर्थन के बिना प्राकृतिक वातावरण में खुद को विकसित करने और स्थापित करने में असमर्थ होता है। यह देखते हुए कि, सहजीवी अंकुरण प्रोटोकॉल को न केवल एमएच प्रजातियों पर लागू किया जा सकता है, बल्कि प्रकाश संश्लेषण ऑर्किड के लिए भी लागू किया जा सकता है, जिसका उद्देश्य अंकुरण और प्रोटोकॉर्म विकास में ऑर्किड-कवक विशिष्टता की जांच करना है, खतरे वाली प्रजातियों 9,10,11 के संरक्षण के लिए पहल में एक बेहद लागू पद्धति।

इस विधि असेंबली में, हम शारीरिक अध्ययन (धारा 1), सतह विश्लेषण और नमूना चयन (धारा 2), सेक्शनिंग विधियों (फ्रीहैंड: अनुभाग 3, माइक्रोटॉमी: धारा 4, क्रायोमाइक्रोटॉमी: धारा 5), धुंधला और बढ़ते (धारा 6), प्रतिदीप्ति और फंगल एंडोफाइट्स (धारा 7) के कंफोकल माइक्रोस्कोपी, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (धारा 8) के लिए एमएच पौधे के नमूनों को इकट्ठा करने, ठीक करने और संग्रहीत करने में शामिल महत्वपूर्ण चरणों का वर्णन करते हैं और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (धारा 9)। इसके अतिरिक्त, हम ऑर्किड बीज (एमएच और ऑटोट्रॉफिक, धारा 10) के लिए एक सहजीवी अंकुरण विधि का वर्णन करते हैं, क्योंकि पहले उल्लिखित इमेजिंग विधियों को अंकुरण प्रक्रिया में बीज, प्रोटोकॉर्म और रोपाई के कवक उपनिवेशीकरण का विश्लेषण करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: इमेजिंग विधियों का योजनाबद्ध सारांश। योजनाबद्ध प्रोटोकॉल चरणों के संकेत प्रदान करते हैं जिसमें वे विस्तृत हैं। संक्षिप्त नाम: जीएमए = ग्लाइकोल मेथैक्रिलेट, ओसीटी = इष्टतम काटने का तापमान यौगिक, एसईएम = स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

विस्तार से यहां वर्णित माइक्रोस्कोपी तकनीक (चित्रा 1) निम्नलिखित आवश्यक चरणों से पहले हैं: नमूने एकत्र करना, फिक्सिंग, निर्जलीकरण, एम्बेडिंग और सेक्शनिंग नमूने। चूंकि चरण चुने हुए तकनीक (ओं) के आधार पर चर (चित्रा 1) हैं, इसलिए आगे सोचना महत्वपूर्ण है, फिक्सेटिव तैयार करने और संग्रह साइट पर ले जाने के लिए, फिक्सिंग से पहले नमूने कैसे तैयार किए जाने चाहिए, निर्जलीकरण प्रक्रियाओं का उपयोग किया जाना चाहिए (अनुभाग 1), और विभिन्न एम्बेडिंग संभावनाएं और सेक्शनिंग विधियां (अनुभाग 4, 5, और 9)। चित्रा 1 नीचे वर्णित प्रत्येक माइक्रोस्कोपी तकनीक के लिए आवश्यक सभी चरणों को क्रमिक रूप से सारांशित करता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. नमूने एकत्र करना, फिक्सिंग करना और बनाए रखना

नोट: पूरी तरह से एमएच पौधे आमतौर पर अंधेरे जंगल अंडरस्टोरी12,13 में पाए जा सकते हैं, मुख्य रूप से आर्द्र और कूड़े-प्रचुर मात्रा में क्षेत्रों में, जबकि आंशिक रूप से एमएच पौधे अधिक खुले जंगलों12,13 में पाए जा सकते हैं। एमएच पौधों में आमतौर पर विभिन्न आकारों और आकारों में अच्छी तरह से विकसित भूमिगत अंग होते हैं।

  1. एमएच प्रजातियों को इकट्ठा करते समय, पौधे के आधार के आसपास की मिट्टी का पता लगाएं, भूमिगत अंगों को नुकसान न पहुंचाएं, और भूमिगत लोगों से हवाई अंगों को डिस्कनेक्ट करने से रोकने के लिए पौधों को जमीन से खींचने से बचें।
  2. इन संरचनाओं को नुकसान पहुंचाए बिना जड़ों, उपजी, प्रकंद और भंडारण अंगों जैसे भूमिगत अंगों की खोज करते समय बागवानी ट्रॉवेल का उपयोग करके हवाई संरचनाओं के चारों ओर सावधानीपूर्वक खुदाई करें।
  3. नाजुक संरचनाओं को संरक्षित करने के लिए मिट्टी के कणों को हटा दें, और नमूनों को ठीक करने से पहले शेष मिट्टी के कणों को कुल्ला करने के लिए नल के पानी से इन अंगों को नाजुक रूप से धो लें।
  4. पत्ती कूड़े से जुड़े एमएच पौधे अतिरिक्त ध्यान देने की मांग करते हैं; सावधानीपूर्वक अपने हाइप के माध्यम से विघटित सामग्री से जुड़े अंगों को इकट्ठा करें, इन अंगों को जुड़े संरचनाओं से खींचने से बचें, और उन्हें सावधानीपूर्वक इकट्ठा करें क्योंकि ये भाग अत्यधिक नाजुक हैं। इस तरह के कनेक्शन के साथ संरचनाओं को संरक्षित करें और विश्लेषण के लिए कूड़े को भी इकट्ठा करें।
  5. यदि इमेजिंग तकनीकों का उपयोग करके ताजा सामग्री का विश्लेषण करने का विकल्प चुनते हैं, तो पर्याप्त नमी के साथ बंद प्लास्टिक की थैलियों में नमूनों को बनाए रखें, पर्याप्त पानी वाष्पित हो रहा है और पौधे को मॉइस्चराइज कर रहा है, अत्यधिक पानी को नमूनों के संपर्क में आने से रोकता है। उन्हें तुरंत प्रयोगशाला में ले जाएं और उसी दिन नमूनों का विश्लेषण करें जिस दिन वे एकत्र किए गए थे, जबकि ध्यान देते हुए कि क्या उनका विश्लेषण करते समय नमूने अभी भी संरक्षित हैं।
  6. अच्छी तरह से सील कंटेनरों में संग्रह स्थल पर फिक्सेटिव ले जाएं। निम्नलिखित फिक्सेटिव में से किसी में प्रकाश माइक्रोस्कोपी (एलएम) और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) के संग्रह के तुरंत बाद नमूने ठीक करें: 10% तटस्थ बफर फॉर्मलिन (एनबीएफ14, तालिका 1) या कार्नोव्स्की का समाधान (संशोधित15, तालिका 2)। कार्नोव्स्की का समाधान 0.2 एम फॉस्फेट बफर15 के साथ तैयार किया जा सकता है, जिसके लिए नुस्खा तालिका 3 में वर्णित है।
  7. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) द्वारा विश्लेषण के लिए, 1-2 मिमी मोटाई के छोटे वर्गों में ग्लूटाराल्डिहाइड-सोडियम कैकोडाइलेट बफर (संशोधित16, तालिका 4) की एक बूंद के अंदर 4-3 मिमी की मोटाई वाले नमूनों को अनुभाग करें। बूंद के बाहर काटे गए किनारों को त्यागें। नमूनों की मात्रा से 10 गुना अधिक फिक्सेटिव की मात्रा के साथ अनुभागों को तुरंत एक संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें, क्योंकि यह एक योजक फिक्सेटिव है (यानी, इसके अणुओं को रासायनिक रूप से प्रोटीन में जोड़ा जाता है16).
    सावधानी: तीन वर्णित फिक्सेटिव अत्यधिक विषाक्त हैं। साँस लेने से बचें, खासकर क्षेत्र में उनके उपयोग के दौरान। दस्ताने का उपयोग करके एक धूआं हुड में सभी फिक्सेटिव तैयार करें। कैकोडाइलेट और एसिड का मिश्रण न करें, क्योंकि आर्सेनिक गैस का गठन किया जा सकताहै 16.
  8. यदि निश्चित नमूने फिक्सेटिव में तैरते हैं, तो यह पौधे के ऊतकों में गैस की उपस्थिति को इंगित करता है। हवा और अन्य गैसें फिक्सेटिव को पूरे नमूने में प्रवेश करने से रोकती हैं2. छोटे भागों में उन्हें पुन: नमूना देकर और एक वैक्यूम पंप (-300 से -400 इंचएचजी दबाव) का उपयोग करके ऊतकों से गैस निकालें जब तक कि सभी नमूने समाधान17 के नीचे डूब न जाएं। सावधान रहें क्योंकि पंप द्वारा लगाए गए अत्यधिक दबाव नमूनों को नुकसान पहुंचा सकते हैं।
  9. कार्नोव्स्की के समाधान या 10% एनबीएफ में कम से कम 48 घंटे के बाद, नमूनों को 0.2 एम पीबी (तालिका 3) में धो लें और उन्हें 10%, 30%, 50% और अंत में 70% इथेनॉल की श्रृंखला के साथ निर्जलित करें। नाजुक नमूनों के लिए, प्रत्येक एकाग्रता में 30 मिनट के लिए निर्जलीकरण; बड़े नमूनों के लिए, 1 घंटे या उससे अधिक समय तक निर्जलीकरण करें।
    नोट: एक 70% इथेनॉल समाधान नमूने भंडारण के लिए आदर्श माध्यम है। 70% इथेनॉल में नमूने वर्षों तक कमरे के तापमान पर संग्रहीत किए जा सकते हैं। फिक्सेटिव में लंबे समय तक पौधे की सामग्री को स्टोर न करें, क्योंकि फिक्सिंग एजेंटों को हटाना निर्धारण2 के बाद एक आवश्यक कदम है।
  10. पोस्टफिक्सेशन (चरण 9.1) पर आगे बढ़ने से पहले ग्लूटाराल्डिहाइड-कैकोडाइलेट में नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
10% तटस्थ बफर्ड फॉर्मलिन (एनबीएफ) 14
चरण 1 आसुत जल के 80 मिलीलीटर में 37-40% फॉर्मलाडेहाइड समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें
चरण 2 0.4 ग्राम सोडियम फॉस्फेट मोनोबेसिक मोनोहाइड्रेट जोड़ें (एनएएच2पीओ4 · एच2हे) समाधान के लिए
चरण 3 0.65 ग्राम सोडियम फॉस्फेट डिबेसिक, निर्जल जोड़ें (ना2एचपीओ4)
चरण 4 100 एमएल तक की मात्रा बनाते हैं

तालिका 1: 10% तटस्थ बफर फॉर्मलिन नुस्खा14.

कार्नोव्स्की का समाधान (संशोधित15)
चरण 1 60-70 डिग्री सेल्सियस पर आसुत जल के 20 मिलीलीटर में
चरण 2 पैराफॉर्मलडिहाइड के 0.8 ग्राम जोड़ें (4% डब्ल्यू / वी प्राप्त करने के लिए), सरगर्मी
चरण 3 40% एनएओएच की 1-4 बूंदें जोड़ें और समाधान स्पष्ट होने तक हलचल करें
चरण 4 इसे ठंडा करें और 0.2 एम फॉस्फेट बफर पीएच 7.2 के 30 मिलीलीटर जोड़ें (तालिका 3)
चरण 5 1% ग्लूटाराल्डिहाइड (अंतिम मात्रा: ~ 60 एमएल) प्राप्त करने के लिए 0.1 एम पीबी (पीएच 7.2) में 25% ग्लूटाराल्डिहाइड पतला करें
चरण 6 100 मिलीलीटर फिक्सेटिव बनाने तक चरण 4 में प्राप्त समाधान में 1% ग्लूटाराल्डिहाइड (चरण 5) जोड़ें

तालिका 2: कार्नोव्स्की का समाधान नुस्खा (संशोधित15)।

0.2 एम फॉस्फेट बफर (पीबी) पीएच 7.2
चरण 1 आसुत जल के 400 मिलीलीटर के लिए 14.196 ग्राम सोडियम फॉस्फेट डिबेसिक, निर्जल (एनए2एचपीओ 4) जोड़ें
चरण 2 13.8 ग्राम सोडियम फॉस्फेट मोनोबासिक मोनोहाइड्रेट जोड़ें (एनएएच2पीओ4 · एच2ओ)
चरण 3 समाधान स्पष्ट होने तक हलचल करें
चरण 4 आसुत जल के साथ 500 मिलीलीटर करने के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करें
चरण 5 7.2 करने के लिए पीएच समायोजित करें
चरण 6 0.1 एम पीबी के लिए, पतला 1: 1

तालिका 3: 0.2 एम फॉस्फेट बफर नुस्खा।

3% ग्लूटाराल्डिहाइड 0.2 एम सोडियम कैकोडाइलेट बफर (संशोधित16)
चरण 1 0.2 एम कैकोडाइलेट बफर: आसुत जल के 100 मिलीलीटर में 4.28 ग्राम सोडियम कैकोडाइलेट ट्राइहाइड्रेट जोड़ें
चरण 2 7.2 करने के लिए पीएच समायोजित करें
चरण 3 चरण 2 में समाधान के 25 मिलीलीटर में 25% ग्लूटाराल्डिहाइड के 12 एमएल जोड़ें (0.2 एम कैकोडाइलेट बफर पीएच 7.2)
चरण 4 आसुत जल के साथ 100 मिलीलीटर तक की मात्रा बनाएं

तालिका 4: 3% ग्लूटाराल्डिहाइड 0.2 एम सोडियम कैकोडाइलेट बफर नुस्खा (संशोधित16)।

2. निश्चित और गैर-निश्चित सामग्री में अंगों की सतह विश्लेषण

  1. अंगों में सतही हाइप का विश्लेषण करने के लिए, विशेष रूप से भूमिगत लोगों, और पत्ती कूड़े के संपर्क में आने वाले, विश्लेषण किए गए नमूनों के आधार पर 7.5x या उससे अधिक के आवर्धन पर एक विदारक माइक्रोस्कोप (स्टीरियोमाइक्रोस्कोप) में निश्चित या ताजा सामग्री का निरीक्षण करें।
    1. फिक्सेटिव, 70% इथेनॉल (यदि इसमें संग्रहीत), या ताजा सामग्री के मामले में नल के पानी में डूबे हुए नमूनों की कल्पना करें। विदारक माइक्रोस्कोप से प्रत्यक्ष प्रकाश को रोकें क्योंकि यह नमूनों को सूखा और नुकसान पहुंचा सकता है।
    2. नमूनों में रुचि के क्षेत्रों की खोज करें, सतही हाइपऔर राइजोमोर्फ द्वारा निर्देशित। उन नमूनों का चयन करें जिनमें सतही राइजोमोर्फ वाले क्षेत्र होते हैं क्योंकि इन्हें जड़ों और उपजी में कॉर्टिकल कोशिकाओं के भीतर पेलोटॉन और हाइप कॉइल की कल्पना करने के लिए खंडित किया जा सकता है।
    3. चयन के बाद, नमूने अभी तक तय नहीं कर रहे हैं, तो चरण 1.6 और 1.9 का पालन करें। यदि वांछित है, तो धारा 3 में वर्णित के रूप में फिक्सिंग के बिना एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर ताजा नमूने फोटोग्राफ।
    4. अंग सतहों, राइजोमोर्फ और अन्य संरचनाओं से छवियों को इकट्ठा करने के लिए स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के साथ युग्मित कैमरे का उपयोग करें। ऐसे मामलों में, सामग्री के साथ अच्छी तरह से विपरीत करने के लिए पर्याप्त पृष्ठभूमि रंग की व्यवस्था करें और यदि संभव हो, तो कम खुरदरी सतह (जैसे, कागज) के साथ पृष्ठभूमि सामग्री चुनें।

3. पौधे के अंगों के फ्रीहैंड अनुभाग

नोट: पौधे के अंगों के फ्रीहैंड अनुभाग चुनौतीपूर्ण हो सकते हैं, खासकर छोटी और पतली संरचनाओं के लिए। हालांकि, फंगल एंडोफाइट्स के साथ ऊतकों के ये खंड, कुछ मामलों में, पतले वर्गों की तुलना में हाइपहे और अन्य विशेषताओं को बेहतर ढंग से उजागर कर सकते हैं।

  1. एक तेज ब्लेड के साथ ताजा या निश्चित नमूने अनुभाग, उन्हें जितना संभव हो उतना पतला काटना और उन्हें तुरंत पानी (यदि ताजा) या 70% इथेनॉल (यदि तय किया गया हो) के साथ एक छोटे पेट्री डिश में रखना। उन्हें नुकसान पहुंचाए बिना वर्गों में हेरफेर करने के लिए एक छोटे से पेंटब्रश का उपयोग करें।
  2. अधिक चुनौतीपूर्ण सामग्रियों (यानी, छोटे, पतले, लचीले अंगों) को विभाजित करने की सुविधा के लिए, नमूने को एक संरचना में घेरें, उदाहरण के लिए, पॉलीस्टाइनिन या सेक्रोपिया पेटीओल। नमूना को समायोजित करने और नमूने का एक पतला खंड बनाने और पूरी तरह से समर्थन करने के लिए समर्थन को उकेरें।
  3. धारा 6 में वर्णित नमूनों को दाग और माउंट करें।

4. राल और सेक्शनिंग में पौधे के नमूनों को एम्बेड करना

  1. आगे 80%, 96%, और 100% इथेनॉल में 2x में 70% इथेनॉल में संग्रहीत नमूनों को निर्जलित करें, नमूनों के आकार और संरचना के आधार पर 30 मिनट से 2 घंटे के लिए।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार ग्लाइकोल मेथाक्रिलेट (जीएमए) राल किट का उपयोग करें। आगे के विचारों के लिए गेरिट्स और होरोबिन (1996)18 की जांच करें। तदनुसार घुसपैठ और एम्बेडिंग चरणों का पालन करें।
    सावधानी: जीएमए राल विषाक्त है, यह एलर्जी की प्रतिक्रिया और त्वचा, आंखों और श्लेष्म जलन पैदा कर सकता है। एक धूआं हुड में अभिकर्मकों का उपयोग करें और दस्ताने का उपयोग करें।
  3. नमूनों के आकार द्वारा चयनित एम्बेडिंग के लिए पॉलीथीन मोल्डिंग ट्रे का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, बड़े नमूनों के लिए 13 मिमी x 19 मिमी x 5 मिमी, छोटे लोगों के लिए 6 मिमी एक्स 8 मिमी एक्स 5 मिमी)। मोल्ड के अंदर वांछित नमूना अभिविन्यास पर ध्यान दें, और उन्मुख करने में मदद करने के लिए एक सुई का उपयोग करें।
  4. पोलीमराइजेशन के लिए छोड़ दें, अधिमानतः कमरे के तापमान पर, जब तक कि पूरी तरह से जम न जाए। सख्त प्रक्रिया में आमतौर पर कुछ घंटे लगते हैं, हालांकि अगले दिन ब्लॉक को अनमोल्ड करने की सिफारिश की जाती है। पोलीमराइजेशन के बाद, सावधानीपूर्वक राल ब्लॉक को मोल्ड्स से अलग करें और ब्लॉक घुमावदार से बचने के लिए जितनी जल्दी हो सके ब्लॉक संलग्न करने के लिए आगे बढ़ें।
  5. राल ब्लॉक के चेहरे को रेत दें जो संलग्न होगा, एक सपाट सतह बनाएगा। मध्यम चिपचिपाहट के तरल साइनोएक्रिलेट चिपकने वाला ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ एक लकड़ी के घनाभ (2 सेमी x 2 सेमी x 3 सेमी अनुशंसित) के लिए राल ब्लॉक को गोंद करें। सुनिश्चित करें कि सेक्शनिंग से समझौता करने से बचने के लिए राल पूरी तरह से जुड़ा हुआ है।
  6. नीचे वर्णित रोटरी माइक्रोटोम में सेक्शनिंग करें।
    सावधानी: माइक्रोटोम चाकू के ब्लेड बहुत तेज होते हैं और दुर्घटनाओं का कारण बन सकते हैं। सभी सुरक्षा उपायों का पालन करते हुए उन्हें संभालना सुनिश्चित करें। चाकू के पास आने से पहले (उदाहरण के लिए, ब्लॉक को बदलने के लिए, राल को नम करने के लिए), मोटे हैंडव्हील को लॉक करें और ब्लेड सुरक्षा कवर रखें। उचित मामलों में डिस्पोजेबल ब्लेड स्टोर करें। ब्लेड बदलते समय बेहद सावधान रहें।
    नोट: विभिन्न प्रकार के चाकू (जैसे, डिस्पोजेबल या फिक्स्ड; ग्लास या स्टील) का उपयोग जीएमए राल18 को खंडित करने के लिए किया जा सकता है। वर्गों की गुणवत्ता इस बात पर निर्भर करती है कि चाकू कितना तेज है। सुनिश्चित करें कि चाकू अच्छी तरह से जुड़ा हुआ है और हिल नहीं सकता है। डिस्पोजेबल चाकू को बेहतर सेक्शनिंग प्राप्त करने के लिए नियमित रूप से बदलने की आवश्यकता हो सकती है।
    1. लकड़ी के घनाभ को ब्लॉक धारक से दृढ़ता से संलग्न करें। अभिविन्यास शिकंजा का उपयोग करके सेक्शनिंग के अभिविन्यास को समायोजित करें और चाकू झुकाव का उपयोग करके चाकू का पर्याप्त कोण सुनिश्चित करें। अनुभागों की मोटाई का चयन करें; ट्रिमिंग के लिए एक मोटी सेटिंग और चयनित वर्गों के लिए एक पतली सेटिंग का उपयोग करें, क्योंकि जीएमए अनुभाग पतले होने पर ग्लास स्लाइड का अधिक उचित रूप से पालन करते हैं; पौधे के ऊतकों के लिए सुझाई गई मोटाई 5-8 μm है।
    2. शुरू करने से पहले, यदि आवश्यक हो, तो कमरे को ठंडा करें, क्योंकि उच्च तापमान वर्गों की गुणवत्ता को खराब करता है। सेक्शनिंग के लिए निम्नलिखित तैयार करें: आसुत जल, एक गर्म प्लेट, पेंटब्रश (कम से कम दो), ठीक बिंदु चिमटी, एक पाश्चर पिपेट, ग्लास स्लाइड, फिल्टर पेपर (या टिशू पेपर), और एक पेंसिल के साथ एक बीकर (खंडित किए जा रहे नमूनों की पहचान करने के लिए)।
    3. गर्म प्लेट को 50 डिग्री सेल्सियस तक समायोजित करें और उस पर बीकर रखें। गर्म प्लेट के क्षेत्र के आधार पर हीटिंग में अंतर पर ध्यान दें (आमतौर पर, मध्य क्षेत्र किनारों से अधिक गर्म होता है; बीच में पानी गर्म करें, अधिमानतः)।
    4. एक ग्लास स्लाइड उठाओ, इसे एक पेंसिल के साथ पहचानें, और स्लाइड सतह पर गर्म आसुत पानी पिपेट करें। यदि आवश्यक हो, तो पानी और कांच के बीच तनाव को तोड़ने के लिए एक समाधान (जैसे, डिटर्जेंट और पानी, या 70% इथेनॉल) का उपयोग करें, ताकि पूरी स्लाइड समान रूप से कवर हो। पर्याप्त अनुभाग पालन प्राप्त करने के लिए कुछ स्लाइड प्रकारों को 70% इथेनॉल के साथ पूर्व-साफ किया जाना चाहिए।
    5. चाकू ब्लेड की ओर राल ब्लॉक के चेहरे को धीरे-धीरे आगे बढ़ाकर शुरू करें। पहले ब्लॉक को आगे बढ़ाए बिना सेक्शनिंग की कोशिश न करें, अन्यथा उपकरण और ब्लॉक क्षतिग्रस्त हो सकते हैं। यदि आवश्यक हो, तो उच्च मोटाई (10 μm और ऊपर) का उपयोग करके ब्लॉक को ट्रिम करें।
    6. एक उपयुक्त अनुभाग के पास पहुंचते समय, हैंडव्हील के साथ एक फर्म एक तरफा आंदोलन करें, इसलिए अनुभाग एक बार में बनाया जाता है। राल की नमी पर नजर रखें। सेक्शनिंग के दौरान, नियमित रूप से कर्लिंग सेक्शन के साथ कोई समस्या होने पर आसुत जल में डूबे पेंटब्रश का उपयोग करके काटे जा रहे ब्लॉक के चेहरे को मॉइस्चराइज करें। एक टिशू पेपर के साथ अतिरिक्त पानी निकालें।
    7. ठीक बिंदु चिमटी की एक जोड़ी के साथ, स्लाइड पर पानी में प्राप्त अनुभाग रखें। पानी के संपर्क में आने पर, जीएमए राल फैलता है। यदि आवश्यक हो, तो धीरे-धीरे अनुभागों को प्रकट करने और फैलाने के लिए एक पेंटब्रश का उपयोग करें। ब्लेड को राल मलबे से लगातार मुक्त रखने के लिए एक और पेंटब्रश का उपयोग करें। ब्लेड को गीला करने से बचने के लिए पेंटब्रश के बीच स्विच न करें।
    8. स्लाइड में सभी वांछित वर्गों को कतारबद्ध करने के बाद, स्लाइड के निचले चेहरे को सुखाएं और इसे गर्म प्लेट के ऊपर रखें। एक फिल्टर पेपर (वैकल्पिक) के साथ धीरे-धीरे डबिंग करके स्लाइड के ऊपर से अतिरिक्त पानी निकालें। स्लाइड से पानी वाष्पित होने पर अनुभागों का पालन किया जाएगा। अत्यधिक गर्मी से क्षतिग्रस्त होने वाले वर्गों को रोकने के लिए स्लाइड्स को बहुत लंबा न छोड़ें।
    9. स्लाइड्स को धूल और सूरज से दूर स्लाइड बॉक्स में स्टोर करें, और धुंधला और अन्य प्रक्रियाओं के लिए उनका उपयोग करें। स्लाइड्स को कई वर्षों तक संग्रहीत किया जा सकता है।

5. ठंड संयंत्र के नमूने और क्रायोस्टैट के साथ सेक्शनिंग

नोट: क्रायोसेक्शनिंग जैविक ऊतक में आवश्यक विचार बर्फ क्रिस्टल गठन के कारण नुकसान को कम करना है जब नमूने ठंडे होते हैं। क्रायोप्रोटेक्शन आमतौर पर रासायनिक रूप से निष्क्रिय समाधान जैसे ग्लिसरॉल या सुक्रोज19,20 को संक्रमित करके किया जाता है।

  1. नमूना अनुभागीकरण से एक दिन पहले, निम्न चरणों का पालन करें।
    1. 0.1 एम पीबी के 200 एमएल प्राप्त करने के लिए आसुत जल के 100 मिलीलीटर में 0.2 एम पीबी (तालिका 3) के 100 एमएल पतला करें। 0.1 एम पीबी में 10%, 20% और 30% सुक्रोज समाधान तैयार करें (उदाहरण के लिए, 10% समाधान के लिए, बफर के 20 मिलीलीटर में 2 ग्राम सुक्रोज जोड़ें)।
    2. ताजा नमूनों के लिए, उन्हें 30 मिनट के लिए 0.1 एम पीबी में धो लें। एक फिक्सेटिव में नमूनों के लिए, उन्हें 30 मिनट के लिए फिक्सेटिव तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही बफर में धो लें। 70% इथेनॉल में नमूनों के लिए, उन्हें 50% और 30% इथेनॉल में हाइड्रेट करें और प्रत्येक समाधान में 1 घंटे के लिए 0.1 एम पीबी में धो लें।
    3. कमरे के तापमान पर 10% सुक्रोज में 2 घंटे, 20% सुक्रोज में 2 घंटे, और 30% सुक्रोज में 2 घंटे के लिए नमूने सेते हैं। बाद में, 4 डिग्री सेल्सियस पर 30% सुक्रोज में रात भर सेते हैं (या कम से कम 3 घंटे के लिए; अधिकतम समय 48 घंटे है)।
  2. सेक्शनिंग के दिन, 0.1 एम पीबी में 40% और 50% सुक्रोज तैयार करें; अग्रिम में 12 घंटे से अधिक सुक्रोज समाधान तैयार न करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर, प्रत्येक सुक्रोज एकाग्रता में 2 घंटे के लिए सेते हैं।
  3. एम्बेडिंग के लिए, छोटे सांचों में, ओसीटी यौगिक (इष्टतम काटने का तापमान माध्यम, नमूनों को एम्बेड करने और ठंडा करने के लिए उपयोग किया जाता है) की एक परत बनाएं और इसे फ्रीज करने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें। मोल्ड नियमित हिस्टोलॉजिकल मोल्ड हो सकते हैं, हालांकि ब्लॉक, पेपर या टिनफॉइल को अनमोल्ड करने की सुविधा के लिए एक फ्रेम और चिपकने वाला टेप के रूप में एक छोटे घनाभ का उपयोग करके बनाया जा सकता है।
  4. ओसीटी यौगिक की निचली परत मोल्डों में जमे हुए होने के बाद, क्रायोस्टैट कक्ष (सीए -27 डिग्री सेल्सियस) के अंदर काम करें। मोल्ड्स में 50% सुक्रोज में ऊष्मायन किए गए नमूनों को रखें, अभिविन्यास में जिसमें उन्हें खंडित किया जाएगा। एक घनाभ ब्लॉक का ऊपरी चेहरा आमतौर पर सेक्शनिंग का एक बेहतर चेहरा होता है। मोल्ड में चिह्नित करें जहां नमूने रखे जाते हैं, इसलिए ब्लॉक को आसानी से छंटनी की जा सकती है, और सही अभिविन्यास बनाए रखा जा सकता है।
  5. ओसीटी यौगिक में नमूनों को घेरें और नमूनों को छूने वाले किसी भी हवा के बुलबुले को फट दें। उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें। ब्लॉक पूरी तरह से जमे हुए के साथ, उन्हें क्रायोस्टैट चैंबर (सीए -27 डिग्री सेल्सियस) के अंदर रखें। ब्लॉक के अंदर नमूना स्थान को इंगित करने वाले चिह्नों का उपयोग करने और ध्यान देने से पहले प्रत्येक को अनमोल्ड करें।
  6. चूंकि ओसीटी यौगिक आसानी से ब्लेड के साथ काट दिया जाता है, इसलिए चक पर स्थित करने से पहले ब्लॉक को उचित रूप से ट्रिम करें। क्रायोस्टैट चक में कुछ ओसीटी यौगिक रखें और ब्लॉक को स्थिति दें ताकि ऊपरी चेहरा विभाजित हो। छोटे क्षेत्रों वाले चेहरे बेहतर अनुभाग प्रदान करते हैं। तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि ब्लॉक चक से अच्छी तरह से जुड़ा न हो और अनुभाग शुरू करने से पहले इसका परीक्षण करें।
  7. चक धारक में चक को मजबूती से रखें। अभिविन्यास शिकंजा का उपयोग करके सेक्शनिंग के अभिविन्यास को समायोजित करें। चाकू झुकाव का उपयोग करके चाकू के कोण को समायोजित करें। अनुभागों की मोटाई का चयन करें। नमूनों को सामान्य राल वर्गों की तुलना में मोटा किया जा सकता है। 5-20 μm के बीच की सीमा में अनुभाग सफलतापूर्वक प्राप्त किए जाते हैं, मोटे वर्गों को बनाना आसान होता है (कम कर्लिंग और संरचनाओं की कम क्षति)।
  8. चाकू ब्लेड की ओर जमे हुए ब्लॉक के चेहरे को आगे बढ़ाएं। ऐसा किए बिना सेक्शनिंग की कोशिश न करें, अन्यथा ब्लॉक को चक से अलग किया जा सकता है और क्षतिग्रस्त किया जा सकता है। यदि आवश्यक हो, तो उच्च मोटाई (10 μm और ऊपर) का उपयोग करके ब्लॉक को ट्रिम करें।
  9. एक उपयुक्त अनुभाग के पास पहुंचते समय, चाकू के ऊपर एंटी-रोल प्लेट (यानी, एक पारदर्शी प्लेट जो अनुभाग को बनाए रखेगी) रखें और हैंडव्हील के साथ एक फर्म एक तरफा आंदोलन करें, इसलिए अनुभाग एक बार में बनाया जाता है। कर्लिंग समस्याएं हो सकती हैं यदि एंटी-रोल प्लेट को समायोजित करने की आवश्यकता होती है (यह आमतौर पर ब्लेड के संदर्भ में समायोज्य होता है) या यदि ब्लेड में मलबा होता है। मलबे को हटाने के लिए ब्लेड को पेंटब्रश से लगातार साफ करें।
  10. विशेष स्लाइड्स का उपयोग करें ताकि अनुभाग आसानी से संलग्न हों, जैसे कि सिलेनाइज्ड स्लाइड्स (वाणिज्यिक या एसीटोन21 में 2% एमिनोअल्किलसिलेन के साथ तैयार), या आसुत जल21 या 0.2 % जिलेटिन में 500 μg / एमएल पॉली-एल-लाइसिन के साथ तैयार स्लाइड (विवरण21 देखें)। कमरे के तापमान पर स्लाइड बनाए रखें।
  11. अनुभाग को स्लाइड पर पालन करने के लिए, एंटी-रोल प्लेट उठाएं और तेजी से स्लाइड को अनुभाग को स्पर्श करें। चूंकि स्लाइड कमरे के तापमान पर है, अनुभाग तुरंत पिघल जाता है और स्लाइड का पालन करता है। स्लाइड के इलाज किए गए चेहरे को अनुभाग में बदलने के लिए ध्यान दें, जो चाकू के ऊपर या एंटी-रोल प्लेट के आंतरिक चेहरे पर रह सकता है। अनुभागों के कर्लिंग से बचने के लिए, प्लेट उठाते ही इस चरण को तेजी से करें और सावधान रहें कि अनुभाग को नष्ट न करें।
  12. स्लाइड को क्रायोस्टैट चैंबर (कमरे के तापमान पर) के बाहर छोड़ दें यदि इसमें नए वर्गों को जोड़ा जाना है। स्लाइड के लिए सभी वांछित वर्गों का पालन करने के बाद, इसे क्रायोस्टैट कक्ष के अंदर या फ्रीजर (-20 डिग्री सेल्सियस या उससे नीचे) में रखें। स्लाइड्स को आर्द्रता में उजागर न करें। उन्हें एक स्लाइड बॉक्स में रखें और एक पेंसिल के साथ स्लाइड्स की पहचान करना याद रखें।
    नोट: ओसीटी की स्लाइड और ब्लॉक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं, हालांकि बहुत लंबे समय तक नहीं। बेहतर परिणाम प्राप्त करने के लिए, कुछ दिनों के भीतर स्लाइड और ब्लॉक का उपयोग करें।

6. प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए धुंधला पौधे वर्गों और एंडोफाइट्स

नोट: पौधे वर्गों के लिए कई प्रकार के दाग का उपयोग किया जा सकता है। एंडोफाइटिक कवक और पौधे के ऊतकों को अलग-अलग दागना चुनौतीपूर्ण है। यद्यपि धुंधला प्रक्रिया नहीं है, कवक संरचनाओं को चिह्नित करने के लिए एक विधि धारा 7 (गेहूं के रोगाणु एग्लूटिनिन संयुग्म के साथ प्रतिदीप्ति) में प्रस्तुत की जाती है। फ्रीहैंड अनुभाग (धारा 3 में समझाया गया है), राल अनुभाग (धारा 4), और क्रायोसेक्शन (धारा 5) को दाग दिया जा सकता है, हालांकि फिनोल और अल्कोहल-आधारित दाग इन नमूनों के लिए चुनौतीपूर्ण हैं क्योंकि जीएमए राल और ओसीटी इन मामलों में स्लाइड का पालन खो देते हैं।

  1. एक का उपयोग करें या पौधे के नमूनों के लिए निम्नलिखित सामान्य धुंधला तरीकों को गठबंधन करें।
    1. टोलुइडीन ब्लू ओ 22,23, पौधे वर्गों के सामान्य धुंधला होने के लिए एक बेहद लागू विधि। प्रजातियों और ऊतक के प्रकारों के आधार पर 0.1 एम फॉस्फेट (पीएच 6.8) या 0.09 एम साइट्रेट बफर (पीएच 4.5-4.8) में 0.05% टोलुइडीन ब्लू ओ का समाधान तैयार करें। एक स्लाइड धुंधला जार का उपयोग कर या कुछ स्लाइड दाग रहे हैं, तो वर्गों के ऊपर कुछ बूंदें रखकर 2-10 मिनट के लिए जीएमए राल वर्गों सेते हैं। इनक्यूबेशन के बाद आसुत जल या बफर के साथ सावधानी से धो लें और स्लाइड को पानी से माउंट करें या चरण 6.3 में वर्णित स्थायी स्लाइड का उत्पादन करने के लिए उन्हें गर्म प्लेट पर सुखाएं।
    2. लुगोल अभिकर्मक2 स्टार्च की उपस्थिति को इंगित करता है। आसुत जल में 5% आयोडीन (आई2) और 10% पोटेशियम आयोडाइड (केआई) समाधान तैयार करें। स्लाइड के ऊपर कुछ बूंदें जोड़कर, 2 मिनट के लिए दाग अनुभाग, और फिर आसुत पानी से धो लें। यह हिस्टोकेमिकल परीक्षण आमतौर पर अस्थायी स्लाइड पर लागू होता है।
    3. सूडान III, IV, और काले बी 24,25 विभिन्न लिपिड के लिए दाग। 70% इथेनॉल में 0.3% सूडान (III, IV, या काले बी) का समाधान तैयार करें, इसे उबलने तक गर्म करें, और ठंडा होने दें। सतह पर तैरनेवाला का उपयोग करें, इसे फ़िल्टर करें, और एक बंद पेट्री डिश में 15-30 मिनट के लिए अनुभागों सेते हैं। 70% इथेनॉल और आसुत जल के साथ वर्गों को सावधानी से धो लें। स्लाइड्स को पानी के साथ माउंट करें (आमतौर पर केवल अस्थायी स्लाइड्स पर लागू होता है)।
      नोट: चूंकि सूडान एक अल्कोहल-आधारित डाई है, इसलिए यह फ्रीहैंड वर्गों के लिए अधिक उपयुक्त है। जीएमए राल अनुभाग धुंधला सावधानी से आचरण के रूप में वे आमतौर पर स्लाइड से अलग।
  2. अस्थायी स्लाइड के लिए, पानी या ग्लिसरीन में वर्गों को माउंट करें और बाद में निरीक्षण करें। कवरस्लिप को थोड़ी देर तक संरक्षित करने के लिए नेल पॉलिश के साथ सील करें।
  3. स्थायी स्लाइड के लिए, सिंथेटिक रेजिन के साथ वर्गों को माउंट करें (उदाहरण के लिए, तेजी से बढ़ते माध्यम, सामग्री की तालिका देखें)। बढ़ते माध्यम की कुछ बूंदें ड्रिप करें (यह कवरस्लिप को ओवरफ्लो कर सकता है), बुलबुले से बचने के लिए कवरस्लिप को सावधानी से रखें, और पूरी तरह से सूखने तक कवरस्लिप के खिलाफ स्लाइड को दबाने के लिए कपड़े के खूंटे का उपयोग करें। एक रेजर ब्लेड के साथ सूखे बढ़ते माध्यम की अधिकता निकालें।

7. प्रतिदीप्ति और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी में गेहूं के रोगाणु एग्लूटिनिन के लिए संयुग्मित फ्लोरोक्रोम का अनुप्रयोग

नोट: इस विधि को फ्रीहैंड अनुभागों (धारा 3 में समझाया गया), राल अनुभाग (धारा 4), और क्रायोसेक्शन (अनुभाग 5) पर लागू किया जा सकता है। कन्फोकल माइक्रोस्कोपी उद्देश्यों के लिए क्रायोसेक्शन पर्याप्त हो सकते हैं, क्योंकि राल वर्गों की तुलना में मोटे नमूने प्रदान किए जा सकते हैं, लेकिन फ्रीहैंड वाले जितने मोटे नहीं। गेहूं के रोगाणु एग्लूटिनिन (डब्ल्यूजीए, सामग्री की तालिका देखें) के लिए संयुग्मित एक फ्लोरोक्रोम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी26 में फंगल इमेजिंग पर लागू होता है। एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप आवश्यक नहीं है, हालांकि यह पौधे संरचनाओं की स्पष्ट त्रि-आयामी छवियां प्रदान कर सकताहै 27.

  1. एमएल डब्ल्यूजीए-फ्लोरोक्रोम संयुग्म का समाधान 0.1 एम पीबी28 (पीएच 7.2, चरण 5.1.1 और तालिका 3 की जांच करें) में तैयार करें। 0.1 एम पीबी (पीएच 7.2) में 1% कैल्कोफ्लोर व्हाइट का समाधान तैयार करें। इन समाधानों की थोड़ी मात्रा तैयार करें, क्योंकि अनुभाग सीधे उनके साथ ऊष्मायन किए जाते हैं।
  2. डब्ल्यूजीए-फ्लोरोक्रोम संयुग्म समाधान29 में 30 मिनट के लिए ग्लास स्लाइड में वर्गों सेते हैं, वर्गों को कवर करने के लिए पर्याप्त मात्रा का उपयोग करते हुए, फिर 0.1 एम पीबी में धो लें।
  3. एक बढ़ते माध्यम के रूप में पर्याप्त मात्रा का उपयोग करते हुए, कैल्कोफ्लोर समाधान में वर्गों सेते हैं। समाधान अवलोकन अवधि के दौरान बनाए रखा जा सकता है।
  4. स्लाइड्स पर कवरलिप्स डालें और निम्नलिखित फिल्टर का उपयोग करके एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप या प्रतिदीप्ति प्रकाश माइक्रोस्कोप में निरीक्षण करें: टीसी / जीएफपी (उत्तेजना: 470-440, उत्सर्जन: 525-550, सामग्री की तालिका में डब्ल्यूजीए-फ्लोरोक्रोम के लिए - इस फिल्टर29 के तहत फंगल सेल दीवार फ्लोरोसिस हरा) और डीएपीआई (उत्तेजना: 358, उत्सर्जन: 463, कैल्कोफ्लोर व्हाइट के लिए)
    नोट: तीन आयामी छवियों को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप27 में जेड-श्रृंखला फ़ंक्शन का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है।

8. पौधे के अंगों की इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी को स्कैन करना

  1. नमूने ठीक करने, निर्जलीकरण करने और 70% इथेनॉल (धारा 1) में भंडारण करने के बाद, एक संभावना एसईएम विश्लेषण के लिए किसी भी वांछित सतह को उजागर करने के लिए नमूनों को काटना है, यदि आवश्यक हो (उदाहरण के लिए, आंतरिक ऊतक, अंडाशय संरचना)। एक तेज और नए रेजर ब्लेड का उपयोग करें और एसईएम में इन क्षेत्रों की क्षतिग्रस्त उपस्थिति से परहेज करते हुए, एक तरफा आंदोलन के साथ कटौती करें। यदि आवश्यक हो, तो नमूनों का चयन करने के लिए एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करें और नमूना आकार निर्धारित करने के लिए धातु स्टब्स क्षेत्र पर विचार करें।
  2. इथेनॉलिक श्रृंखला में एसईएम के लिए आगे निर्जलीकरण नमूने: पूर्ण एथिल अल्कोहल (≥99.8%) में 80%, 96%, और 2 एक्स। प्रत्येक एकाग्रता में 30 मिनट के लिए छोटे और नाजुक नमूने बनाए रखें और 1 घंटे के लिए बड़े और सघन नमूने।
  3. अगले चरणों के लिए नमूनों को व्यवस्थित करने के लिए टिशू पेपर का उपयोग करके छोटे लिफाफे मोड़ो, बड़े नमूनों को लिफाफे के बिना संभाला जा सकता है। एक पत्र या एक संख्या लिखकर एक पेंसिल के साथ लिफाफे की पहचान करें, और प्रत्येक में सभी नमूनों का एक लॉग रखें। नमूनों को निरपेक्ष इथेनॉल में रखें, हालांकि लंबे समय तक नहीं, और जितनी जल्दी हो सके चरण 8.4 पर आगे बढ़ें।
  4. क्रिटिकल-पॉइंट (सीपी) सुखाने के लिए आगे बढ़ें। मानक संचालन प्रक्रियाओं के अनुसार एक सीपी ड्रायर संचालित करें। एक दबाव कक्ष में निरपेक्ष इथेनॉल (मध्यवर्ती तरल पदार्थ) में नमूने रखें। सीओ2 महत्वपूर्ण बिंदु (31 डिग्री सेल्सियस, 7.3 x 106 पीए) पर मध्यवर्ती तरल पदार्थ संक्रमण द्रव (तरल कार्बन डाइऑक्साइड) में घुल जाता है, और नमूने सूख जाते हैं31।
  5. सीपी सुखाने के बाद, जितनी जल्दी हो सके नमूनों को एक निर्जलीकरण कंटेनर में स्टोर करें, उदाहरण के लिए, सिलिका जेल युक्त एक सीलबंद फ्लास्क। वायुमंडलीय आर्द्रता नमूनों को नष्ट कर सकती है यदि पुन: अवशोषित31.
  6. नमूनों को माउंट करने के लिए धातु स्टब्स का उपयोग करें। बढ़ते से पहले, स्टब्स में हेरफेर करने के लिए दस्ताने डालें, किसी भी वसा को खत्म करने के लिए उन्हें 5 मिनट के लिए एसीटोन में विसर्जित करें, और उन्हें सूखने दें। स्टब पर नमूनों को ठीक करने के लिए एक प्रवाहकीय डबल-पक्षीय कार्बन चिपकने वाला टेप का उपयोग करें, और स्थिति नमूनों की मदद करने के लिए एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करें, यह ध्यान में रखते हुए कि ऊपर से दृष्टि एसईएम छवियों में एकमात्र संभावित परिप्रेक्ष्य है।
  7. ठीक बिंदु चिमटी के साथ नमूनों में हेरफेर करें, सावधान रहें क्योंकि चिमटी द्वारा छुआ गया नमूना भाग आमतौर पर क्षतिग्रस्त हो जाता है, इसलिए ब्याज के क्षेत्रों (जैसे, टेप के संपर्क में आने वाले क्षेत्रों) से दूर स्थित भागों को छूने का प्रयास करें। सिलिका जेल के साथ एक मुहरबंद पेट्री डिश में नमूनों के साथ स्टब्स बनाए रखें। जितनी जल्दी हो सके चरण 8.8 पर आगे बढ़ें।
  8. एक निष्क्रिय गैस के कम दबाव वाले वातावरण में नमूनों की सतह पर धातु की एक परत, आमतौर पर सोना या प्लैटिनम जमा करने के लिए एक स्पटर कोटर का उपयोग करें, अक्सर आर्गन31। स्पटर कोटर का उपयोग करते समय मानक संचालन प्रक्रियाओं का पालन करें। कोटिंग मोटाई नमूनों की स्थलाकृति पर निर्भर करती है, आमतौर पर 15-40 एनएम32 के बीच।
  9. सिलिका जेल के साथ एक मुहरबंद पेट्री डिश में लेपित स्टब्स को बनाए रखें, और बशर्ते कि सिलिका जेल आर्द्रता बनाए रख रहा हो, नमूनों को हफ्तों तक इस तरह से संग्रहीत किया जा सकता है। नमूनों का विश्लेषण करने के लिए एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। रिक्तिका में नमूने इलेक्ट्रॉनों के एक बीम द्वारा मारा जाता है, और इस तरह की बातचीत से संकेतों के उत्सर्जन को छवियों31 के रूप में व्याख्या की जाती है। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के संचालन के बारे में विवरण के लिए, जेफरी और रीड (1991)31 और बोज़ोला और रसेल (1999)32 पढ़ें।
  10. स्टब्स का पुन: उपयोग करने के लिए, चिपकने वाला टेप खींचें और उन्हें तार ऊन के साथ साफ़ करें। नल के पानी में धोएं, पूर्ण इथेनॉल में विसर्जित करें, और उन्हें पर्याप्त रूप से सुखाएं, घटक धातु के ऑक्सीकरण को रोकें।

9. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी

  1. ग्लूटाराल्डिहाइड-कैकोडाइलेट बफर के साथ उपसर्ग नमूने जैसा कि चरण 1.7 और 1.10 में समझाया गया है। उपसर्ग के 12-24 घंटे के बाद, 10 मिनट के लिए 0.2 एम कैकोडाइलेट बफर (पीएच 7.25) में नमूने 3एक्स धो लें। कमरे के तापमान पर, अंधेरे में 12 घंटे के लिए, 0.2 एम कैकोडाइलेट बफर में 1% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड (ओएसओ4) के साथ पोस्टफिक्सेशन करें। 5 मिनट के लिए आसुत जल के साथ 3x धो लें।
    सावधानी: कैकोडाइलेट और ऑस्मियम टेट्रोक्साइड अत्यधिक विषाक्त हैं और इन्हें साँस नहीं लेना चाहिए। संबंधित सुरक्षा डेटा शीट का पालन करते हुए, उन्हें धूआं हुड में उपयोग करें।
  2. 30%, 50%, 70%, और 96% इथेनॉल के साथ नमूनों को निर्जलित करें, प्रत्येक एकाग्रता में 2x, 10 मिनट के लिए। फिर, पूर्ण शराब में 3x निर्जलित, हर बार 15 मिनट के लिए।
  3. हाइड्रोफिलिक ऐक्रेलिक रेजिन में नमूनों में घुसपैठ करें ( सामग्री की तालिका देखें), एक बार 1: 1 राल + पूर्ण इथेनॉल और 8-12 घंटे के लिए शुद्ध राल के साथ 3x। पूरी तरह से जमने तक 60 डिग्री सेल्सियस पर जिलेटिन कैप्सूल में पोलीमराइजेशन का संचालन करें (12 घंटे अधिकतम17)।
  4. राल ब्लॉक के अंदर नमूनों के अभिविन्यास का बारीकी से मूल्यांकन करें; ब्लॉक के शीर्ष भाग को एक रेजर ब्लेड के साथ काटें, एक पिरामिड आकार बनाते हैं जो सेक्शनिंग क्षेत्र में नमूने को केंद्रित करता है। हीरे के चाकू के साथ अल्ट्रामाइक्रोटोम में सेमीथिन सेक्शन (250-500 एनएम) 33 प्राप्त करें और पानी की कुछ बूंदों में ग्लास स्लाइड पर रखें।
  5. 60 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट पर स्लाइड रखें। चरण 6.1.1 के रूप में टोलुइडीन नीले ओ के साथ वर्गों को दाग दें और दाग को पूरी तरह से सूखने दें। नल के पानी से सावधानी से धो लें। चार चतुर्थांश ड्राइंग और विश्लेषण के लिए सबसे उपयुक्त चतुर्थांश का चयन करके प्राप्त अनुभाग का मूल्यांकन करें।
  6. ब्लॉक को ट्रिम करें ताकि पिरामिड आकार ब्लॉक के ऊपरी चेहरे पर चुने हुए चतुर्थांश को केंद्रित करे। अल्ट्राथिन वर्गों (50-100 एनएम) 33,34 का उत्पादन करें। वर्गों के हस्तक्षेप रंग के अनुसार मोटाई का मूल्यांकन किया जाता है: लगभग 70 एनएम वाले खंड चांदी-सोना दिखाई देते हैं, लगभग 100 एनएम के साथ सोना दिखाई देते हैं, और लगभग 200 एनएम के साथ नीला34 दिखाई देता है।
  7. तांबे के ग्रिड का उपयोग करके पानी से अल्ट्राथिन वर्गों को इकट्ठा करें और नीचे वर्णित के रूप में यूरेनियल एसीटेट और लीड साइट्रेट के साथ विपरीत धुंधला विधि पर आगे बढ़ें।
    1. एक लीड साइट्रेट समाधान (तालिका 5) तैयार करें और प्रत्येक में 1 मिलीलीटर समाधान के साथ माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में अंतिम समाधान को फ्रीज करें, केवल उपयोग से ठीक पहले विगलन करें।
    2. एक यूरेनियल एसीटेट समाधान तैयार करें: हाल ही में उबले हुए और ठंडा आसुत जल के25 मिलीलीटर में 0.625 ग्राम यूरेनियल एसीटेट [यूओ 2 (सीएच3सीओओ)2] भंग करें। फ्रीजर में एक अंधेरे फ्लास्क में स्टोर करें।
      सावधानी: अगर निगला जाता है तो लीड नाइट्रेट विषाक्त होता है। 1 एन एनएओएच अत्यधिक संक्षारक है। यूरेनियल एसीटेट रेडियोधर्मी और विषाक्त है। इसे निगलना, साँस लेना या त्वचा के संपर्क में नहीं आना चाहिए।
    3. धुंधला होने पर, फिल्टर इकाइयों के साथ अलग-अलग 3 एमएल सिरिंज में दोनों तैयार अभिकर्मकों को रखें (0.22 μm छिद्र, सामग्री की तालिका देखें)। सीओ2 32 (चित्रा 2 देखें) के लिए एक जाल के रूप में किनारों पर एनएओएच छर्रों के साथ, एक सीलिंग थर्माप्लास्टिक फिल्म के साथ एक पेट्री डिश उल्टा बदल गया (सामग्री की तालिका देखें) और एक व्यापक पकवान के अंदर तैयार करें।
    4. पहली बूंद को त्यागें, और फिल्म पर यूरेनियल एसीटेट की एक बूंद और प्रत्येक ग्रिड के लिए आसुत जल की तीन बूंदें रखें। लेड साइट्रेट के साथ भी ऐसा ही करें और आसुत जल की तीन और बूंदें जोड़ें।
    5. 30 मिनट (चर समय) के लिए यूरेनियल में ग्रिड (अपारदर्शी पक्ष के साथ नीचे की ओर, जहां वर्गों रहे हैं) सेते हैं। आसुत जल बूंदों में 3x धो लें, शानदार पक्ष पर फिल्टर पेपर के साथ हर बार धीरे-धीरे ग्रिड को सुखाएं। लीड साइट्रेट ड्रॉप (30 मिनट) के साथ दोहराएं और इसे धो लें।
  8. कम से कम 4 घंटे के बाद, एक ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में ग्रिड का विश्लेषण करें। इस माइक्रोस्कोप में, इलेक्ट्रॉनों की एक किरण रिक्तिका में वर्गों से गुजरती है और छवि को फ्लोरोसेंट स्क्रीन पर प्रक्षेपित किया जाता है। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के संचालन के बारे में विवरण के लिए, बोज़ोला और रसेल (1999)32 पढ़ें।
लीड साइट्रेट समाधान (टीईएम विपरीत धुंधला के लिए)
चरण 1 टिनफ़ॉइल के साथ एक बीकर को घेरें
चरण 2 हाल ही में उबले हुए और ठंडे आसुत जल के 6 मिलीलीटर में 0.266 ग्राम लीड नाइट्रेट [पीबी (एनओ3)2] भंग करें
चरण 3 2 मिनट के लिए आंदोलन
चरण 4 0.352 ग्राम ट्राइसोडियम साइट्रेट जोड़ें [ना3 (सी6एच5ओ7).2 एच2ओ] (समाधान को दूधिया उपस्थिति प्राप्त करनी चाहिए)
चरण 5 15 मिनट के लिए आंदोलन, टिनफॉइल के साथ बीकर सील और एक 10 मिलीलीटर बीकर के लिए समाधान हस्तांतरण
चरण 6 1 एन एनएओएच के 1.6 एमएल और आसुत जल के 2.4 एमएल जोड़ें (समाधान पारदर्शी होना चाहिए)
चरण 7 यदि आवश्यक हो, तो पीएच को 12 के करीब समायोजित करें

तालिका 5: लीड साइट्रेट समाधान नुस्खा।

Figure 2
चित्रा 2: लीड साइट्रेट और यूरेनियल एसीटेट समाधानों के साथ कंट्रास्ट धुंधला योजना( ए) पेट्री डिश तैयार करें, थर्माप्लास्टिक फिल्म के साथ एक उल्टा (केंद्र में) बदल गया ताकि बूंदों को इसके ऊपर रखा जा सके, एक व्यापक के अंदर। एनएओएच छर्रों केंद्रीय पकवान के आसपास के स्थान हैं। (बी) यूरेनिल एसीटेट बूंदों को अक्षर यू के साथ हलकों में रखा जाता है, और एल डीडब्ल्यू चिह्नित हलकों में सीसा साइट्रेट बूंदें आसुत जल की बूंदों को इंगित करती हैं। ग्रिड को कॉलम में क्रमिक रूप से दाग दिया जाता है, इसलिए पांच ग्रिड को एक साथ दाग दिया जा सकता है जैसा कि प्रतिनिधित्व किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

10. ऑर्किड के बीजों का सहजीवी अंकुरण

  1. सुनिश्चित करें कि बीज के सहजीवी अंकुरण में उपयोग किए जाने वाले समाधान और सभी सामग्री संदूषण से बचने के लिए बाँझ हैं। 121 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए उन्हें ऑटोक्लेविंग करके शुरू करें। सहजीवी अंकुरण चरणों चित्रा 3 में संक्षेप में प्रस्तुत कर रहे हैं।
  2. फलों और बीजों की कठोरता और मोटाई पर विचार करते हुए फलों और बीजों को फलों के लिए 10-15 मिनट और बीजों के लिए 7-10 मिनट के लिए 2% सक्रिय क्लोरीन युक्त सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान में डुबोकर सतही रूप से कीटाणुरहितकरें। स्लिम और नाजुक बीज को 1: 1 पतला सोडियम हाइपोक्लोराइट समाधान में डुबोया जा सकता है। बाद में, हाइपोक्लोराइट समाधान को हटाने के लिए आटोक्लेव आसुत जल में 3x धो लें।
  3. सेरिग्राफिक कपड़े में छानकर बीजों को पुनः प्राप्त करें और अंकुरण परीक्षण (अधिमानतः) के साथ आगे बढ़ने के लिए बीज का उपयोग करें। यदि आवश्यक हो, तो उन्हें सिलिका जेल के साथ ग्लास फ्लास्क के अंदर फिल्टर पेपर लिफाफे में स्टोर करें, 4 डिग्री सेल्सियस पर, फ्लास्क को बंद करें और उन्हें क्लिंग फिल्म के साथ सील करें। धोने की प्रक्रिया की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए अंतिम धोने से आलू डेक्सट्रोज अगर (पीडीए, 39 ग्राम / एल) में पानी की कुछ बूंदों को स्थानांतरित करें।
  4. संस्कृति माध्यम में बीज बोने से पहले, टेट्राज़ोलियम परीक्षण (वैकल्पिक) के माध्यम से उनकी व्यवहार्यता का मूल्यांकन करें जैसा कि35 से नीचे वर्णित है।
    1. प्रकाश में कमरे के तापमान (सीए 25 डिग्री सेल्सियस) पर 24 घंटे के लिए, आसुत जल में 10% सुक्रोज के 1 एमएल के साथ एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में लगभग 10 मिलीग्राम बीज सेते हैं।
    2. एक माइक्रोपिपेट के साथ सुक्रोज समाधान निकालें और आसुत जल में 1% टेट्राज़ोलियम समाधान (ट्राइफेनिल्टेट्राज़ोलियम क्लोराइड) का 1 मिलीलीटर जोड़ें। अंधेरे में 24 घंटे के लिए एक थर्मोब्लॉक में 40 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    3. एक माइक्रोपिपेट के साथ टेट्राज़ोलियम समाधान निकालें और आसुत जल 2x के साथ या समाधान हटाए जाने तक बीज धो लें। सभी तरल पदार्थों को हटा दें। यदि आवश्यक हो, तो विश्लेषण करने से पहले बीज को फ्रीजर में एक सप्ताह तक (चरण 10.3 के रूप में) संग्रहीत किया जा सकता है।
    4. आसुत जल में बीजों को पुन: निलंबित करें और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत उनका विश्लेषण करें। व्यवहार्य बीज हल्के से गहरे लाल रंग को प्राप्त करते हैं, जबकि गैर-व्यवहार्य बीज अपने प्राकृतिक रंग को बनाए रखते हैं।
  5. ऑर्किड बीज के सहजीवी अंकुरण के लिए निम्नलिखित अनुकूलित9 प्रोटोकॉल करें।
    1. दलिया अगर (ओएमए) संस्कृति माध्यम (2.5 ग्राम / एल जई के गुच्छे और 7 ग्राम / एल अगर, पीएच 6) के साथ पेट्री व्यंजनों में रखे गए आटोक्लेव फिल्टर पेपर डिस्क (व्यास में 1-2 सेमी) पर बीज सेते हैं।
    2. पेट्री डिश के केंद्र में, अंकुरण प्रक्रिया के लिए चुने हुए पृथक कवक से माइसेलियम युक्त संस्कृति माध्यम (सीए 1 सेमी2) के एक टुकड़े को टीका लगाएं। चिपकने वाली फिल्म के साथ पेट्री व्यंजनों को सील करें और उन्हें लगभग 25 डिग्री सेल्सियस या कमरे के तापमान पर अंधेरे में सेते हैं, क्योंकि यह कवक विकास के लिए अधिक पर्याप्त है।
    3. अंकुरण परीक्षण के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में बीज के साथ और कवक टीकाकरण के बिना कुछ व्यंजन तैयार करें।
  6. मात्रात्मक और गुणात्मक डेटा एकत्र करके और प्रोटोकॉर्म और रोपाई की तस्वीर खींचकर अंकुरण परिणामों का साप्ताहिक विश्लेषण करें। अंकुरण के अधिक सटीक मूल्यांकन के लिए स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके बीज और प्रोटोकॉर्म का अवलोकन किया जाना चाहिए। नीचे से आने वाले प्रकाश स्रोत का उपयोग करें, क्योंकि यह अधिक विपरीत की अनुमति देता है, जिससे प्रोटोकॉर्म से फंगल मायसेलियम को अधिक आसानी से भेदभाव करना संभव हो जाता है।
    1. विभिन्न विकास चरणों में नमूने इकट्ठा करें और शारीरिक विश्लेषण (धारा 1) के लिए तय करें। अंकुरण के दौरान बीज, प्रोटोकॉर्म और रोपाई में फंगल एंडोफाइट्स की जांच करने के लिए पहले वर्णित सभी छवि विश्लेषण लागू करें (प्रकाश माइक्रोस्कोपी - अनुभाग 4, 5, और 6; कंफोकल और प्रतिदीप्ति - धारा 7; एसईएम और टीईएम - धारा 8 और 9)।
    2. तालिका 6 के अनुसार चरणों के वर्गीकरण के बाद मात्रात्मक परिणाम उत्पन्न करें। चरणमाइकोहेटेरोट्रोफिक ऑर्किड से बीज के सामान्य विकास का वर्णन करते हैं। प्रत्येक मनाया चरण की प्रारंभिक तिथियों के साथ डेटा साप्ताहिक और तालिका एकत्र करें।
    3. इसके अतिरिक्त, अंकुरण प्रतिशत और दर का अनुमान लगाते हुए मात्रात्मक डेटा एकत्र करें। कम से कम 100 बीजों की गिनती करें या गिनती खेतोंको परिभाषित करें 35। पेट्री डिश प्रति तीन या अधिक गिनती क्षेत्रों का सीमांकन करें, जिसमें एक मानकीकृत क्षेत्र के साथ निश्चित क्षेत्र शामिल हैं, और साप्ताहिक मूल्यांकन करें। वृद्धि सूचकांक (जीआई) समीकरण के अनुसार एकत्र किए गए डेटा की गणना करें:
      Equation 1
      जहां एन0 चरण 0 में गिने गए बीजों की संख्या है, एन1 चरण 1 को संदर्भित करता है, और यह चरण 6 (एन 6 के रूप में पंजीकृत)36 तक अनुसरण करता है।

Figure 3
चित्रा 3: बीज पद्धति के सहजीवी अंकुरण का योजनाबद्ध सारांश। योजनाबद्धप्रोटोकॉल में विस्तृत चरणों के संकेत प्रदान करते हैं। संक्षिप्त नाम: ओएमए = दलिया अगर, पीडीए = आलू डेक्सट्रोज अगर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अंकुरण की अवस्था वर्णन
0 अंकुरण नहीं
1 भ्रूण की सूजन
2 टेस्टा का टूटना
3 शोषक बाल विकसित होते हैं
4 स्टेम प्रक्षेपण विकसित होता है
5 तराजू (ब्रैक्ट्स) की रक्षा करना विकसित होता है
6 पहली जड़ें विकसित होती हैं

तालिका 6: अंकुरण परीक्षणों के आवधिक विश्लेषण के लिए लागू प्रोटोकॉर्म विकास चरणों का विवरण। ओटेरो एट अल 36 में वर्णित चरणों से संशोधित।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

पौधे के ऊतकों को ठीक करने के आवश्यक चरणों के बाद सेलुलर घटकों और ऊतकों के आकारिकी, मात्रा और स्थानिक संगठन पर विचार करते हुए जीवित अवस्था के समान सेलुलर संरचनाएं उत्पन्न होतीहैं 16. रासायनिक निर्धारण (चित्रा 4) के बाद नमूनों में ऐसे लक्षणों का निरीक्षण करें। चित्रा 4सी-एफ प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत पर्याप्त रूप से निश्चित नमूनों का प्रतिनिधित्व करता है। वर्णित निर्धारण प्रक्रियाओं के बाद और नमूने संरचना के साथ परिचित प्राप्त करने से निर्धारण सफलता का विश्लेषण करने में मदद मिलती है।

Figure 4
चित्रा 4: सतही विश्लेषण और एमएच ऑर्किड वुल्शलेगेलिया एफिला (एसडब्ल्यू) आरसीएचबीएफ (ए और बी) राइज़ोमोर्फ्स की फिलिफॉर्म जड़ों से वर्गों फिलिफॉर्म रूट सतह में। (सी और डी) फ्रीहैंड अनुभाग दाग नहीं, कॉर्टिकल कोशिकाओं में पेलोटन को उजागर करते हैं। संक्षिप्त नाम: एन = एंडोडर्मिस, ईपी = एपिडर्मिस, सीटी = कॉर्टेक्स, हाइ = हाइफा, पीसी = पैरेन्काइमेटस सेल, पीई = फ्लोएम तत्व, पीएल = पेलोटन, आरएफएल = रूट (फिलिफॉर्म), आरएम = राइजोमोर्फ, वीसी = संवहनी सिलेंडर, एक्सई = जाइलम तत्व। स्केल सलाखों: ए = 2 मिमी; बी = 500 μm; सी और ई = 200 μm; डी = 100 μm; F = 20 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 4 सी, डी में ध्यान दें संरचनाओं की नियमितता और 10% एनबीएफ द्वारा तय किए गए नमूने के फ्रीहैंड अनुभाग में क्षतिग्रस्त क्षेत्रों की अनुपस्थिति। सेलुलर वॉल्यूम संरक्षित है, जीवित ऊतकों जैसा दिखता है। एक फ्रीहैंड-सेक्शन वाले ताजा अंग के साथ तुलना करना भी अच्छी तरह से निश्चित नमूनों को पहचानने में महत्वपूर्ण है। चित्रा 4 ई, एफ में, जीएमए राल में एम्बेडेड नमूनों से वर्गों और 10% एनबीएफ द्वारा तय टोलुइडीन नीले ओ के साथ दाग दिया गया था, विकृतियों या क्षतिग्रस्त क्षेत्रों के बिना सेल दीवारों की अच्छी तरह से संरक्षित संरचनाओं को नोट करें, एक फ्रीहैंड-सेक्शन किए गए नमूने (चित्रा 4 सी, डी) के समान लक्षण दिखा रहा है।

भूमिगत अंगों की सतह का विश्लेषण करते समय, राइजोमोर्फ्स की उपस्थिति आंतरिक ऊतकों को उपनिवेशित करने वाले हाइपहे को इंगित करती है। राइजोमोर्फ वनस्पति संरचनाएं हैं जो अत्यधिक विभेदित हाइपहे के समुच्चय से बनी होती हैं और कवक की कुछ प्रजातियों द्वारा बनाई जाती हैं, मुख्य रूप से सैप्रोट्रॉफिक जो लकड़ी37,38 को विघटित करती हैं। राइजोमोर्फ को आसानी से पहचाना जा सकता है, आमतौर पर अंधेरे जूते जैसी संरचनाओं37 के रूप में, चित्रा 4 ए, बी और चित्रा 7 डी में देखा जाता है। इन कवक संरचनाओं की खोज पौधों के अंगों में कवक उपनिवेशीकरण के पैटर्न का निरीक्षण करने के लिए नमूना चयन की सुविधा प्रदान करती है। चित्रा 4 सी, डी में, वर्गों को सतही राइजोमोर्फ वाले क्षेत्रों में प्राप्त किया गया था, जबकि चित्रा 4 ई में, इस तरह के मानदंड के चयन के बिना एक ही अंग का एक खंड दिखाया गया है। व्यक्तिगत हाइपहे को एक बोधगम्य अवलोकन के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत भी पहचाना जा सकता है।

Figure 5
चित्रा 5: उलियोर्चिस एसपी भंडारण संरचना के फ्रीहैंड वर्गों. (ए) एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत अनुभाग। (बी) एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत पेलोटन, अंग के प्रांतस्था के एक क्षेत्र में केंद्रित। (सी और डी) विश्लेषण किए गए पेलोटन के हाइप विवरण। संक्षिप्त नाम: हाय = हाइफा, पीसी = पैरेन्काइमेटस सेल, पीएल = पेलोटन, एस = सेप्टा। स्केल सलाखों: ए = 2 मिमी; बी = 500 μm; C और D = 50 μm। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

जैसा कि पहले बताया गया है, उद्देश्य के आधार पर पतली सेक्शनिंग की तुलना में फ्रीहैंड सेक्शनिंग को प्राथमिकता दी जा सकती है। फ्रीहैंड या मोटे वर्गों (10 μm मोटी से अधिक) प्राप्त करने के अन्य तरीके बेहतर तरीके से पेलोटन को उजागर कर सकते हैं और उपनिवेशीकरण के कवक पैटर्न की अधिक प्रतिनिधि छवियां प्रदान कर सकते हैं (उदाहरण के लिए, चित्रा 4 सी, डी और चित्रा 5 ए, बी)। फ्रीहैंड अनुभाग उच्च प्रवर्धन में हाइपहे विश्लेषण के लिए भी उपयुक्त हो सकते हैं, जैसा कि चित्रा 5 सी, डी में दिखाया गया है, हालांकि जीएमए राल में एम्बेडेड नमूने से चित्रा 7 ए के रूप में पतले वर्गों में विवरण बेहतर ढंग से प्राप्त किए जाते हैं। प्लांट सेल संरचनाओं के कुछ विवरण पतले वर्गों में पर्याप्त रूप से देखे जाते हैं, उदाहरण के लिए, चित्रा 4 एफ। माउंटिंग भी एक महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि बेहतर गुणवत्ता वाली छवियां बढ़ते माध्यम पर निर्भर कर सकती हैं। जीएमए राल स्लाइड को पानी या ग्लिसरीन में लगाया जा सकता है, हालांकि एक वाणिज्यिक बढ़ते माध्यम (सामग्री की तालिका देखें) अंतिम छवि में सुधार करेगा क्योंकि यह सेक्शनिंग प्रक्रिया से खामियों को भरता है। चित्रा 6 सी में, खामियों को जीएमए राल अनुभाग में देखा जा सकता है (तीरहेड्स), क्योंकि स्लाइड पानी के साथ घुड़सवार थी।

Figure 6
चित्रा 6: लूगोल समाधान के साथ दाग वाले डब्ल्यू एफिला की फ्यूसीफॉर्म जड़ों के अनुभाग( ए) फ्रीहैंड अनुभाग टोलुइडीन ब्लू ओ और लुगोल के साथ दाग दिया गया। (सी) जीएमए राल में पतला खंड लैक्टोफेनोल कपास नीले और लुगोल के साथ दाग, तीरहेड्स: ब्लेड अनियमितताओं से खामियां। (डी) फ्रीहैंड अनुभाग केवल लुगोल के साथ दाग। संक्षिप्त नाम: सीडब्ल्यू = सेल की दीवार, पीसी = पैरेन्काइमेटस सेल, एसजी = स्टार्च अनाज, वीसी = संवहनी सिलेंडर। स्केल सलाखों: ए = 200 μm; बी और सी = 100 μm; D = 50 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

टोलुइडीन ब्लू ओ (पतले वर्गों में अधिक पर्याप्त परिणाम) का उपयोग करने में मुख्य लाभ इस दाग के महत्वपूर्ण मेटाक्रोमैटिक गुण हैं, जिसका अर्थ है कि यह सेलुलर घटक के आधार पर विभिन्न रंगों को प्राप्त करता है जो इसे बांधता है और सेल की दीवारों की विभिन्न रचनाओं को अलग करने के लिए उपयुक्त पॉलीक्रोमैटिक दाग के रूप में कार्य करता है23. चित्रा 4 एफ में, जाइलम तत्वों में माध्यमिक सेल की दीवारों को हल्के रंग टोलुइडीन अधिग्रहण द्वारा आसानी से पहचाना जा सकता है। इस बीच फ्लोएम तत्व, केवल प्राथमिक सेल की दीवारों से बने होते हैं, उनकी पतली और गहरे रंग की कोशिका दीवारों द्वारा पहचाने जाते हैं। एक और महत्वपूर्ण दाग, मुख्य रूप से एमएच पौधों पर विचार करते हुए, लुगोल समाधान है, क्योंकि स्टार्च अनाज आसानी से पहचाने जाते हैं जब इसके द्वारा दाग दिया जाता है। अनुभागों को चित्रा 6 ए-डी में दर्शाया गया है: चित्रा 6 ए में टोलुइडीन ब्लू ओ और लुगोल के साथ दाग वाले फ्रीहैंड सेक्शन और चित्रा 6 बी में केवल टोलुइडीन ब्लू ओ; जीएमए राल में पतली धारा लैक्टोफिनोल कपास नीले और चित्रा 6 सी में लुगोल के साथ दाग; फ्रीहैंड अनुभाग केवल चित्रा 6 डी में लुगोल के साथ दाग।

फ्रीहैंड (चित्रा 7 सी), जीएमए राल (चित्रा 7 बी), या डब्ल्यूजीए-फ्लोरोक्रोम संयुग्म और कैल्कोफ्लोर व्हाइट के साथ ओसीटी वर्गों की इनक्यूबेशन क्रमशः फंगल सेल दीवार और पौधे सेल की दीवार की संरचनाओं को बढ़ा सकती है। यह हाइपहे की पुष्टि करने का एक महत्वपूर्ण तरीका है, क्योंकि डब्ल्यूजीए संयुग्म में कवक की कोशिका भित्ति में मौजूद एन-एसिटाइलग्लूकोसामिनिल अवशेषों की विशिष्टता है। चित्रा 7 ए टोलुइडीन नीले ओ के साथ दाग पुष्प स्टेम के एक खंड को दर्शाता है, जबकि चित्रा 7 बी एक ही अंग से है और पुष्टि करता है कि चित्रा 7 ए में देखी गई संरचनाएं हाइपहे हैं। ऑटोफ्लोरेसेंस द्वारा कलाकृतियों को जीएमए राल वर्गों (तीरहेड्स, चित्रा 7 बी) में देखा जा सकता है। ये कलाकृतियां आमतौर पर फ्लोरोक्रोम एकाग्रता से संबंधित होती हैं और बफर के साथ नमूनों को अधिक बार धोकर बचा जा सकता है। चित्रा 7 सी में, रूट का एक फ्रीहैंड अनुभाग दिखाया गया है, जिसमें आंतरिक और बाहरी हाइपहे हैं। एक ही अंग चित्रा 7 डी में एसईएम द्वारा देखा जा सकता है, इसकी सतह पर राइजोमोर्फ और व्यक्तिगत हाइप की बहुतायत के साथ। पर्याप्त एसईएम माइक्रोग्राफ में ग्रे के रंगों के बीच अच्छा विपरीत होता है, इसलिए त्रिआयामीता को देखा जा सकता है और अच्छी तरह से व्याख्या की जा सकती है। प्रतिनिधि छवियों का चयन करें और भ्रामक लोगों से बचें (आगे पढ़ना: इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ32 चुनने के लिए सुझाव)।

Figure 7
चित्रा 7: डब्ल्यू एफिला के पुष्प स्टेम और फिलिफॉर्म जड़ों से अनुभाग और एसईएम द्वारा फिलिफॉर्म रूट का सतही विश्लेषण ( ए ) जीएमए राल में पुष्प स्टेम का पतला खंड, टोलुइडीन नीले ओ के साथ दाग दिया गया ओ (बी) जीएमए राल में पुष्प स्टेम का पतला खंड डब्ल्यूजीए-फ्लोरोक्रोम संयुग्म + कैल्कोफ्लोर व्हाइट, एरोहेड्स के साथ ऊष्मायन: ऑटोफ्लोरेस द्वारा कलाकृतियां। (सी) डब्ल्यूजीए-फ्लोरोक्रोम संयुग्म + कैल्कोफ्लोर व्हाइट के साथ ऊष्मायन फिलिफॉर्म रूट का फ्रीहैंड अनुभाग। (डी) फिलिफॉर्म रूट सतह के इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ को स्कैन करना। संक्षिप्त नाम: सीडब्ल्यू = सेल की दीवार, हाइ = हाइप, पीसी = पैरेन्काइमेटस सेल, पीएल = पेलोटन, आरएफएल = रूट (फिलिफॉर्म), आरएम = राइजोमोर्फ। स्केल सलाखों: ए, सी, और डी = 100 μm; B = 20 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

अंगों के पूर्ण सतही कीटाणुशोधन (चित्रा 8 ए) की गारंटी देने के लिए, विभिन्न ऑर्किड प्रजातियों के फलों को 15 मिनट के लिए 2% सक्रिय क्लोरीन के साथ सोडियम हाइपोक्लोराइट में डुबोया गया था। वेनिला एसपी (चित्रा 8 ए) और पोगोनियोप्सिस शेंकी (चित्रा 9 बी-डी) से अधिक कठोर बीज कोट वाले बीज 10 मिनट (चित्रा 8 सी) के लिए एक ही समाधान में डूबे हुए थे, जबकि पतले लोग, लेलिया एसपी और कैटल्या एसपी से, 7 मिनट (चित्रा 9 ए) के लिए बनाए रखा गया था। अंतिम धोने से पानी के एक विभाज्य को स्थानांतरित करने से अंकुरण परीक्षणों में आगे बढ़ने से पहले कीटाणुशोधन प्रक्रिया की प्रभावशीलता की पुष्टि हुई, वर्णित विसर्जन की दोनों अवधियों पर विचार किया गया।

Figure 8
चित्र 8: वेनिला पैनिफोलिया के फलों और बीजों का सतही कीटाणुशोधन, एक प्रकाश संश्लेषक ऑर्किड प्रजाति। (ए) सक्रिय क्लोरीन के साथ सोडियम हाइपोक्लोराइट में फल विसर्जन। (बी) फल अनुदैर्ध्य रूप से खंडित। (सी) सोडियम हाइपोक्लोराइट में विसर्जन के बाद सेरिग्राफिक कपड़े का उपयोग करके फ़िल्टर किए गए बीज, सिलिका जेल में बोने या संग्रहीत होने के लिए तैयार हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

फिल्टर पेपर डिस्क पर बीज बोना आश्वासन देता है कि संस्कृति माध्यम से सतही पानी की परत के नीचे पूरी तरह से डूबे बिना अंकुरण और भ्रूण के विकास (चित्रा 9 ए-डी) के लिए पर्याप्त आर्द्रता और ऑक्सीजन है। कुछ फंगल आइसोलेट्स बीज पर सख्ती से बढ़ सकते हैं। कुचल जई के गुच्छे के 2 ग्राम / एल युक्त माध्यम कवक विकास का बेहतर नियंत्रण प्रदान करता है, बीज (चित्रा 9 बी) के दृश्य और विश्लेषण में सुधार करता है। 50-60 दिनों के पृथक टीकाकरण के बाद, माध्यम को नवीनीकृत किया जाना चाहिए, इसलिए कवक सक्रिय रहता है। यह बीज को एक ही सूत्रीकरण के एक नए ओएमए माध्यम में स्थानांतरित करके किया जा सकता है। बीजों को फिल्टर पेपर के साथ स्थानांतरित किया जा सकता है, प्रोटोकॉर्म की नाजुक संरचनाओं को नुकसान पहुंचाए बिना उनके स्थानांतरण की सुविधा प्रदान की जा सकती है, इसके अलावा उन्हें पहले से स्थापित गिनती क्षेत्रों से समझौता किए बिना मूल स्थिति में रखा जा सकता है।

Figure 9
चित्रा 9: सहजीवी अंकुरण का प्रोटोकॉल( ए) ओएमए माध्यम में फिल्टर पेपर पर व्यवस्थित बीज। (बी) बीज और एक टीका कवक (संभावित माइकोराइजल) के साथ पेट्री व्यंजन, सीए 21 दिनों के लिए ऊष्मायन किया जाता है। (सी और डी) विभिन्न कवक आइसोलेट्स के साथ सहजीवी अंकुरण व्यंजन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अधिकांश ऑर्किड प्रजातियां टीका लगाए गए कवक से संक्रमित होने के कुछ हफ्तों के भीतर या लगभग एक महीने से अधिक समय तक अंकुरित होती हैं (चित्रा 10)। बीज जो 3 महीने के भीतर अंकुरित नहीं होते हैं, वे शायद तब तक अंकुरित नहीं होंगे जब तक कि पद्धति को समायोजित नहीं किया जाता है। ऐसे मामलों में, बीज सुप्तावस्था या कवक पृथक माइकोराइजल नहीं होने जैसी संभावनाओं पर विचार करें। कुछ प्रजातियों को सुप्तावस्था को तोड़ने के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है, अन्य बस कुछ माइकोरिज़ल भागीदारों के लिए एक उच्च विशिष्टता प्रस्तुत करते हैं, जो सहजीवी अंकुरण परीक्षण (डेटा प्रकाशित नहीं) के लिए चुने गए लोगों से अलग है।

Figure 10
चित्रा 10: ओएमए माध्यम में पोगोनियोप्सिस शेंकी बीज, एक एक्लोरोफिलस और एमएच ऑर्किड, ओएमए माध्यम में कवक टीकाकरण39 अंकुरण को उत्तेजित करने में सक्षम है। (ए-डी) विभिन्न विकास चरणों में अंकुरित बीज और प्रोटोकॉर्म नहीं। संक्षिप्त नाम: एनजी = कोई अंकुरण नहीं, पीटी = प्रोटोकॉर्म, री = टूटा हुआ पूर्णांक, टीएस = टर्गिड बीज। स्केल सलाखों = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पृथक टीका लगाने के बाद पहले कुछ हफ्तों में, व्यंजनों का मूल्यांकन किया जाता है, क्योंकि हाइपहे बीज प्राप्त करने तक आमतौर पर 7-14 दिन लगते हैं। इस अवधि पर विचार करें, क्योंकि भ्रूण के विकास को पंजीकृत करना शुरू करना प्रबल है। अंकुरण चरणों के दौरान सूक्ष्म परिवर्तन केवल एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत पता लगाया जा सकता है, यह देखते हुए कि संरचनाएं इतनी सूक्ष्म हैं। कुछ प्रजातियों प्रोटोकॉर्म का विश्लेषण शोषक बालों की पहचान करने और हाइप के अलावा उन्हें बताने के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत किया जाना चाहिए। जीआई विश्लेषण अधिक प्रशंसनीय रूप से तुलनीय परिणाम प्रदान कर सकता है, एकत्र किए गए डेटा का प्रतिनिधित्व उत्पन्न कर सकता है और अधिक उन्नत अंकुरण चरणों के अनुरूप मूल्यों को अधिक वजन प्रदान कर सकता है। अंतिम मान शून्य और छह (या परिभाषित अंतिम चरण के अनुसार) के बीच हो सकते हैं। सहजीवी अंकुरण परीक्षण करते समय शोधकर्ता के प्रश्नों और मांगों के आधार पर जीआई विश्लेषण (जैसे, एनोवा, महत्व स्तर) पर विभिन्न सांख्यिकीय परीक्षण लागू किए जा सकते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

पादप शरीर रचना विज्ञान और आकृति विज्ञान में छवि विश्लेषण में उद्देश्यों को पूरा करने और माइकोहेटेरोट्रोफिक पौधों और उनके अपरिहार्य कवक एंडोफाइट्स के बीच संबंधों को समझने में मदद करने की एक महत्वपूर्ण क्षमता है, जैसा कि भूमिगत अंगों 6,40 के अध्ययन, बीज39 के सहजीवी अंकुरण के संरचनात्मक विश्लेषण, और हवाई और प्रजनन संरचनाओं41 . संरचनात्मक वनस्पति विज्ञान, पिछले दशक1 में पौधे विज्ञान के अन्य क्षेत्रों में अपनी प्रतिष्ठा और स्थान खोने के बावजूद, अभी भी सवालों के जवाब देने और विकास, पारिस्थितिकी, शरीर विज्ञान और विकास से संबंधित सस्ता माल और आवश्यक पौधों के लक्षणों का अनावरण करने में मदद करने में प्रमुख है। ये विधियां सामूहिक रूप से एमएच संयंत्र विश्लेषण के महत्वपूर्ण पहलुओं पर विचार करते हुए पौधों के संरचनात्मक अध्ययन के लिए एक आधार हैं।

एमएच पौधों को सावधानीपूर्वक इकट्ठा करने के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान की जाती है, अन्यथा अच्छी तरह से विकसित भूमिगत अंगक्षतिग्रस्त हो सकते हैं और पूरी तरह से एकत्र नहीं किए जा सकते हैं। भूमिगत संरचनाओं को इकट्ठा करने और संरक्षित करते समय इन संरचनाओं के उल्लेखनीय अनुकूलन6 और मिट्टी से कवक के साथ अंतरंग संपर्क, ऑटोट्रॉफिक पौधों42 या विघटित पत्ती कूड़े40 से जुड़ा हुआ है। नमूना निर्धारण के आवश्यक चरणों का पर्याप्त रूप से पालन करने की आवश्यकता है, फिक्सेटिव और समय के मुद्दों की सही तैयारी के बारे में, एकत्र करने और फिक्सिंग के बीच आवश्यक न्यूनतम समय, और भंडारण के लिए आगे बढ़ने से पहले फिक्सेटिव में आवश्यक न्यूनतम समय। अच्छी तरह से संरक्षित नमूनों का संरचनात्मक विश्लेषण निर्धारण प्रक्रिया पर निर्भर करता है, और पौधे शरीर रचना विज्ञान और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का अध्ययन करने के लिए लागू सबसे आम और सर्वोत्तम-संरक्षण फिक्सेटिव प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित हैं। अन्य फिक्सेटिव14,16,25 भी लागू किए जा सकते हैं।

जैसा कि पहले कहा गया है, रासायनिक फिक्सेटिव का उपयोग करने की प्रक्रिया निर्णायक है और नमूना छवियों को प्राप्त करते समय इसका मूल्यांकन किया जा सकता है। एलएम में, सेलुलर संरचनाएं जीवित ऊतकों की तुलना में यथासंभव समान होनी चाहिए16. पहचानयोग्य सेलुलर घटकों की मात्रा, आकृति विज्ञान और स्थानिक स्वभाव ताजा ऊतकों (गैर-निश्चित) के लिए जितना संभव हो उतना समान होना चाहिए। टीईएम में, अच्छी तरह से संरक्षित ऊतकों को तब उजागर किया जा सकता है जब टोनोप्लास्ट दिखाई देता है, चिकनी आकृति के साथ, और साइटोप्लाज्म16 से दूर नहीं खींचा जाता है। प्लाज्मा झिल्ली को कोशिका भित्ति से अलग और सिकुड़ा नहीं जा सकता है। टीईएम के लिए नमूने जितना संभव हो उतना पतला और फिक्सेटिव की एक बूंद के अंदर एकत्र किया जाना चाहिए, जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में समझाया गया है। फिक्सिंग एजेंटों से जुड़े बफर का उपयोग सेलुलर संरचना और अल्ट्रास्ट्रक्चर16 में जितना संभव हो उतने परिवर्तनों से परहेज करते हुए, तय किए जा रहे नमूनों को ऑस्मोलरिटी और आयनिक संरचना की महत्वपूर्ण स्थितियां प्रदान करता है। एसईएम में, एक प्रमुख चिंता आइसोटोनिक फिक्सेटिव के साथ है और उन्हें बफर के साथ तैयार करना है, इसलिए नमूना मात्रा (सूजन या संकोचन) 16 में कोई महत्वपूर्ण बदलाव नहीं है।

विभिन्न उद्देश्यों के लिए अनुभाग प्राप्त करने के लिए एलएम के लिए कई अलग-अलग एम्बेडिंग विधियां उपलब्ध हैं। धुंधला और फ्लोरोसेंट-रंगों को ध्यान में रखते हुए इनक्यूबेशन, एमएच पौधों के अंगों का विश्लेषण करने के लिए दो महत्वपूर्ण तरीके प्रस्तुत किए जाते हैं। ऊपर वर्णित (फ्रीहैंड सेक्शन, जीएमए राल और ओसीटी एम्बेडिंग) सबसे आम और सरल हैं, जो कई प्रकार के विश्लेषण के लिए पद्धतिगत स्वतंत्रता और उपयुक्तता प्रदान करते हैं। संयुग्मित डब्ल्यूजीए-फ्लोरोक्रोम में एमएच पौधों के अध्ययन में काफी क्षमता है, क्योंकि यह वर्तमान में फंगल रोगजनकों 28,29,30 पर अधिक लागू होता है और एमएच पौधों के फंगल एंडोफाइट्स के साथ शायद ही कभी उपयोग किया जाता है। स्कैनिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए बुनियादी और आवश्यक कदम विस्तृत हैं, क्योंकि ये तकनीकें पौधों के संरचनात्मक विश्लेषण में बहुत योगदान दे सकती हैं। एसईएम और टीईएम साहित्य समृद्ध है, और यदि अन्य प्रकार के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण का परीक्षण किया जाना है तो 32,33,34,43 को आगे पढ़ने की सिफारिश की जाती है।

सहजीवी अंकुरण प्रक्रियाओं के संबंध में, बीजों को सीधे कीटाणुरहित करने की आवश्यकता के बिना, विघटन से पहले फल एसेप्सिस का संचालन करना संभव है। हालांकि, एंडोफाइट्स (पहले से ही एमएच प्रजातियों39,41 के लिए वर्णित) द्वारा पहले से ही खुले या उपनिवेशित फलों के बीज सीधे कीटाणुरहित होना चाहिए। एक महत्वपूर्ण टिप्पणी: भंडारण और एसेप्सिस प्रक्रियाओं का समय और शर्तें कुछ प्रजातियों से बीजों की व्यवहार्यता को कम कर सकती हैं जैसा कि इन प्रयोगों को करते समय देखा गया था। टेट्राज़ोलियम अभिकर्मक व्यवहार्य बीजों से भ्रूण के लिए प्रकाश से गहरे लाल तक एक रंग प्रदान करता है। गैर-व्यवहार्य बीजों से भ्रूण अपने प्राकृतिक रंग के साथ रहते हैं। भारी रंगद्रव्य टेगुमेंट्स या कठोर बीज कोट वाले बीजों को अंकुरण परीक्षण से पहले पूर्व-उपचार की आवश्यकता हो सकती है। भ्रूण35 के दृश्य को सक्षम करते हुए, उनके टेगुमेंट का स्कार्फिकेशन करने की सिफारिश की जाती है।

उष्णकटिबंधीय ऑर्किड से कुछ संभावित माइकोराइजल फंगल आइसोलेट्स, उदाहरण के लिए, सेराटोबासिडियम प्रजातियों में पोषक तत्वों से भरपूर संस्कृति माध्यम में जोरदार और त्वरित वृद्धि होती है। उपचार के दौरान, यह संभव है कि आइसोलेट्स पूरी तरह से बीज को कवर करते हैं जब वे बढ़ते हैं, जिससे डेटा संग्रह मुश्किल या असंभव हो जाता है। आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला प्रोटोकॉल जिसमें कुचल जई के गुच्छे9 के सहजीवी अंकुरण में डेटा संग्रह को रोका जाता है पी शेंकी, कुचल जई के गुच्छे39 के 2 ग्राम / सहजीवी अंकुरण में ओएमए माध्यम की रचना करने के लिए लगभग 2.5 ग्राम / एल जई के गुच्छे का उपयोग करना अधिक जोरदार फंगल आइसोलेट्स (अप्रकाशित डेटा) के विकास को सीमित करने में संतोषजनक प्रतीत होता है।

वर्णित विधियों से सीमाएं उत्पन्न हो सकती हैं, जिनमें से कुछ को प्रक्रियाओं को अपनाकर या अन्य तरीकों को लागू करके प्रभावी ढंग से दूर किया जा सकता है। जैसा कि पहले चर्चा की गई है, जीएमए एम्बेडिंग केवल 8 μm मोटी तक सेक्शनिंग के लिए प्रभावी है। हालांकि, ओसीटी एम्बेडिंग विभिन्न मोटाई वर्गों को प्रदान करता है, जिसमें मोटे लोग (जैसे, 10-20 μm) शामिल हैं। पौधों के ऊतकों में केवल कवक संरचनाओं को धुंधला करना आसानी से आयोजित नहीं किया जाता है, हालांकि डब्ल्यूजीए-फ्लोरोक्रोम एक महत्वपूर्ण और प्रभावी संयुग्म फ्लोरोक्रोम है जो फंगल सेल की दीवारों को चिह्नित करता है, हालांकि यह महंगा है। एसईएम और टीईएम विधियों में अन्य लागत सीमाएं उत्पन्न हो सकती हैं, क्योंकि उपकरणों की उच्च लागत और अनिवार्यता इस तरह के विश्लेषण को तुच्छ और हर शोध समूह के लिए सामान्य नहीं बनाती है। बीज परीक्षणों का सहजीवी अंकुरण, हालांकि सरल और कम खर्चीला है, बीजों को टीका लगाने के लिए माइकोरिज़ल कवक की मांग करता है और संदूषण से बचने के लिए सावधानीपूर्वक प्रक्रियाएं करता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक एफएईपीईएक्स और एफएपीईएसपी (2015/26479-6) से धन का धन्यवाद करते हैं। एमपीपी ने अपनी मास्टर डिग्री छात्रवृत्ति (प्रक्रिया 88887.600591/2021-00) और सीएनपीक्यू जीएलएसएम उत्पादकता अनुदान (303664 / 2020-7) के लिए सीएनपीक्यू धन्यवाद के लिए कैप्स को धन्यवाद दिया। लेखक एलएमई (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की प्रयोगशाला - आईबी / यूनिकैम्प), आईएनएफएबीआईसी (नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ साइंस एंड टेक्नोलॉजी ऑन फोटोनिक्स एप्लाइड टू सेल बायोलॉजी - यूनिकैम्प), और लाबीवास्क (संवहनी जीवविज्ञान की प्रयोगशाला - डीबीईएफ / आईबी / यूनिकैम्प) द्वारा प्रदान किए गए उपकरणों और सहायता तक पहुंच का भी धन्यवाद करते हैं; क्रायोप्रोटेक्शन प्रोटोकॉल में योगदान के लिए एलएएमईबी (यूएफएससी) और एलियाना डी मेडिरोस ओलिवेरा (यूएफएससी); टीईएम प्रोटोकॉल में योगदान के लिए एलएमई।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma-Aldrich 179124 (for SEM stubs mounting)
Agar-agar (AA) Sigma-Aldrich A1296 (for seeds germination tests)
Calcofluor White Stain Sigma-Aldrich 18909 fluorescent dye (detects cellulose)
Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8 Sigma-Aldrich C2488 (for toluidine blue O staining)
Conductive Double-Sided Carbon Tape Fisher Scientific 50-285-81 (for SEM)
Confocal Microscope Zeiss (any model)
Copper Grids Sigma-Aldrich G4776 (for TEM)
Critical-point dryer Balzers (any model)
Cryostat Leica Biosystems (any model)
Dissecting microscope Leica Biosystems (= stereomicroscope, any model)
Entellan Sigma-Aldrich 107960 rapid mounting medium for microscopy
Ethyl alcohol, pure (≥99.5%) Sigma-Aldrich 459836 (= ethanol, for dehydration processes)
Formaldehyde solution, 37% Sigma-Aldrich 252549 (for NBF solution preparation)
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128 histological tissue fixative
Gelatin capsules for TEM Fisher Scientific 50-248-71 (for resin polymerisation in TEM)
Gelatin solution, 2% in H2O Sigma-Aldrich G1393 (dilute for slides preparation - OCT adherence)
Glutaraldehyde solution, 25% Sigma-Aldrich G6257 (for Karnovsky’s solution preparation)
HistoResin Leica Biosystems 14702231731 glycol methacrylate (GMA) embedding kit
Iodine Sigma-Aldrich 207772 (for Lugol solution preparation)
Lead(II) nitrate Sigma-Aldrich 228621 Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)
Light Microscope Olympus (any model)
LR White acrylic resin Sigma-Aldrich L9774 hydrophilic acrylic resin for TEM
Lugol solution Sigma-Aldrich 62650 (for staining)
Metal stubs for specimen mounts Rave Scientific (for SEM, different models)
Microtome Leica Biosystems manual rotary microtome or other model
Oatmeal agar (OMA) Millipore O3506 (for seeds germination tests)
OCT Compound, Tissue-Tek Sakura Finetek USA 4583 embedding medium for frozen tissues
Osmium tetroxide Sigma-Aldrich 201030 OsO4 (for TEM postfixation)
Parafilm M Sigma-Aldrich P7793 sealing thermoplastic film
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 (for Karnovsky’s solution preparation)
Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O Sigma-Aldrich P8920 (for slides preparation - OCT adherence)
Poly-Prep Slides Sigma-Aldrich P0425 poly-L-lysine coated glass slides
Polyethylene Molding Cup Trays Polysciences 17177A-3 (6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Polyethylene Molding Cup Trays Polysciences 17177C-3 (13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Potassium iodide Sigma-Aldrich 221945 (for Lugol solution preparation)
Potato Dextrose Agar (PDA) Millipore 70139 (for seeds germination tests)
Scanning Electron Microscope Jeol (any model)
Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane] Sigma-Aldrich A3648 (for slides preparation - OCT adherence)
Silane-Prep Slides Sigma-Aldrich S4651 glass slides coated with silane
Silica gel orange, granular Supelco 10087 (for dessicating processes)
Sodium cacodylate trihydrate Sigma-Aldrich C0250 (for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881 NaOH (for Karnovsky’s solution preparation and TEM contrast staining)
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 425044 NaClO (for seeds surface disinfection)
Sodium phosphate dibasic, anhydrous Sigma-Aldrich 71640 Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich S9638 NaH2PO4·H2O (for NBF and PB)
Sputter coater Balzers (any model)
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)
Sudan III Sigma-Aldrich S4131 (for staining)
Sudan IV Sigma-Aldrich 198102 (for staining)
Sudan Black B Sigma-Aldrich 199664 (for staining)
Syringe (3 mL, any brand, for TEM contrast staining)
Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 µm Millipore SLGV033R PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)
Tek Bond Super Glue 793 Tek Bond Saint-Gobain 78072720018 liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity
Toluidine Blue O Sigma-Aldrich T3260 (for staining)
Transmission Electron Microscope Jeol (any model)
Triphenyltetrazolium chloride Sigma-Aldrich T8877 (for the tetrazolium test in seeds germination)
Trisodium citrate dihydrate Sigma-Aldrich S1804 Na3(C6H5O7)·2H2O (for TEM contrast staining)
Ultramicrotome Leica Biosystems (any model)
Uranyl acetate Fisher Scientific 18-607-645 UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)
Vacuum pump (any model)
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate TermoFisher Scientific W11261 fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Evert, R. F. Esau’s Plant Anatomy: Meristems, Cells, and Tissues of the Plant Body: Their Structure, Function, and Development. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ, USA. (2006).
  2. Yeung, E. C. T., Stasolla, C., Sumner, M. J., Huang, B. Q. Plant Microtechniques and Protocols. , Springer International Publishing. Cham, Switzerland. (2015).
  3. Sokoloff, D. D., Jura-Morawiec, J., Zoric, L., Fay, M. F. Plant anatomy: at the heart of modern botany. Botanical Journal of the Linnean Society. 195 (3), 249-253 (2021).
  4. Leake, J. R. The biology of myco-heterotrophic (‘saprophytic’) plants. New Phytologist. 127 (2), 171-216 (1994).
  5. Bidartondo, M. I. The evolutionary ecology of myco-heterotrophy. New Phytologist. 167 (2), 335-352 (2005).
  6. Imhof, S., Massicotte, H. B., Melville, L. H., Peterson, R. L. Subterranean morphology and mycorrhizal structures. Mycoheterotrophy. , Springer. New York, NY. 157-214 (2013).
  7. Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style. Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).
  8. Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jersáková, J., Těšitelová, T. Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements. Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).
  9. Zettler, L. W. Terrestrial orchid conservation by symbiotic seed germination: techniques and perspectives. Selbyana. 18 (2), 188-194 (1997).
  10. Stewart, S. L., Kane, M. E. Symbiotic seed germination and evidence for in vitro mycobiont specificity in Spiranthes brevilabris (Orchidaceae) and its implications for species-level conservation. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. 43 (3), 178-186 (2007).
  11. Zhao, D. -K., et al. Orchid reintroduction based on seed germination-promoting mycorrhizal fungi derived from protocorms or seedlings. Frontiers in Plant Science. 12, 701152 (2021).
  12. Selosse, M. A., Roy, M. Green plants that feed on fungi: facts and questions about mixotrophy. Trends in Plant Science. 14 (2), 64-70 (2009).
  13. Merckx, V. S. F. T., Mennes, C. B., Peay, K. G., Geml, J. Evolution and diversification. Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , Springer. New York, NY. 215-244 (2013).
  14. Boon, M. E., Drijver, J. Routine Cytological Staining Techniques: Theoretical Background and Practice. Macmillan International Higher Education. , Hampshire, UK. (1986).
  15. Karnovsky, M. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27 (2), 137-138 (1964).
  16. Hayat, M. Fixation for Electron Microscopy. , Academic Press. New York, USA. (1981).
  17. Roland, J. C., Vian, B. General preparation and staining of thin sections. Electron Microscopy of Plant Cells. 1, 675 (1991).
  18. Gerrits, P. O., Horobin, R. W. Glycol methacrylate embedding for light microscopy: basic principles and trouble-shooting. Journal of Histotechnology. 19 (4), 297-311 (1996).
  19. Zhang, Z., Niu, L., Chen, X., Xu, X., Ru, Z. Improvement of plant cryosection. Frontiers in Biology. 7 (4), 374-377 (2012).
  20. BeneŠ, K. On the media improving freeze-sectioning of plant material. Biologia Plantarum. 15 (1), 50-56 (1973).
  21. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Preparation of slides and coverslips for microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), (2008).
  22. Sakai, W. S. Simple method for differential staining of paraffin embedded plant material using toluidine blue O. Stain Technology. 48 (5), 247-249 (1973).
  23. O’Brien, T., Feder, N., McCully, M. E. Polychromatic staining of plant cell walls by toluidine blue O. Protoplasma. 59 (2), 368-373 (1964).
  24. Ventrella, M. C., Almeida, A. L., Nery, L. A., Coelho, V. P. deM. Métodos Histoquímicos Aplicados às Sementes. Universidade Federal de Viçosa. , Viçosa, Brazil. (2013).
  25. Pearse, A. G. E. Histochemistry, Theoretical and Applied. , J & A Churchill. London, UK. (1960).
  26. Andrade-Linares, D. R., Franken, P. Fungal endophytes in plant roots: taxonomy, colonization patterns, and functions. Symbiotic Endophytes. , Springer. Berlin. 311-334 (2013).
  27. Wymer, C. L., Beven, A. F., Boudonck, K., Lloyd, C. W. Confocal microscopy of plant cells. Confocal Microscopy Methods and Protocols. , Humana Press. Totowa. 103-130 (1999).
  28. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. Manual de Técnicas Aplicadas à Histopatologia Vegetal. FEALQ. , Piracicaba, Brazil. (2021).
  29. Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera. European Journal of Plant Pathology. 154 (4), 1185-1193 (2019).
  30. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum. Frontiers in Plant Science. 9, 698 (2018).
  31. Jeffree, C. E., Read, N. D. Ambient-and low-temperature scanning electron microscopy. Electron Microscopy of Plant Cells. , 313-413 (1991).
  32. Bozzola, J. J., Russell, L. D. Electron Microscopy: Principles and Techniques for Biologists. , Jones & Bartlett Learning. Sudbury, MA, USA. (1999).
  33. Murray, S. Basic transmission and scanning electron microscopy. Introduction to electron Microscopy for Biologists. , Academic Press. 3-18 (2008).
  34. Tanaka, M. Glossary of TEM terms. , Available from: https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/ (2021).
  35. Seaton, P. T., et al. Orchid seed and pollen: a toolkit for long-term storage, viability assessment and conservation. Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses—Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 71-98 (2018).
  36. Otero, J. T., Ackerman, J. D., Bayman, P. Differences in mycorrhizal preferences between two tropical orchids. Molecular Ecology. 13 (8), 2393-2404 (2004).
  37. Koch, R. A., et al. Marasmioid rhizomorphs in bird nests: Species diversity, functional specificity, and new species from the tropics. Mycologia. 112 (6), 1086-1103 (2020).
  38. Webster, J., Weber, R. Introduction to Fungi. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
  39. Sisti, L. S., et al. The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn. Frontiers in Plant Science. 10, 1589 (2019).
  40. Martos, F., et al. Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids. New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).
  41. Alves, M. F., et al. Reproductive development and genetic structure of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn. BMC Plant Biology. 21 (1), 332 (2021).
  42. Merckx, V. S. F. T. Mycoheterotrophy: an introduction. Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , 1-17 (2013).
  43. Hall, J. L., Hawes, C. Electron Microscopy of Plant Cells. , Academic Press. Cambridge, UK. (1991).

Tags

जीव विज्ञान अंक 183 क्रायोसेक्शन एंडोफाइटिक कवक प्रकाश माइक्रोस्कोपी माइक्रोटॉमी माइकोहेटरोट्रॉफिक पौधे पौधे शरीर रचना विज्ञान स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी बीज अंकुरण धुंधला तकनीक सहजीवी अंकुरण ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी गेहूं रोगाणु एग्लूटिनिन संयुग्म
माइकोहेटरोट्रॉफिक पौधों के ऊतकों और बीजों के सहजीवी अंकुरण में फंगल उपनिवेशीकरण की व्याख्या के लिए माइक्रोस्कोपी तकनीक
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pena-Passos, M., Sisti, L. S.,… More

Pena-Passos, M., Sisti, L. S., Mayer, J. L. S. Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds. J. Vis. Exp. (183), e63777, doi:10.3791/63777 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter