Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Mikroskopitekniker för tolkning av svampkolonisering i mykoheterotrofa växtvävnader och symbiotisk spiring av frön

Published: May 17, 2022 doi: 10.3791/63777
Automatic Translation
1, 1, 1
1LabPlaM - Mycoheterotrophic Plants Research Lab, Department of Plant Biology, University of Campinas (UNICAMP)

Summary

Detta protokoll syftar till att tillhandahålla detaljerade procedurer för insamling, fixering och underhåll av mykoheterotrofa växtprover, med tillämpning av olika mikroskopitekniker som skannings- och överföringselektronmikroskopi, ljus-, konfokal- och fluorescensmikroskopi för att studera svampkolonisering i växtvävnader och frön groddar med mykorrhizasvampar.

Abstract

Strukturell botanik är ett oumbärligt perspektiv för att fullt ut förstå växternas ekologi, fysiologi, utveckling och utveckling. När man undersöker mykoheterotrofa växter (dvs växter som får kol från svampar) kan anmärkningsvärda aspekter av deras strukturella anpassningar, mönstren för vävnadskolonisering av svampar och morfoanatomin hos underjordiska organ upplysa deras utvecklingsstrategier och deras relationer med hyfer, källan till näringsämnen. En annan viktig roll av symbiotiska svampar är relaterad till spiring av orkidéfrön; alla Orchidaceae-arter är mykoheterotrofa under groning och plantor (initial mykoheterotrofi), även de som fotosyntetiserar i vuxna stadier. På grund av bristen på näringsreserver i orkidéfrön är svampsymbionter viktiga för att ge substrat och möjliggöra spiring. Att analysera grobarhetsstadier med strukturella perspektiv kan också svara på viktiga frågor om svamparnas interaktion med fröna. Olika avbildningstekniker kan tillämpas för att avslöja svampendofyter i växtvävnader, som föreslås i denna artikel. Frihand och tunna delar av växtorgan kan färgas och sedan observeras med hjälp av ljusmikroskopi. En fluorokrom konjugerad till vetegroddar agglutinin kan appliceras på svamparna och inkuberas tillsammans med Calcofluor White för att markera växtcellväggar i konfokalmikroskopi. Dessutom beskrivs metoderna för skanning och överföringselektronmikroskopi för mykoheterotrofa orkidéer, och möjligheterna att tillämpa sådana protokoll i besläktade växter undersöks. Symbiotisk spiring av orkidéfrön (dvs i närvaro av mykorrhizasvampar) beskrivs i protokollet i detalj, tillsammans med möjligheter att förbereda strukturerna erhållna från olika stadier av spiring för analyser med ljus-, konfokal- och elektronmikroskopi.

Introduction

Strukturforskning inom botanik, som omfattar växtmorfologi och anatomi, är grundläggande för att förstå hela organismen1,2 och ger oumbärliga perspektiv för att integrera och bidra till kunskap om växters ekologi, fysiologi, utveckling och utveckling3. Metoder inom växtmorfologi och anatomi omfattar för närvarande protokoll, utrustning och kunskap som utvecklats nyligen såväl som för mer än ett sekel sedan2. Det kontinuerliga utförandet och anpassningen av klassiska metoder (t.ex. ljusmikroskopi) tillsammans med nyare tekniker (t.ex. konfokalmikroskopi, röntgenmikrotomografi) har samma väsentliga grund: teoretisk kunskap som möjliggör utveckling av en metod.

Huvudverktyget i växtanatomi och morfologi är bilden. Trots missuppfattningen att sådana analyser är enkla observationer, vilket ger utrymme för subjektiva tolkningar2, kräver analys och förståelse av bilder inom detta område kunskap om de metoder som tillämpas (utrustning, typ av analys, metodologiska förfaranden), cellkomponenter, histokemi och växtkroppen (vävnadsorganisation och funktion, ontogeni, morfologiska anpassningar). Tolkning av de bilder som erhållits via en mängd olika metoder kan leda till korrelerande form och funktion, dechiffrera den kemiska sammansättningen av en struktur, bekräfta i beskrivningen av taxa, förstå infektioner av fytopatogener och andra sådana bedömningar.

När man undersöker mykoheterotrofa (MH) växter (dvs. icke-fotosyntetiska växter som erhåller kol från mykorrhizasvampar4,5), kan anmärkningsvärda aspekter av deras strukturella anpassningar, mönstren för vävnadskolonisering av svampar och morfoanatomin hos underjordiska organ upplysa deras utvecklingsstrategier och relationer med hyfer, som är källan till näringsämnen. De underjordiska organen hos MH-växter visar vanligtvis viktiga anpassningar relaterade till deras förening med marksvampar, därför är det viktigt att utföra dessa anatomiska och morfologiska undersökningar6. MH-arters luftorgan bör inte ignoreras, eftersom endofyter också kan finnas i dessa vävnader, även om de inte är mykorrhizasvampar (personliga observationer, inte publicerade ännu).

Förutom den väletablerade väsentligheten hos mykorrhizasvampar som associeras med MH-arter under hela deras livscykel7, har varje orkidéart, även de autotrofa, ett initialt obligatoriskt mykoheterotrofiskt stadium i naturliga miljöer. Det uppstår eftersom orkidéernas embryo är odifferentierat och saknar endosperm eller kotyledoner, vilket är oförmöget att utveckla och etablera sig i naturliga miljöer utan näringsstöd från svamppartners 4,8. Med tanke på detta kan symbiotiska grobarhetsprotokoll tillämpas inte bara på MH-arter utan också på fotosyntetiserande orkidéer, som syftar till att undersöka orkidé-svampspecificitet vid grobarhet och protocormutveckling, en mycket tillämpad metod i initiativ för bevarande av hotade arter 9,10,11.

I denna metodsammansättning beskriver vi viktiga steg som är involverade i insamling, fixering och lagring av MH-växtprover för anatomiska studier (avsnitt 1), ytanalys och provval (avsnitt 2), sektionsmetoder (frihand: avsnitt 3, mikrotomi: avsnitt 4, kryomikrotomi: avsnitt 5), färgning och montering (avsnitt 6), fluorescens och konfokalmikroskopi av svampendofyter (avsnitt 7), svepelektronmikroskopi (avsnitt 8), och transmissionselektronmikroskopi (avsnitt 9). Dessutom beskriver vi en symbiotisk grobarhetsmetod för orkidéfrön (MH och autotrofisk, avsnitt 10), eftersom de tidigare nämnda avbildningsmetoderna framgångsrikt kan tillämpas för att analysera svampkolonisering av frön, protokormer och plantor i groningsprocessen.

Figure 1
Figur 1: Schematisk sammanfattning av avbildningsmetoder. Scheman ger indikationer på protokollsteg där de är detaljerade. Förkortningar: GMA = glykolmetakrylat, OCT = optimal skärtemperaturförening, SEM = svepelektronmikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

De mikroskopitekniker som beskrivs här i detalj (figur 1) föregås av följande viktiga steg: insamling, fixering, uttorkning, inbäddning och sektionering av prover. Eftersom stegen är variabla (figur 1) beroende på den eller de valda teknikerna är det viktigt att tänka framåt, med tanke på de fixeringsmedel som ska beredas och transporteras till uppsamlingsplatsen, hur proverna måste beredas innan de fixeras, de uttorkningsprocesser som ska användas (avsnitt 1) och olika inbäddningsmöjligheter och sektioneringsmetoder (avsnitt 4, 5). och 9). Figur 1 sammanfattar sekventiellt alla steg som krävs för varje mikroskopiteknik som beskrivs noggrant nedan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Insamling, fixering och underhåll av prover

OBS: Helt MH-växter kan vanligtvis hittas i den mörka skogen understory 12,13, främst i fuktiga och kullrika områden, medan delvis MH-växter finns i mer öppna skogar12,13. MH-växter har vanligtvis välutvecklade underjordiska organ i olika former och storlekar.

  1. När du samlar MH-arter, utforska jorden runt växtbasen, var försiktig så att du inte skadar underjordiska organ och undvik att dra växterna från marken för att förhindra att luftorganen kopplas bort från de underjordiska.
  2. Gräv försiktigt runt luftstrukturer med hjälp av en trädgårdsslev medan du utforskar de underjordiska organen som rötter, stjälkar, rhizomer och lagringsorgan utan att skada dessa strukturer.
  3. Ta bort jordpartiklar för att bevara bräckliga strukturer och tvätta dessa organ försiktigt med kranvatten för att skölja bort de återstående jordpartiklarna innan proverna fixeras.
  4. MH-växter i samband med bladskräp kräver extra uppmärksamhet; Samla försiktigt organ som är anslutna till det sönderdelande materialet genom sina hyfer, undvik att dra dessa organ från de anslutna strukturerna och samla dem noggrant eftersom dessa delar är mycket känsliga. Bevara strukturer med sådana anslutningar och samla skräpet också för analys.
  5. Om du väljer att analysera färskt material med hjälp av bildtekniker, behåll proverna i slutna plastpåsar med tillräcklig fukt, tillräckligt med vatten som avdunstar och fuktar växten, vilket förhindrar att alltför mycket vatten kommer i kontakt med proverna. Transportera dem omedelbart till laboratoriet och analysera proverna samma dag som de samlades in, samtidigt som du uppmärksammar om proverna fortfarande bevaras vid analys av dem.
  6. Bär fixeringsmedel till uppsamlingsplatsen i väl förseglade behållare. Fixa prover snabbt efter insamling för ljusmikroskopi (LM) och svepelektronmikroskopi (SEM) i något av följande fixeringsmedel: 10% neutralt buffrat formalin (NBF14, tabell 1) eller Karnovskys lösning (modifierad15, tabell 2). Karnovskys lösning kan framställas med 0,2 M fosfatbuffert15, vars recept beskrivs i tabell 3.
  7. För analys med transmissionselektronmikroskopi (TEM), dela proverna med en tjocklek av 4-3 mm inuti en droppe glutaraldehyd-natriumkakodylatbuffert (modifierad16, tabell 4) i mindre sektioner med en tjocklek på 1-2 mm. Kassera kanterna som skärs utanför droppen. Överför omedelbart sektionerna till ett uppsamlingsrör med en volym fixativ mer än 10 gånger större än provernas volym, eftersom det är ett additivt fixativ (dvs dess molekyler tillsätts kemiskt till proteinerna fixerade16).
    VARNING: De tre beskrivna fixeringsmedlen är mycket giftiga. Undvik inandning, särskilt under användning i fältet. Förbered alla fixeringsmedel i en dragskåp med handskar. Blanda inte kakodylat och syror, eftersom arsengas kan bildas16.
  8. Om de fasta proverna flyter i fixeringsmedlet indikerar detta närvaron av gas i växtvävnader. Luft och andra gaser hindrar fixeringsmedlet från att tränga igenom hela provet2. Ta bort gas från vävnader genom att ta om dem i mindre delar och använda en vakuumpump (-300 till -400 inHg tryck) tills alla prover sjunker till botten av lösningen17. Var försiktig eftersom överdrivet tryck som utövas av pumpen kan skada prover.
  9. Efter minst 48 h i Karnovskys lösning eller 10% NBF, tvätta proverna i 0,2 M PB (tabell 3) och dehydrera dem med en serie av 10%, 30%, 50% och slutligen 70% etanol. För känsliga prover, dehydratisera i 30 minuter i varje koncentration; För större prover, torka ut i 1 timme eller längre.
    OBS: En 70% etanollösning är det perfekta mediet för lagring av prover. Prover i 70% etanol kan förvaras vid rumstemperatur i flera år. Förvara inte växtmaterial under långa perioder i fixeringsmedlen, eftersom avlägsnande av fixeringsmedel är ett viktigt steg efter fixering2.
  10. Förvara proverna i glutaraldehyd-kakodilat vid 4 °C innan du fortsätter till postfixering (steg 9.1).
10% neutralt buffrat formalin (NBF)14
steg 1 tillsätt 10 ml 37-40% formaldehydlösning i 80 ml destillerat vatten
steg 2 tillsätt 0,4 g natriumfosfatmonobasiskt monohydrat (NaH2PO4· H2O) till lösningen
steg 3 tillsätt 0,65 g natriumfosfat dibasisk, vattenfritt (Na2HPO4)
steg 4 fyll på volymen till 100 ml

Tabell 1: 10% neutralt buffrat formalinrecept 14.

Karnovskys lösning (modifierad15)
steg 1 i 20 ml destillerat vatten vid 60–70 °C
steg 2 tillsätt 0,8 g paraformaldehyd (för att erhålla 4 % vikt/volym) under omrörning
steg 3 tillsätt 1-4 droppar 40% NaOH och rör om tills lösningen blir klar
steg 4 kyla den och tillsätt 30 ml 0,2 M fosfatbuffert pH 7,2 (tabell 3)
steg 5 späd 25% glutaraldehyd i 0,1 M PB (pH 7,2) för att erhålla 1% glutaraldehyd (slutlig volym: ~ 60 ml)
steg 6 tillsätt 1% glutaraldehyd (steg 5) till den lösning som erhålls i steg 4 tills den bereder upp till 100 ml fixeringsmedel

Tabell 2: Karnovskys lösningsrecept (modifierat15).

0,2 M fosfatbuffert (PB) pH 7,2
steg 1 tillsätt 14,196 g natriumfosfat dibasisk, vattenfritt (Na2HPO4) till 400 ml destillerat vatten
steg 2 tillsätt 13,8 g natriumfosfatmonobasiskt monohydrat (NaH2PO4· H2O)
steg 3 rör om tills lösningen är klar
steg 4 justera den slutliga volymen till 500 ml med destillerat vatten
steg 5 justera pH till 7,2
steg 6 för en 0,1 M PB, späd 1:1

Tabell 3: 0,2 M fosfatbuffertrecept.

3% glutaraldehyd 0,2 M natriumkakodylatbuffert (modifierad16)
steg 1 0,2 M kakodylatbuffert: tillsätt 4,28 g natriumkakodylattrihydrat i 100 ml destillerat vatten
steg 2 justera pH till 7,2
steg 3 tillsätt 12 ml 25% glutaraldehyd i 25 ml av lösningen i steg 2 (0,2 M kakodylatbuffert pH 7,2)
steg 4 fyll på 100 ml med destillerat vatten

Tabell 4: 3% glutaraldehyd 0,2 M natriumkakodylatbuffertrecept (modifierat16).

2. Ytanalys av organ i fast och icke-fixerat material

  1. För att analysera ytliga hyfer i organ, särskilt underjordiska, och de som kommer i kontakt med bladskräp, observera fast eller färskt material i ett dissekerande mikroskop (stereomikroskop) med en förstoring på 7,5x eller högre, beroende på de analyserade proverna.
    1. Visualisera proverna nedsänkta i fixeringsmedlet, 70% etanol (om det lagras i det) eller kranvatten när det gäller färskt material. Förhindra direkt ljus från dissekeringsmikroskopet eftersom det kan torka och skada prover.
    2. Sök efter intressanta områden i proverna, styrda av ytliga hyfer och rhizomorfer. Välj prover som innehåller områden med ytliga rhizomorfer eftersom dessa kan sektioneras för att visualisera pelotoner och hyfaspolar i kortikala celler i rötter och stjälkar.
    3. Efter valet, följ steg 1.6 och 1.9 om proverna ännu inte är fixade. Om så önskas, fotografera färska prover med hjälp av ett ljusmikroskop utan fixering, enligt beskrivningen i avsnitt 3.
    4. Använd kameran kopplad till stereomikroskopet för att samla in bilder från orgelytor, rhizomorfer och andra observerade strukturer. I sådana fall, ordna en adekvat bakgrundsfärg för att kontrastera väl med materialet och, om möjligt, välj ett bakgrundsmaterial med en mindre grov yta (t.ex. papper).

3. Frihandssektioner av växtorgan

OBS: Frihandssektioner av växtorgan kan vara utmanande, särskilt för små och tunna strukturer. Dessa delar av vävnader med svampendofyter kan emellertid i vissa fall bättre evincehyfer och andra funktioner jämfört med tunna sektioner.

  1. Dela färska eller fasta prover med ett skarpt blad, skär dem så tunna som möjligt och placera dem omedelbart i en liten petriskål med vatten (om det är friskt) eller 70% etanol (om det är fixerat). Använd en liten pensel för att manipulera sektionerna utan att skada dem.
  2. För att underlätta sektionering av mer utmanande material (dvs. små, tunna, flexibla organ), omger provet i en struktur, till exempel polystyren eller Cecropia petiole. Skär stödet för att rymma provet och gör en tunn del av provet och stödet helt och hållet.
  3. Fläcka och montera proverna enligt beskrivningen i avsnitt 6.

4. Inbäddning av växtprover i harts och sektionering

  1. Dehydrera proverna ytterligare i 70% etanol i 80%, 96% och 2x i 100% etanol, i 30 min till 2 timmar beroende på provernas storlek och sammansättning.
  2. Använd ett glykolmetakrylat (GMA) hartssats enligt tillverkarens instruktioner. Kontrollera Gerrits och Horobin (1996)18 för ytterligare överväganden. Följ infiltrerings- och inbäddningsstegen i enlighet med detta.
    VARNING: GMA-harts är giftigt, det kan orsaka allergisk reaktion och hud, ögon och slemhinneirritation. Använd reagenserna i en dragskåp och använd handskar.
  3. Använd polyetengjutbrickor för inbäddning, utvalda efter provstorlek (t.ex. 13 mm x 19 mm x 5 mm för större prover, 6 mm x 8 mm x 5 mm för mindre). Var uppmärksam på önskad provorientering inuti formen och använd en nål för att orientera.
  4. Låt stå för polymerisation, helst vid rumstemperatur, tills den är helt stelnad. Härdningsprocessen tar vanligtvis några timmar, även om det rekommenderas att avforma blocken följande dag. Efter polymerisation, lossa försiktigt hartsblocken från formarna och fortsätt att fästa blocken så snart som möjligt för att undvika blockböjning.
  5. Slipa ansiktet på hartsblocket som kommer att fästas, vilket skapar en plan yta. Limma hartsblocket på en träkuboid (2 cm x 2 cm x 3 cm rekommenderas) med ett flytande cyanoakrylatlim med medelviskositet (se materialtabell). Se till att hartset är helt fastsatt för att undvika att kompromissa med sektionering.
  6. Utför sektionering i en roterande mikrotom enligt beskrivningen nedan.
    VARNING: Bladen på mikrotomknivar är mycket vassa och kan orsaka olyckor. Var noga med att hantera dem enligt alla säkerhetsåtgärder. Innan du närmar dig kniven (t.ex. för att byta block, för att fukta hartset), lås det grova handhjulet och placera bladets säkerhetsskydd på. Förvara engångsblad i lämpliga fall. Var extremt försiktig när du byter blad.
    OBS: Olika typer av knivar (t.ex. engångs- eller fasta; glas eller stål) kan användas för att sektionera GMA-harts18. Kvaliteten på sektionerna beror på hur vass kniven är. Se till att kniven är väl fastsatt och inte kan röra sig. Engångsknivar kan behöva bytas regelbundet för att uppnå bättre sektionering.
    1. Fäst träkuboiden ordentligt på blockhållaren. Justera orienteringen av sektionering med orienteringsskruvarna och se till att kniven är tillräckligt vinkel med knivens lutning. Välj tjockleken på sektionerna; använd en tjockare inställning för trimning och en tunnare inställning för utvalda sektioner, eftersom GMA-sektioner fäster mer lämpligt vid glasskivan när de är tunnare; Föreslagen tjocklek för växtvävnader är 5-8 μm.
    2. Innan du börjar, kyla rummet, om det behövs, eftersom högre temperaturer förvärrar kvaliteten på sektionerna. Förbered följande för sektionering: en bägare med destillerat vatten, en kokplatta, penslar (minst två), pincett med fina punkter, en pasteurpipett, glasskivor, filterpapper (eller silkespapper) och en penna (för att identifiera proverna som sektioneras).
    3. Justera kokplattan till 50 °C och placera bägaren på den. Var uppmärksam på skillnader i uppvärmning beroende på värmeplattans yta (vanligtvis värms mittområdet mer än kanterna; värm vattnet i mitten, helst).
    4. Välj en glasskiva, identifiera den med en penna och pipettera det varma destillerade vattnet över hela glidytan. Använd vid behov en lösning (t.ex. tvättmedel och vatten eller 70% etanol) för att bryta spänningen mellan vattnet och glaset, så att hela bilden är lika täckt. Vissa glidtyper måste förrensas med 70% etanol för att få tillräcklig sektionsföljsamhet.
    5. Börja med att gradvis föra hartsblockets yta mot knivbladet. Försök inte sektionera utan att avancera blocket först, annars kan utrustningen och blocket skadas. Trimma vid behov blocket med en högre tjocklek (10 μm och högre).
    6. När du närmar dig en lämplig sektion, gör en fast envägsrörelse med handhjulet, så att sektionen görs på en gång. Kontrollera hartsfuktigheten. Under sektionering, fuktar regelbundet ytan på blocket som skärs med en pensel doppad i destillerat vatten om det finns problem med curlingsektioner. Ta bort överflödigt vatten med ett silkespapper.
    7. Med en fin pekpinne placerar du den erhållna sektionen i vattnet över rutschkanan. Vid kontakt med vatten sträcker sig GMA-harts. Använd vid behov en pensel för att försiktigt veckla ut och sträcka ut sektionerna. Använd en annan pensel för att ständigt hålla bladet fritt från hartsskräp. Växla inte mellan penslarna för att undvika att väta bladet.
    8. Efter att ha köat upp alla önskade sektioner i bilden, torka bildens nedre yta och placera den ovanför kokplattan. Ta bort överflödigt vatten från toppen av bilden genom att försiktigt dabba med ett filterpapper (valfritt). Sektionerna kommer att fästa när vattnet avdunstar från bilden. Lämna inte bilderna för länge för att förhindra att sektionerna skadas av överdriven värme.
    9. Förvara bilderna i en glidlåda, borta från damm och solen, och använd dem för färgning och andra procedurer. Bilderna kan lagras i flera år.

5. Frysning av växtprover och sektionering med en kryostat

OBS: Det väsentliga övervägandet vid kryosektion av biologisk vävnad är att minska skador på grund av iskristallbildning vid frysning av prover. Kryoskydd görs vanligtvis genom att införa kemiskt inerta lösningar såsom glycerol eller sackaros19,20.

  1. Utför följande steg en dag före provsektionering.
    1. Späd 100 ml 0,2 M PB (tabell 3) i 100 ml destillerat vatten för att erhålla 200 ml 0,1 M PB. Förbered 10%, 20% och 30% sackaroslösningar i 0,1 M PB (t.ex. för en 10% lösning, tillsätt 2 g sackaros i 20 ml buffert).
    2. För färska prover, tvätta dem i 0,1 M PB i 30 min. För prover i ett fixeringsmedel, tvätta dem i samma buffert som används för att bereda fixeringsmedlet i 30 minuter. För prover i 70% etanol, hydrera dem i 50% och 30% etanol och tvätta i 0,1 M PB i 1 h i varje lösning.
    3. Inkubera proverna i 2 timmar i 10% sackaros, 2 h i 20% sackaros och 2 h i 30% sackaros vid rumstemperatur. Inkubera därefter över natten i 30% sackaros vid 4 ° C (eller åtminstone i 3 timmar; maximal tid är 48 timmar).
  2. På sektionsdagen, förbered 40% och 50% sackaros i 0,1 M PB; Förbered inte sackaroslösningar mer än 12 timmar i förväg. Inkubera i 2 timmar i varje sackaroskoncentration vid 4 °C.
  3. För inbäddning, i små formar, gör ett lager av OCT-förening (optimalt skärtemperaturmedium, används för att bädda in och frysa proverna) och håll det vid -20 ° C för att frysa. Formarna kan vara vanliga histologiska formar, men för att underlätta avformning av blocken kan papper eller tinfoil tillverkas med en liten kuboid som ram och tejp.
  4. Efter att bottenskiktet av OCT-föreningen har frysts i formarna, arbeta inuti en kryostatkammare (ca -27 °C). Placera proverna inkuberade i 50% sackaros i formarna, i den riktning där de kommer att delas. Den övre ytan av ett kuboidblock är vanligtvis ett bättre ansikte av sektionering. Markera i formen där proverna placeras, så att blocket enkelt kan trimmas och rätt orientering bibehållas.
  5. Omge proverna i OCT-förening och spräck eventuell luftbubbla som vidrör proverna. Frys dem vid -20 °C. När blocken är helt frysta, placera dem inuti kryostatkammaren (ca -27 °C). Avforma var och en endast innan du använder och var uppmärksam på märkena som indikerar provplats inuti blocket.
  6. Eftersom OCT-förening lätt skärs med ett blad, trimma blocken ordentligt innan du placerar dem på chuckarna. Lägg lite OCT-förening i kryostatchucken och placera blocket så att övre ansiktet är sektionerat. Ansikten med mindre områden ger bättre sektioner. Vänta tills blocket är väl fäst vid chucken och testa det innan du börjar dela.
  7. Placera chucken ordentligt i chuckhållaren. Justera orienteringen av sektionering med orienteringsskruvarna. Justera knivens vinkel med knivens lutning. Välj tjockleken på sektionerna. Proverna kan sektioneras tjockare än vanliga hartssektioner. Sektioner i ett intervall mellan 5-20 μm erhålls framgångsrikt, med tjockare sektioner som är lättare att göra (mindre curling och mindre skador på strukturer).
  8. För fram ansiktet på det frusna blocket mot knivbladet. Försök inte sektionera utan att göra det, annars kan blocket lossas från chucken och skadas. Trimma vid behov blocket med en högre tjocklek (10 μm och högre).
  9. När du närmar dig en lämplig sektion, placera anti-rullplattan (dvs en transparent platta som behåller sektionen) ovanför kniven och gör en fast enkelriktad rörelse med handhjulet, så att sektionen görs på en gång. Curlingproblem kan orsakas om krängningsplattan behöver justeras (den är vanligtvis justerbar med hänvisning till bladet) eller om det finns skräp i bladet. Rengör bladet hela tiden med en pensel för att ta bort skräp.
  10. Använd speciella bilder så att sektionerna lätt fäster, som silaniserade objektglas (kommersiella eller beredda med 2% aminoalkylsilan i aceton 21), eller diabilder beredda med 500 μg / ml poly-L-lysin i destillerat vatten 21 eller 0,2% gelatin (se detaljer21). Håll bilderna vid rumstemperatur.
  11. För att fästa sektionen på en bild, lyft anti-rullplattan och låt snabbt bilden röra vid sektionen. Eftersom bilden är vid rumstemperatur smälter sektionen omedelbart och fäster vid bilden. Var uppmärksam på att vrida den behandlade ytan på bilden till sektionen, som kan förbli ovanför kniven eller på insidan av rullplattan. För att undvika curling av sektioner, utför detta steg snabbt så snart plattan lyfts och var försiktig så att du inte förvränger sektionen.
  12. Lämna bilden utanför kryostatkammaren (vid rumstemperatur) om nya sektioner ska läggas till den. Efter att ha fäst alla önskade sektioner på bilden, håll den inuti kryostatkammaren eller i frysen (-20 ° C eller lägre). Utsätt inte bilderna för fuktighet. Förvara dem i en bildruta och kom ihåg att identifiera bilderna med en penna.
    OBS: Slides och block av OCT kan förvaras vid -20 °C, men inte för länge. För att uppnå bättre resultat, använd bilderna och blocken inom några dagar.

6. Färgning av växtsektioner och endofyter för ljusmikroskopi

OBS: Många typer av fläckar kan användas för växtsektioner. Det är utmanande att differentiellt fläcka endofytiska svampar och växtvävnader. Även om det inte är ett färgningsförfarande presenteras en metod för märkning av svampstrukturer i avsnitt 7 (fluorescens med ett vetegroddaragglutininkonjugat). Frihandssektioner (förklaras i avsnitt 3), hartsavsnitt (avsnitt 4) och kryosektioner (avsnitt 5) kan färgas, även om fenol- och alkoholbaserade fläckar är utmanande för dessa prover eftersom GMA-harts och OCT förlorar vidhäftning till bilden i dessa fall.

  1. Använd en eller kombinera följande vanliga färgningsmetoder för växtprover.
    1. Toluidinblå O22,23, en mycket tillämpad metod för allmän färgning av växtsektioner. Förbered en lösning av 0,05% toluidinblå O i 0,1 M fosfat (pH 6,8) eller 0,09 M citratbuffert (pH 4,5-4,8), beroende på art och typ av vävnad. Inkubera GMA-hartssektioner i 2-10 minuter med en glasfärgningsburk eller genom att placera några droppar ovanför sektionerna om få glasrutschbanor är färgade. Tvätta försiktigt med destillerat vatten eller buffert efter inkubation och montera objektglasen med vatten eller torka dem på en värmeplatta för att producera permanenta objektglas enligt beskrivningen i steg 6.3.
    2. Lugolreagens2 indikerar närvaron av stärkelse. Förbered en 5% jod (I2) och 10% kaliumjodid (KI) lösning i destillerat vatten. Fläcksektioner i 2 minuter genom att lägga till några droppar ovanför bilden och tvätta sedan med destillerat vatten. Detta histokemiska test tillämpas vanligtvis på tillfälliga objektglas.
    3. Sudan III, IV och svart B24,25 fläckar för olika lipider. Förbered en lösning av 0,3% Sudan (III, IV eller svart B) i 70% etanol, värm den tills den kokar och låt svalna. Använd supernatanten, filtrera den och inkubera sektioner i 15-30 min i en sluten petriskål. Tvätta sektionerna noggrant med 70% etanol och destillerat vatten. Montera bilderna med vatten (vanligtvis appliceras endast på tillfälliga bilder).
      OBS: Eftersom Sudan är ett alkoholbaserat färgämne är det mer lämpligt för frihandssektioner. Utför färgning av GMA-hartssektion försiktigt eftersom de vanligtvis lossnar från bilden.
  2. För tillfälliga glidbanor, montera sektionerna i vatten eller glycerin och observera därefter. Försegla täckglaset med nagellack för att bevara dem lite längre.
  3. För permanenta objektglas, montera sektionerna med syntetiska hartser (t.ex. snabbt monteringsmedium, se materialförteckning). Droppa några droppar av monteringsmediet (det kan svämma över täckglaset), sätt täckglaset försiktigt för att undvika bubblor och använd klädpinnar för att trycka glidbanan mot täckglaset tills det är helt torrt. Ta bort överskottet av torkat monteringsmedium med ett rakblad.

7. Applicering av en fluorokrom konjugerad till vetegroddaragglutinin i fluorescens och konfokalmikroskopi

OBS: Denna metod kan tillämpas på frihandssektioner (förklaras i avsnitt 3), hartssektioner (avsnitt 4) och kryosektioner (avsnitt 5). Kryosektioner kan vara tillräckliga för konfokalmikroskopi, eftersom tjockare prover kan tillhandahållas jämfört med hartssektioner, men inte lika tjocka som frihandsavsnitt. En fluorokrom konjugerad till vetegroddaragglutinin (WGA, se materialförteckning) appliceras på svampavbildning i fluorescensmikroskopi26. Ett konfokalmikroskop är inte nödvändigt, även om det kan ge tydliga tredimensionella bilder av växtstrukturer27.

  1. Bered en lösning av 0,2 mg/ml WGA-fluorokromkonjugat i 0,1 M PB28 (pH 7.2, kontrollera steg 5.1.1 och tabell 3). Förbered en lösning av 1% Calcofluor White i 0,1 M PB (pH 7,2). Förbered små mängder av dessa lösningar, eftersom sektionerna inkuberas direkt med dem.
  2. Inkubera sektionerna i glasskivorna i 30 minuter i WGA-fluorokromkonjugatlösning29, använd tillräckligt med volym för att täcka sektionerna och tvätta sedan i 0,1 M PB.
  3. Inkubera sektionerna i kalcofluorlösningen med tillräckligt med volym som monteringsmedium. Lösningen kan bibehållas under observationsperioden.
  4. Sätt täckglas på bilderna och observera i ett konfokalmikroskop eller ett fluorescensljusmikroskop med följande filter: TC / GFP (excitation: 470-440, utsläpp: 525-550, för WGA-fluorokrom i materialtabellen - svampcellväggsfluoresces grön under detta filter29) och DAPI (excitation: 358, utsläpp: 463, för Calcofluor White)30.
    OBS: Tredimensionella bilder kan erhållas med Z-seriens funktion i konfokalmikroskopet27.

8. Svepelektronmikroskopi av växtorgan

  1. Efter fixering av prover, uttorkning och lagring i 70% etanol (avsnitt 1) är en möjlighet att skära prover för att exponera önskad yta för SEM-analys, om det behövs (t.ex. inre vävnader, äggstocksstruktur). Använd ett vasst och nytt rakblad och gör snitt med en enkelriktad rörelse och undvik ett skadat utseende av dessa områden i SEM. Använd vid behov ett stereomikroskop för att välja proverna och överväga metallstubbområdet för att bestämma provstorlekar.
  2. Ytterligare dehydratprover för SEM i en etanolserie: 80%, 96% och 2x i absolut etylalkohol (≥99,8%). Håll små och känsliga prover i 30 minuter i varje koncentration och större och tätare prover i 1 timme.
  3. Vik små kuvert med silkespapper för att organisera prover för nästa steg, större prover kan hanteras utan kuvert. Identifiera kuverten med en penna genom att skriva ett brev eller ett nummer och föra en logg över alla prover i var och en. Förvara proverna i absolut etanol, men inte länge, och fortsätt till steg 8.4 så snart som möjligt.
  4. Fortsätt för torkning av kritisk punkt (CP). Använd en CP-torktumlare enligt standardrutiner. Placera proverna i absolut etanol (mellanvätska) i en tryckkammare. Vid den kritiska punkten för CO2 (31 °C, 7,3 x 106 Pa) löses mellanvätskan upp i övergångsvätskan (flytande koldioxid) och proverna torkas31.
  5. Efter CP-torkning, förvara proverna så snart som möjligt i en uttorkningsbehållare, till exempel en förseglad kolv som innehåller kiselgel. Luftfuktighet kan förstöra proverna om de återabsorberas31.
  6. Använd metallstubbar för att montera proverna. Innan du monterar, sätt på handskar för att manipulera stubbarna, sänk ner dem i aceton i 5 minuter för att eliminera fett och låt dem torka. Använd en ledande dubbelsidig koltejp för att fixa prover på stubben och ett stereomikroskop för att hjälpa till att placera prover, med tanke på att synen ovanifrån är det enda möjliga perspektivet i SEM-bilder.
  7. Manipulera prover med finpunktspincett, var försiktig eftersom provdelen som berörs av pincetten vanligtvis är skadad, så försök att röra vid delar som är placerade bort från de intressanta områdena (t.ex. områden i kontakt med tejpen). Behåll stubbarna med prover i en förseglad petriskål med kiselgel. Fortsätt till steg 8.8 så snart som möjligt.
  8. Använd en sputterbeläggning för att deponera ett lager av metall, vanligtvis guld eller platina, på ytan av proverna i en lågtrycksatmosfär av en inert gas, ofta argon31. Följ standardrutinerna när du använder en sputterbeläggning. Beläggningstjockleken beror på provernas topografi, vanligtvis mellan 15-40 nm32.
  9. Håll de belagda stubbarna i en förseglad petriskål med kiselgel, och förutsatt att kiselgelén behåller fuktigheten kan prover förvaras på detta sätt i veckor. Använd ett svepelektronmikroskop för att analysera proverna. Proverna i vacuo träffas av en stråle av elektroner, och emissionen av signaler från sådan interaktion tolkas som bilder31. För detaljer om hur du använder ett svepelektronmikroskop, läs Jeffree and Read (1991)31 och Bozzola och Russell (1999)32.
  10. För att återanvända stubbarna, dra i tejpen och skrubba dem med trådull. Tvätta i kranvatten, sänk ner i absolut etanol och torka dem tillräckligt, vilket förhindrar oxidation av den ingående metallen.

9. Transmissionselektronmikroskopi

  1. Prefixprover med glutaraldehyd-kakodylatbuffert enligt beskrivningen i steg 1.7 och 1.10. Efter 12-24 timmars prefixering, tvätta proverna 3x i 0,2 M kakodylatbuffert (pH 7,25) i 10 min. Utför postfixering med 1% osmiumtetroxid (OsO4) i 0,2 M kakodylatbuffert, i 12 timmar i mörkret, vid rumstemperatur. Tvätta 3x med destillerat vatten i 5 min.
    VARNING: Kakodilat och osmiumtetroxid är mycket giftiga och ska inte inhaleras. Använd dem i dragskåp, följ respektive säkerhetsdatablad.
  2. Dehydrera proverna med 30%, 50%, 70% och 96% etanol, 2x i varje koncentration, i 10 min. Torka sedan ut 3x i absolut alkohol, i 15 minuter varje gång.
  3. Infiltrera proverna i hydrofila akrylhartser (se materialtabell), en gång med 1:1 harts + absolut etanol och 3x med rent harts i 8-12 timmar vardera. Utför polymerisation i gelatinkapslar vid 60 °C tills den är helt stelnad (högst12 timmar).
  4. Noggrant utvärdera orienteringen av prover inuti hartsblocket; skär den övre delen av blocket, med ett rakblad, vilket gör en pyramidform som koncentrerar provet i sektionsområdet. Skaffa halvtunna sektioner (250-500 nm)33 i en ultramikrotom med en diamantkniv och placera på glasskivor i några droppar vatten.
  5. Förvara rutschkanorna på en värmeplatta vid 60 °C. Färga sektionerna med toluidinblått O som i steg 6.1.1 och låt fläcken torka helt. Tvätta försiktigt med kranvatten. Utvärdera den erhållna sektionen genom att rita fyra kvadranter och välja den lämpligaste kvadranten för analys.
  6. Trimma blocket så att pyramidformen koncentrerar den valda kvadranten på blockets övre yta. Producera ultratunna sektioner (50-100 nm)33,34. Tjockleken utvärderas enligt sektionernas interferensfärg: sektioner med cirka 70 nm verkar silverguld, med cirka 100 nm visas guld och med cirka 200 nm verkar blå34.
  7. Samla de ultratunna sektionerna från vatten med kopparnät och fortsätt till kontrastfärgningsmetoden med uranylacetat och blycitrat, som beskrivs nedan.
    1. Bered en blycitratlösning (tabell 5) och frys den slutliga lösningen i mikrocentrifugrör med 1 ml lösning i varje, endast tinande strax före användning.
    2. Bered en uranylacetatlösning: lös upp 0,625 g uranylacetat [UO2(CH3COO)2] i 25 ml nyligen kokt och kylt destillerat vatten. Förvara i en mörk kolv i frysen.
      VARNING: Blynitrat är giftigt vid förtäring. 1 N NaOH är mycket frätande. Uranylacetat är radioaktivt och giftigt. Det får inte intas, inandas eller komma i kontakt med huden.
    3. Vid färgning, placera båda beredda reagenserna i separata 3 ml sprutor med filterenheter (0,22 μm por, se materialförteckning). Förbered en petriskål vänd upp och ner med en tätande termoplastfilm över den (se materialtabell) och inuti en bredare skål, med NaOH-pellets på kanterna som en fälla för CO 2 32 (se figur 2).
    4. Kassera den första droppen och placera en droppe uranylacetat och tre droppar destillerat vatten över filmen för varje färgat galler. Gör samma sak med blycitrat och tillsätt ytterligare tre droppar destillerat vatten.
    5. Inkubera rutnätet (med den ogenomskinliga sidan nedåt, där sektionerna är) i uranyl i 30 min (variabel tid). Tvätta 3x i de destillerade vattendropparna och torka gallret varje gång försiktigt med filterpapper på den lysande sidan. Upprepa med blycitratdroppen (30 min) och tvätta den.
  8. Efter minst 4 h, analysera gallren i ett transmissionselektronmikroskop. I detta mikroskop passerar en stråle av elektroner genom sektionerna i vacuo och bilden projiceras på en fluorescerande skärm. För detaljer om hur du använder ett transmissionselektronmikroskop, läs Bozzola och Russell (1999)32.
blycitratlösning (för kontrastfärgning i tvärgående elektromagnetiskt läge)
steg 1 omge en bägare med tinfoil
steg 2 lös 0,266 g blynitrat [Pb(NO-3)2] i 6 ml nyligen kokt och kylt destillerat vatten
steg 3 agitera i 2 min
steg 4 tillsätt 0,352 g trinatriumcitrat [Na3(C6H5O7).2H2O] (lösningen måste få ett mjölkigt utseende)
steg 5 agitera i 15 min, försegla bägaren med tinfoil och överför lösningen till en 10 ml bägare
steg 6 tillsätt 1,6 ml 1N NaOH och 2,4 ml destillerat vatten (lösningen måste vara genomskinlig)
steg 7 vid behov justera pH-värdet nära 12

Tabell 5: Recept på blycitratlösning.

Figure 2
Figur 2: Kontrastfärgningsschema med blycitrat och uranylacetatlösningar . (A) Förbered petriskålarna, en vänd upp och ner (i mitten) med termoplastfilm så att droppar kan placeras ovanför den, inuti en bredare. NaOH-pellets är platser runt den centrala skålen. (B) Uranylacetatdroppar placeras i cirklarna med bokstaven U, och blycitratdroppar i cirklarna märkta L. DW indikerar droppar destillerat vatten. Gallren färgas sekventiellt i kolumnen, så fem rutnät kan färgas samtidigt som de representeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

10. Symbiotisk spiring av orkidéfrön

  1. Se till att lösningarna och alla material som används vid symbiotisk spiring av frön är sterila för att undvika kontaminering. Börja med att autoklavera dem i 20 minuter vid 121 °C. De symbiotiska grobarhetsstegen sammanfattas i figur 3.
  2. Desinficera ytligt frukter och frön genom att nedsänka dem i natriumhypokloritlösning innehållande 2% aktivt klor i 10-15 min för frukt och 7-10 min för frön, med tanke på styvheten och tjockleken på fröbeläggning9. Smala och bräckliga frön kan nedsänkas i en 1:1 utspädd natriumhypokloritlösning. Tvätta sedan 3x i autoklaverat destillerat vatten för att avlägsna hypokloritlösningen.
  3. Återhämta fröna genom att filtrera i serigrafiskt tyg och använd fröna för att fortsätta med grobarhetstester (helst). Förvara dem vid behov i filterpappershöljen inuti glasflaskor med kiselgel vid 4 °C, stäng kolvarna hermetiskt och försegla dem med plastfolie. Överför några droppar vatten från den sista tvätten till potatisdextrosagar (PDA, 39 g / L) för att utvärdera tvättprocessens effektivitet.
  4. Innan du sår frön i odlingsmediet, utvärdera deras livskraft genom tetrazoliumtestet (valfritt) enligt beskrivningen nedan35.
    1. Inkubera cirka 10 mg frön i ett mikrocentrifugrör med 1 ml 10% sackaros i destillerat vatten i 24 timmar vid rumstemperatur (ca 25 °C) i ljus.
    2. Ta bort sackaroslösningen med en mikropipett och tillsätt 1 ml 1% tetrazoliumlösning (trifenyltetrazoliumklorid) i destillerat vatten. Inkubera vid 40 °C i ett termoblock i 24 timmar i mörker.
    3. Ta bort tetrazoliumlösningen med en mikropipett och tvätta fröna med destillerat vatten 2x eller tills lösningen har tagits bort. Ta bort alla vätskor. Vid behov kan fröna förvaras i frysen i upp till en vecka (som i steg 10.3) innan de analyseras.
    4. Återsuspendera fröna i destillerat vatten och analysera dem under ett ljusmikroskop. Livskraftiga frön förvärvar ljus till mörkröd färg, medan icke-livskraftiga frön behåller sin naturliga färg.
  5. Utför följande anpassade9-protokoll för symbiotisk spiring av orkidéfrön.
    1. Inkubera fröna över autoklaverade filterpappersskivor (1-2 cm i diameter) placerade i petriskålar med havregrynagar (OMA) odlingsmedium (2,5 g / L havreflingor och 7 g / L agar, pH 6).
    2. I mitten av petriskålen inokulerar du ett fragment av odlingsmedium (ca 1 cm2) innehållande mycelium från den valda isolerade svampen för groningsförfarande. Försegla petriskålarna med plastfolie och inkubera dem i mörkret vid cirka 25 °C eller rumstemperatur, eftersom det är mer adekvat för svamptillväxt.
    3. Förbered några rätter med frön och utan svampinokulering, som en negativ kontroll för grobarhetstestet.
  6. Analysera grobarhetsresultaten varje vecka genom att samla in kvantitativa och kvalitativa data och fotografera protokormer och plantor. Observationen av frön och protokormer bör utföras med hjälp av ett stereomikroskop för en mer exakt bedömning av spiring. Använd en ljuskälla som kommer underifrån, eftersom det möjliggör större kontrast, vilket gör det möjligt att lättare skilja svampmyceliet från protocormer.
    1. Samla in prover i olika utvecklingsstadier och fixa för anatomiska analyser (avsnitt 1). Tillämpa alla tidigare beskrivna bildanalyser för att undersöka svampendofyter i frön, protokormer och plantor under groning (ljusmikroskopi - avsnitt 4, 5 och 6; konfokal och fluorescens - avsnitt 7; SEM och TEM - avsnitt 8 och 9).
    2. Generera kvantitativa resultat efter klassificering av steg enligt tabell 6. Stegen beskriver den vanliga utvecklingen av frön från mykoheterotrofa orkidéer. Samla in data varje vecka och tabell med de första datumen för varje observerat steg.
    3. Dessutom samla in kvantitativa data som uppskattar grobarhetsprocent och hastighet. Räkna minst 100 frön eller definiera räknefält35. Avgränsa tre eller flera räknefält per petriskål, bestående av fasta regioner med ett standardiserat område, och utvärdera varje vecka. Beräkna insamlade data enligt tillväxtindex (GI) ekvation:
      Equation 1
      där N 0 är antalet räknade frön i steg0 , N 1 avser steg1 , och det följer fram till steg 6 (registrerat som N6)36.

Figure 3
Figur 3: Schematisk sammanfattning av symbiotisk spiring av frön metodik. Scheman ger indikationer på detaljerade steg i protokollet. Förkortningar: OMA = havregrynagar, PDA = potatisdextrosagar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Sprängningsstadium Beskrivning
0 Ingen spiring
1 Svullnad av embryot
2 Testa-bristning
3 Absorberande hårstrån utvecklas
4 Stamprojektion utvecklas
5 Skydda skalor (skottblad) utvecklas
6 Första rötterna utvecklas

Tabell 6: Beskrivning av protocormutvecklingsstadier som tillämpas på periodiska analyser av grobarhetstester. Modifierad från stadier som beskrivs i Otero et al.36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter de väsentliga stadierna för fixering av växtvävnad ger cellulära strukturer så lika som möjligt till levande tillstånd, med tanke på morfologi, volym och rumslig organisation av cellulära komponenter och vävnader16. Observera sådana egenskaper i proverna efter kemisk fixering (figur 4). Figur 4C-F representerar tillräckligt fixerade prover under ljusmikroskopi. Att följa de beskrivna fixeringsprocedurerna och förvärva förtrogenhet med provstrukturen hjälper till att analysera fixeringsframgång.

Figure 4
Figur 4: Ytlig analys och sektioner från filiforma rötter av MH -orkidén Wullschlaegelia aphylla (Sw.) Rchb.f. (A och B) Rhizomorphs i filiform rotyta. (C och D) Frihandssektioner som inte är färgade, vilket visar pelotoner i kortikala celler. (E och F) Tunna sektioner färgade med toluidinblå O. Förkortningar: en = endodermis, ep = epidermis, ct = cortex, hy = hypha, pc = parenkymatös cell, pe = floemelement, pl = peloton, rfl = rot (filiform), rm = rhizomorph, vc = vaskulär cylinder, xe = xylemelement. Skalstänger: A = 2 mm; B = 500 μm; C och E = 200 μm; D = 100 μm; F = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Notera i figur 4C,D strukturernas regelbundenhet och frånvaro av skadade områden i en frihandssektion av ett prov som fixerats med 10 % NBF. Cellvolymen bevaras, som liknar levande vävnader. Att jämföra med ett frihandssnittat färskt organ är också viktigt för att känna igen väl fixerade prover. I figur 4E,F färgades sektioner från prover inbäddade i GMA-harts och fixerade med 10% NBF med toluidinblått O. Observera de välbevarade strukturerna i cellväggar, utan snedvridningar eller skadade områden, som visar mycket liknande egenskaper som i ett frihandssnittat prov (figur 4C,D).

Vid analys av ytan av underjordiska organ indikerar närvaron av rhizomorfer hyfer som koloniserar inre vävnader. Rhizomorfer är vegetativa strukturer som består av ett aggregat av mycket differentierade hyfer och bildas av några svamparter, främst saprotrofiska som sönderdelar trä37,38. Rhizomerna kan lätt kännas igen, vanligtvis som mörka skosnöreliknande strukturer37, sett i figur 4A, B och figur 7D. Att söka efter dessa svampstrukturer underlättar provvalet för att observera mönstret för svampkolonisering i växtorgan. I figur 4C,D erhölls sektionerna i områden med ytliga rhizomorfer, medan i figur 4E visas en sektion av samma organ utan val av sådant kriterium. Individualiserade hyfer kan också identifieras under ett dissekerande mikroskop med en perceptiv observation.

Figure 5
Figur 5: Frihandssektioner av Uleiorchis sp. lagringsstruktur . (A) Avsnitt under ett dissekerande mikroskop. (B) Pelotoner under ett ljusmikroskop, koncentrerade i ett område av organets cortex. (C och D) Hyphae-detaljer om de analyserade pelotonerna. Förkortningar: hy = hypha, pc = parenkymatös cell, pl = peloton, s = septa. Skalstänger: A = 2 mm; B = 500 μm; C och D = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Som tidigare förklarats kan frihandssektionering föredras i jämförelse med tunn sektionering beroende på syftet. Frihand eller andra metoder för att erhålla tjockare sektioner (mer än 10 μm tjocka) kan bättre evince pelotons och ge mer representativa bilder av svampmönster för kolonisering (till exempel figur 4C, D och figur 5A, B). Frihandssektioner kan också vara lämpliga för hyphae-analys vid högre förstärkning, vilket visas i figur 5C,D, även om detaljer uppnås bättre i tunnare sektioner, som i figur 7A, från ett prov inbäddat i GMA-harts. Vissa detaljer om växtcellstrukturer observeras tillräckligt i tunna sektioner, till exempel figur 4F. Montering är också ett viktigt steg, eftersom bilder av bättre kvalitet kan bero på monteringsmediet. GMA-hartsglas kan monteras i vatten eller glycerin, även om ett kommersiellt monteringsmedium (se materialtabell) kommer att förbättra den slutliga bilden eftersom den fyller brister från sektionsprocessen. I figur 6C kan brister ses (pilspetsar) i en GMA-hartssektion, eftersom bilden monterades med vatten.

Figure 6
Figur 6: Sektioner av fusiforma rötter av W. aphylla färgade med Lugol-lösning . (A) Frihandssektion färgad med toluidinblå O och Lugol. (B) Färgad endast med toluidinblått O. (C) Tunn sektion i GMA-harts färgad med laktofenolbomullsblå och Lugol, pilspetsar: brister från ojämnheter i bladet. (D) Frihandssektion färgad endast med Lugol. Förkortningar: cw = cellvägg, pc = parenkymatös cell, sg = stärkelsekorn, vc = kärlcylinder. Skalstänger: A = 200 μm; B och C = 100 μm; D = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Den största fördelen med att använda toluidinblå O (mer adekvata resultat i tunna sektioner) är de viktiga metakromatiska egenskaperna hos denna fläck, vilket innebär att den förvärvar olika färger beroende på den cellulära komponenten den binder till och fungerar som en polykromatisk fläck som är lämplig för att differentiera olika kompositioner av cellväggar23. I figur 4F kan sekundära cellväggar i xylemelement lätt identifieras med den ljusa färgen toluidin förvärvar. Under tiden identifieras floemelement, som endast består av primära cellväggar, av deras tunnare och mörkare cellväggar. En annan viktig fläck, främst med tanke på MH-växter, är Lugol-lösning, eftersom stärkelsekorn lätt identifieras när de färgas av den. Sektioner representeras i figur 6A-D: frihandssektion färgad med toluidinblå O och Lugol i figur 6A och endast toluidinblå O i figur 6B; Tunt avsnitt i genetiskt modifierat harts färgat med laktofenolbomull blått och lugol i figur 6C. frihandssektion färgad endast med Lugol i figur 6D.

Inkubation av frihand (figur 7C), GMA-harts (figur 7B) eller ULT-sektioner med WGA-fluorokromkonjugat och Calcofluor White kan förbättra strukturerna i svampcellväggen respektive växtcellväggen. Det är en viktig metod för att bekräfta hyfer, eftersom WGA-konjugat har specificitet mot N-acetylglukosaminylrester, närvarande i svampens cellvägg. Figur 7A visar en sektion av blommig stam färgad med toluidinblå O, medan figur 7B är från samma organ och bekräftar att strukturerna som ses i figur 7A är hyfer. Artefakter genom autofluorescens kan ses i GMA-hartssektioner (pilspetsar, figur 7B). Dessa artefakter är vanligtvis relaterade till fluorokromkoncentration och kan undvikas genom att tvätta proverna fler gånger med bufferten. I figur 7C visas en frihandssektion av rot, med interna och externa hyfer. Samma organ kan ses av SEM i figur 7D, med ett överflöd av rhizomorfer och individuella hyfer på dess yta. Adekvata SEM-mikrografer har god kontrast mellan nyanser av grått, så tridimensionalitet kan ses och tolkas väl. Välj representativa bilder och undvik vilseledande bilder (vidare läsning: tips för att välja elektronmikroskop32).

Figure 7
Figur 7: Sektioner från blommigstammen och filiformrötterna av W. aphylla och ytlig analys av filiformrot av SEM. (A) Tunn sektion av blommig stam i GMA-harts, färgad med toluidinblått O. (B) Tunn sektion av blommig stam i GMA-harts inkuberad med WGA-fluorokromkonjugat + Calcofluor White, pilspetsar: artefakter genom autofluorescens. (C) Frihandssektion av filiformrot inkuberad med WGA-fluorokromkonjugat + Calcofluor White. (D) Svepelektronmikrograf av filiformrotytan. Förkortningar: cw = cellvägg, hy = hyphae, pc = parenkymatös cell, pl = peloton, rfl = rot (filiform), rm = rhizomorph. Skalstreck: A, C och D = 100 μm; B = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Frukt från olika orkidéarter nedsänktes i natriumhypoklorit med 2% aktivt klor i 15 minuter för att garantera fullständig ytlig desinfektion av organen (Figur 8A). Frön med styvare fröskikt från Vanilla sp. (Figur 8A) och Pogoniopsis schenckii (Figur 9B-D) nedsänktes i samma lösning i 10 min (Figur 8C), medan smalare, som från Laelia sp. och Cattleya sp., bibehölls i 7 minuter (Figur 9A). Överföring av en alikvot av vatten från den sista tvätten bekräftade desinfektionsprocessens effektivitet innan man fortsatte till groningstesterna, med tanke på båda varaktigheterna av nedsänkning som beskrivs.

Figure 8
Figur 8: Ytlig desinfektion av frukter och frön av Vanilla panifolia, en fotosyntetisk orkidéart . (A) Fruktsänkning i natriumhypoklorit med aktivt klor. B) Frukt i längdriktningen. C) Frön som filtrerats med serigrafisk väv efter nedsänkning i natriumhypoklorit, redo att sås eller förvaras i kiselgel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Såning av fröna över filterpappersskivor säkerställer att det finns tillräckligt med fuktighet och syre för grobarhet och embryoutveckling (figur 9A-D) utan att vara helt nedsänkt under det ytliga vattenskiktet från odlingsmediet. Vissa svampisolat kan växa kraftigt över fröna. Mediet som innehåller 2 g / L krossade havreflingor ger bättre kontroll över svamptillväxt, vilket förbättrar visualiseringen och analysen av frön (figur 9B). Efter ca 50-60 dagars isolatinokulering måste mediet förnyas, så svampen förblir aktiv. Detta kan göras genom att överföra fröna till ett nytt OMA-medium med samma formulering. Fröna kan överföras med filterpapperet, vilket underlättar deras överföring utan att skada protocorms känsliga strukturer, förutom att hålla dem i den ursprungliga positionen utan att kompromissa med de tidigare etablerade räknefälten.

Figure 9
Figur 9: Protokoll för symbiotisk spiring . (A) Frön arrangerade över filterpapper i OMA-medium. (B) Petriskålar med frön och en inokulerad svamp (potentiellt mykorrhiza), inkuberad i ca 21 dagar. (C och D) Symbiotiska grobarhetsrätter med olika svampisolat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

De flesta orkidéarter gror inom några veckor efter att ha smittats av den inokulerade svampen eller fram till nästan mer än en månad (figur 10). Frön som inte gror inom 3 månader kommer förmodligen inte att gro om inte metodiken justeras. I sådana fall, överväga möjligheter som frö viloläge eller svampisolatet som inte är mykorrhizal. Vissa arter behöver specifika protokoll för att bryta viloläge, andra presenterar helt enkelt en hög specificitet för vissa mykorrhizapartners, som skiljer sig från de som valts för det symbiotiska grobarhetstestet (data som inte publicerats).

Figure 10
Figur 10: Pogoniopsis schenckii frön, en aklorofyll och MH orkidé, i OMA-medium med svampinokulat39 som kan stimulera spiring. (A-D) Inte grodda frön och protokormer i olika utvecklingsstadier. Förkortningar: ng = ingen grobarhet, pt = protocorm, ri = brusten integument, ts = turgid frö. Skalstänger = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Under de första veckorna efter inokulering av isolatet utvärderas diskarna, eftersom det vanligtvis tar 7-14 dagar tills hyphae uppnår fröna. Tänk på denna period, eftersom det är övervägande att börja registrera embryonernas utveckling. De subtila förändringarna under grobarhetsstegen kan endast detekteras under ett dissekerande mikroskop, med tanke på att strukturerna är så små. Vissa arter protocorms måste analyseras under ett ljusmikroskop för att identifiera absorberande hårstrån och skilja dem från hyfer. GI-analys kan ge mer sannolikt jämförbara resultat, generera en representation av insamlade data och ge mer vikt åt värden som motsvarar mer avancerade grobarhetsstadier. De slutliga värdena kan variera mellan noll och sex (eller enligt det sista definierade steget). Olika statistiska tester kan tillämpas på GI-analyser (t.ex. ANOVA, signifikansnivå), beroende på forskarens frågor och krav vid utförande av symbiotiska grobarhetstester.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bildanalyser inom växtanatomi och morfologi har en viktig potential att uppfylla mål och hjälpa till att förstå sambanden mellan mykoheterotrofa växter och deras oumbärliga svampendofyter, vilket framgår av studier av underjordiska organ6,40, strukturella analyser av symbiotisk spiring av frön39 och luft- och reproduktionsstrukturer 41 . Strukturell botanik, trots att den har förlorat sin prestige och sitt utrymme till andra områden inom växtvetenskap under det senaste decenniet1, är fortfarande framträdande när det gäller att svara på frågor och hjälpa till att avslöja nyheter och väsentliga växtegenskaper relaterade till utveckling, ekologi, fysiologi och evolution. Dessa metoder är tillsammans en grund för strukturella studier av växter, med tanke på viktiga aspekter av MH-växtanalys.

Viktig information ges för att noggrant samla MH-växter, eftersom de välutvecklade underjordiska organen annars kan skadas och inte samlas in helt. Anmärkningsvärda anpassningar av dessa strukturer6 och den intima kontakten med svampar från jord, kopplade till autotrofa växter42 eller sönderdelande bladskräp40 ska beaktas vid insamling och bevarande av de underjordiska strukturerna. De väsentliga stegen i provfixeringen måste följas på lämpligt sätt när det gäller korrekt beredning av fixeringsmedel och tidsfrågor, minsta tid som krävs mellan insamling och fixering och minsta tid som krävs i fixeringsmedlet innan du fortsätter till lagring. Strukturell analys av välbevarade prover beror på fixeringsprocessen, och de vanligaste och bäst bevarande fixeringsmedlen som används för att studera växtanatomi och elektronmikroskopi beskrivs i protokollavsnittet. Andra fixeringsmedel14,16,25 kan också tillämpas.

Som tidigare nämnts är processen att använda kemiska fixeringsmedel avgörande och kan utvärderas vid erhållande av provbilder. I LM bör cellulära strukturer vara så lika som möjligt i jämförelse med levande vävnader16. Volymen, morfologin och den rumsliga dispositionen av identifierbara cellulära komponenter bör likna så mycket som möjligt med de färska vävnaderna (icke-fixerade). I TEM kan välbevarade vävnader evinceras när tonoplasten är synlig, med släta konturer och inte dras bort från cytoplasman16. Plasmamembranet kan inte lossas och krympas bort från cellväggen. Prover för TEM måste samlas in så tunt som möjligt och inuti en droppe fixeringsmedel, vilket förklaras i protokollavsnittet. Användningen av buffertar associerade med fixeringsmedel ger viktiga förhållanden för osmolaritet och jonkomposition till proverna som fixeras, vilket undviker så många förändringar som möjligt i cellulär struktur och ultrastruktur16. I SEM är ett stort problem med isotoniska fixeringsmedel och att förbereda dem med buffertar, så det finns inga betydande förändringar i provvolymen (svullnad eller krympning)16.

Många olika inbäddningsmetoder för LM finns tillgängliga för att få sektioner för olika ändamål. Med tanke på färgning och inkubation av fluorescerande färgämnen presenteras två viktiga metoder för att analysera MH-växtorgan. De som beskrivs ovan (frihandssektioner, GMA-harts och ULT-inbäddning) är bland de vanligaste och enklaste, vilket ger metodologisk frihet och lämplighet för många typer av analyser. Konjugatet WGA-fluorokrom har stor potential i MH-växtstudier, eftersom det för närvarande är mer applicerat på svamppatogener28,29,30 och knappt används med MH-växter svampendofyter. De grundläggande och väsentliga stegen för skanning och överföring av elektronmikroskopi är detaljerade, eftersom dessa tekniker i hög grad kan bidra till strukturell analys av växter. SEM- och TEM-litteraturen är rik, och vidare läsning32,33,34,43 rekommenderas om andra typer av elektronmikroskopianalyser ska testas.

När det gäller symbiotiska spiringsförfaranden är det möjligt att genomföra fruktasepsis före dehiscens, utan att behöva desinficera fröna direkt. Frön från frukter som redan är öppna eller koloniserade av endofyter (redan beskrivna för MH-arter39,41) måste dock desinficeras direkt. En viktig anmärkning: tid och förhållanden för lagring och asepsisprocesser kan minska livskraften hos fröna från vissa arter som observerats vid utförandet av dessa experiment. Tetrazoliumreagens ger en färg som sträcker sig från ljus till mörkröd till embryon från livskraftiga frön. Embryon från icke-livskraftiga frön förblir med sin naturliga färg. Frön med kraftigt pigmenterade tegument eller styva fröskikt kan behöva en förbehandling före grobarhetstestet. Det rekommenderas att utföra skarvning av deras tegument, vilket möjliggör visualisering av embryot35.

Vissa potentiella mykorrhizasvampisolat från tropiska orkidéer, till exempel Ceratobasidium-arter , har en kraftig och accelererad tillväxt i ett näringsrikt odlingsmedium. Under behandlingen är det möjligt att isolaten helt täcker fröna när de växer, vilket gör datainsamling svår eller till och med omöjlig. Det vanliga protokollet som innehåller 4 g / L krossade havreflingor9 förhindrade datainsamling vid symbiotisk spiring av P. schenckii, vilket krävde en adequation till 2 g / L krossade havreflingor39. Att använda cirka 2,5 g / L havreflingor för att komponera OMA-medium vid symbiotisk grobarhet verkar vara tillfredsställande för att begränsa tillväxten av kraftigare svampisolat (opublicerade data).

Begränsningar kan uppstå från de beskrivna metoderna, av vilka några effektivt kan övervinnas genom att anpassa förfarandena eller tillämpa andra metoder. Som diskuterats tidigare är GMA-inbäddning endast effektiv för sektionering upp till 8 μm tjock. OCT-inbäddning ger dock olika tjocklekssektioner, inklusive tjockare (t.ex. 10-20 μm). Färgning av endast svampstrukturer i växtvävnader är inte lätt att utföra, även om WGA-fluorokrom är en viktig och effektiv konjugatfluorokrom som markerar svampcellväggar, även om det är dyrt. Andra kostnadsbegränsningar kan uppstå i SEM- och TEM-metoder, eftersom de höga kostnaderna och väsentligheten hos utrustningen gör att sådana analyser inte är triviala och vanliga för varje forskargrupp. Den symbiotiska spiringen av frötester, även om de är enkla och billigare, kräver mykorrhizasvampar för att ympa fröna och noggranna förfaranden för att undvika kontamineringar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna tackar finansiering från FAEPEX och FAPESP (2015/26479-6). MPP tackar Capes för hans magisterexamen stipendium (process 88887.600591/2021-00) och CNPq. JLSM tackar CNPq för produktivitetsbidrag (303664/2020-7). Författarna tackar också tillgången till utrustning och hjälp från LME (Laboratory of Electron Microscopy - IB / Unicamp), INFABiC (National Institute of Science and Technology on Photonics Applied to Cell Biology - Unicamp) och LaBiVasc (Laboratory of Vascular Biology - DBEF / IB / Unicamp); LAMEB (UFSC) och Eliana de Medeiros Oliveira (UFSC) för bidrag till kryoskyddsprotokollet; LME för bidrag till TEM-protokollet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma-Aldrich 179124 (for SEM stubs mounting)
Agar-agar (AA) Sigma-Aldrich A1296 (for seeds germination tests)
Calcofluor White Stain Sigma-Aldrich 18909 fluorescent dye (detects cellulose)
Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8 Sigma-Aldrich C2488 (for toluidine blue O staining)
Conductive Double-Sided Carbon Tape Fisher Scientific 50-285-81 (for SEM)
Confocal Microscope Zeiss (any model)
Copper Grids Sigma-Aldrich G4776 (for TEM)
Critical-point dryer Balzers (any model)
Cryostat Leica Biosystems (any model)
Dissecting microscope Leica Biosystems (= stereomicroscope, any model)
Entellan Sigma-Aldrich 107960 rapid mounting medium for microscopy
Ethyl alcohol, pure (≥99.5%) Sigma-Aldrich 459836 (= ethanol, for dehydration processes)
Formaldehyde solution, 37% Sigma-Aldrich 252549 (for NBF solution preparation)
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128 histological tissue fixative
Gelatin capsules for TEM Fisher Scientific 50-248-71 (for resin polymerisation in TEM)
Gelatin solution, 2% in H2O Sigma-Aldrich G1393 (dilute for slides preparation - OCT adherence)
Glutaraldehyde solution, 25% Sigma-Aldrich G6257 (for Karnovsky’s solution preparation)
HistoResin Leica Biosystems 14702231731 glycol methacrylate (GMA) embedding kit
Iodine Sigma-Aldrich 207772 (for Lugol solution preparation)
Lead(II) nitrate Sigma-Aldrich 228621 Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)
Light Microscope Olympus (any model)
LR White acrylic resin Sigma-Aldrich L9774 hydrophilic acrylic resin for TEM
Lugol solution Sigma-Aldrich 62650 (for staining)
Metal stubs for specimen mounts Rave Scientific (for SEM, different models)
Microtome Leica Biosystems manual rotary microtome or other model
Oatmeal agar (OMA) Millipore O3506 (for seeds germination tests)
OCT Compound, Tissue-Tek Sakura Finetek USA 4583 embedding medium for frozen tissues
Osmium tetroxide Sigma-Aldrich 201030 OsO4 (for TEM postfixation)
Parafilm M Sigma-Aldrich P7793 sealing thermoplastic film
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 (for Karnovsky’s solution preparation)
Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O Sigma-Aldrich P8920 (for slides preparation - OCT adherence)
Poly-Prep Slides Sigma-Aldrich P0425 poly-L-lysine coated glass slides
Polyethylene Molding Cup Trays Polysciences 17177A-3 (6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Polyethylene Molding Cup Trays Polysciences 17177C-3 (13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Potassium iodide Sigma-Aldrich 221945 (for Lugol solution preparation)
Potato Dextrose Agar (PDA) Millipore 70139 (for seeds germination tests)
Scanning Electron Microscope Jeol (any model)
Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane] Sigma-Aldrich A3648 (for slides preparation - OCT adherence)
Silane-Prep Slides Sigma-Aldrich S4651 glass slides coated with silane
Silica gel orange, granular Supelco 10087 (for dessicating processes)
Sodium cacodylate trihydrate Sigma-Aldrich C0250 (for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881 NaOH (for Karnovsky’s solution preparation and TEM contrast staining)
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 425044 NaClO (for seeds surface disinfection)
Sodium phosphate dibasic, anhydrous Sigma-Aldrich 71640 Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich S9638 NaH2PO4·H2O (for NBF and PB)
Sputter coater Balzers (any model)
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)
Sudan III Sigma-Aldrich S4131 (for staining)
Sudan IV Sigma-Aldrich 198102 (for staining)
Sudan Black B Sigma-Aldrich 199664 (for staining)
Syringe (3 mL, any brand, for TEM contrast staining)
Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 µm Millipore SLGV033R PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)
Tek Bond Super Glue 793 Tek Bond Saint-Gobain 78072720018 liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity
Toluidine Blue O Sigma-Aldrich T3260 (for staining)
Transmission Electron Microscope Jeol (any model)
Triphenyltetrazolium chloride Sigma-Aldrich T8877 (for the tetrazolium test in seeds germination)
Trisodium citrate dihydrate Sigma-Aldrich S1804 Na3(C6H5O7)·2H2O (for TEM contrast staining)
Ultramicrotome Leica Biosystems (any model)
Uranyl acetate Fisher Scientific 18-607-645 UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)
Vacuum pump (any model)
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate TermoFisher Scientific W11261 fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Evert, R. F. Esau’s Plant Anatomy: Meristems, Cells, and Tissues of the Plant Body: Their Structure, Function, and Development. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ, USA. (2006).
  2. Yeung, E. C. T., Stasolla, C., Sumner, M. J., Huang, B. Q. Plant Microtechniques and Protocols. , Springer International Publishing. Cham, Switzerland. (2015).
  3. Sokoloff, D. D., Jura-Morawiec, J., Zoric, L., Fay, M. F. Plant anatomy: at the heart of modern botany. Botanical Journal of the Linnean Society. 195 (3), 249-253 (2021).
  4. Leake, J. R. The biology of myco-heterotrophic (‘saprophytic’) plants. New Phytologist. 127 (2), 171-216 (1994).
  5. Bidartondo, M. I. The evolutionary ecology of myco-heterotrophy. New Phytologist. 167 (2), 335-352 (2005).
  6. Imhof, S., Massicotte, H. B., Melville, L. H., Peterson, R. L. Subterranean morphology and mycorrhizal structures. Mycoheterotrophy. , Springer. New York, NY. 157-214 (2013).
  7. Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style. Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).
  8. Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jersáková, J., Těšitelová, T. Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements. Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).
  9. Zettler, L. W. Terrestrial orchid conservation by symbiotic seed germination: techniques and perspectives. Selbyana. 18 (2), 188-194 (1997).
  10. Stewart, S. L., Kane, M. E. Symbiotic seed germination and evidence for in vitro mycobiont specificity in Spiranthes brevilabris (Orchidaceae) and its implications for species-level conservation. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. 43 (3), 178-186 (2007).
  11. Zhao, D. -K., et al. Orchid reintroduction based on seed germination-promoting mycorrhizal fungi derived from protocorms or seedlings. Frontiers in Plant Science. 12, 701152 (2021).
  12. Selosse, M. A., Roy, M. Green plants that feed on fungi: facts and questions about mixotrophy. Trends in Plant Science. 14 (2), 64-70 (2009).
  13. Merckx, V. S. F. T., Mennes, C. B., Peay, K. G., Geml, J. Evolution and diversification. Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , Springer. New York, NY. 215-244 (2013).
  14. Boon, M. E., Drijver, J. Routine Cytological Staining Techniques: Theoretical Background and Practice. Macmillan International Higher Education. , Hampshire, UK. (1986).
  15. Karnovsky, M. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27 (2), 137-138 (1964).
  16. Hayat, M. Fixation for Electron Microscopy. , Academic Press. New York, USA. (1981).
  17. Roland, J. C., Vian, B. General preparation and staining of thin sections. Electron Microscopy of Plant Cells. 1, 675 (1991).
  18. Gerrits, P. O., Horobin, R. W. Glycol methacrylate embedding for light microscopy: basic principles and trouble-shooting. Journal of Histotechnology. 19 (4), 297-311 (1996).
  19. Zhang, Z., Niu, L., Chen, X., Xu, X., Ru, Z. Improvement of plant cryosection. Frontiers in Biology. 7 (4), 374-377 (2012).
  20. BeneŠ, K. On the media improving freeze-sectioning of plant material. Biologia Plantarum. 15 (1), 50-56 (1973).
  21. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Preparation of slides and coverslips for microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), (2008).
  22. Sakai, W. S. Simple method for differential staining of paraffin embedded plant material using toluidine blue O. Stain Technology. 48 (5), 247-249 (1973).
  23. O’Brien, T., Feder, N., McCully, M. E. Polychromatic staining of plant cell walls by toluidine blue O. Protoplasma. 59 (2), 368-373 (1964).
  24. Ventrella, M. C., Almeida, A. L., Nery, L. A., Coelho, V. P. deM. Métodos Histoquímicos Aplicados às Sementes. Universidade Federal de Viçosa. , Viçosa, Brazil. (2013).
  25. Pearse, A. G. E. Histochemistry, Theoretical and Applied. , J & A Churchill. London, UK. (1960).
  26. Andrade-Linares, D. R., Franken, P. Fungal endophytes in plant roots: taxonomy, colonization patterns, and functions. Symbiotic Endophytes. , Springer. Berlin. 311-334 (2013).
  27. Wymer, C. L., Beven, A. F., Boudonck, K., Lloyd, C. W. Confocal microscopy of plant cells. Confocal Microscopy Methods and Protocols. , Humana Press. Totowa. 103-130 (1999).
  28. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. Manual de Técnicas Aplicadas à Histopatologia Vegetal. FEALQ. , Piracicaba, Brazil. (2021).
  29. Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera. European Journal of Plant Pathology. 154 (4), 1185-1193 (2019).
  30. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum. Frontiers in Plant Science. 9, 698 (2018).
  31. Jeffree, C. E., Read, N. D. Ambient-and low-temperature scanning electron microscopy. Electron Microscopy of Plant Cells. , 313-413 (1991).
  32. Bozzola, J. J., Russell, L. D. Electron Microscopy: Principles and Techniques for Biologists. , Jones & Bartlett Learning. Sudbury, MA, USA. (1999).
  33. Murray, S. Basic transmission and scanning electron microscopy. Introduction to electron Microscopy for Biologists. , Academic Press. 3-18 (2008).
  34. Tanaka, M. Glossary of TEM terms. , Available from: https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/ (2021).
  35. Seaton, P. T., et al. Orchid seed and pollen: a toolkit for long-term storage, viability assessment and conservation. Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses—Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 71-98 (2018).
  36. Otero, J. T., Ackerman, J. D., Bayman, P. Differences in mycorrhizal preferences between two tropical orchids. Molecular Ecology. 13 (8), 2393-2404 (2004).
  37. Koch, R. A., et al. Marasmioid rhizomorphs in bird nests: Species diversity, functional specificity, and new species from the tropics. Mycologia. 112 (6), 1086-1103 (2020).
  38. Webster, J., Weber, R. Introduction to Fungi. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
  39. Sisti, L. S., et al. The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn. Frontiers in Plant Science. 10, 1589 (2019).
  40. Martos, F., et al. Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids. New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).
  41. Alves, M. F., et al. Reproductive development and genetic structure of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn. BMC Plant Biology. 21 (1), 332 (2021).
  42. Merckx, V. S. F. T. Mycoheterotrophy: an introduction. Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , 1-17 (2013).
  43. Hall, J. L., Hawes, C. Electron Microscopy of Plant Cells. , Academic Press. Cambridge, UK. (1991).

Tags

Biologi utgåva 183 kryosektioner endofytiska svampar ljusmikroskopi mikrotomi mykoheterotrofa växter växtanatomi svepelektronmikroskopi frögroning färgningstekniker symbiotisk spiring transmissionselektronmikroskopi vetegroddar agglutinininkonjugat
Mikroskopitekniker för tolkning av svampkolonisering i mykoheterotrofa växtvävnader och symbiotisk spiring av frön
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pena-Passos, M., Sisti, L. S.,… More

Pena-Passos, M., Sisti, L. S., Mayer, J. L. S. Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds. J. Vis. Exp. (183), e63777, doi:10.3791/63777 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter