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Biology

Técnicas de Microscopia para Interpretação da Colonização Fúngica em Tecidos de Plantas Micoheterotróficas e Germinação Simbiótica de Sementes

Published: May 17, 2022 doi: 10.3791/63777
Automatic Translation
1, 1, 1
1LabPlaM - Mycoheterotrophic Plants Research Lab, Department of Plant Biology, University of Campinas (UNICAMP)

Summary

Este protocolo visa fornecer procedimentos detalhados para coleta, fixação e manutenção de amostras de plantas micoheterotróficas, aplicando diferentes técnicas de microscopia, como microscopia eletrônica de varredura e transmissão, microscopia de luz, confocal e fluorescência para estudar a colonização fúngica em tecidos e sementes geridas com fungos micorrizais.

Abstract

A botânica estrutural é uma perspectiva indispensável para compreender plenamente a ecologia, a fisiologia, o desenvolvimento e a evolução das plantas. Ao pesquisar plantas micoheterotróficas (ou seja, plantas que obtêm carbono de fungos), aspectos notáveis de suas adaptações estruturais, os padrões de colonização tecidual por fungos e a morfomia de órgãos subterrâneos podem iluminar suas estratégias de desenvolvimento e suas relações com a hifa, fonte de nutrientes. Outro papel importante dos fungos simbióticos está relacionado à germinação de sementes de orquídeas; todas as espécies de Orquídeas são micoterróticas durante a germinação e fase de mudas (micoheterotrofia inicial), mesmo as que fotossintetizam em estágios adultos. Devido à falta de reservas nutricionais em sementes de orquídeas, os simmbiontos fúngicos são essenciais para fornecer substratos e possibilitar a germinação. Analisar etapas de germinação por perspectivas estruturais também pode responder a questões importantes sobre a interação dos fungos com as sementes. Diferentes técnicas de imagem podem ser aplicadas para desvendar endofitos de fungos em tecidos vegetais, como são propostos neste artigo. Seções à mão livre e finas de órgãos vegetais podem ser manchadas e depois observadas usando microscopia leve. Um fluorocromo conjugado à aglutina germina de trigo pode ser aplicado aos fungos e co-incubado com Calcofluor White para destacar paredes de células vegetais em microscopia confocal. Além disso, as metodologias de digitalização e microscopia eletrônica de transmissão são detalhadas para orquídeas micterotróficas, e as possibilidades de aplicação desses protocolos em plantas relacionadas são exploradas. A germinação simbiótica das sementes de orquídeas (ou seja, na presença de fungos micorrizais) é descrita no protocolo em detalhes, juntamente com possibilidades de preparação das estruturas obtidas a partir de diferentes estágios de germinação para análises com microscopia de luz, confocal e elétron.

Introduction

A pesquisa estrutural em botânica, abrangendo morfologia vegetal e anatomia, é fundamental na compreensão de todo o organismo 1,2, e fornece perspectivas indispensáveis para integrar e contribuir para o conhecimento sobre a ecologia, fisiologia, desenvolvimento e evolução das plantas3. Os métodos de morfologia e anatomia vegetal atualmente compreendem protocolos, equipamentos e conhecimentos desenvolvidos recentemente, bem como há mais de um séculoatrás, 2. A execução contínua e adaptação dos métodos clássicos (por exemplo, microscopia leve) juntamente com técnicas mais recentes (por exemplo, microscopia confocal, microtomografia de raios-X) têm a mesma base essencial: conhecimento teórico que permite o desenvolvimento de uma metodologia.

A principal ferramenta na anatomia e morfologia das plantas é a imagem. Apesar do equívoco de que tais análises são observações simples, dando espaço a interpretações subjetivas2, analisar e compreender imagens nessa área requer conhecimento dos métodos aplicados (o equipamento, tipo de análise, procedimentos metodológicos), componentes celulares, histoquímica e o corpo vegetal (organização e função tecidual, ontogenia, adaptações morfológicas). Interpretar as imagens obtidas através de uma variedade de métodos pode levar à correlação entre forma e função, decifrando a composição química de uma estrutura, corroborando na descrição da taxa, na compreensão de infecções por fitopatógenos e outras avaliações desse tipo.

Ao pesquisar plantas micoheterotróficas (MH) (ou seja, plantas não fotossintéticas que obtêm carbono de fungos micorrizais 4,5), aspectos notáveis de suas adaptações estruturais, os padrões de colonização tecidual por fungos e a morfomia de órgãos subterrâneos podem iluminar suas estratégias de desenvolvimento e relações com a hifa, que são a fonte de nutrientes. Os órgãos subterrâneos das plantas de MS geralmente apresentam importantes adaptações relacionadas à sua associação com fungos do solo, por isso é essencial realizar essas investigações anatômicas e morfológicas6. Os órgãos aéreos da espécie MH não devem ser ignorados, pois os endófitos também podem estar presentes nesses tecidos, mesmo que não sejam fungos micorrizais (observações pessoais, ainda não publicadas).

Além da essencialidade bem estabelecida da associação de fungos micorrizais com espécies de MS durante todo o seu ciclode vida 7, todas as espécies de orquídeas, mesmo as autotróficas, têm um estágio micoheterotrófico obrigatório inicial em ambientes naturais. Ocorre porque o embrião das orquídeas é indiferenciado e carece de endosperm ou cotilledons, sendo assim incapaz de se desenvolver e se estabelecer em ambientes naturais sem o apoio nutricional dos parceiros fúngicos 4,8. Considerando isso, os protocolos simbióticos de germinação podem ser aplicados não apenas às espécies de MS, mas também às orquídeas fotossintestares, com o objetivo de investigar a especificidade orquídea-fungo no desenvolvimento de germinação e protocorma, metodologia muito aplicada em iniciativas de conservação de espécies ameaçadas 9,10,11.

Nesta montagem de métodos, descrevemos passos importantes envolvidos na coleta, fixação e armazenamento de amostras de plantas de MS para estudos anatômicos (seção 1), análise de superfície e seleção de amostras (seção 2), métodos de secção (à mão livre: seção 3, microtomia: seção 4, criomicrotomia: seção 5), coloração e montagem (seção 6), fluorescência e microscopia confocal de endofitos fúngicos (seção 7), microscopia eletrônica de varredura (seção 8), e microscopia eletrônica de transmissão (seção 9). Além disso, descrevemos um método de germinação simbiótica para sementes de orquídeas (MH e autotrófico, seção 10), pois os métodos de imagem mencionados anteriormente podem ser aplicados com sucesso para analisar a colonização fúngica de sementes, protocormas e mudas no processo de germinação.

Figure 1
Figura 1: Resumição esquemática dos métodos de imagem. Os esquemas fornecem indicações de etapas de protocolo nas quais são detalhadas. Abreviaturas: GMA = methacrilato glicol, OCT = composto de temperatura de corte ideal, SEM = microscopia eletrônica de varredura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As técnicas de microscopia descritas aqui em detalhes (Figura 1) são precedidas pelas seguintes etapas essenciais: coleta, fixação, desidratação, incorporação e secção de amostras. Como as etapas são variáveis (Figura 1) dependendo da técnica escolhida( s), é importante pensar com antecedência, considerando os fixativos a serem preparados e transportados para o local de coleta, como as amostras devem ser preparadas antes da fixação, os processos de desidratação a serem utilizados (seção 1) e diferentes possibilidades de incorporação e métodos de secção (seções 4, 5, e 9). A Figura 1 resume sequencialmente todas as etapas necessárias para cada técnica de microscopia completamente descrita abaixo.

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Protocol

1. Coleta, fixação e manutenção de amostras

NOTA: Plantas totalmente MS geralmente podem ser encontradas na floresta escura abaixo da história12,13, principalmente em áreas úmidas e abundantes em lixo, enquanto parcialmente plantas DE MS podem ser encontradas em florestas mais abertas12,13. As plantas de MS geralmente têm órgãos subterrâneos bem desenvolvidos em uma variedade de formas e tamanhos.

  1. Ao coletar espécies de MS, explore o solo ao redor da base vegetal, tomando cuidado para não danificar órgãos subterrâneos, e evite retirar as plantas do solo para evitar desconectar os órgãos aéreos dos subterrâneos.
  2. Procure cuidadosamente estruturas aéreas usando uma espátula de jardinagem enquanto explora os órgãos subterrâneos como raízes, caules, rizomas e órgãos de armazenamento, sem danificar essas estruturas.
  3. Remova partículas do solo para preservar estruturas frágeis, e lave delicadamente esses órgãos com água da torneira para enxaguar as partículas restantes do solo antes de fixar as amostras.
  4. As plantas de MS associadas ao lixo das folhas exigem atenção extra; coletar cuidadosamente órgãos ligados ao material em decomposição através de sua hifa, evitar retirar esses órgãos das estruturas conectadas e colecioná-los cuidadosamente, pois essas partes são altamente delicadas. Preservar estruturas com essas conexões e coletar o lixo também para análise.
  5. Se optar por analisar o material fresco utilizando técnicas de imagem, mantenha as amostras em sacos plásticos fechados com umidade adequada, água suficiente evaporando e hidratando a planta, evitando o excesso de água em contato com as amostras. Transporte-as imediatamente para o laboratório e analise as amostras no mesmo dia em que foram coletadas, prestando atenção se as amostras ainda estão preservadas ao analisá-las.
  6. Leve fixativos para o local de coleta em recipientes bem selados. Corrija amostras rapidamente após a coleta para microscopia leve (LM) e microscopia eletrônica de varredura (SEM) em qualquer um dos seguintes fixativos: formalina tamponada 10% neutra (NBF14, Tabela 1) ou solução de Karnovsky (modificada15, Tabela 2). A solução de Karnovsky pode ser preparada com tampão fosfato de 0,2 M15, a receita para a qual está descrita na Tabela 3.
  7. Para análise por microscopia eletrônica de transmissão (TEM), se sectionia as amostras com uma espessura de 4-3 mm dentro de uma gota de tampão de cacodilato de glutaraldeído-sódio (modificado16, Tabela 4) em seções menores de 1-2 mm de espessura. Descarte as bordas cortadas fora da gota. Transfira imediatamente as seções para um tubo de coleta com um volume de fixação mais de 10 vezes maior que o volume das amostras, por ser um fixador aditivo (ou seja, suas moléculas são quimicamente adicionadas às proteínas fixas16).
    ATENÇÃO: Os três fixados descritos são altamente tóxicos. Evite a inalação, especialmente durante seu uso no campo. Prepare todos os fixativos em um capô de fumaça usando luvas. Não misture cacodilato e ácidos, pois o gás arsênico pode ser formado16.
  8. Se as amostras fixas flutuarem no fixador, isso indica a presença de gás nos tecidos vegetais. O ar e outros gases impedem que o fixador penetre toda a amostra2. Remova o gás dos tecidos reamostrando-os em partes menores e usando uma bomba de vácuo (-300 a -400 inHg pressão) até que todas as amostras afundem até o fundo da solução17. Tenha cuidado, pois a pressão excessiva exercida pela bomba pode danificar amostras.
  9. Depois de pelo menos 48 h na solução de Karnovsky ou 10% NBF, lave as amostras em 0,2 M PB (Tabela 3) e desidrate-as com uma série de 10%, 30%, 50% e, finalmente, 70% de etanol. Para amostras delicadas, desidratar por 30 minutos em cada concentração; para amostras maiores, desidratar por 1h ou mais.
    NOTA: Uma solução de 70% de etanol é o meio ideal para armazenar amostras. Amostras em 70% de etanol podem ser armazenadas à temperatura ambiente por anos. Não armazene material vegetal por longos períodos nos fixativos, pois remover agentes de fixação é um passo essencial após a fixação2.
  10. Armazene amostras em glutaraldeído-cacodilato a 4 °C antes de prosseguir para a pósfixação (etapa 9.1).
Formalina tamponada neutra de 10% (NBF)14
passo 1 adicionar 10 mL de solução de formaldeído de 37-40% em 80 mL de água destilada
passo 2 adicionar 0,4 g de monohidrato monobásico fosfato de sódio (NaH2PO4· H2O) para a solução
passo 3 adicionar 0,65 g de fosfato de sódio dibásico, anidra (Na2HPO4)
passo 4 compõem o volume para 100 mL

Tabela 1: 10% de receita de formalina tamponada neutra14.

Solução de Karnovsky (modificada15)
passo 1 em 20 mL de água destilada a 60-70 °C
passo 2 adicionar 0,8 g de paraformaldeído (para obter 4% c/v), agitação
passo 3 adicionar 1-4 gotas de 40% NaOH e mexer até que a solução fique clara
passo 4 esfrie-o e adicione 30 mL de 0,2 M tampão de fosfato pH 7.2 (Tabela 3)
passo 5 diluir 25% de glutaraldeído em 0,1 M PB (pH 7.2) para obter 1% de glutaraldeído (volume final: ~60 mL)
passo 6 adicionar 1% de glutaraldeído (passo 5) à solução obtida na etapa 4 até fazer até 100 mL de fixação

Tabela 2: Receita de solução de Karnovsky (modificada15).

Tampão fosfato de 0,2 M (PB) pH 7.2
passo 1 adicionar 14.196 g de fosfato de sódio dibásico, anidro (Na2HPO4) a 400 mL de água destilada
passo 2 adicionar 13,8 g de monohidrato monobásico fosfato de sódio (NaH2PO4· H2O)
passo 3 mexer até que a solução esteja clara
passo 4 ajustar o volume final para 500 mL com água destilada
passo 5 ajustar pH para 7,2
passo 6 para um PB de 0,1 M, diluir 1:1

Tabela 3: 0,2 M receita tampão fosfato.

3% glutaraldeído 0,2 M tampão de cacodilato de sódio (modificado16)
passo 1 Tampão de cacodilato de 0,2 M: adicione 4,28 g de trihidrato de cacodilato de sódio em 100 mL de água destilada
passo 2 ajustar pH para 7,2
passo 3 adicionar 12 mL de 25% glutaraldeído em 25 mL da solução na etapa 2 (0,2 M de tampão de cacodilato pH 7.2)
passo 4 compõem o volume até 100 mL com água destilada

Tabela 4: 3% glutaraldeído 0,2 M receita tampão de cacodilato de sódio (modificado16).

2. Análise superficial de órgãos em material fixo e não fixo

  1. Para analisar a higfa superficial em órgãos, especialmente os subterrâneos, e aqueles em contato com lixo de folhas, observe material fixo ou fresco em um microscópio dissecador (estereoscópio) a uma ampliação de 7,5x ou mais, dependendo das amostras analisadas.
    1. Visualize as amostras imersas no fixador, 70% etanol (se armazenado nele), ou água da torneira no caso de material fresco. Evite a luz direta do microscópio de dissecação, pois pode secar e danificar amostras.
    2. Busca por áreas de interesse nas amostras, guiadas pelos higifados superficiais e rizomorfos. Selecione amostras que contenham áreas com rizomorfos superficiais, pois estes podem ser seccionados para visualizar pelotões e bobinas de higifize dentro de células corticais em raízes e caules.
    3. Após a seleção, siga as etapas 1.6 e 1.9 se as amostras ainda não estiverem fixas. Se desejar, fotografe amostras frescas usando um microscópio leve sem fixação, conforme descrito na seção 3.
    4. Use a câmera acoplada ao estereómico para coletar imagens de superfícies de órgãos, rizomorfos e outras estruturas observadas. Nesses casos, providencie uma cor de fundo adequada para contrastar bem com o material e, se possível, escolha um material de fundo com uma superfície menos áspera (por exemplo, papel).

3. Seções à mão livre de órgãos vegetais

NOTA: Seções à mão livre de órgãos vegetais podem ser desafiadoras, especialmente para estruturas pequenas e finas. No entanto, essas seções de tecidos com endofífitos fúngicos podem, em alguns casos, melhor evince hyphae e outras características em comparação com seções finas.

  1. Se sectionia amostras frescas ou fixas com uma lâmina afiada, cortando-as o mais finas possível e colocando-as imediatamente em uma pequena placa de Petri com água (se fresca) ou 70% de etanol (se fixada). Use um pequeno pincel para manipular as seções sem danificá-las.
  2. Para facilitar a secção de materiais mais desafiadores (ou seja, órgãos pequenos, finos e flexíveis), cerque a amostra em uma estrutura, por exemplo, poliestireno ou petiole cecropia . Esculpe o suporte para acomodar a amostra e faça uma seção fina da amostra e do suporte completamente.
  3. Colora e monte as amostras conforme descrito na seção 6.

4. Incorporar amostras de plantas em resina e secção

  1. Desidrata ainda mais as amostras armazenadas em 70% de etanol em 80%, 96% e 2x em 100% etanol, por 30 min a 2h, dependendo do tamanho e composição das amostras.
  2. Use um kit de resina de methacrilato glicol (GMA) de acordo com as instruções do fabricante. Verifique Gerrits e Horobin (1996)18 para mais considerações. Siga a infiltração e incorpore etapas de acordo.
    ATENÇÃO: A resina GMA é tóxica, pode causar reação alérgica e irritação de pele, olhos e mucosa. Use os reagentes em um capô de fumaça e use luvas.
  3. Use bandejas de moldagem de polietileno para incorporação, selecionadas pelo tamanho das amostras (por exemplo, 13 mm x 19 mm x 5 mm para amostras maiores, 6 mm x 8 mm x 5 mm para as menores). Preste atenção à orientação amostral desejada dentro do molde e use uma agulha para ajudar a orientar.
  4. Deixe para polimerização, de preferência à temperatura ambiente, até se solidificar completamente. O processo de endurecimento geralmente leva algumas horas, embora seja recomendado desenformar os blocos no dia seguinte. Após a polimerização, desprende cuidadosamente os blocos de resina dos moldes e prossiga para fixar os blocos o mais rápido possível para evitar curvas de blocos.
  5. Lixe a face do bloco de resina que será anexado, criando uma superfície plana. Cole o bloco de resina a um cuboide de madeira (2 cm x 2 cm x 3 cm recomendado) com um adesivo de cianoacrilato líquido de viscosidade média (ver Tabela de Materiais). Certifique-se de que a resina está completamente ligada para evitar comprometer a secção.
  6. Realizar a secção em um microtome rotativo como descrito abaixo.
    ATENÇÃO: As lâminas das facas de microtome são muito afiadas e podem causar acidentes. Certifique-se de manuseá-los seguindo todas as medidas de segurança. Antes de se aproximar da faca (por exemplo, para mudar o bloco, para molizar a resina), tranque o volante grosseiro e coloque a tampa de segurança da lâmina. Armazene lâminas descartáveis em casos apropriados. Tenha muito cuidado ao substituir as lâminas.
    NOTA: Diferentes tipos de facas (por exemplo, descartáveis ou fixas; vidro ou aço) podem ser usadas para seção de resina GMA18. A qualidade das seções depende de quão afiada a faca é. Certifique-se de que a faca está bem presa e não pode se mover. Facas descartáveis podem precisar ser trocadas regularmente para obter uma melhor secção.
    1. Coloque o cuboide de madeira firmemente no suporte do bloco. Ajuste a orientação da secção usando os parafusos de orientação e certifique-se de um ângulo adequado da faca usando a inclinação da faca. Selecione a espessura das seções; use uma configuração mais grossa para aparamento e uma configuração mais fina para seções selecionadas, uma vez que as seções GMA aderem mais adequadamente ao slide de vidro quando mais finos; a espessura sugerida para tecidos vegetais é de 5-8 μm.
    2. Antes de começar, esfrie o quarto, se necessário, pois temperaturas mais altas pioram a qualidade das seções. Prepare o seguinte para secção: um béquer com água destilada, uma placa quente, pincéis (pelo menos dois), pinças de ponta fina, uma pipeta Pasteur, lâminas de vidro, papel filtro (ou papel de tecido) e um lápis (para identificar as amostras que estão sendo seccionadas).
    3. Ajuste a placa quente para 50 °C e coloque o béquer sobre ela. Preste atenção às diferenças no aquecimento dependendo da área da placa quente (geralmente, a área média aquece mais do que as bordas; aqueça a água no meio, de preferência).
    4. Escolha um slide de vidro, identifique-o com um lápis e enco meia a água quente destilada por toda a superfície do slide. Se necessário, use uma solução (por exemplo, detergente e água, ou 70% de etanol) para quebrar a tensão entre a água e o vidro, de modo que todo o slide esteja igualmente coberto. Alguns tipos de slides devem ser pré-limpos com 70% de etanol para obter a adesão adequada da seção.
    5. Comece avançando gradualmente a face do bloco de resina em direção à lâmina da faca. Não tente a secção sem avançar primeiro o bloco, ou então o equipamento e o bloco podem ser danificados. Se necessário, corte o bloco usando uma espessura maior (10 μm e acima).
    6. Ao se aproximar de uma seção adequada, faça um movimento firme de mão única com o volante, de modo que a seção seja feita de uma só vez. Verifique a umidade da resina. Durante a secção, hidrate regularmente a face do bloco sendo cortado usando um pincel mergulhado em água destilada se houver um problema com seções de enrolamento. Remova o excesso de água com um papel de tecido.
    7. Com um par de pinças de ponta fina, coloque a seção obtida na água sobre o escorregador. Ao entrar em contato com a água, a resina GMA se estende. Se necessário, use um pincel para se desdobrar suavemente e esticar as seções. Use outro pincel para manter constantemente a lâmina livre de detritos de resina. Não alternar entre as pincéis para evitar molhar a lâmina.
    8. Depois de fazer fila em todas as seções desejadas no slide, seque a face inferior do slide e coloque-a acima da placa quente. Remova o excesso de água da parte superior do slide, cortando suavemente com um papel filtro (opcional). As seções aderirão quando a água evaporar do deslizamento. Não deixe os slides muito tempo para evitar que as seções sejam danificadas pelo calor excessivo.
    9. Armazene os slides em uma caixa de slides, longe da poeira e do sol, e use-os para coloração e outros procedimentos. Os slides podem ser armazenados por vários anos.

5. Congelar amostras de plantas e seccionar com um criostat

NOTA: A consideração essencial no tecido biológico criosectioning é reduzir os danos devido à formação de cristais de gelo ao congelar amostras. A crioproteção é geralmente feita infundindo soluções quimicamente inertes, como glicerol ou sacarose19,20.

  1. Um dia antes da seção da amostra, execute as seguintes etapas.
    1. Diluir 100 mL de 0,2 M PB (Tabela 3) em 100 mL de água destilada para obter 200 mL de 0,1 M PB. Preparar 10%, 20% e 30% soluções de sacarose em 0,1 M PB (por exemplo, para uma solução de 10%, adicionar 2 g de sacarose em 20 mL de tampão).
    2. Para amostras frescas, lave-as em 0,1 M PB por 30 minutos. Para amostras fixas, lave-as no mesmo tampão usado para preparar o fixador por 30 minutos. Para amostras em 70% de etanol, hidrate-os em 50% e 30% de etanol e lave em 0,1 M PB por 1h em cada solução.
    3. Incubar as amostras por 2h em 10% de sacarose, 2h em 20% de sacarose e 2h em 30% de sacarose, à temperatura ambiente. Em seguida, incubar durante a noite em 30% de sacarose a 4 °C (ou pelo menos por 3h; o tempo máximo é de 48 h).
  2. No dia da secção, prepare 40% e 50% de sacarose em 0,1 M PB; não prepare soluções de sacarose com mais de 12h de antecedência. Incubar por 2h em cada concentração de sacarose, a 4 °C.
  3. Para incorporar, em pequenos moldes, faça uma camada de composto OCT (meio de temperatura de corte ideal, usado para incorporar e congelar as amostras) e mantenha-o a -20 °C para congelar. Os moldes podem ser moldes histológicos regulares, embora para facilitar a desoldagem dos blocos, papel ou papel alumínio podem ser feitos usando um pequeno cuboide como moldura e fita adesiva.
  4. Depois que a camada inferior do composto OCT estiver congelada nos moldes, trabalhe dentro de uma câmara criostat (ca. -27 °C). Coloque as amostras incubadas em 50% de sacarose nos moldes, na orientação em que serão seccionadas. A face superior de um bloco cuboide é geralmente uma melhor face de secção. Marque no molde onde as amostras são colocadas, para que o bloco possa ser facilmente aparado, e a orientação correta mantida.
  5. Cerque as amostras no composto OCT e estoure qualquer bolha de ar tocando as amostras. Congele-os a -20 °C. Com os blocos totalmente congelados, coloque-os dentro da câmara criostat (ca. -27 °C). Desenforme cada um antes de usar e preste atenção às marcas que indicam a localização da amostra dentro do bloco.
  6. Como o composto OCT é facilmente cortado com uma lâmina, corte adequadamente os blocos antes de posicioná-los sobre os mandris. Coloque algum composto OCT no mandril criostat e posicione o bloco para que a face superior seja seccionada. Rostos com áreas menores fornecem seções melhores. Aguarde até que o bloco esteja bem ligado ao mandril e teste-o antes de começar a seção.
  7. Coloque o mandril firmemente no suporte do mandril. Ajuste a orientação da secção usando os parafusos de orientação. Ajuste o ângulo da faca usando a inclinação da faca. Selecione a espessura das seções. As amostras podem ser seccionadas mais grossas do que as seções de resina usuais. Seções em uma faixa entre 5-20 μm são obtidas com sucesso, com seções mais grossas sendo mais fáceis de fazer (menos curling e menos danos de estruturas).
  8. Avance a face do bloco congelado em direção à lâmina da faca. Não tente seccionar sem fazê-lo, ou então o bloco pode ser retirado do mandril e danificado. Se necessário, corte o bloco usando uma espessura maior (10 μm e acima).
  9. Ao se aproximar de uma seção adequada, coloque a placa anti-rolo (ou seja, uma placa transparente que manterá a seção) acima da faca e faça um movimento firme de mão única com o volante, de modo que a seção seja feita de uma só vez. Problemas de enrolamento podem ser causados se a placa anti-rolo precisar ser ajustada (geralmente é ajustável em referência à lâmina) ou se houver detritos na lâmina. Limpe a lâmina constantemente com um pincel para remover detritos.
  10. Use slides especiais para que as seções se conectem facilmente, como slides silanizados (comercial ou preparado com 2% de aminoalkylsilane na acetona21), ou slides preparados com 500 μg/mL poli-L-Lysine em água destilada21 ou 0,2% de gelatina (veja detalhes21). Mantenha os slides em temperatura ambiente.
  11. Para aderir a seção a um slide, levante a placa anti-rolo e faça rapidamente o slide tocar na seção. Como o slide está em temperatura ambiente, a seção derrete imediatamente e adere ao slide. Preste atenção para virar a face tratada do slide para a seção, que pode permanecer acima da faca ou na face interna da placa anti-rolo. Para evitar enrolar as seções, execute esta etapa rapidamente assim que a placa for levantada e tenha cuidado para não contortar a seção.
  12. Deixe o slide fora da câmara criostat (em temperatura ambiente) se novas seções forem adicionadas a ela. Depois de aderir a todas as seções desejadas ao slide, mantenha-a dentro da câmara criostat ou no congelador (-20 °C ou abaixo). Não exponha os slides à umidade. Mantenha-os em uma caixa de slides e lembre-se de identificar os slides com um lápis.
    NOTA: Slides e blocos de OCT podem ser armazenados a -20 °C, embora não por muito tempo. Para obter melhores resultados, use os slides e os blocos dentro de alguns dias.

6. Seções de plantas de coloração e endofitos para microscopia leve

NOTA: Muitos tipos de manchas podem ser usadas para seções de plantas. É desafiador manchar diferencialmente fungos endofíticos e tecidos vegetais. Embora não seja um procedimento de coloração, um método para marcar estruturas de fungos é apresentado na seção 7 (fluorescência com um conjugado de aglutina de germe de trigo). Seções à mão livre (explicadas na seção 3), seções de resina (seção 4) e criosections (seção 5) podem ser manchadas, embora as manchas à base de fenol e álcool sejam desafiadoras para essas amostras, pois a resina GMA e o OCT perdem a adesão ao slide nesses casos.

  1. Use um ou combine os seguintes métodos habituais de coloração para amostras de plantas.
    1. Toluidina azul O 22,23, um método muito aplicado para coloração geral de seções vegetais. Prepare uma solução de 0,05% toluidina azul O em fosfato de 0,1 M (pH 6,8) ou tampão citrato de 0,09 M (pH 4,5-4,8), dependendo das espécies e tipos de tecido. Incubar seções de resina GMA por 2-10 min usando um frasco de coloração de slides ou colocando algumas gotas acima das seções se poucos slides estiverem manchados. Lave cuidadosamente com água destilada ou tampão após a incubação e monte os slides com água ou seque-os em uma placa quente para produzir lâminas permanentes conforme descrito na etapa 6.3.
    2. O reagente Lugol2 indica a presença de amido. Prepare uma solução de iodo de 5% (I2) e 10% de iodeto de potássio (KI) em água destilada. Manchas por 2 minutos, adicionando algumas gotas acima do escorregador e, em seguida, lave com água destilada. Este teste histoquímico é geralmente aplicado a slides temporários.
    3. Sudão III, IV e mancha B24,25 preta para diferentes lipídios. Prepare uma solução de 0,3% Sudão (III, IV ou B preto) em 70% de etanol, aqueça-o até ferver e deixe esfriar. Use o supernaspeuta, filtre-o e incuba seções por 15-30 min em uma placa de Petri fechada. Lave as seções cuidadosamente com 70% de etanol e água destilada. Monte os slides com água (geralmente aplicado apenas a lâminas temporárias).
      NOTA: Como o Sudão é um corante à base de álcool, é mais adequado para seções à mão livre. Conduza a mancha da seção de resina GMA cuidadosamente, pois elas geralmente se desprendem do slide.
  2. Para lâminas temporárias, monte as seções em água ou glicerina e observe posteriormente. Sele a mancha com esmalte para preservá-los um pouco mais.
  3. Para slides permanentes, monte as seções com resinas sintéticas (por exemplo, meio de montagem rápida, consulte Tabela de Materiais). Goteque algumas gotas do meio de montagem (pode transbordar a tampa), coloque o deslizamento de tampa cuidadosamente para evitar bolhas e use pinos de roupas para pressionar o slide contra o deslizamento até ficar totalmente seco. Remova o excesso de meio de montagem seca com uma lâmina de barbear.

7. Aplicação de um fluorocromo conjugado ao germe de trigo aglutinina em fluorescência e microscopia confocal

NOTA: Este método pode ser aplicado em seções à mão livre (explicadas na seção 3), seções de resina (seção 4) e crioseções (seção 5). As criosecções podem ser adequadas para fins de microscopia confocal, uma vez que amostras mais grossas podem ser fornecidas quando comparadas a seções de resina, mas não tão grossas quanto as à mão livre. Um fluorocromo conjugado à aglutinina germe de trigo (WGA, ver Tabela de Materiais) é aplicado à imagem fúngica na microscopia de fluorescência26. Um microscópio confocal não é essencial, embora possa fornecer imagens tridimensionais claras das estruturas das plantas27.

  1. Prepare uma solução de 0,2 mg/mL WGA-fluorocromo conjugado em 0,1 M PB28 (pH 7.2, confira a etapa 5.1.1 e a Tabela 3). Prepare uma solução de 1% Calcofluor Branco em 0,1 M PB (pH 7.2). Prepare pequenas quantidades dessas soluções, pois as seções são incubadas diretamente com elas.
  2. Incubar as seções nas lâminas de vidro por 30 minutos na solução conjugada WGA-fluorocromo29, utilizando volume suficiente para cobrir as seções e depois lave em 0,1 M PB.
  3. Incubar as seções na solução calcofluor, utilizando volume suficiente como meio de montagem. A solução pode ser mantida durante o período de observação.
  4. Coloque tampas nos slides e observe em um microscópio confocal ou um microscópio de luz de fluorescência usando os seguintes filtros: TC/GFP (excitação: 470-440, emissão: 525-550, para WGA-fluorocromo na Tabela de Materiais - fluoresces de parede fúngica verde sob este filtro29) e DAPI (excitação: 358, emissão: 463, para Calcofluor Branco)30.
    NOTA: Imagens tridimensionais podem ser obtidas usando a função série Z no microscópio confocal27.

8. Microscopia eletrônica de varredura de órgãos vegetais

  1. Após a fixação de amostras, a realização de desidratação e o armazenamento em 70% de etanol (seção 1), uma possibilidade é cortar amostras para expor qualquer superfície desejada para análise sem, se necessário (por exemplo, tecidos internos, estrutura do ovário). Use uma lâmina afiada e nova e faça cortes com um movimento unidireita, evitando uma aparência danificada dessas áreas no SEM. Se necessário, use um estereoscópio para selecionar as amostras e considere a área de stubs metálicos para determinar os tamanhos da amostra.
  2. Desidratar ainda mais amostras para MEI em séries etanolicas: 80%, 96% e 2x em álcool etil absoluto (≥99,8%). Mantenha amostras pequenas e delicadas por 30 minutos em cada concentração e amostras maiores e mais densas por 1h.
  3. Dobre pequenos envelopes usando papel de tecido para organizar amostras para os próximos passos, amostras maiores podem ser manuseadas sem um envelope. Identifique os envelopes com um lápis escrevendo uma letra ou um número, e mantenha um registro de todas as amostras em cada uma delas. Mantenha as amostras em etanol absoluto, embora não por muito tempo, e prossiga para a etapa 8.4 o mais rápido possível.
  4. Prossiga para a secagem de ponto crítico (CP). Opere uma secadora cp de acordo com os procedimentos operacionais padrão. Coloque amostras em etanol absoluto (fluido intermediário) em uma câmara de pressão. No ponto crítico de CO2 (31 °C, 7,3 x 106 Pa) o fluido intermediário dissolve-se no fluido de transição (dióxido de carbono líquido), e as amostras são secas31.
  5. Após a secagem do CP, armazene amostras o mais rápido possível em um recipiente de dessacação, por exemplo, um frasco selado contendo gel de sílica. A umidade atmosférica pode destruir as amostras se reabsorvida31.
  6. Use estações metálicas para montar as amostras. Antes de montar, coloque luvas para manipular os stubs, mergulhe-os em acetona por 5 minutos para eliminar qualquer gordura e deixe-os secar. Use uma fita adesiva de carbono de dois lados condutor para corrigir amostras no stub, e um estereótipo para ajudar a posicionar amostras, tendo em mente que a visão de cima é a única perspectiva possível em imagens SEM.
  7. Manipule amostras com pinças de ponta fina, tomando cuidado, pois a parte da amostra tocada pela pinça é geralmente danificada, por isso tente tocar peças posicionadas longe das áreas de interesse (por exemplo, áreas em contato com a fita). Mantenha os stubs com amostras em uma placa de Petri selada com gel de sílica. Prossiga para a etapa 8.8 o mais rápido possível.
  8. Use um cabador de sputter para depositar uma camada de metal, geralmente ouro ou platina, na superfície das amostras em uma atmosfera de baixa pressão de um gás inerte, frequentemente argônio31. Siga os procedimentos operacionais padrão ao usar um revestimento sputter. A espessura do revestimento depende da topografia das amostras, geralmente entre 15-40 nm32.
  9. Mantenha os stubs revestidos em uma placa de Petri selada com gel de sílica, e desde que o gel de sílica esteja retendo a umidade, as amostras podem ser armazenadas desta forma por semanas. Use um microscópio eletrônico de varredura para analisar as amostras. As amostras em vacuo são atingidas por um feixe de elétrons, e a emissão de sinais de tal interação é interpretada como imagens31. Para obter detalhes sobre a operação de um microscópio eletrônico de varredura, leia Jeffree and Read (1991)31 e Bozzola e Russell (1999)32.
  10. Para reutilizar os stubs, puxe a fita adesiva e esfregue-as com lã de arame. Lave na água da torneira, mergulhe no etanol absoluto e seque-os adequadamente, impedindo a oxidação do metal constituinte.

9. Microscopia eletrônica de transmissão

  1. Amostras de prefixo com tampão glutaraldeído-cacodilato, conforme explicado nas etapas 1.7 e 1.10. Após 12-24 h de prefixação, lave as amostras 3x em tampão de cacodilato de 0,2 M (pH 7,25) por 10 minutos. Realize a pósfixação com 1% de tetroxida de ósmio (OsO4) em tampão de cacodilato de 0,2 M, por 12 h no escuro, à temperatura ambiente. Lave 3x com água destilada por 5 minutos.
    ATENÇÃO: Cacodilato e tetroxida de ósmio são altamente tóxicos e não devem ser inalados. Use-os em capas de fumaça, seguindo as respectivas folhas de dados de segurança.
  2. Desidratar as amostras com 30%, 50%, 70% e 96% de etanol, 2x em cada concentração, por 10 minutos. Em seguida, desidratar 3x em álcool absoluto, por 15 minutos cada vez.
  3. Infiltrar-se nas amostras em resinas acrílicas hidrofílicas (ver Tabela de Materiais), uma vez com resina 1:1 + etanol absoluto e 3x com resina pura por 8-12 h cada. Realizar polimerização em cápsulas de gelatina a 60 °C até solidificar completamente (12h no máximo17).
  4. Avaliar de perto a orientação das amostras dentro do bloco de resina; corte a parte superior do bloco, com uma lâmina de barbear, fazendo uma forma piramipcional que concentra a amostra na área de secção. Obtenha seções semi-mente (250-500 nm)33 em um ultramicromo com uma faca de diamante e coloque em lâminas de vidro em poucas gotas de água.
  5. Mantenha os slides em uma placa quente a 60 °C. Manche as seções com toluidina azul O como na etapa 6.1.1 e deixe a mancha secar completamente. Lave com cuidado com a água da torneira. Avalie a seção obtida desenhando quatro quadrantes e selecionando o quadrante mais adequado para análise.
  6. Corte o bloco para que a forma piramimia concentre o quadrante escolhido na face superior do bloco. Produzir seções ultrathin (50-100 nm)33,34. A espessura é avaliada de acordo com a cor de interferência das seções: seções com cerca de 70 nm aparecem prata-ouro, com cerca de 100 nm aparecem de ouro, e com cerca de 200 nm aparecem azuis34.
  7. Colete as seções ultrathin da água usando redes de cobre e prossiga para o método de coloração de contraste com acetato deuranyl e citrato de chumbo, conforme descrito abaixo.
    1. Prepare uma solução de citrato de chumbo (Tabela 5) e congele a solução final em tubos de microcentrifuus com 1 mL de solução em cada, só descongelando antes do uso.
    2. Prepare uma solução de acetato deuranyl: dissolva 0,625 g de acetato de urano [UO2(CH3COO)2] em 25 mL de água recém-fervida e resfriada. Guarde em um frasco escuro no congelador.
      ATENÇÃO: O nitrato de chumbo é tóxico se ingerido. 1 N NaOH é altamente corrosivo. O acetato deuranyl é radioativo e tóxico. Não deve ser ingerido, inalado ou entrar em contato com a pele.
    3. Ao colorar, coloque ambos os reagentes preparados em seringas separadas de 3 mL com unidades de filtro (poros de 0,22 μm, ver Tabela de Materiais). Prepare uma placa de Petri virada de cabeça para baixo com um filme termoplástico de vedação sobre ele (ver Tabela de Materiais) e dentro de uma placa mais larga, com pelotas NaOH nas bordas como uma armadilha para CO232 (ver Figura 2).
    4. Descarte a primeira gota, e sobre o filme coloque uma gota de acetato deuranyl e três gotas de água destilada para cada grade manchada. Faça o mesmo com citrato de chumbo e adicione mais três gotas de água destilada.
    5. Incubar a grade (com o lado opaco para baixo, onde as seções estão) em urano por 30 minutos (tempo variável). Lave 3x nas gotas de água destiladas, secando a grade de cada vez suavemente com papel filtro no lado brilhante. Repita com a queda do citrato de chumbo (30 min) e lave-a.
  8. Após pelo menos 4 horas, analise as redes em um microscópio eletrônico de transmissão. Neste microscópio, um feixe de elétrons passa pelas seções em vacuo e a imagem é projetada em uma tela fluorescente. Para obter detalhes sobre a operação de um microscópio eletrônico de transmissão, leia Bozzola e Russell (1999)32.
solução de citrato de chumbo (para coloração de contraste TEM)
passo 1 cercar um béquer com papel alumínio
passo 2 dissolver 0,266 g de nitrato de chumbo [Pb(NO3)2] em 6 mL de água recém-fervida e resfriada destilada
passo 3 agitar por 2 minutos
passo 4 adicionar 0,352 g de citrato de trisódio [Na3(C6H5O7).2H2O] (a solução deve adquirir uma aparência leitosa)
passo 5 agitar por 15 minutos, selar o béquer com papel alumínio e transferir a solução para um béquer de 10 mL
passo 6 adicionar 1,6 mL de 1N NaOH e 2,4 mL de água destilada (a solução deve ser translúcida)
passo 7 se necessário, ajuste o pH perto de 12

Tabela 5: Receita de solução de citrato de chumbo.

Figure 2
Figura 2: Esquema de coloração de contraste com soluções de cite de chumbo e acetato deuranyl. (A) Prepare as placas de Petri, uma virada de cabeça para baixo (no centro) com filme termoplástico para que as gotas possam ser colocadas acima dele, dentro de uma mais ampla. Pelotas NaOH são lugares ao redor do prato central. (B) Gotas de acetato de urano são colocadas nos círculos com a letra U, e gotas de citrato de chumbo nos círculos marcados L. DW indica gotas de água destilada. As grades são manchadas sequencialmente na coluna, de modo que cinco grades podem ser manchadas simultaneamente como representadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

10. Germinação simbiótica de sementes de orquídeas

  1. Certifique-se de que as soluções e todos os materiais utilizados na germinação simbiótica das sementes sejam estéreis para evitar contaminação. Comece autoclavando-os por 20 min a 121 °C. As etapas de germinação simbiótica são resumidas na Figura 3.
  2. Desinfetar superficialmente frutas e sementes, imergindo-as em solução de hipoclorito de sódio contendo 2% de cloro ativo para 10-15 min para frutas e 7-10 min para sementes, considerando a rigidez e espessura do casaco de sementes9. Sementes finas e frágeis podem ser imersas em uma solução de hipoclorito de sódio diluído 1:1. Depois, lave 3x em água destilada autoclavada para remover a solução de hipoclorito.
  3. Recuperar as sementes filtrando em tecido serigráfico e usar as sementes para prosseguir com testes de germinação (preferencialmente). Se necessário, armazene-os em envelopes de papel filtro dentro de frascos de vidro com gel de sílica, a 4 °C, feche hermeticamente os frascos e sele-os com filme de aderência. Transfira algumas gotas de água da última lavagem para o ágar de dextrose de batata (PDA, 39 g/L), para avaliar a eficácia do processo de lavagem.
  4. Antes de semear sementes no meio da cultura, avalie sua viabilidade através do teste de tetrazolium (opcional) conforme descrito abaixo de35.
    1. Incubar aproximadamente 10 mg de sementes em um tubo de microcentrifuuge com 1 mL de 10% de sacarose em água destilada, por 24 h em temperatura ambiente (cerca de 25 °C), em luz.
    2. Remova a solução de sacarose com uma micropipette e adicione 1 mL de solução de tetrazolium de 1% (cloreto de tripheniltetrazolium) em água destilada. Incubar a 40 °C em um termbloco por 24 h no escuro.
    3. Remova a solução de tetrazolium com uma micropipette e lave as sementes com água destilada 2x ou até que a solução seja removida. Remova todos os líquidos. Se necessário, as sementes podem ser armazenadas no congelador por até uma semana (como na etapa 10.3) antes de serem analisadas.
    4. Resuspenda as sementes em água destilada e analise-as sob um microscópio leve. As sementes viáveis adquirem luz à cor vermelha escura, enquanto as sementes não viáveis mantêm sua cor natural.
  5. Realize o seguinte protocoloadaptado 9 para germinação simbiótica de sementes de orquídeas.
    1. Incubar as sementes sobre discos de papel filtro autoclavados (1-2 cm de diâmetro) colocados em placas de Petri com meio de cultura de áclon (OMA) (2,5 g/L de flocos de aveia e 7 g/L de ágar, pH 6).
    2. No centro da placa de Petri, inocular um fragmento de meio de cultura (cerca de 1 cm2) contendo micélio do fungo isolado escolhido para o procedimento de germinação. Sele as placas de Petri com filme agarrado e incuba-as no escuro a cerca de 25 °C ou temperatura ambiente, pois é mais adequada para o crescimento fúngico.
    3. Prepare alguns pratos com sementes e sem inoculação fúngica, como um controle negativo para o teste de germinação.
  6. Analisar os resultados da germinação semanalmente, coletando dados quantitativos e qualitativos e fotografando protocormes e mudas. A observação de sementes e protocormes deve ser realizada utilizando um estereoscópio para uma avaliação mais precisa da germinação. Use uma fonte de luz vinda de baixo, pois permite maior contraste, possibilitando discriminar o micélio fúngico dos protocormes com mais facilidade.
    1. Coletar amostras em diferentes estágios de desenvolvimento e fixar para análises anatômicas (seção 1). Aplique todas as análises de imagem descritas anteriormente para investigar endofofados fúngicos em sementes, protocormes e mudas durante a germinação (microscopia leve - seções 4, 5 e 6; confocal e fluorescência - seção 7; SEM e TEM - seções 8 e 9).
    2. Gerar resultados quantitativos após a classificação das etapas de acordo com a Tabela 6. Os estágios descrevem o desenvolvimento habitual de sementes de orquídeas micoheterotróficas. Coletar dados semanalmente e tabela com as datas iniciais de cada etapa observada.
    3. Além disso, colete dados quantitativos estimando percentual e taxa de germinação. Conte pelo menos 100 sementes ou defina os campos de contagem35. Demarcar três ou mais campos de contagem por placa de Petri, constituídos por regiões fixas com área padronizada, e avaliar semanalmente. Calcular os dados coletados de acordo com a equação do índice de crescimento (GI):
      Equation 1
      onde n0 é o número de sementes contadas na fase 0, N1 refere-se ao estágio 1, e segue até a fase 6 (registrada como N6)36.

Figure 3
Figura 3: Resumição esquemática da germinação simbiótica da metodologia de sementes. Os esquemas fornecem indicações de etapas detalhadas no protocolo. Abreviaturas: OMA = ágar de aveia, PDA = ágar de dextrose de batata. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Fase de germinação Descrição
0 Sem germinação
1 Inchaço do embrião
2 Ruptura de Testa
3 Cabelos absorventes se desenvolvem
4 Projeção de troncos se desenvolve
5 As escalas de proteção (bracts) desenvolvem
6 As primeiras raízes se desenvolvem

Tabela 6: Descrição das etapas de desenvolvimento do protocorm aplicadas às análises periódicas dos testes de germinação. Modificado a partir de estágios descritos em Otero et al.36.

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Representative Results

Seguindo os estágios essenciais de fixação do tecido vegetal produz estruturas celulares o mais semelhantes possível ao estado vivo, considerando a morfologia, o volume e a organização espacial dos componentes celulares e tecidos16. Observe tais características nas amostras após a fixação química (Figura 4). A Figura 4C-F representa amostras adequadamente fixas sob microscopia leve. Seguir os procedimentos de fixação descritos e adquirir familiaridade com a estrutura das amostras ajuda a analisar o sucesso da fixação.

Figure 4
Figura 4: Análise superficial e seções de raízes filiformes da orquídea MH Wullschlaegelia aphylla (Sw.) Rchb.f. (A e B) Rizomorphs na superfície raiz filiforme. (C e D) Seções à mão livre não manchadas, evidenciando pelotões em células corticais. (E e F) Seções finas manchadas com toluidina azul O. Abreviaturas: en = endoderme, ep = epiderme, ct = córtex, hy = hy = hypha, pc = célula parêntesa, pe = elementos phloem, pl = pelotão, rfl = raiz (filiforme), rm = rizomorph, vc = cilindro vascular, xe = elemento xylem. Barras de escala: A = 2 mm; B = 500 μm; C e E = 200 μm; D = 100 μm; F = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Note na Figura 4C,D a regularidade das estruturas e a ausência de áreas danificadas em uma seção à mão livre de uma amostra fixada por 10% de NBF. O volume celular é preservado, assemelhando-se a tecidos vivos. Comparar com um órgão fresco seccionado à mão livre também é importante no reconhecimento de amostras bem fixas. Na Figura 4E,F, seções de amostras embutidas na resina GMA e fixadas por 10% NBF foram manchadas com o azul toluidina O. Observe as estruturas bem preservadas das paredes celulares, sem distorções ou áreas danificadas, mostrando traços muito semelhantes como em uma amostra seccionada à mão livre (Figura 4C,D).

Ao analisar a superfície dos órgãos subterrâneos, a presença de rizomorfos indica hifa colonizando tecidos internos. Os rizomorfos são estruturas vegetativas compostas por um agregado de hifas altamente diferenciadas e formadas por algumas espécies de fungos, principalmente saprotrópicos que decompõem madeira37,38. Os rizomófos podem ser facilmente reconhecidos, geralmente como estruturas escuras semelhantes a sapatos37, vistas na Figura 4A,B e Figura 7D. A busca por essas estruturas fúngicas facilita a seleção de amostras para observar o padrão de colonização fúngica em órgãos vegetais. Na Figura 4C,D, as seções foram obtidas em áreas com rizomorfos superficiais, enquanto na Figura 4E, mostra-se uma seção do mesmo órgão sem seleção de tal critério. A hifa individualizada também pode ser identificada sob um microscópio dissecando com uma observação perceptiva.

Figure 5
Figura 5: Seções à mão livre da estrutura de armazenamento Uleiorchis sp. (A) Sob um microscópio dissecando. (B) Pelotões sob um microscópio leve, concentrado em uma região do córtex do órgão. (C e D) Detalhes de hifa dos pelotões analisados. Abreviaturas: hy = hypha, pc = célula parêntesa, pl = pelotão, s = septa. Barras de escala: A = 2 mm; B = 500 μm; C e D = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Como explicado anteriormente, a secção à mão livre pode ser preferida em comparação com a secção fina, dependendo do objetivo. Mão livre ou outros métodos de obtenção de seções mais grossas (mais de 10 μm de espessura) podem evidenciar melhor pelotões e fornecer imagens mais representativas de padrões fúngicos de colonização (por exemplo, Figura 4C,D e Figura 5A,B). As seções à mão livre também podem ser adequadas para análise de hifas em maior amplificação, como demonstrado na Figura 5C,D, embora os detalhes sejam melhor alcançados em seções mais finas, como na Figura 7A, a partir de uma amostra incorporada na resina GMA. Alguns detalhes das estruturas das células vegetais são adequadamente observados em seções finas, por exemplo, Figura 4F. A montagem também é um passo importante, pois imagens de melhor qualidade podem depender do meio de montagem. Os slides de resina GMA podem ser montados em água ou glicerina, embora um meio de montagem comercial (ver Tabela de Materiais) melhore a imagem final à medida que preenche imperfeições do processo de secção. Na Figura 6C, imperfeições podem ser vistas (pontas de flecha) em uma seção de resina GMA, já que o escorregador foi montado com água.

Figure 6
Figura 6: Seções de raízes fusiformes de W. aphylla manchadas com solução Lugol. (A) Seção à mão livre manchada com azul toluidina O e Lugol. (B) Manchada apenas com toluidina azul O. (C) Seção fina na resina GMA manchada com azul de algodão lactofenol e Lugol, pontas de flecha: imperfeições de irregularidades da lâmina. (D) Seção à mão livre manchada apenas com Lugol. Abreviaturas: cw = parede celular, pc = célula parêntesa, sg = grãos de amido, vc = cilindro vascular. Barras de escala: A = 200 μm; B e C = 100 μm; D = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O principal benefício no uso do azul toluidina O (resultados mais adequados em seções finas) são as importantes propriedades metachromáticas desta mancha, o que significa que adquire cores diferentes dependendo do componente celular a que se liga e funciona como uma mancha policromática adequada para diferenciar diferentes composições das paredescelulares 23. Na Figura 4F, paredes de células secundárias em elementos xilem podem ser facilmente identificadas pela cor clara que toluidina adquire. Enquanto isso, os elementos de phloem, compostos apenas de paredes celulares primárias, são identificados por suas paredes celulares mais finas e escuras. Outra mancha importante, principalmente considerando as plantas de MS, é a solução Lugol, já que os grãos de amido são facilmente identificados quando manchados por ela. As seções estão representadas na Figura 6A-D: seção à mão livre manchada com toluidina azul O e Lugol na Figura 6A e apenas toluidina azul O na Figura 6B; seção fina na resina GMA manchada com azul de algodão lactofenol e Lugol na Figura 6C; seção à mão livre manchada apenas com Lugol na Figura 6D.

Incubação de freehand (Figura 7C), resina GMA (Figura 7B), ou seções OCT com conjugado WGA-fluorocromo e Calcofluor White podem melhorar as estruturas da parede celular fúngica e da parede celular vegetal, respectivamente. É um método importante de confirmação da hifa, pois o conjugado WGA tem especificidade para resíduos de N-acetilglucosaminyl, presentes na parede celular dos fungos. A Figura 7A demonstra uma seção de caule floral manchada com toluidina azul O, enquanto a Figura 7B é do mesmo órgão e confirma que as estruturas vistas na Figura 7A são hifas. Artefatos por autofluorescência podem ser vistos em seções de resina GMA (pontas de flecha, Figura 7B). Estes artefatos geralmente estão relacionados à concentração fluorocromática e podem ser evitados lavando as amostras mais vezes com o tampão. Na Figura 7C, é mostrada uma seção à mão livre da raiz, com hifas internas e externas. O mesmo órgão pode ser visto pelo SEM na Figura 7D, com abundância de rizomorfos e hifas individuais em sua superfície. Micrografos sem adequados têm bom contraste entre tons de cinza, de modo que a tridimensionalidade pode ser vista e bem interpretada. Escolha imagens representativas e evite as enganosas (leitura posterior: dicas para escolher micrografoseletrônicos 32).

Figure 7
Figura 7: Seções das raízes florais de caule e filiforme de W. aphylla e análise superficial da raiz filiforme por SEM. (A) Fina seção de caule floral em resina GMA, manchada com toluidina azul O. (B) Fina seção de tronco floral em resina GMA incubada com conjugado WGA-fluorocromo + Calcofluor White, pontas de flecha: artefatos por autofluorescência. (C) Seção à mão livre da raiz filiforme incubada com conjugado WGA-fluorocromo + Calcofluor Branco. (D) Micrografo eletrônico de varredura da superfície raiz filiforme. Abreviaturas: cw = parede celular, hy = hiphae, pc = célula parêntesa, pl = pelotão, rfl = raiz (filiforme), rm = rizomorph. Barras de escala: A, C e D = 100 μm; B = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Frutas de diferentes espécies de orquídeas foram imersas em hipoclorito de sódio com cloro ativo de 2% por 15 minutos, para garantir a desinfecção superficial completa dos órgãos (Figura 8A). Sementes com casacos de sementes mais rígidos a partir de Baunilha sp. (Figura 8A) e Pogoniopsis schenckii (Figura 9B-D) foram imersas na mesma solução por 10 min (Figura 8C), enquanto as mais finas, a partir de Laelia sp. e Cattleya sp., mantidas por 7 min (Figura 9A). A transferência de uma alíquota de água da última lavagem confirmou a eficácia do processo de desinfecção antes de prosseguir para os testes de germinação, considerando ambas as durações de imersão descritas.

Figure 8
Figura 8: Desinfecção superficial de frutas e sementes de baunilha panifolia, uma espécie de orquídea fotossintética. (A) Imersão de frutas em hipoclorito de sódio com cloro ativo. (B) Frutas longitudinalmente seccionadas. (C) Sementes filtradas usando tecido serigráfico após imersão em hipoclorito de sódio, prontas para serem semeadas ou armazenadas em gel de sílica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Semeando as sementes sobre discos de papel filtro garantem que há umidade e oxigênio suficientes para germinação e desenvolvimento de embriões (Figura 9A-D) sem estar completamente submerso sob a camada de água superficial do meio de cultura. Alguns isolados fúngicos podem crescer vigorosamente sobre as sementes. O meio contendo 2 g/L de flocos de aveia esmagados proporciona melhor controle do crescimento fúngico, melhorando a visualização e análise das sementes (Figura 9B). Após 50-60 dias de inoculação isolada, o meio deve ser renovado, para que o fungo permaneça ativo. Isso pode ser feito transferindo as sementes para um novo meio OMA da mesma formulação. As sementes podem ser transferidas com o papel filtro, facilitando sua transferência sem danificar as estruturas delicadas dos protocorms, além de mantê-las na posição original sem comprometer os campos de contagem previamente estabelecidos.

Figure 9
Figura 9: Protocolo de germinação simbiótica. (A) Sementes dispostas sobre papel filtro em meio OMA. (B) Pratos de petri com sementes e um fungo inoculado (potencialmente micorhizal), incubados por cerca de 21 dias. (C e D) Pratos de germinação simbiótica com diferentes isolados fúngicos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A maioria das espécies de orquídeas germinam dentro de algumas semanas após serem infectadas pelo fungo inoculado ou até quase mais de um mês (Figura 10). As sementes que não germinam dentro de 3 meses provavelmente não germinarão a menos que ajuste a metodologia. Nesses casos, considere possibilidades como dormência de sementes ou o isolado fúngico não ser micorrizal. Algumas espécies precisam de protocolos específicos para quebrar a dormência, outras simplesmente apresentam uma alta especificidade para certos parceiros micorrizais, diferente das escolhidas para o teste de germinação simbiótica (dados não publicados).

Figure 10
Figura 10: Sementes pogoniopsis schenckii, uma orquídea aclorofisma e MH, em meio OMA com inoculação fúngica39 capaz de estimular a germinação. (A-D) Sementes e protocormos não germinados em diferentes estágios de desenvolvimento. Abreviaturas: ng = sem germinação, pt = protocorm, ri = integument rompido, ts = semente turva. Barras de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nas primeiras semanas após a inoculação do isolado, os pratos são avaliados, pois geralmente demora de 7 a 14 dias até que a hifa atinja as sementes. Considere esse período, pois é preponderante começar a registrar o desenvolvimento dos embriões. As mudanças sutis durante os estágios de germinação só podem ser detectadas sob um microscópio dissecando, considerando que as estruturas são tão minuciosas. Alguns protocormos de espécies devem ser analisados sob um microscópio leve para identificar cabelos absorventes e distingui-los da hifa. A análise de GI pode fornecer resultados mais plausivelmente comparáveis, gerando uma representação dos dados coletados e conferindo mais peso a valores correspondentes a estágios de germinação mais avançados. Os valores finais podem variar entre zero e seis (ou de acordo com a última etapa definida). Diferentes testes estatísticos podem ser aplicados às análises de GI (por exemplo, ANOVA, nível de significância), dependendo das perguntas e demandas do pesquisador na realização de testes de germinação simbiótica.

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Discussion

As análises de imagem na anatomia e morfologia das plantas têm um importante potencial para cumprir objetivos e ajudar a entender as relações entre as plantas micoheterotróficas e seus endofofados fúngicos indispensáveis, como demonstrado por estudos de órgãos subterrâneos 6,40, análises estruturais da germinação simbiótica das sementes39, e estruturas aéreas e reprodutivas41 . A botânica estrutural, apesar de ter perdido seu prestígio e espaço para outras áreas de ciências vegetais na última década1, ainda é destaque em responder perguntas e ajudar a desvendar novidades e traços essenciais das plantas relacionados ao desenvolvimento, ecologia, fisiologia e evolução. Esses métodos são coletivamente uma base para estudos estruturais das plantas, considerando aspectos importantes da análise vegetal de MS.

Informações essenciais são fornecidas para coletar cuidadosamente plantas de MS, pois caso contrário, os órgãos subterrâneos bem desenvolvidos podem ser danificados e não completamente coletados. Adaptações notáveis dessas estruturas6 e o contato íntimo com fungos do solo, ligados a plantas autotróficas42 ou lixo de folhas em decomposição40 devem ser considerados na coleta e preservação das estruturas subterrâneas. As etapas essenciais da fixação amostral precisam ser adequadamente seguidas, no que diz respeito à preparação correta de fixações e problemas de tempo, tempo mínimo necessário entre coleta e fixação e tempo mínimo necessário no fixador antes de prosseguir para o armazenamento. A análise estrutural de amostras bem preservadas depende do processo de fixação, e os fixativos mais comuns e mais bem preservados aplicados ao estudo da anatomia vegetal e da microscopia eletrônica são descritos na seção de protocolos. Outros fixativos 14,16,25 também podem ser aplicados.

Como dito anteriormente, o processo de uso de fixação química é decisivo e pode ser avaliado na obtenção de imagens amostrais. Em LM, as estruturas celulares devem ser as mais semelhantes possíveis em comparação com os tecidos vivos16. O volume, a morfologia e a disposição espacial dos componentes celulares identificáveis devem se assemelhar tanto quanto possível aos tecidos frescos (não fixos). No TEM, tecidos bem preservados podem ser evidenciados quando o tonoplasto é visível, com contornos lisos, e não retirados do citoplasma16. A membrana plasmática não pode ser separada e encolhida da parede celular. As amostras para TEM devem ser coletadas o mais finamente possível e dentro de uma gota de fixação, conforme explicado na seção de protocolo. O uso de tampões associados aos agentes de fixação proporciona condições importantes de osmolaridade e composição iônica às amostras sendo fixadas, evitando o maior número possível de alterações na estrutura celular e ultraestrutura16. No SEM, uma grande preocupação é com fixações isotônicas e prepará-los com buffers, de modo que não há mudanças consideráveis no volume amostral (inchaço ou encolhimento)16.

Muitos métodos diferentes de incorporação para LM estão disponíveis para obter seções para vários propósitos. Considerando a coloração e a incubação de corantes fluorescentes, duas metodologias importantes são apresentadas para analisar órgãos de plantas de MS. As descritas acima (seções à mão livre, resina GMA e incorporação de OCT) estão entre as mais comuns e simples, proporcionando liberdade metodológica e adequação a muitos tipos de análise. O conjugado WGA-fluorocromo tem um potencial considerável em estudos de plantas de MS, pois atualmente é mais aplicado a patógenos fúngicos 28,29,30 e pouco utilizado com endofitas fúngicas de plantas MH. Os passos básicos e essenciais para a digitalização e a microscopia eletrônica de transmissão são detalhados, pois essas técnicas podem contribuir muito para a análise estrutural das plantas. A literatura SEM e TEM é rica, e a leitura adicionalde 32,33,34,43 é recomendada se outros tipos de análises de microscopia eletrônica forem testadas.

Quanto aos procedimentos de germinação simbiótica, é possível realizar assepsia frífica antes da deshiscência, sem a necessidade de desinfetar diretamente as sementes. No entanto, as sementes de frutas já abertas ou colonizadas por endofitos (já descritos para espéciesde MS 39,41) devem ser diretamente desinfetadas. Uma observação importante: o tempo e as condições dos processos de armazenamento e assepsia podem reduzir a viabilidade das sementes de algumas espécies, como observado durante a realização desses experimentos. O reagente tetrazolium confere uma cor que vai da luz ao vermelho escuro a embriões de sementes viáveis. Embriões de sementes não viáveis permanecem com sua cor natural. Sementes com tegumentos fortemente pigmentados ou casacos de sementes rígidas podem precisar de um pré-tratamento antes do teste de germinação. Recomenda-se realizar a escarificação de seu tegument, possibilitando a visualização do embrião35.

Alguns potenciais isolados fúngicos micorrizais de orquídeas tropicais, por exemplo, espécies de Ceratobasidium , têm um crescimento vigoroso e acelerado em um meio de cultura rico em nutrientes. Durante o tratamento, é possível que os isolados cubram completamente as sementes quando crescem, dificultando ou até mesmo impossível a coleta de dados. O protocolo comumente utilizado contendo 4 g/L de flocos de aveia esmagados9 impediu a coleta de dados em germinação simbiótica de P. schenckii, exigindo uma adequação a 2 g/L de flocos de aveia esmagados39. O uso de aproximadamente 2,5 g/L de flocos de aveia para compor o meio OMA na germinação simbiótica parece ser satisfatório em limitar o crescimento de isolados fúngicos mais vigorosos (dados inéditos).

Limitações podem surgir dos métodos descritos, alguns dos quais podem ser efetivamente superados adaptando os procedimentos ou aplicando outros métodos. Como discutido anteriormente, a incorporação do GMA só é eficaz para secção de até 8 μm de espessura. No entanto, a incorporação de OCT fornece diferentes seções de espessura, incluindo as mais grossas (por exemplo, 10-20 μm). A coloração apenas de estruturas de fungos em tecidos vegetais não é facilmente conduzida, embora o WGA-fluorocromo seja um fluorocromo conjugado importante e eficaz que marca paredes celulares fúngicos, embora seja caro. Outras limitações de custos podem surgir nos métodos SEM e TEM, pois os altos custos e a essencialidade dos equipamentos tornam tais análises não triviais e usuais a todos os grupos de pesquisa. A germinação simbiótica dos testes de sementes, embora simples e menos caras, exigem que fungos micorrizais inoculam as sementes e procedimentos cuidadosos evitando contaminações.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores agradecem financiamento da FAEPEX e fapesp (2015/26479-6). MPP agradece à Capes pela bolsa de mestrado (processo 88887.600591/2021-00) e CNPq. JLSM agradece ao CNPq por bolsas de produtividade (303664/2020-7). Os autores também agradecem o acesso aos equipamentos e assistência prestados pelo LME (Laboratório de Microscopia Eletrônica - IB/Unicamp), INFABiC (Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Fotônica Aplicada à Biologia Celular - Unicamp) e LaBiVasc (Laboratório de Biologia Vascular - DBEF/IB/Unicamp); LAMEB (UFSC) e Eliana de Medeiros Oliveira (UFSC) por contribuições ao protocolo de crioproteção; LME para contribuições ao protocolo TEM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma-Aldrich 179124 (for SEM stubs mounting)
Agar-agar (AA) Sigma-Aldrich A1296 (for seeds germination tests)
Calcofluor White Stain Sigma-Aldrich 18909 fluorescent dye (detects cellulose)
Citrate Buffer Solution, 0.09M pH 4.8 Sigma-Aldrich C2488 (for toluidine blue O staining)
Conductive Double-Sided Carbon Tape Fisher Scientific 50-285-81 (for SEM)
Confocal Microscope Zeiss (any model)
Copper Grids Sigma-Aldrich G4776 (for TEM)
Critical-point dryer Balzers (any model)
Cryostat Leica Biosystems (any model)
Dissecting microscope Leica Biosystems (= stereomicroscope, any model)
Entellan Sigma-Aldrich 107960 rapid mounting medium for microscopy
Ethyl alcohol, pure (≥99.5%) Sigma-Aldrich 459836 (= ethanol, for dehydration processes)
Formaldehyde solution, 37% Sigma-Aldrich 252549 (for NBF solution preparation)
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-Aldrich HT501128 histological tissue fixative
Gelatin capsules for TEM Fisher Scientific 50-248-71 (for resin polymerisation in TEM)
Gelatin solution, 2% in H2O Sigma-Aldrich G1393 (dilute for slides preparation - OCT adherence)
Glutaraldehyde solution, 25% Sigma-Aldrich G6257 (for Karnovsky’s solution preparation)
HistoResin Leica Biosystems 14702231731 glycol methacrylate (GMA) embedding kit
Iodine Sigma-Aldrich 207772 (for Lugol solution preparation)
Lead(II) nitrate Sigma-Aldrich 228621 Pb(NO3)2 (for TEM contrast staining)
Light Microscope Olympus (any model)
LR White acrylic resin Sigma-Aldrich L9774 hydrophilic acrylic resin for TEM
Lugol solution Sigma-Aldrich 62650 (for staining)
Metal stubs for specimen mounts Rave Scientific (for SEM, different models)
Microtome Leica Biosystems manual rotary microtome or other model
Oatmeal agar (OMA) Millipore O3506 (for seeds germination tests)
OCT Compound, Tissue-Tek Sakura Finetek USA 4583 embedding medium for frozen tissues
Osmium tetroxide Sigma-Aldrich 201030 OsO4 (for TEM postfixation)
Parafilm M Sigma-Aldrich P7793 sealing thermoplastic film
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127 (for Karnovsky’s solution preparation)
Poly-L-lysine solution, 0.1% in H2O Sigma-Aldrich P8920 (for slides preparation - OCT adherence)
Poly-Prep Slides Sigma-Aldrich P0425 poly-L-lysine coated glass slides
Polyethylene Molding Cup Trays Polysciences 17177A-3 (6x8x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Polyethylene Molding Cup Trays Polysciences 17177C-3 (13x19x5 mm, for embbeding samples in GMA resin)
Potassium iodide Sigma-Aldrich 221945 (for Lugol solution preparation)
Potato Dextrose Agar (PDA) Millipore 70139 (for seeds germination tests)
Scanning Electron Microscope Jeol (any model)
Silane [(3-Aminopropyl)triethoxysilane] Sigma-Aldrich A3648 (for slides preparation - OCT adherence)
Silane-Prep Slides Sigma-Aldrich S4651 glass slides coated with silane
Silica gel orange, granular Supelco 10087 (for dessicating processes)
Sodium cacodylate trihydrate Sigma-Aldrich C0250 (for glutaraldehyde-sodium cacodylate buffer)
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881 NaOH (for Karnovsky’s solution preparation and TEM contrast staining)
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 425044 NaClO (for seeds surface disinfection)
Sodium phosphate dibasic, anhydrous Sigma-Aldrich 71640 Na2HPO4 (for NBF solution and PB preparation)
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich S9638 NaH2PO4·H2O (for NBF and PB)
Sputter coater Balzers (any model)
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 C12H22O11 (for cryoprotection and germination test)
Sudan III Sigma-Aldrich S4131 (for staining)
Sudan IV Sigma-Aldrich 198102 (for staining)
Sudan Black B Sigma-Aldrich 199664 (for staining)
Syringe (3 mL, any brand, for TEM contrast staining)
Syringe Filter Unit, Millex-GV 0.22 µm Millipore SLGV033R PVDF, 33 mm, gamma sterilized (for TEM contrast staining)
Tek Bond Super Glue 793 Tek Bond Saint-Gobain 78072720018 liquid cyanoacrylate adhesive, medium viscosity
Toluidine Blue O Sigma-Aldrich T3260 (for staining)
Transmission Electron Microscope Jeol (any model)
Triphenyltetrazolium chloride Sigma-Aldrich T8877 (for the tetrazolium test in seeds germination)
Trisodium citrate dihydrate Sigma-Aldrich S1804 Na3(C6H5O7)·2H2O (for TEM contrast staining)
Ultramicrotome Leica Biosystems (any model)
Uranyl acetate Fisher Scientific 18-607-645 UO2(CH3COO)2 (for TEM contrast staining)
Vacuum pump (any model)
Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate TermoFisher Scientific W11261 fluorescent dye-conjugated lectin (detects sialic acid and N-acetylglucosaminyl residues)

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References

  1. Evert, R. F. Esau’s Plant Anatomy: Meristems, Cells, and Tissues of the Plant Body: Their Structure, Function, and Development. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ, USA. (2006).
  2. Yeung, E. C. T., Stasolla, C., Sumner, M. J., Huang, B. Q. Plant Microtechniques and Protocols. , Springer International Publishing. Cham, Switzerland. (2015).
  3. Sokoloff, D. D., Jura-Morawiec, J., Zoric, L., Fay, M. F. Plant anatomy: at the heart of modern botany. Botanical Journal of the Linnean Society. 195 (3), 249-253 (2021).
  4. Leake, J. R. The biology of myco-heterotrophic (‘saprophytic’) plants. New Phytologist. 127 (2), 171-216 (1994).
  5. Bidartondo, M. I. The evolutionary ecology of myco-heterotrophy. New Phytologist. 167 (2), 335-352 (2005).
  6. Imhof, S., Massicotte, H. B., Melville, L. H., Peterson, R. L. Subterranean morphology and mycorrhizal structures. Mycoheterotrophy. , Springer. New York, NY. 157-214 (2013).
  7. Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style. Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).
  8. Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jersáková, J., Těšitelová, T. Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements. Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).
  9. Zettler, L. W. Terrestrial orchid conservation by symbiotic seed germination: techniques and perspectives. Selbyana. 18 (2), 188-194 (1997).
  10. Stewart, S. L., Kane, M. E. Symbiotic seed germination and evidence for in vitro mycobiont specificity in Spiranthes brevilabris (Orchidaceae) and its implications for species-level conservation. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant. 43 (3), 178-186 (2007).
  11. Zhao, D. -K., et al. Orchid reintroduction based on seed germination-promoting mycorrhizal fungi derived from protocorms or seedlings. Frontiers in Plant Science. 12, 701152 (2021).
  12. Selosse, M. A., Roy, M. Green plants that feed on fungi: facts and questions about mixotrophy. Trends in Plant Science. 14 (2), 64-70 (2009).
  13. Merckx, V. S. F. T., Mennes, C. B., Peay, K. G., Geml, J. Evolution and diversification. Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , Springer. New York, NY. 215-244 (2013).
  14. Boon, M. E., Drijver, J. Routine Cytological Staining Techniques: Theoretical Background and Practice. Macmillan International Higher Education. , Hampshire, UK. (1986).
  15. Karnovsky, M. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27 (2), 137-138 (1964).
  16. Hayat, M. Fixation for Electron Microscopy. , Academic Press. New York, USA. (1981).
  17. Roland, J. C., Vian, B. General preparation and staining of thin sections. Electron Microscopy of Plant Cells. 1, 675 (1991).
  18. Gerrits, P. O., Horobin, R. W. Glycol methacrylate embedding for light microscopy: basic principles and trouble-shooting. Journal of Histotechnology. 19 (4), 297-311 (1996).
  19. Zhang, Z., Niu, L., Chen, X., Xu, X., Ru, Z. Improvement of plant cryosection. Frontiers in Biology. 7 (4), 374-377 (2012).
  20. BeneŠ, K. On the media improving freeze-sectioning of plant material. Biologia Plantarum. 15 (1), 50-56 (1973).
  21. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Preparation of slides and coverslips for microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), (2008).
  22. Sakai, W. S. Simple method for differential staining of paraffin embedded plant material using toluidine blue O. Stain Technology. 48 (5), 247-249 (1973).
  23. O’Brien, T., Feder, N., McCully, M. E. Polychromatic staining of plant cell walls by toluidine blue O. Protoplasma. 59 (2), 368-373 (1964).
  24. Ventrella, M. C., Almeida, A. L., Nery, L. A., Coelho, V. P. deM. Métodos Histoquímicos Aplicados às Sementes. Universidade Federal de Viçosa. , Viçosa, Brazil. (2013).
  25. Pearse, A. G. E. Histochemistry, Theoretical and Applied. , J & A Churchill. London, UK. (1960).
  26. Andrade-Linares, D. R., Franken, P. Fungal endophytes in plant roots: taxonomy, colonization patterns, and functions. Symbiotic Endophytes. , Springer. Berlin. 311-334 (2013).
  27. Wymer, C. L., Beven, A. F., Boudonck, K., Lloyd, C. W. Confocal microscopy of plant cells. Confocal Microscopy Methods and Protocols. , Humana Press. Totowa. 103-130 (1999).
  28. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. Manual de Técnicas Aplicadas à Histopatologia Vegetal. FEALQ. , Piracicaba, Brazil. (2021).
  29. Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera. European Journal of Plant Pathology. 154 (4), 1185-1193 (2019).
  30. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum. Frontiers in Plant Science. 9, 698 (2018).
  31. Jeffree, C. E., Read, N. D. Ambient-and low-temperature scanning electron microscopy. Electron Microscopy of Plant Cells. , 313-413 (1991).
  32. Bozzola, J. J., Russell, L. D. Electron Microscopy: Principles and Techniques for Biologists. , Jones & Bartlett Learning. Sudbury, MA, USA. (1999).
  33. Murray, S. Basic transmission and scanning electron microscopy. Introduction to electron Microscopy for Biologists. , Academic Press. 3-18 (2008).
  34. Tanaka, M. Glossary of TEM terms. , Available from: https://www.jeol.co.jp/en/words/emterms/ (2021).
  35. Seaton, P. T., et al. Orchid seed and pollen: a toolkit for long-term storage, viability assessment and conservation. Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses—Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 71-98 (2018).
  36. Otero, J. T., Ackerman, J. D., Bayman, P. Differences in mycorrhizal preferences between two tropical orchids. Molecular Ecology. 13 (8), 2393-2404 (2004).
  37. Koch, R. A., et al. Marasmioid rhizomorphs in bird nests: Species diversity, functional specificity, and new species from the tropics. Mycologia. 112 (6), 1086-1103 (2020).
  38. Webster, J., Weber, R. Introduction to Fungi. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).
  39. Sisti, L. S., et al. The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn. Frontiers in Plant Science. 10, 1589 (2019).
  40. Martos, F., et al. Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids. New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).
  41. Alves, M. F., et al. Reproductive development and genetic structure of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn. BMC Plant Biology. 21 (1), 332 (2021).
  42. Merckx, V. S. F. T. Mycoheterotrophy: an introduction. Mycoheterotrophy: The Biology of Plants Living on Fungi. , 1-17 (2013).
  43. Hall, J. L., Hawes, C. Electron Microscopy of Plant Cells. , Academic Press. Cambridge, UK. (1991).

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