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Biology

पुनर्गठित सक्रिय सूक्ष्मनलिका बंडलों के भीतर सीधे बलों को मापना

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63819
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biological Sciences and Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies, Rensselaer Polytechnic Institute
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम विट्रो में सूक्ष्मनलिका बंडलों के पुनर्गठन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और एक साथ ऑप्टिकल ट्रैपिंग और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके उनके भीतर लगाए गए बलों को सीधे निर्धारित करते हैं। यह परख सक्रिय सूक्ष्मनलिका नेटवर्क के भीतर प्रोटीन पहनावा द्वारा उत्पन्न बलों और विस्थापन के नैनोस्केल-स्तरीय माप की अनुमति देती है।

Abstract

माइक्रोट्यूबुल्स नेटवर्क को कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला को पूरा करने के लिए कोशिकाओं में नियोजित किया जाता है, जिसमें पुटिका परिवहन के लिए ट्रैक के रूप में कार्य करने से लेकर क्रोमोसोम अलगाव को विनियमित करने के लिए माइटोसिस के दौरान विशेष सरणियों के रूप में काम करना शामिल है। सूक्ष्मनलिकाएं के साथ बातचीत करने वाले प्रोटीन में काइन्सिन और डायनेन जैसे मोटर शामिल होते हैं, जो सक्रिय बल और दिशात्मक गति उत्पन्न कर सकते हैं, साथ ही गैर-मोटर प्रोटीन जो फिलामेंट्स को उच्च क्रम के नेटवर्क में क्रॉसलिंक करते हैं या फिलामेंट गतिशीलता को विनियमित करते हैं। आज तक, सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन के बायोफिज़िकल अध्ययनों ने पुटिका परिवहन के लिए आवश्यक एकल मोटर प्रोटीन की भूमिका पर अत्यधिक ध्यान केंद्रित किया है, और बल पैदा करने वाले गुणों और काइन्सिन और डायनिन के मेकेनोकेमिकल विनियमन को स्पष्ट करने में महत्वपूर्ण प्रगति हुई है। हालांकि, उन प्रक्रियाओं के लिए जिनमें सूक्ष्मनलिकाएं कार्गो और ट्रैक दोनों के रूप में कार्य करती हैं, जैसे कि माइटोटिक स्पिंडल के भीतर फिलामेंट स्लाइडिंग के दौरान, इसमें शामिल क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन के पहनावा के बायोफिज़िकल विनियमन के बारे में बहुत कम समझा जाता है। यहां, हम शुद्ध सूक्ष्मनलिकाएं और माइटोटिक प्रोटीन से पुनर्गठित क्रॉसलिंक्ड माइक्रोट्यूबुल्स न्यूनतम नेटवर्क के भीतर बल उत्पादन और प्रतिक्रिया की सीधे जांच के लिए हमारी पद्धति का विस्तार करते हैं। माइक्रोट्यूबुल्स जोड़े रुचि के प्रोटीन द्वारा क्रॉसलिंक किए जाते हैं, एक सूक्ष्मनलिका को माइक्रोस्कोप कवरस्लिप में स्थिर किया जाता है, और दूसरे सूक्ष्मनलिका को ऑप्टिकल ट्रैप द्वारा हेरफेर किया जाता है। एक साथ कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी इस सूक्ष्मनलिका नेटवर्क के सभी घटकों के मल्टीचैनल विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है क्योंकि फिलामेंट्स बल उत्पन्न करने के लिए अलग हो जाते हैं। हम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि इन तकनीकों का उपयोग काइन्सिन -5 एन्सेंबल द्वारा लगाए गए धक्का बलों की जांच करने के लिए कैसे किया जा सकता है और माइटोटिक एमएपी पीआरसी 1 द्वारा क्रॉसलिंक किए गए स्लाइडिंग माइक्रोट्यूबुल्स जोड़े के बीच चिपचिपा ब्रेकिंग बल कैसे उत्पन्न होते हैं। ये परख स्पिंडल असेंबली और फ़ंक्शन के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं और विभिन्न संदर्भों में घने सूक्ष्मनलिका नेटवर्क यांत्रिकी का अध्ययन करने के लिए अधिक व्यापक रूप से अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि न्यूरॉन्स और ध्रुवीय उपकला कोशिकाओं के अक्षतंतु और डेंड्राइट।

Introduction

कोशिकाएं सूक्ष्मनलिका नेटवर्क को यांत्रिक कार्यों की एक विस्तृत विविधता को करने के लिए नियोजित करती हैं, जिसमें माइटोसिस 4,5,6 के दौरान पुटिका परिवहन 1,2,3 से लेकर गुणसूत्र अलगाव तक शामिल हैं। कई प्रोटीन जो सूक्ष्मनलिकाएं के साथ बातचीत करते हैं, जैसे आणविक मोटर प्रोटीन काइन्सिन और डायनिन, बल उत्पन्न करते हैं और यांत्रिक भार द्वारा विनियमित होते हैं। ये महत्वपूर्ण अणु कैसे कार्य करते हैं, यह बेहतर ढंग से समझने के लिए, शोधकर्ताओं ने एकल-अणु बायोफिज़िकल विधियों, जैसे ऑप्टिकल ट्रैपिंग और टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी को नियोजित किया है, ताकि व्यक्तिगत प्रोटीन के लिए अनलोडेड स्टेपिंग दर, प्रक्रियाशीलता और बल-वेग संबंधों जैसे महत्वपूर्ण मापदंडों की सीधे निगरानी की जा सके। सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली प्रयोगात्मक ज्यामिति मोटर प्रोटीन को सीधे मोतियों को फंसाने के लिए संलग्न करने के लिए किया गया है जिनकी गोलाकार ज्यामिति और आकार मोटर-संचालित परिवहन से गुजरने वाले पुटिकाओं की नकल करते हैं। काइन्सिन -1 7,8,9, काइन्सिन -2 10,11,12, काइन्सिन -313,14,15,16 किनेसिन -5 17,18, किन्सिन -8 19,20, साथ ही डायनेन और डायनेइन कॉम्प्लेक्स21,22, इन विधियों के साथ 23,24,25 का अध्ययन किया गया है।

कई सेलुलर प्रक्रियाओं में, हालांकि, मोटर और गैर-मोटर प्रोटीन ट्रैक और कार्गो26,27 दोनों के रूप में सूक्ष्मनलिकाएं का उपयोग करते हैं। इसके अलावा, इन परिदृश्यों में जहां सूक्ष्मनलिका तंतुओं को उच्च-क्रम के बंडलों में क्रॉसलिंक किया जाता है, ये प्रोटीन एकल इकाइयों के बजाय पहनावा के रूप में कार्य करते हैं। उदाहरण के लिए, दैहिक कोशिकाओं को विभाजित करने के भीतर, घने फिलामेंट नेटवर्क माइटोटिक स्पिंडल उपकरण 28,29,30 के निर्माण के लिए स्वयं-व्यवस्थित होते हैं। इंटरपोलर स्पिंडल माइक्रोट्यूबुल्स नेटवर्क अत्यधिक गतिशील है और काफी हद तक स्पिंडल ध्रुवों की ओर इशारा करने वाले माइनस-एंड्स के साथ व्यवस्थित होता है और स्पिंडल भूमध्य रेखा के पास ओवरलैपिंग प्लस-एंड्स ओवरलैपिंग होता है। स्पिंडल के भीतर फिलामेंट्स मोटर प्रोटीन जैसे कि किनेसिन -5 31,32,33, किनेसिन -1234,35,36, और काइन्सिन -14 37,38,39, या गैर-मोटर प्रोटीन जैसे पीआरसी 1 40,41,42,43 या एनयूएमए 44,45 द्वारा क्रॉसलिंक किए जाते हैं। 46. वे अक्सर पोलवर्ड फ्लक्स जैसी प्रक्रियाओं के दौरान यांत्रिक तनाव को स्थानांतरित या अनुभव करते हैं या एनाफ़ेज़ 47,48,49,50,51,52 के दौरान मेटाफ़ेज़ या क्रोमोसोम अलगाव के दौरान क्रोमोसोम सेंटरिंग का समन्वय करते हैं। माइटोसिस के माध्यम से माइक्रोन-स्केल स्पिंडल तंत्र की अखंडता, इसलिए, बातचीत फिलामेंट्स के इस नेटवर्क द्वारा उत्पन्न और बनाए रखने वाले बलों को धक्का देने और खींचने के सावधानीपूर्वक विनियमित संतुलन पर निर्भर करती है। हालांकि, इस यांत्रिक विनियमन की जांच करने और यह समझाने के लिए आवश्यक उपकरण कि माइक्रोट्यूबुल्स गति को समन्वयित करने और स्पिंडल को ठीक से इकट्ठा करने के लिए आवश्यक बलों का उत्पादन करने के लिए प्रोटीन पहनावा कैसे काम करता है, हाल ही में विकसित किया गया है, और हम अभी बायोफिज़िकल नियमों को समझना शुरू कर रहे हैं जो गतिशील सूक्ष्मनलिका नेटवर्क को परिभाषित करते हैं।

इस पांडुलिपि का लक्ष्य विट्रो में क्रॉसलिंक्ड माइक्रोट्यूबुल्स जोड़े को पुनर्गठित करने के लिए आवश्यक चरणों को प्रदर्शित करना है, इन बंडलों को एक माइक्रोस्कोपी कक्ष में स्थिर करना है जो सूक्ष्मनलिकाएं और क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन और नैनोस्केल बल माप दोनों के एक साथ प्रतिदीप्ति विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है, और इन डेटा को मजबूती से संसाधित करता है। हम फ्लोरेसेंस-लेबल माइक्रोट्यूबुल्स को स्थिर रूप से पॉलीमराइज करने, अटैचमेंट के लिए माइक्रोस्कोप कवरलिप तैयार करने, ऑप्टिकल ट्रैपिंग प्रयोगों के लिए पॉलीस्टाइनिन बीड्स तैयार करने और क्रॉसलिंक्ड फिलामेंट नेटवर्क को इकट्ठा करने के लिए आवश्यक चरणों का विस्तार करते हैं जो प्रत्यक्ष बायोफिज़िकल हेरफेर की अनुमति देते हुए उनकी विवो कार्यक्षमता को संरक्षित करते हैं।

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Protocol

1. सूक्ष्मनलिकाएं तैयार करना

नोट: जीएफपी-लेबल क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन को नियोजित करते समय, लाल (जैसे, रोडामाइन) और दूर-लाल (उदाहरण के लिए, बायोटिनिलेटेड हायलाइट 647, जिसे बाकी पाठ में बायोटिनिलेटेड सुदूर लाल कहा जाता है) सूक्ष्मनलिकाएं का कार्बनिक फ्लोरोफोर लेबलिंग अच्छी तरह से काम करता है। उच्च गुणवत्ता वाले क्वाड बैंड कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) फिल्टर का उपयोग करके इमेजिंग के दौरान सभी तीन चैनलों के बीच न्यूनतम क्रॉसस्टॉक प्राप्त किया जा सकता है।

  1. GMPCPP सूक्ष्मनलिका बीज स्टॉक तैयार करें
    1. 84 μL बर्फ-ठंडा 1x BRB80 (80 mM PIPEs, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA; pH 6.8) में 1 मिलीग्राम बिना लेबल वाले लियोफिलाइज्ड ट्यूबुलिन को निलंबित करें, जिसमें DTT को उपयोग से ठीक पहले 1 mM की अंतिम सांद्रता में जोड़ा जाता है। 1 एमएम डीटीटी के साथ 6 μL ठंडे 1x BRB80 में फ्लोरोफोरे-लेबल लियोफिलाइज्ड ट्यूबुलिन के 60 μg को निलंबित करें। 1 एमएम डीटीटी के साथ 6 μL ठंडे 1x BRB80 में बायोटिन-लेबल लियोफिलाइज्ड ट्यूबुलिन के 60 μg को निलंबित करें।
    2. 1: 10 के लेबलिंग अनुपात के साथ गैर-बायोटिनिलेटेड रोडामाइन-लेबल ट्यूबुलिन बीज स्टॉक तैयार करने के लिए, 84 μL अनलेबल ट्यूबुलिन, 6 μL फ्लोरोफोर-लेबल ट्यूबुलिन, और 10 mM GMPCPP स्टॉक समाधान का 10 μL 0.5 mL ट्यूब में जोड़ें। धीरे-धीरे पाइप करके अच्छी तरह मिलाएं और बर्फ पर रखें।
      नोट: जीएमपीसीपीपी पोलीमराइजेशन को इन परखों के लिए पसंद किया जाता है क्योंकि सूक्ष्मनलिकाएं अधिक स्थिर होती हैं और जीटीपी के साथ पोलीमराइज्ड होने या टैक्सोल छोड़े जाने की तुलना में ऑप्टिकल ट्रैप के साथ सीधे हेरफेर के लिए उत्तरदायी होती हैं।
    3. 1: 10 के फ्लोरोसेंट लेबलिंग अनुपात के साथ बायोटिनिलेटेड सुदूर लाल लेबल वाले ट्यूबुलिन बीज स्टॉक को तैयार करने के लिए, 0.5 एमएल ट्यूब में 80 μL अनलेबल ट्यूबुलिन, 6 μL फ्लोरोफोरे-लेबल ट्यूबुलिन, 4 μL बायोटिन-लेबल ट्यूबुलिन और 10 mM GMPCPP स्टॉक समाधान का 10 μL जोड़ें। धीरे-धीरे पाइप करके अच्छी तरह मिलाएं और बर्फ पर रखें। 5 मिनट के लिए बर्फ पर बीज स्टॉक को इनक्यूबेट करें।
    4. ट्यूबुलिन समाधान को उच्च गति सेंट्रीफ्यूजेशन के लिए उपयुक्त पॉली कार्बोनेट ट्यूब में स्थानांतरित करें। सूक्ष्मनलिका पोलीमराइजेशन को रोकने और एलिकोटिंग के लिए सतह पर तैरने वाले को पुनर्प्राप्त करने के लिए 2 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ~ 350,000 x g पर बीज स्टॉक को सेंट्रीफ्यूज करें। इस स्तर पर ट्यूबुलिन की अंतिम अनुमानित एकाग्रता ~ 50 μM है।
    5. 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूबों का उपयोग करके, बीज स्टॉक के 2 μL एलिकोट तैयार करें और तरल नाइट्रोजन के साथ फ्लैश फ्रीज करें। एलिकोट को 6 महीने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. सूक्ष्मनलिकाएं का पोलीमराइजेशन
    1. 1x BRB80 का 500 μL तैयार करें और बर्फ पर रखें। पिघलने के लिए बर्फ पर बायोटिनिलेटेड सुदूर लाल और गैर-बायोटिनिलेटेड रोडामाइन बीज स्टॉक एलिकोट में से प्रत्येक को रखें।
    2. 5 मिनट के लिए बर्फ पर बीज स्टॉक को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन अवधि के अंत में, तुरंत प्रत्येक ट्यूब में 1x BRB80 का 26 μL जोड़ें। यदि लंबे सूक्ष्मनलिकाएं वांछित हैं, तो बीआरबी 80 की मात्रा को 5-10 μL तक बढ़ाएं, जबकि, छोटे सूक्ष्मनलिकाएं के लिए, पोलीमराइजेशन के लिए मात्रा को 5 μL तक कम करें।
    3. पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सूक्ष्मनलिका बीज स्टॉक को इनक्यूबेट करें। कमरे के तापमान के 298.5 μL 1x BRB80 और 1.5 μL 4 mM taxol स्टॉक समाधान को 20 μM taxol समाधान का उत्पादन करने के लिए संयोजित करें। 1x BRB80 का 300 μL तैयार करें और दोनों ट्यूबों को कमरे के तापमान पर रखें।
    4. एक उपयुक्त उच्च गति वाले रोटर को 30 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। यह 30 डिग्री सेल्सियस पर सेट टेबलटॉप अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज में किया जा सकता है। पानी के स्नान से सूक्ष्मनलिकाएं निकालें और 10-15 मिनट के लिए बेंचटॉप पर कमरे के तापमान पर रखें।
  3. सूक्ष्मनलिकाएं का स्पष्टीकरण
    1. सूक्ष्मनलिका विकास समाधान में कमरे के तापमान 1x BRB80 का 100 μL जोड़ें और ट्यूब को ~ 10 बार या धीरे से पाइपिंग करके मिलाएं। माइक्रोट्यूबुल्स विकास समाधान को पॉली कार्बोनेट सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. पॉली कार्बोनेट ट्यूब के एक तरफ चिह्नित करें, जो सेंट्रीफ्यूज के रोटेशन के सापेक्ष बाहर की ओर होगा। यह सूक्ष्मनलिका गोली का पता लगाने में सहायता करेगा, जो सामग्री की छोटी मात्रा के कारण मुश्किल से दिखाई देगा।
    3. 30 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए ~ 350,000 x g पर सूक्ष्मनलिका समाधान को सेंट्रीफ्यूज करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, यदि संभव हो तो गोली के लिए सूक्ष्मनलिकाएं युक्त ट्यूब का निरीक्षण करें। गोली को परेशान किए बिना, तरल के अंतिम कुछ माइक्रोलीटर को ध्यान से हटा दें। यदि गोली स्पष्ट रूप से दिखाई नहीं दे रही है, तो उस क्षेत्र को परेशान करने से बचने के लिए गाइड के रूप में किए गए अंकन का उपयोग करें जहां गोली स्थित है।
    4. तुरंत माइक्रोट्यूबुल्स ट्यूब में 1x BRB80 + 20 μM taxol का 100 μL जोड़ें। इसे सीधे गोली पर जोड़ा जा सकता है; इस स्तर पर पेलेट का विघटन स्पष्टीकरण प्रक्रिया को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं करता है।
    5. सूक्ष्मनलिकाएं फिर से ~ 350,000 x g पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें, यह सुनिश्चित करने के लिए सावधान रहें कि ट्यूब का चिह्नित खंड फिर से सेंट्रीफ्यूज के घूर्णन के सापेक्ष बाहर की ओर उन्मुख है।
    6. समाधान के कुछ माइक्रोलीटर को छोड़कर सभी को पहले की तरह हटा दें, फिर से सूक्ष्मनलिका गोली को बाधित करने से बचने के लिए सावधान रहें। चरण 1.3.4.-1.3.5 दोहराएँ। और फिर माइक्रोट्यूबुल्स पेलेट को 1x BRB80 + 20 μM taxol के 20-50 μL में पुन: निलंबित करें।
    7. अधिकांश पुन: निलंबन मात्रा को पाइप करके पुन: निलंबन की मात्रा को पुन: निलंबित करें और धीरे से इसे सीधे गोली पर बाहर निकालें, 20-30 गुना दोहराएं या जब तक कि गोली पूरी तरह से पुन: निलंबित न हो जाए। यह सावधानी के साथ किया जाना चाहिए ताकि अत्यधिक जोरदार पाइपिंग द्वारा सूक्ष्मनलिकाएं न हों। उद्घाटन के आकार को बढ़ाने के लिए पिपेट टिप को काटना सूक्ष्मनलिका कतरनी को कम करने में भी सहायक हो सकता है।
    8. फ्लोरोफोरेस को प्रकाश से बचाने और बेंचटॉप पर रखने के लिए ट्यूब को पन्नी में लपेटकर कमरे के तापमान पर सूक्ष्मनलिकाएं स्टोर करें। सूक्ष्मनलिकाएं आमतौर पर स्पष्टीकरण के बाद 2-3 दिनों के लिए उपयोग करने योग्य होती हैं।
  4. माइक्रोस्कोपी के माध्यम से सूक्ष्मनलिकाएं का आकलन
    1. 1 μL सूक्ष्मनलिकाएं और कमरे के तापमान 1x BRB80 के 9 μL को मिलाकर स्पष्ट सूक्ष्मनलिका समाधान का 1:10 कमजोर पड़ने की तैयारी करें। माइक्रोस्कोप स्लाइड पर 10 μL पाइप करके और फिर स्क्वैश बनाने के लिए बूंद के ऊपर एक कवरस्लिप रखकर इस घोल को तुरंत छवि दें।
    2. सुनिश्चित करें कि उच्च घनत्व पर 8-25 μm तक की लंबाई में सूक्ष्मनलिकाएं दिखाई देती हैं (घने जाल में स्तरित दृश्य के कई सौ प्रति पूर्ण क्षेत्र) फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके कल्पना की जाती है और सूक्ष्मनलिका कमजोर पड़ने के संपर्क में कवरस्लिप सतह पर केंद्रित 100x उद्देश्य दिखाई देता है।

2. पासिवेटेड कवरलिप्स की तैयारी

  1. कवरलिप्स धोना
    1. गैर-प्रतिक्रियाशील प्लास्टिक रैक में 18 मिमी x 18 मिमी कवरलिप रखें, फिर प्रत्येक रैक को 100 एमएल बीकर में रखें। रैक में प्रति स्लॉट एक कवरलिप रखें, क्योंकि कवरलिप्स के दोनों किनारों की सफाई आवश्यक है।
    2. प्रत्येक सोनिकेशन चक्र के लिए दिए गए क्रम में निम्नलिखित समाधानों के 50 एमएल का उपयोग करके 5 मिनट के लिए स्नान सोनिकेट करें: (1) विआयनीकृत पानी (18.3 एम-सेमी प्रतिरोधकता के साथ), (2) 2% माइक्रो -90 समाधान, (3) विआयनीकृत पानी, (4) ताजा तैयार 0.1 एम केओएच, (5) विआयनीकृत पानी (चित्रा 1 ए)। सुनिश्चित करें कि कवरलिप पूरी तरह से तरल में कवर किए गए हैं। सोनिकेशन चक्रों के बीच, विआयनीकृत पानी में रैक को ऊपर और नीचे 10-20 गुना डुबोने के लिए चिमटी का उपयोग करके विआयनीकृत पानी में कवरलिप्स के प्रत्येक रैक को कुल्ला करें, पानी को बदलें, और कुल्ला प्रक्रिया को 2 गुना दोहराएं।
    3. कवरलिप्स को पानी में 3 गुना कुल्ला करें, फिर बीकर को 100% इथेनॉल के साथ फिर से भरें और रैक को बीकर को वापस करें। बीकर्स को एक फ्यूम हुड में ले जाएं और सभी कवरस्लिप रैक के लिए जगह बनाने के लिए पर्याप्त ऊतक पोंछे बिछाएं। फिर, ट्वीज़र्स के साथ रैक को हटा दें और ऊतक पोंछे पर रखें।
    4. सूखी नाइट्रोजन गैस धारा का उपयोग करके, इथेनॉल को कवरलिप्स और उनके रैक से सूखने तक उड़ा दें। बीकर से शेष इथेनॉल का निपटान करें और इसी तरह उन्हें सूखी नाइट्रोजन गैस धारा (चित्रा 1 ए) का उपयोग करके सुखाएं।
  2. कवरस्लिप्स पर एमिनोसिलेन सतह कार्यात्मकता
    1. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 40 एमएल एसीटोन और 400 आरएल एपीटीईएस अभिकर्मक जोड़कर (3-एमिनोप्रोपाइल) टाईथोक्सीसिलेन (एपीटीईएस) अभिकर्मक समाधान तैयार करें, कसकर कैप करें, और 10x को उलटकर मिलाएं।
    2. कवरलिप्स के एक रैक को इसके संबंधित सूखे बीकर में ले जाएं, और फिर एपीटीईएस समाधान में पूरी तरह से डूब जाएं। 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें (चित्रा 1 ए)। एपीटीईएस-उपचारित रैक को एक नए सूखे बीकर में ले जाएं, और 5 मीटर के लिए इनक्यूबेट करने के लिए एपीटीईएस में एक नया रैक ले जाएं।
    3. चरण 2.1.2 में वर्णित रैक को 10-20x डुबोकर उपचारित रैक को विआयनीकृत पानी से धोएं, पानी 5x की जगह लें। तब तक दोहराएं जब तक कि सभी कवरलिप्स का इलाज और धोया न जाए।
  3. एमिनोसिलेन सतह का पीईजीनाइलेशन
    1. दो पीईजी समाधान तैयार करें, एक 25% डब्ल्यू / वी पीईजी के साथ ~ 100 μL का और दूसरा ~ 10% w / v बायोटिन-पीईजी के साथ ~ 10 μL का, दोनों ताजा तैयार 0.1 M NaHCO 3 में निलंबित हैं,जो 24 कवरलिप्स को कोट करने के लिए पर्याप्त है। पीईजी को पूरी तरह से भंग करने के लिए 0.1 एम एनएएचसीओ 3 को जोड़ने के बाद 20 सेकंड के लिए 3,000 x g पर25 % पीईजी समाधान को सेंट्रीफ्यूज करें; समाधान बादल छाए रह सकते हैं। बायोटिन-पीईजी को कोमल पाइपिंग द्वारा मिलाएं (चित्रा 1 बी)।
    2. पीईजी और बायोटिन-पीईजी समाधानों का मिश्रण तैयार करें, जिसमें पीईजी की 33.3 गुना मात्रा से बायोटिन-पीईजी की 1 मात्रा (उदाहरण के लिए, पीईजी समाधान का 100 μL और बायोटिन-पीईजी समाधान का 3 μL) हो।
    3. एक फ्यूम हुड में, कई बाँझ और लिंट-फ्री वाइप्स बिछाएं। कवरस्लिप रैक को वाइप्स पर ले जाएं और पहले की तरह सूखी नाइट्रोजन गैस धारा के साथ सूखा दें। कई नए और सूखे पोंछे पर, अब पूरी तरह से सूखे कवरलिप्स को जोड़े में व्यवस्थित करें और प्रत्येक को "बी" जैसे असममित प्रतीक के साथ नीचे दाएं कोने में लेबल करें। यह अंकन कवरस्लिप की नमूना सतह के विपरीत होगा और प्रयोग (चित्रा 1 बी) में हस्तक्षेप नहीं करेगा।
    4. चिमटी के साथ प्रत्येक जोड़ी में एक कवरलिप फ्लिप करें। प्रत्येक फ़्लिप किए गए कवरस्लिप पर, पीईजी / बायोटिन-पीईजी मिश्रण के 6 μL रखें और दूसरे कवरस्लिप को शीर्ष पर रखें ताकि दोनों "बी" लेबल बाहर की ओर हों।
    5. कवरस्लिप किनारों को संरेखित करें, और सुखाने से रोकने के लिए एक ह्यूमिडिफाइड और एयरटाइट कक्ष में रखें। 3 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर आर्द्रता कक्ष में कवरलिप्स को इनक्यूबेट करें।
    6. इनक्यूबेशन के बाद, आर्द्रता कक्ष से कवरलिप्स को हटा दें, कवरस्लिप जोड़े को सावधानीपूर्वक अलग करें, और उन्हें अपने रैक में वापस रखें। प्रत्येक रैक को पहले की तरह विआयनीकृत पानी में धो लें, रैक को 10-20 गुना चिमटी का उपयोग करके डुबोएं और पानी को कुल 5 गुना बदल दें।
    7. कवरलिप्स के सभी PEGylated किनारों को एक ही दिशा के सामने रखें ताकि कोई भी दो PEGylated कवरस्लिप सतहें एक-दूसरे का सामना न करें। PEGylated सतह तब तक बहुत चिपचिपी होगी जब तक कि यह पूरी तरह से सूख न जाए, इसलिए कवरलिप्स को छूने से रोकने के लिए अतिरिक्त सावधानी बरतें। सूखी नाइट्रोजन गैस धारा (चित्रा 1 बी) का उपयोग करके प्रत्येक रैक और कवरलिप को पहले की तरह सुखाएं।
    8. एक बार जब कवरलिप और उनके रैक पूरी तरह से सूख जाते हैं, तो सतह कोटिंग के क्षरण को रोकने के लिए वैक्यूम डेसिकेटर में स्टोर करें। पीईजी कोटिंग को बाधित करने से नमी को रोकने के लिए वैक्यूम के तहत और डेसिकेंट के साथ ठीक से संग्रहीत; कवरलिप का उपयोग लगभग 1 सप्ताह के लिए किया जा सकता है।

3. काइन्सिन-लेपित मोतियों की तैयारी

  1. कठोरता काइन्सिन निर्माण का चयन और तैयारी
    1. प्रकाशित प्रोटोकॉल53,54 के अनुसार कठोरता काइन्सिन संरचनाओं को व्यक्त और शुद्ध करें। फ़्लैश फ्रीज 0.02 मिलीग्राम / एमएल काइन्सिन समाधान के 5 μL एलिकोट और 1 वर्ष तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: रिगोर किनेसिन प्रोटीन में जी 234 ए बिंदु उत्परिवर्तन होता है जो एटीपी हाइड्रोलिसिस को रोकता है। जब माइक्रोबीड्स के साथ संयुग्मित किया जाता है, तो सूक्ष्मनलिका के साथ उच्च आत्मीयता बातचीत मोतियों को कई मिनटों तक 10-20 पीएन के भार को बनाए रखने की अनुमति देती है। आमतौर पर नियोजित काइन्सिन -1 होमोडिमर K560 53 और एक और अनुकूलितK439 निर्माण55 दोनों के रिगोर उत्परिवर्तित संस्करणों को भी इनपरखों में सफलता के साथ नियोजित किया गया है। इस बेहतर K439 निर्माण में स्थिरता बढ़ाने के लिए एक ईबी 1 डिमराइजेशन डोमेन और 6-हिज एंटीबॉडी के लिए विशिष्ट बंधन के लिए एक सी-टर्मिनल 6-हिज टैग शामिल है, जैसा कि नीचे वर्णित है।
  2. 6-उनके एंटीबॉडी को स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित मोतियों से बांधना
    1. 0.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 1 μm व्यास स्ट्रेप्टाविडिन-लेपित पॉलीस्टाइनिन मोती का 50 μL जोड़ें। 30 सेकंड के लिए सोनिकेट।
    2. 1x BRB80 के 790 μL में 200 mM DTT का 10 μL जोड़ें। इस 1x BRB80 + 2.5 mM DTT बफर के 40 μL में 10 μL सोनिकेटेड मोती जोड़ें।
    3. बायोटिनाइलेटेड 6-हिस एंटीबॉडी के 1 μL और 1x BRB80 + 2.5 mM DTT के 49 μL को मिलाएं; भंवर को संक्षेप में मिश्रण करना है।
    4. एक नई ट्यूब में पतला मोती मिश्रण के 50 μL और एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के 50 μL को मिलाएं। ट्यूब को 4 डिग्री सेल्सियस पर घूमने वाली ट्यूब में रखें और 1 घंटे के लिए घुमाएं। मोती मिश्रण को 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,000 x g पर 10 मिनट के लिए घुमाएं।
    5. पिपेट ने सतह पर तैरने वाले को उतार दिया और 1x BRB80 में 2 mg/mL कैसिइन समाधान के 100 μL में गोली को फिर से निलंबित कर दिया। इस सेंट्रीफ्यूजेशन और रीसस्पेंशन 2x को दोहराएं।
  3. कठोरता काइन्सिन के अलावा
    1. अंतिम गोली को 2 मिलीग्राम / एमएल कैसिइन समाधान के 100 μL में पुन: निलंबित करें। 0.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, 0.02 मिलीग्राम / एमएल कठोरता काइन्सिन और 5 μL मोतियों के 5 μL को मिलाएं, ट्यूब ~ 10x को हल्के से फ्लिक करके धीरे से मिलाएं।
    2. उपयोग में नहीं होने पर के 439 जी 234 ए बीड सस्पेंशन और शेष 6-हिज बीड्स दोनों को रोटर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। मोतियों को ताजा तैयार किया जाना चाहिए और प्रयोगों के लिए उसी दिन उपयोग किया जाना चाहिए क्योंकि वे इस समय से परे गतिविधि को झुंझलाते और खो देते हैं।

4. माइक्रोस्कोपी कक्ष की असेंबली

  1. ग्लास स्लाइड और कक्ष निर्माण की तैयारी
    1. 75 मिमी x 25 मिमी माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड को पहले अल्ट्राप्योर पानी से धोएं, उसके बाद नॉन-स्ट्रीक अमोनिया-डी ग्लास क्लीनर, और फिर एक बार अल्ट्राप्योर पानी के साथ। अतिरिक्त पानी की बूंदों को हटाने के लिए हिलाएं। नाइट्रोजन स्ट्रीम का उपयोग करके स्लाइड्स को सुखाएं ताकि कोई लकीर न रहे और स्लाइड्स को पेपर टॉवल (चित्रा 2 ए) पर रखें।
    2. कैंची के साथ, डबल-साइडेड टेप को ~ 2-3 मिमी x 2.5 सेमी (प्रति एकल कक्ष 2 स्ट्रिप्स और 3 प्रति डबल चैंबर) की स्ट्रिप्स में काटें।
    3. फोर्सप्स का उपयोग करके, एक ग्लास स्लाइड पर टेप की दो स्ट्रिप्स बिछाएं ताकि एक एकल कक्ष बनाने के लिए उनके बीच ~ 0.5 सेमी जगह हो। डबल कक्षों के लिए, एक ही रिक्ति का उपयोग करें, लेकिन टेप की तीन स्ट्रिप्स के साथ (चित्रा 2 बी)। इस विधि का उपयोग करने वाले नमूना चैनल की मात्रा लगभग 10 μL है।
      नोट: कक्ष (ओं) जितना व्यापक होगा, उतनी ही अधिक संभावना है कि समाधान प्रवाहित होने पर बुलबुले बनेंगे; हालांकि, 0.5 सेमी से कम चौड़े कक्ष इमेजिंग के लिए कम क्षेत्र के कारण उपयोग करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है।
    4. टेप की प्रत्येक पट्टी की लंबाई को बल का उपयोग करके खुरचें ताकि टेप को ग्लास स्लाइड से मजबूती से जोड़ा जा सके।
    5. डेसिकेटर से दबाव छोड़ें और स्टोरेज रैक से एक बायोटिनाइलेटेड कवरस्लिप को हटाने के लिए फोर्स का उपयोग करें। फोर्सप्स का उपयोग करके ग्लास स्लाइड के शीर्ष पर एक बायोटिनाइलेटेड कवरस्लिप रखें। सुनिश्चित करें कि बायोटिनाइलेटेड पक्ष ग्लास स्लाइड की ओर अंदर की ओर है।
    6. फोर्सप्स के फ्लैट बैक एंड का उपयोग करके, धीरे से ग्लास पर दबाएं जहां कवरस्लिप कक्षों को सुरक्षित रूप से सील करने के लिए टेप को छूता है। यह सुनिश्चित करने के लिए प्रकाश दबाव का उपयोग किया जाना चाहिए कि कवरस्लिप दरार नहीं करता है (चित्रा 2 सी)।
    7. तैयार माइक्रोस्कोपी कक्षों को एक एयरटाइट कंटेनर में स्टोर करें, सीधे प्रकाश से दूर, उपयोग तक (चित्रा 2 डी)।
      नोट: उसी दिन कक्षों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है जिस दिन वे बनाए जाते हैं, क्योंकि हवा के संपर्क में आने पर बायोटिनाइलेटेड कवरलिप्स खराब हो जाते हैं।
  2. माइक्रोस्कोपी अभिकर्मकों का प्रवाह
    1. एक खाली पिपेट टिप बॉक्स के तल पर अल्ट्राप्योर पानी से कम मुड़े हुए लिंट-मुक्त ऊतक को रखकर एक आर्द्रता कक्ष का निर्माण करें। चैनल से समाधानों के वाष्पीकरण को कम करने के लिए नमूना कक्षों को प्रवाह-इन चरणों के बीच इस बॉक्स में रखा जाना चाहिए।
    2. चैनल के एक छोर पर तरल को पाइप करके और विपरीत छोर पर तरल को बाहर निकालकर सभी अभिकर्मकों का परिचय दें। बात करने के लिए, ऊतक के एक छोर को मोड़ें और धीरे से इसे कक्ष के निकास पक्ष पर रखें, जिससे केशिका क्रिया को अभिकर्मक को सजातीय रूप से वितरित करने की अनुमति मिलती है (चित्रा 3 ए)। सूक्ष्मनलिका डीपोलीमराइजेशन को रोकने के लिए बहने से ठीक पहले सभी अभिकर्मकों को कमरे के तापमान पर लाएं।
    3. 20 μL कोण वाले पिपेट टिप का उपयोग करके ताकि यह एक कक्ष के प्रवेश पक्ष को छू रहा हो, धीरे-धीरे 0.5 mg/ mL स्ट्रेप्टाविडिन या न्यूट्राविडिन के 10 μL में प्रवाहित हो। कक्ष में बुलबुले प्राप्त करने की संभावना को कम करने के लिए छोटे पिपेट युक्तियों और अभिकर्मकों के धीमे, निरंतर प्रवाह का उपयोग करें (चित्रा 3 बी)।
    4. 4 मिनट के लिए आर्द्रता कक्ष में स्लाइड को इनक्यूबेट करें, जिसमें कक्ष का कवरस्लिप साइड नीचे की ओर हो। यह अभिविन्यास बड़ी वस्तुओं, जैसे सूक्ष्मनलिकाएं या मोती, को PEGylated सतह के पास डूबने की अनुमति देगा।
    5. तरल पदार्थ निकालने के लिए लिंट-मुक्त ऊतक का उपयोग करके, 1x BRB80 के 20 μL का उपयोग करके कक्ष को बाहर निकालें। यदि कक्ष में कोई रिसाव मौजूद है, तो स्लाइड को छोड़ दें और दूसरे से शुरू करें; कक्ष में होने वाले छोटे बुलबुले इमेजिंग को हानिकारक रूप से प्रभावित नहीं करेंगे।
    6. फ्लो-इन, इनक्यूबेशन और फ्लश चरणों को 0.5 मिलीग्राम / एमएल कैसिइन ब्लॉकिंग समाधान के 10 μL के साथ दोहराएं (चित्रा 3 सी)। पतला बायोटिनिलेटेड दूर-लाल सूक्ष्मनलिकाएं ~ 1: 20 और कक्ष में 10 μL प्रवाहित करें। 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें और कक्ष को 1x BRB80 (चित्रा 3D) के 20 μL के साथ फ्लश करें। 100 μm x 100 μm इमेजिंग क्षेत्र के भीतर इन सूक्ष्मनलिकाएं का इष्टतम घनत्व 10-20 होना चाहिए; और इस स्तर पर कमजोर पड़ने को इस सतह-बाध्यकारी अनुपात को प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए।
    7. अध्ययन किए जाने वाले उचित सांद्रता (आमतौर पर 1-10 एनएम) क्रॉसलिंकिंग मोटर या गैर-मोटर प्रोटीन के 10 μL के साथ फ्लो-इन, इनक्यूबेशन और फ्लश चरणों को दोहराएं (चित्रा 3 ई)।
    8. रोडामाइन सूक्ष्मनलिकाएं के 10 μL में प्रवाह पिछले बायोटिनिलेटेड दूर-लाल सूक्ष्मनलिकाएं के समान एकाग्रता तक पतला हो जाता है। इनक्यूबेशन और फ्लश चरणों को दोहराएं (चित्रा 3 एफ)।
    9. क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन गतिविधि के लिए अनुकूलित कठोरता काइन्सिन-लेपित मोतियों के 1 μL और प्रतिक्रिया बफर के 19 μL को मिलाएं। उदाहरण के लिए, काइन्सिन -5 गतिविधि के विश्लेषण के लिए, 1 एमएम टीसीईपी बॉन्ड ब्रेकर, 0.2 मिलीग्राम / एमएल अल्फा कैसिइन, 70 एमएम केसीएल, ऑक्सीजन स्कैवेंजिंग सिस्टम (4.5 मिलीग्राम / एमएल ग्लूकोज, 350 यूनिट / एमएल ग्लूकोज ऑक्सीडेज, 34 यूनिट / एमएल कैटालेज), 1 एमएम डीटीटी, और वांछित एकाग्रता पर एटीपी के साथ प्रतिक्रिया बफर का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, अधिकतम किनेसिन वेग स्थितियों के लिए 1 एमएम)। ). गैर-मोटर प्रोटीन के विश्लेषण के लिए, एटीपी को छोड़ दें और इन परखों में प्रोटीन-सूक्ष्मनलिकाएं बातचीत की ताकत को संशोधित करने के लिए केसीएल की एकाग्रता को बदलें।
    10. कक्ष के दोनों किनारों को स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ सील करें और इमेजिंग से पहले पॉलिश के सूखने तक प्रतीक्षा करें (चित्रा 3 एच)। एक सफलतापूर्वक निर्मित कक्ष में कोई रिसाव मौजूद नहीं होगा और न्यूनतम बुलबुले होंगे।

5. 3-रंग टीआईआरएफ के साथ इमेजिंग माइक्रोट्यूबुल्स बंडल

  1. एक उल्टे माइक्रोस्कोप उपकरण को नियोजित करें जिसमें टीआईआरएफ इमेजिंग क्षमताएं हैं, और जिसमें एक एकल-बीम ऑप्टिकल ट्रैप का निर्माण किया गया है (चित्रा 4)।
    नोट: यहां वर्णित अध्ययनों के लिए, एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग क्रमशः जीएफपी-टैग किए गए प्रोटीन, रोडामाइन-लेबल माइक्रोट्यूबुल्स और बायोटिनिलेटेड सुदूर लाल लेबल वाले सूक्ष्मनलिकाएं के लिए 488 एनएम, 561 एनएम और 640 एनएम पर तीन लेजर के साथ 100x / NA1.49 तेल उद्देश्य लेंस, TIRF मॉड्यूल और तीन लेजर के साथ किया गया था।
    1. नमूना कक्ष के कवरस्लिप पर विसर्जन तेल की एक बूंद जोड़ें। अत्यधिक तेल माइक्रोस्कोप उद्देश्य को नुकसान पहुंचा सकता है। नमूना कक्ष के कवरस्लिप पक्ष के साथ नीचे की ओर, नमूना को माइक्रोस्कोप प्लेटफॉर्म पर चित्रित करने के लिए रखें।
    2. धीरे-धीरे उद्देश्य को ऊपर लाएं ताकि तेल के माध्यम से कवरस्लिप और उद्देश्य दोनों के बीच संपर्क हो। उद्देश्य ऊंचाई समायोजित करें ताकि नमूना कक्ष की कवरस्लिप सतह फोकस में हो।
    3. सभी तीन चैनलों में नमूने की एकल फ्रेम छवियों को रिकॉर्ड करें। यहां प्रयोगों के लिए, सभी तीन चैनलों में इष्टतम इमेजिंग अवधि के रूप में 100-200 एमएस एक्सपोजर का उपयोग करें; लंबे समय तक एक्सपोजर समय के परिणामस्वरूप फोटोब्लीचिंग में वृद्धि हो सकती है।
    4. व्यक्तिगत बंडल की परख होने पर 2-5 मिनट में फोटोब्लीचिंग को कम करते हुए नमूनों से एक अच्छा सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए लेजर शक्ति को समायोजित करें। यहां उपयोग किए जाने वाले लेजर (चित्रा 4 और चित्रा 5) के लिए, जीएफपी चैनल के लिए 5 मेगावाट और दोनों सूक्ष्मनलिका चैनलों के लिए 3 मेगावाट की लेजर शक्ति का इष्टतम के रूप में उपयोग करें।
      नोट: सफलतापूर्वक इकट्ठे किए गए बंडलों में दूर-लाल चैनल में एक सतह-स्थिर सूक्ष्मनलिकाएं, महत्वपूर्ण जीएफपी-प्रोटीन सिग्नल के साथ कई माइक्रोन का एक सह-व्यापक क्षेत्र, और इन क्षेत्रों को ओवरलैप करने वाला एक रोडामाइन माइक्रोट्यूबुल्स होना चाहिए और फिर बंडल से कई माइक्रोन दूर तक फैला होना चाहिए (चित्रा 5 बी, सी और चित्रा 6)। ). रोडामाइन माइक्रोट्यूबुल्स की लाइव इमेजिंग को गैर-क्रॉसलिंक्ड माइक्रोट्यूबुल्स छोर पर सूक्ष्म उतार-चढ़ाव प्रकट करना चाहिए, यह दर्शाता है कि यह फिलामेंट सतह या कक्ष में अन्य प्रोटीन से जुड़ा नहीं है।
    5. दृश्य के प्रति क्षेत्र सूक्ष्मनलिका बंडलों की आवृत्ति का निरीक्षण करें। सफलतापूर्वक तैयार नमूने के लिए, प्रति कक्ष प्रति 100 μL x 100 μL क्षेत्र में लगभग 3-4 सूक्ष्मनलिकाएं मौजूद होनी चाहिए।

6. सूक्ष्मनलिका बंडलों पर ऑप्टिकल ट्रैप प्रयोगों का प्रदर्शन

  1. शर्तों का पूर्व-प्रयोगात्मक अंशांकन
    1. इन प्रयोगों को करने के लिए, 0.05-0.1 pN / nm की कठोरता के साथ एकल-बीम ऑप्टिकल जाल का उपयोग करें। ट्रैपिंग ऑप्टिक्स और स्थिति-संवेदनशील फोटोडिटेक्टर को क्रमशः उद्देश्य के ठीक नीचे और कंडेनसर के ऊपर शॉर्ट पास फिल्टर पेश करके टीआईआरएफ-सक्षम उल्टे माइक्रोस्कोप में शामिल करें (चित्रा 4)।
    2. इसके अलावा, एक नैनोपोजिशनिंग चरण जोड़ें जिस पर नमूना बैठता है ताकि उपयोगकर्ता को इन परखों के दौरान नियंत्रित तरीके से नैनोमीटर-स्केल परिशुद्धता के साथ सूक्ष्मनलिकाएं स्थानांतरित करने की अनुमति मिल सके। प्रतिनिधि डेटा प्राप्त करने के लिए यहां उपयोग की जाने वाली प्रणाली को प्रकाशित कार्य 27,53,54,56,57 में वर्णित किया गया है।
      नोट: हालांकि इस प्रोटोकॉल के दायरे से परे, कई संसाधन उपलब्ध हैं जो एकल-बीम ऑप्टिकल ट्रैप 58,59,60 के निर्माण और अंशांकन का विवरण देते हैं।
    3. एक ब्राइटफील्ड या डीआईसी चैनल का उपयोग करके नमूने में मोतियों के घनत्व और माइक्रोस्कोप पर 100x उद्देश्य का निरीक्षण करें। ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग केवल मोतियों की पहचान और हेरफेर करने के लिए करें और फ्लोरेसेंस छवि अधिग्रहण के साथ एक साथ रिकॉर्ड न करें। मोतियों को औसतन एक दूसरे से न्यूनतम 10 μm होने के लिए स्पेस करें, और सुनिश्चित करें कि वे किसी भी प्रकार के सतह कारावास या लगाव से मुक्त हैं और एक दूसरे या अन्यथा क्लस्टरिंग से जुड़े नहीं हैं।
    4. सुनिश्चित करें कि बायोटिनिलेटेड दूर-लाल सूक्ष्मनलिकाएं कवरस्लिप की सतह से मजबूती से जुड़ी हुई हैं, जिसमें कोई दिखाई देने वाली ब्राउनियन गति नहीं है, जैसे कि सूक्ष्मनलिका अक्ष के साथ गति या समाधान में उतार-चढ़ाव वाले सूक्ष्मनलिकाएं के मुक्त छोर।
    5. सुनिश्चित करें कि रोडामाइन सूक्ष्मनलिकाएं क्रॉसलिंकिंग एमएपी के माध्यम से बायोटिनिलेटेड सूक्ष्मनलिकाएं से जुड़ी हुई हैं और उनके मुक्त सिरों पर स्पष्ट रूप से उतार-चढ़ाव हो रही हैं। गैर-बायोटिनिलेटेड सूक्ष्मनलिकाएं की सतह संलग्नक अक्सर इंगित करती है कि पीईजीनाइलेशन असफल हो सकता है या पीईजी कोटिंग खराब हो गई है।
  2. मोटर-ड्राइव सूक्ष्मनलिका स्लाइडिंग माप
    1. प्रकाशित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए रुचि के मोटर प्रोटीन को व्यक्त और शुद्ध करें। उदाहरण के लिए, पूर्ण लंबाई वाले जीएफपी-टैग किए गए किन्सिन -5 प्रोटीन को सफलतापूर्वक शुद्ध किया गया है और इनपरखों में नियोजित किया गया है 53,61, साथ ही बिना लेबल वाले किनेसिन -1262 और किन्सिन -1463। चरण 4 और 5 में ऊपर वर्णित मोटर-प्रोटीन क्रॉसलिंक बंडलों को इकट्ठा और विज़ुअलाइज़ करें।
    2. ऑप्टिकल ट्रैप के साथ समाधान में एक मुक्त एकल मोती कैप्चर करें जो ब्राउनियन गति का प्रदर्शन कर रहा है। मोती को दृश्य क्षेत्र के मध्य में ले जाने के लिए आवश्यक रूप से जाल प्रकाशिकी को समायोजित करें। सुनिश्चित करें कि ट्रैप बीम से प्रतिबिंबित हस्तक्षेप पैटर्न सममित है और किसी भी बीम विषमताओं को हल करने के लिए ट्रैप ऑप्टिक्स को समायोजित करें।
    3. नमूना चरण को स्थानांतरित करें ताकि एक बंडल के भीतर रोडामाइन सूक्ष्मनलिका का मुक्त छोर सीधे मोती के नीचे हो और जाल बीम-प्रेरित फोटोब्लीचिंग को कम करने के लिए क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन युक्त ओवरलैप क्षेत्र से कई माइक्रोन दूर हो। जेड-अक्ष में मोती को तब तक कम करें जब तक कि यह सूक्ष्मनलिका से न टकरा जाए। मोती को धीरे से कम करने का ध्यान रखें, और मोती को कवरस्लिप सतह के खिलाफ धक्का न दें, क्योंकि इससे कवरस्लिप सतह पर चिपक सकता है।
    4. स्लाइडिंग सूक्ष्मनलिका से जुड़े मोती की गतिशीलता को ब्राइटफील्ड चैनल के साथ देखने के लिए संक्षेप में जाल बंद करें। मोटर प्रोटीन परख करते समय, संलग्न मोती दिशात्मक रूप से आगे बढ़ेगा क्योंकि सूक्ष्मनलिकाएं अलग हो जाती हैं। जाल को फिर से सक्रिय करें और मोती को फिर से पकड़ें।
    5. लेजर पावर और एक्सपोज़र समय का उपयोग करके तीन (488 एनएम, 561 एनएम, 640 एनएम) चैनलों में प्रतिदीप्ति डेटा को 1-2 फ्रेम प्रति सेकंड की दर से रिकॉर्ड करना शुरू करें जो ऊपर चरण 5 में अनुकूलित किए गए थे।
    6. ट्रैपिंग कंप्यूटर सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, स्थिति-संवेदनशील फोटोडिटेक्टर (एक्स, वाई, और एसयूएम तीव्रता सिग्नल), नैनोपोजिशनिंग स्टेज (एक्स, वाई और जेड निर्देशांक), और टीआईआरएफ कैमरा शटर स्थिति से वोल्टेज डेटा रिकॉर्ड करें। प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के आधार पर 1-10 kHz की दर पर उपयुक्त सॉफ़्टवेयर (जैसे कस्टम-लिखित लैबव्यू कोड) द्वारा नियंत्रित एक समर्पित वोल्टेज इनपुट डेटा अधिग्रहण बोर्ड का उपयोग करके इन ट्रैप वोल्टेज मूल्यों को डिजिटाइज़ करना शुरू करें।
    7. डेटा प्राप्त होने पर बल संकेत की निगरानी करें और किसी भी विसंगतियों पर पूरा ध्यान दें जो सफल डेटा संग्रह में हस्तक्षेप कर सकते हैं।
      नोट: विसंगतियों में शामिल हैं लेकिन (1) जाल में जाने वाले अन्य मोतियों तक सीमित नहीं हैं, (2) जाल से समय से पहले बच निकलने वाले मोती, और (3) बल की अचानक गिरावट और बाद में जाल के खिलाफ बल को फिर से शुरू करने में विफलता, मोती की सतह पर कठोरता किनेसिन अणुओं के साथ मुद्दों को दर्शाता है।
    8. माप के बाद, मोती को छोड़ने के लिए जाल को निष्क्रिय करें और एक नए मोती और नए सूक्ष्मनलिका के साथ दोहराएं जब तक कि प्रयोगात्मक दोहराव की आवश्यक संख्या प्राप्त न हो जाए।
  3. निष्क्रिय क्रॉसलिंकिंग प्रतिरोध माप
    1. प्रकाशित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए रुचि के गैर-मोटर क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन को व्यक्त और शुद्ध करें। उदाहरण के लिए, पूर्ण लंबाई वाले जीएफपी-लेबल वाले पीआरसी 1 43,54,57 और एक डिमेरिक न्यूमा कटे हुए निर्माण56 को सफलतापूर्वक इन परखों में नियोजित किया गया है। चरण 4 और 5 में ऊपर वर्णित क्रॉसलिंक किए गए बंडलों को इकट्ठा करें और कल्पना करें।
    2. एक उपयुक्त सूक्ष्मनलिका बंडल की पहचान करें जिसमें केवल दो सूक्ष्मनलिकाएं होती हैं, एक पूर्ण सतह लगाव के साथ बायोटिनाइलेटेड और एक गैर-बायोटिनाइलेटेड माइक्रोट्यूबुल्स जो समाधान में आंशिक रूप से मुक्त होता है; यह एक मोती संलग्न करने के लिए एक मुक्त अंत देता है और गारंटी देता है कि मोती सतह-बाध्य सूक्ष्मनलिका से जुड़ा नहीं है और एक्स- या वाई-अक्ष पर संरेखित है, जैसे कि चरण गति केवल एक अक्ष के साथ होगी।
    3. ब्राउनियन गति से गुजरने वाले एक मुक्त मोती को पकड़ने के लिए ऑप्टिकल ट्रैप का उपयोग करें। एक बार जब मोती फंस जाता है, तो सावधानीपूर्वक मोती को चयनित सूक्ष्मनलिका बंडल पर ले जाएं, यह सुनिश्चित करते हुए कि इस प्रक्रिया में कोई अन्य मोती जाल में नहीं खींचा जाता है। सुनिश्चित करें कि जीएफपी टैग के फोटोब्लीचिंग को कम करने के लिए मोती क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन युक्त ओवरलैप क्षेत्र से कई माइक्रोन दूर है।
    4. जेड-अक्ष में मोती को सावधानीपूर्वक कम करें जब तक कि यह रोडामाइन सूक्ष्मनलिका के मुक्त खंड के किनारे से संपर्क न करे। धीरे से खींचें और सूक्ष्मनलिका अक्ष के लंबवत आगे बढ़ें ताकि रोडामाइन सूक्ष्मनलिकाएं झुकने और मोती की स्थिति का पालन करके लगाव की जांच की जा सके। यदि संलग्न नहीं है, तो संलग्न होने तक सूक्ष्मनलिका पर मोती के कोमल उभार को दोहराएं।
    5. नैनोपोजिशनिंग चरण को स्थानांतरित करके सतह से जुड़े सूक्ष्मनलिका के सूक्ष्मनलिका अक्ष के साथ रोडामाइन माइक्रोट्यूबुल्स को सावधानीपूर्वक पुन: संरेखित करें और सूक्ष्मनलिका बंडल के स्वचालित खींचने के लिए पैरामीटर सेट करें। सूक्ष्मनलिकाएं के समानांतर अक्ष के साथ दिशा निर्धारित करें, वांछित खींचने की गति सेट करें (25-200 एनएम / एस गति की एक उपयोगी सीमा है), और ओवरलैप लंबाई के आधार पर वांछित खींचने का समय (लगभग 30 सेकंड से 2 मिनट) सेट करें।
    6. 1-2 फ्रेम प्रति सेकंड की दर से तीन (488 एनएम, 561 एनएम, 640 एनएम) चैनलों में फ्लोरेसेंस डेटा रिकॉर्ड करना शुरू करें। ऊपर चरण 5 में अनुकूलित लेजर शक्तियों और एक्सपोज़र समय का उपयोग करें।
    7. स्थिति-संवेदनशील डिटेक्टर, चरण और टीआईआरएफ कैमरा स्थिति से स्वचालित चरण गति और रिकॉर्ड ट्रैपिंग डेटा शुरू करें। किसी भी कारक के लिए निगरानी करें जो डेटा संग्रह में हस्तक्षेप कर सकते हैं, जिसमें शामिल हैं लेकिन (1) जाल में प्रवेश करने वाले एक और मोती तक सीमित नहीं हैं, (2) माइक्रोट्यूबुल्स क्रॉसलिंकिंग का समय से पहले नुकसान, या (3) रोडामाइन माइक्रोट्यूबुल्स से मोती अलगाव।
    8. मोती को छोड़ने के लिए जाल को निष्क्रिय करें और वांछित रूप से प्रयोग दोहराएं। बंडलों के क्षरण और प्रोटीन गतिविधि के नुकसान से पहले एक विशिष्ट नमूना कक्ष का उपयोग लगभग 30 मिनट के लिए किया जा सकता है।
      नोट: क्षरण प्रभाव उपयोग किए गए क्रॉसलिंकर द्वारा भिन्न होंगे, लेकिन सूक्ष्मनलिकाएं या सतह पर स्थिर पंक्टा के गठन के रूप में प्रकट हो सकते हैं, गैर-विशिष्ट बंधन का संकेत देने वाले सूक्ष्मनलिका उतार-चढ़ाव का नुकसान, या सूक्ष्मनलिकाएं के लिए मोतियों को स्थिर रूप से संलग्न करने में असमर्थता।

7. ऑप्टिकल ट्रैप रिकॉर्ड के साथ प्रतिदीप्ति छवियों के डेटा और सहसंबंध का विश्लेषण

नोट: डेटा संग्रह को अनुकूलित करने के लिए, दो अलग-अलग कंप्यूटर नियंत्रण प्रणालियों को नियोजित करना फायदेमंद है: एक ऑप्टिकल ट्रैपिंग सॉफ्टवेयर के लिए और दूसरा प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए। यह सेटअप प्रयोगात्मक तौर-तरीकों दोनों में उच्च गति डेटा अधिग्रहण की अनुमति देता है और डेटा में पेश किए जा रहे ऑपरेशन निष्पादन में नैनो- और माइक्रोसेकंड देरी को समाप्त करता है, जो एकल सीपीयू का उपयोग करते समय उत्पन्न हो सकता है।

  1. नियोजित मोटर या गैर-मोटर क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन और स्टेपिंग की उनकी अपेक्षित दरों (जैसे, आमतौर पर 1-10 kHz के बीच) के लिए अनुकूलित दर पर ऑप्टिकल ट्रैपिंग डेटा को डिजिटाइज़ करें।
  2. स्थिति-संवेदनशील फोटोडिटेक्टर से रिकॉर्ड एक्स, वाई और एसयूएम वोल्टेज सिग्नल, साथ ही ऑप्टिकल ट्रैप को नियंत्रित करने और इन घटकों से डिजिटल वोल्टेज संकेतों का नमूना लेने के लिए समर्पित सॉफ्टवेयर का उपयोग करके नैनो-पोजिशनिंग चरण के एक्स, वाई और जेड पोजिशनल डेटा।
  3. ऑप्टिकल ट्रैपिंग डेटा अधिग्रहण बोर्ड पर एक अतिरिक्त वोल्टेज इनपुट चैनल के साथ कैमरे से शटर-ओपन स्टेट डिजिटल सिग्नल रिकॉर्ड करें। यह ऑप्टिकल ट्रैपिंग टाइम ट्रेस के साथ फ्लोरेसेंस इमेजिंग डेटा के सहसंबंध की अनुमति देता है। इमेजिंग की शुरुआत से पहले ऑप्टिकल ट्रैप के साथ डेटा संग्रह शुरू करें ताकि पहले फ्रेम से कैमरा सिग्नल ठीक से रिकॉर्ड किया जा सके।
  4. आवश्यकताओं के आधार पर एक उपयुक्त फ़िल्टरिंग विधि, जैसे स्लाइडिंग विंडो, माध्य फ़िल्टर या गॉसियन फ़िल्टर का उपयोग करके उच्च नमूना दरों पर प्राप्त कच्चे समय श्रृंखला डेटा का औसत निकालें।
  5. लाइनस्कैन विश्लेषण जैसे तरीकों का उपयोग करके प्रतिदीप्ति छवि समय श्रृंखला डेटा की मात्रा निर्धारित करें, जिसमें सूक्ष्मनलिका क्षेत्र की लंबाई के साथ पिक्सेल तीव्रता मूल्य की गणना की जाती है। इन लाइनों से, सूक्ष्मनलिका किनारों की पहचान करें, और इसलिए, ओवरलैप क्षेत्र। इसके अलावा, प्रोटीन स्थानीयकरण, एकाग्रता और घनत्व की गणना करने के लिए क्रॉसलिंकर प्रोटीन चैनल से प्रतिदीप्ति तीव्रता का उपयोग करें।
  6. बल और छवि डेटा का सहसंबंध इस प्रयोगात्मक प्रणाली का एक आवश्यक आउटपुट है। उदाहरण के लिए, किसी दिए गए कैमरा एक्सपोज़र क्षेत्र (कैमरा चैनल में संबंधित डिजिटल सिग्नल स्पाइक द्वारा इंगित) के भीतर सभी बल डेटा बिंदुओं का चयन और औसत करें ताकि सीधे संबंधित प्रतिदीप्ति छवि फ्रेम के साथ तुलना की जा सके। इसके बाद, बल परिमाण और क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन की संख्या, ओवरलैप लंबाई, या क्रॉसलिंकर वितरण के बीच संबंधों को निकालें।

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Representative Results

बायोफिज़िकल विश्लेषण के लिए उपयुक्त सूक्ष्मनलिका बंडलों की तैयारी को सफल माना जाता है यदि कई प्रमुख मानदंड ों को पूरा किया जाता है। सबसे पहले, तीन रंगों में इमेजिंग को क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन की एकाग्रता के साथ दो संरेखित सूक्ष्मनलिकाएं प्रकट करनी चाहिए जो ओवरलैप क्षेत्र (चित्रा 5 बी, सी और चित्रा 6 बी) को अधिमानतः सजाती हैं। आदर्श रूप से, ट्रैपिंग बीम और फ्लोरेसेंस-लेबल प्रोटीन के बीच पर्याप्त भौतिक स्थान प्रदान करने के लिए रोडामाइन माइक्रोट्यूबुल्स के ओवरलैप किनारे और मुक्त छोर के बीच की दूरी कम से कम 5 μm होनी चाहिए। दूसरा, उन क्षेत्रों में न्यूनतम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति संकेत होना चाहिए जिनमें बायोटिनिलेटेड दूर-लाल सूक्ष्मनलिकाएं की कमी होती है, खासकर उसी चैनल से जिसके साथ क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन लेबल किया जाता है। उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति खराब कवरस्लिप निष्क्रियऔर ग्लास-बाध्य प्रोटीन की उच्च सांद्रता का संकेत है, जो संभवतः सूक्ष्मनलिकाएं या ट्रैपिंग बीड के साथ गैर-विशेष रूप से बातचीत करेगा। इसके अतिरिक्त, सूक्ष्मनलिका इमेजिंग चैनलों में से किसी एक में देखे गए छोटे गोल पंक्टा या छोटे टुकड़ों की उपस्थिति से पता चलता है कि सूक्ष्मनलिकाएं पोलीमराइजेशन और स्पष्टीकरण असफल थे या सूक्ष्मनलिकाएं वृद्ध या क्षतिग्रस्त थीं।

तीसरा, ट्रैपिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले मोती एकल मोतियों के रूप में दिखाई देने चाहिए, न कि कई मोतियों वाले झुरमुट के भीतर। यह संभावना है कि मोतियों का एक छोटा सा अंश अपरिवर्तनीय रूप से सतह का पालन करेगा, लेकिन नमूना कक्ष में फैले व्यक्तिगत कणों के रूप में एक महत्वपूर्ण अंश देखा जाना चाहिए। कक्ष में बहने से पहले कम से कम 10 मिनट के लिए मोतियों को चिकना करके अत्यधिक झुरमुट को अक्सर कम किया जा सकता है। चौथा, एक मोती को सूक्ष्मनलिका से जोड़ने से अच्छा लगाव होना चाहिए, जब ट्रैपिंग लेजर प्रकाश बंद हो जाता है तो मोती बंधा रहता है। सतह के संपर्क में लाए जाने पर मोतियों को गैर-विशेष रूप से चिपकना नहीं चाहिए, और, एक बार जब एक मोती सूक्ष्मनलिका से जुड़ जाता है, तो माप से पहले फिलामेंट में हल्के से हेरफेर करना (जैसे, मोड़ना या फ्लेक्स करना) संभव होना चाहिए। अंत में, बल लागू होने पर ओवरलैप लंबाई में परिवर्तन का निरीक्षण करना संभव होना चाहिए, या मोटर गतिविधि को आगे बढ़ने की अनुमति दी जाती है। उदाहरण के लिए, यदि मोटर प्रोटीन-संचालित स्लाइडिंग का अवलोकन किया जाता है, तो ओवरलैप लंबाई मोटर प्रोटीन स्टेपिंग की दर के अनुरूप दर से कम होनी चाहिए। यदि निष्क्रिय क्रॉसलिंकर की जांच की जाती है, तो बल के आवेदन के परिणामस्वरूप ओवरलैप लंबाई में बदलाव होना चाहिए। इन आउटपुट से संकेत मिलता है कि रोडामाइन माइक्रोट्यूबुल्स केवल क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन के माध्यम से सतह-बाध्य सूक्ष्मनलिका से जुड़ा होता है, बजाय गैर-विशेष रूप से कवरस्लिप सतह से चिपकने के।

जब ये सभी मानदंड पूरे हो जाते हैं, तो आवश्यक बायोफिज़िकल मापदंडों को निकालने के लिए प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला करना संभव है जो पहनावा यांत्रिकी को परिभाषित करते हैं। पिछले अध्ययनों में माइटोटिक क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन की जांच करने के लिए इस परख या इसी तरह के परख का बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। उदाहरण के लिए, हमने दिखाया है कि आवश्यक माइटोटिक मोटर प्रोटीन काइन्सिन -5 के पहनावा धक्का और ब्रेकिंग बल दोनों उत्पन्न करके सूक्ष्मनलिका स्लाइडिंग को नियंत्रित कर सकते हैं जो ओवरलैप लंबाई64 (चित्रा 5) के साथ रैखिक रूप से स्केल करते हैं। या तो एक एंटीपैरेलल या समानांतर ज्यामिति में सूक्ष्मनलिकाएं काइन्सिन -5 अणुओं के एक छोटे समूह द्वारा क्रॉसलिंक की गई थीं। जैसे ही ये मोटर प्रोटीन सूक्ष्मनलिका प्लस-सिरों की ओर बढ़े, फिलामेंट्स या तो अलग (एंटीपैरेलल) खिसक गए या तेजी से आगे-पीछे (समानांतर) उतार-चढ़ाव हुआ। इस मिनी-स्पिंडल ज्यामिति के भीतर यांत्रिकी की निगरानी करके, हमने फिलामेंट ओवरलैप की लंबाई के साथ-साथ क्रॉसलिंकिंग मोटर प्रोटीन की संख्या दोनों के साथ बल के परिमाण को मापा। जब सूक्ष्मनलिकाएं काइन्सिन -5 की अनलोडेड स्टेपिंग दर की तुलना में तेजी से वेग से स्थानांतरित की गईं, तो मोटर प्रोटीन ने एक प्रतिरोधक ब्रेकिंग बल प्रदान किया। यह भी पाया गया कि कुशल क्रॉसलिंकिंग और फोर्स जनरेशन61 (चित्रा 5 बी, सी) के लिए सी-टर्मिनल टेल डोमेन की आवश्यकता होती है। पूर्ण लंबाई वाला प्रोटीन निरंतर बल उत्पन्न करने में सक्षम है जो पठार पर पहुंचता है जब सभी मोटर प्रोटीन अपने व्यक्तिगत स्टाल बल (चित्रा 5 डी) तक पहुंचते हैं। हालांकि, सी-टर्मिनल टेल की कमी वाले काइन्सिन -5 मोटर अधिकतम बल उत्पन्न करते हैं जो परिमाण में लगभग पांच गुना छोटे होते हैं (चित्रा 5 ई, एफ)। साथ में, इन परिणामों से पता चलता है कि कैसे काइन्सिन -5 प्रोटीन स्पिंडल असेंबली के दौरान सूक्ष्मनलिकाएं ध्रुव की ओर धकेलने और अणु के भीतर आवश्यक नियामक प्रोटीन डोमेन के बायोफिज़िकल फ़ंक्शन को स्पष्ट करने के लिए पहनावा में काम करते हैं।

हमने यह भी प्रदर्शित किया है कि गैर-मोटर माइटोटिक प्रोटीन पीआरसी 1 के पहनावा एनाफ़ेज़ स्पिंडल मिडज़ोन54 (चित्रा 6 ए-सी) में सूक्ष्मनलिका स्लाइडिंग का विरोध करने के लिए एक यांत्रिक डैशपॉट के रूप में काम करते हैं। पीआरसी 1 घर्षण प्रतिरोध उत्पन्न करता है जो खींचने की गति के साथ रैखिक रूप से तराजू करता है, जैसे एक यांत्रिक डैशपॉट वेग-निर्भर प्रतिरोधक बलों का उत्पादन करता है। ये प्रतिरोधक बल सूक्ष्मनलिका जोड़े या स्थानीय क्रॉसलिंकर घनत्व के बीच ओवरलैप क्षेत्रों की लंबाई पर निर्भर नहीं करते हैं, लेकिन वे व्यस्त पीआरसी 1 अणुओं की कुल एकाग्रता पर दृढ़ता से निर्भर करते हैं (चित्रा 6 डी, ई)। इन परिणामों से, यह प्रस्तावित किया गया है कि पीआरसी 1 एन्सेम्बल एक लीक पिस्टन के रूप में कार्य करते हैं, जिसमें क्रॉसलिंकर का संपीड़न वेग-निर्भर प्रतिरोध पैदा करता है, लेकिन सूक्ष्मनलिका प्लस-एंड्स पर क्रॉसलिंकर का नुकसान बड़े संपीड़ित बलों को कम करता है।

इसी तरह के परख ज्यामिति का उपयोग माइटोटिक काइन्सिन -12 प्रोटीन Kif1562 की जांच करने के लिए भी किया गया था। सूक्ष्मनलिकाएं अलग धकेले जाने के कारण उत्पन्न बल को मापकर, रेनीमैन एट अल.62 ने पाया कि किफ 15 एनसेंबल फिलामेंट्स को एक महत्वपूर्ण पठार बल तक धकेल सकते हैं और सूक्ष्मनलिकाएं को कुशलतापूर्वक पार करने और निरंतर भार बनाने के लिए प्रोटीन के सी-टर्मिनल टेल टेथर क्षेत्र की आवश्यकता होती है। रीनेमैन एट अल ने यह भी सुरुचिपूर्ण ढंग से प्रदर्शित किया कि काइन्सिन -14 एचएसईटी, एक माइनस-एंड निर्देशित किन्सिन, इसी तरह एंटीपैरेलल माइक्रोट्यूबुल्स63 को अलग कर सकता है। जब प्लस-एंड निर्देशित काइन्सिन -5 ईजी 5 प्रोटीन की समान मात्रा के साथ मिलाया जाता है, तो एचएसईटी ईजी 5 स्लाइडिंग गतिविधि को रोकने का कार्य करता है, जो ओवरलैप क्षेत्र के भीतर सूक्ष्मनलिका स्लाइडिंग गति के लिए एक रस्साकशी में संलग्न होता है। साथ में, ये परिणाम सभी सक्रिय सूक्ष्मनलिका बंडलों में प्रत्यक्ष बल माप की शक्ति का प्रदर्शन करते हैं और जैविक रूप से उपयुक्त नेटवर्क ज्यामिति में प्रोटीन फ़ंक्शन को चिह्नित करने की आवश्यकता को स्पष्ट करते हैं।

Figure 1
चित्र 1: ग्लास कवरलिप्स का निष्क्रियीकरण। (ए) एमिनो-सिलेन संयुग्मन के लिए नंबर 1.5 ग्लास कवरलिप्स के अनुक्रमिक वॉश स्टेप्स, सुखाने और संयुग्मन को दर्शाने वाला योजनाबद्ध। (बी) पीईजी और बायोटिन-पीईजी समूहों को ग्लास कवरस्लिप, धोने और सुखाने से सहसंयोजक रूप से जोड़ने के लिए प्रोटोकॉल को चित्रित करना, और अल्पकालिक भंडारण के लिए वैक्यूम के तहत कवरलिप्स को सील करना। योजनाबद्ध के कुछ भाग 65 से संशोधित छवियां हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: एक नमूना कक्ष की असेंबली। (ए) माइक्रोस्कोप स्लाइड में पासिवेटेड कवरलिप्स और एक मानक 3 का उपयोग करके नमूना प्रवाह कक्ष की असेंबली को दर्शाने वाला योजनाबद्ध। (बी) एकल और दोहरे चैनल प्रवाह कक्षों की असेंबली और विशिष्ट आयाम जो ऑप्टिकल ट्रैपिंग और सूक्ष्मनलिका बंडलों के प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए अनुकूलित हैं। योजनाबद्ध के कुछ भाग 65 से संशोधित छवियां हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: ऑप्टिकल ट्रैपिंग और टीआईआरएफ-आधारित इमेजिंग के लिए सतह-स्थिर सूक्ष्मनलिका बंडलों की पीढ़ी। ऑप्टिकल रूप से ट्रैपेबल माइक्रोट्यूबुल्स बंडलों की चरणबद्ध असेंबली को दर्शाने वाले योजनाबद्ध। (ए) अभिकर्मकों को कक्ष के प्रवेश बंदरगाह से प्रवाहित किया जाता है और निकास चैनल से तरल पदार्थ बाहर निकलता है। (बी) स्ट्रेप्टाविडिन (नीला) पहले कवरस्लिप पर बायोटिन-पीईजी साइटों को बांधता है, और (सी) कैसिइन (लाल) को एक अतिरिक्त ब्लॉकिंग एजेंट के रूप में पेश किया जाता है। (डी) बायोटिनिलेटेड सुदूर लाल लेबल वाले सूक्ष्मनलिकाएं (मैजेंटा) को पेश किया जाता है और ~ 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दी जाती है, इसके बाद (ई) क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन (हरा), (एफ) गैर-बायोटिनिलेटेड रोडामाइन-लेबल माइक्रोट्यूबुल्स (लाल), और अंत में, (जी) कठोरता किन्सिन-लेपित माइक्रोसेफर्स को बंडल से लगाव और ऑप्टिकल ट्रैप-आधारित हेरफेर के लिए उपयुक्त प्रतिक्रिया बफर में निलंबित कर दिया जाता है। (एच) प्रयोगों के दौरान नमूना बफर के वाष्पीकरण को रोकने के लिए कक्ष को स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ सील किया जाता है। योजनाबद्ध के कुछ भाग 65 से संशोधित छवियां हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: ऑप्टिकल ट्वीज़र्स / टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप सिस्टम का योजनाबद्ध। एक एकल-बीम ऑप्टिकल ट्रैप को एक उल्टे माइक्रोस्कोप के भीतर एक उद्देश्य-आधारित टीआईआरएफ इमेजिंग सिस्टम के ऑप्टिकल पथ में पेश किया जाता है। उद्देश्य के ठीक नीचे डाला गया एक छोटा पास फ़िल्टर ट्रैप बीम को उद्देश्य के पीछे के एपर्चर में निर्देशित करने की अनुमति देता है, जहां इसे नमूना कवरस्लिप की सतह के ठीक ऊपर केंद्रित किया जाएगा, जिससे एक ऑप्टिकल ट्रैप बनेगा। एक स्थिति-संवेदनशील फोटोडिटेक्टर संचारित प्रकाश को इकट्ठा करेगा, जिससे मोती की स्थिति और बल का पता लगाने की अनुमति मिलेगी। फ्लोरेसेंस डेटा के कई चैनलों को टीआईआरएफ इमेजिंग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है और उच्च संवेदनशीलता ईएमसीसीडी या एससीएमओएस कैमरे पर रिकॉर्ड किया जा सकता है। प्रयोगों के सेटअप के दौरान मोतियों को इमेज ट्रैप करने के लिए एक व्यापक स्पेक्ट्रम प्रकाश स्रोत का उपयोग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: काइन्सिन -5 द्वारा बल उत्पादन को मापने का प्रतिनिधि उदाहरण। (ए) प्रयोगात्मक ज्यामिति को दर्शाने वाला योजनाबद्ध, काइन्सिन -5 मोटर प्रोटीन द्वारा क्रॉसलिंक किए गए सूक्ष्मनलिकाएं दिखाते हैं जो फिलामेंट्स को अलग करते समय बल उत्पन्न करते हैं, जिसे ऑप्टिकल ट्रैप के साथ मापा जाता है। सतह-स्थिर सूक्ष्मनलिकाएं, जीएफपी-काइन्सिन -5, और रोडामाइन-लेबल परिवहन सूक्ष्मनलिकाएं से बने बंडलों की प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवियां। (बी) पूर्ण लंबाई और (सी) सी-टर्मिनल टेल कटे हुए किनेसिन -5 संरचनाओं को नियोजित किया गया था। स्केल सलाखों = 5 μm. (डी) पूर्ण लंबाई और (ई) टेललेस के लिए बल उत्पादन के नमूना रिकॉर्ड दिखाए गए हैं, जिसमें औसत बल को समय के कार्य के रूप में प्लॉट किया गया है। (च) दोनों संरचनाओं के लिए अधिकतम पठार बल और संगत ओवरलैप लंबाई के भूखंड दिखाए गए हैं, जिससे पता चलता है कि पूर्ण लंबाई वाले काइन्सिन निर्माण ओवरलैप-लंबाई निर्भर बल उत्पन्न करता है जो पूंछ रहित काइन्सिन निर्माण की तुलना में परिमाण में काफी बड़ा होता है। इस आंकड़े को61 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: पीआरसी 1 द्वारा घर्षण बलों को मापने का प्रतिनिधि उदाहरण। (ए) प्रयोगात्मक ज्यामिति को दर्शाने वाला योजनाबद्ध, जीएफपी-पीआरसी 1 (साइटोकिनेसिस के प्रोटीन नियामक) क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन द्वारा क्रॉसलिंक किए गए सूक्ष्मनलिकाएं दिखाते हैं जो प्रतिरोध उत्पन्न करते हैं क्योंकि फिलामेंट्स निरंतर वेग पर कवरस्लिप को स्थानांतरित करके अलग हो जाते हैं। (बी) प्रतिनिधि समय श्रृंखला प्रतिदीप्ति छवियां चलती सतह-स्थिर दूर-लाल सूक्ष्मनलिकाएं, जीएफपी-पीआरसी 1 अणु सिकुड़ते ओवरलैप के भीतर संघनित होती हैं, और मोती के साथ आयोजित मुक्त रोडामाइन सूक्ष्मनलिकाएं दिखाती हैं। फ्रेम के बीच समय अंतराल = 6 एस; स्केल बार = 5 μm. (C) उदाहरण बल ट्रेस स्लाइडिंग घटना के दौरान घर्षण बल को दर्शाता है, विघटन की घटना और बल शून्य (~ 55 सेकंड) तक गिर जाता है जब ओवरलैप 0 μm तक पहुंच जाता है। (D) चार अलग-अलग स्लाइडिंग वेगों पर ओवरलैप के भीतर माध्य बल और एकीकृत GFP तीव्रता का सहसंबंध। (ई) माध्य ढलान और (डी) में निशान की गणना की गई फिट त्रुटियों से पता चलता है कि प्रति पीआरसी 1 अणु बल स्लाइडिंग वेग के कार्य के रूप में रैखिक रूप से बढ़ता है। इस आंकड़े को66 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

माइक्रोट्यूबुल्स नेटवर्क को असंख्य सेल प्रकारों द्वारा कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला को पूरा करने के लिए नियोजित किया जाता है जो प्रकृति में मौलिक रूप से यांत्रिक हैं। यह वर्णन करने के लिए कि स्वस्थ और रोग दोनों अवस्थाओं में कोशिकाएं कैसे कार्य करती हैं, यह समझना महत्वपूर्ण है कि इन माइक्रोन-स्केल नेटवर्क को नैनोमीटर के आकार के प्रोटीन द्वारा कैसे व्यवस्थित और विनियमित किया जाता है जो सामूहिक रूप से उनका निर्माण करते हैं। ऑप्टिकल ट्वीज़र्स जैसे बायोफिज़िकल उपकरण इस पैमाने पर प्रमुख प्रोटीन के मेकेनोकेमिस्ट्री की जांच करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं। सूक्ष्मनलिका नेटवर्क फ़ंक्शन की विविधता को दर्शाते हुए, ऑप्टिकल ट्वीज़र्स को नियोजित करने वाले जटिल प्रयोगात्मक ज्यामिति का पता लगाया गया है, जिसमें सूक्ष्मनलिका टिप गतिशीलता67,68 के बल-निर्भर विश्लेषण, किनेटोकोर घटकों द्वारा बलों की पीढ़ी 69,70,71, और सूक्ष्मनलिका फिलामेंट यांत्रिकी की जांच के लिए दो-बीम डंबल ट्रैप ज्यामिति72,73 शामिल हैं . इस प्रोटोकॉल में, हमने बंडलों जैसे मौलिक सूक्ष्मनलिका नेटवर्क रूपांकनों के पुनर्गठन और सेलुलर फ़ंक्शन के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी का आकलन करने के लिए एकल-अणु फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी और ऑप्टिकल ट्रैपिंग के बायोफिज़िकल टूल को लागू करने के लिए नए तरीकों का वर्णन किया है।

जबकि इस प्रोटोकॉल में अधिकांश व्यक्तिगत कदम तकनीकी रूप से सरल हैं, एक साथ विफलता के कई संभावित बिंदु हैं जो उत्पन्न हो सकते हैं, और सफल माप सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक बिंदु पर पर्याप्त देखभाल की जानी चाहिए। सबसे पहले, कई माइक्रोस्कोप-आधारित एकल-अणु प्रयोगात्मक परखों के साथ, उचित सतह निष्क्रिय होना महत्वपूर्ण है, क्योंकि कवरस्लिप सतह पर प्रोटीन या मोतियों का गैर-विशिष्ट बंधन लगभग हमेशा इन प्रयोगों के सफल समापन को रोकता है। दूसरा, उच्च गुणवत्ता वाले एकल-प्रजाति उत्पादों को सुनिश्चित करने के लिए रुचि के क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन (ओं) की अभिव्यक्ति और शुद्धि को अनुकूलित किया जाना चाहिए, क्योंकि संदूषक कई तरीकों से परख में हस्तक्षेप कर सकते हैं, जैसे कि फिलामेंट्स के अतिरिक्त बंडलिंग को प्रेरित करना या मोती और सूक्ष्मनलिका लगाव में हस्तक्षेप करना, बल डेटा की व्याख्या में जटिलताओं को पेश करने का उल्लेख नहीं करना। तीसरा, मजबूत मोती-सूक्ष्मनलिका लगाव को बनाए रखने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले कठोरता किनेसिन मोटर्स की आवश्यकता होती है जो ट्रैपिंग बीड से उच्च घनत्व पर बंधे होते हैं, जैसे कि कई किन्सिन-फिलामेंट अटैचमेंट पॉइंट बनाए जा सकते हैं। ये बांड कई मिनटों के लिए बल के 10 एस का सामना कर सकते हैं, जो इस तकनीक को नियोजित करने वाले अध्ययन की संभावित प्रणालियों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त है।

हम यह भी ध्यान देते हैं कि ऐसे कई तरीके हैं जिनमें इस प्रोटोकॉल को अंतिम उपयोगकर्ता के इंस्ट्रूमेंटेशन या जैविक प्रणाली की जरूरतों के अनुरूप संशोधित किया जा सकता है। जबकि हमने उन प्रयोगों का वर्णन किया है जो जीएफपी-लेबल क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन और लाल / दूर लाल लेबल वाले सूक्ष्मनलिकाएं को नियोजित करते हैं, आवश्यकतानुसार फ्लोरोसेंट लेबलिंग को स्वैप करना भी संभव है। उदाहरण के लिए, यदि उपयोगकर्ता के पास तीन-रंग टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी करने के लिए पर्याप्त लेजर लाइनें नहीं हैं, तो सूक्ष्मनलिकाएं की प्रत्येक प्रजाति के लिए अलग-अलग सांद्रता (जैसे, मंद बनाम उज्ज्वल) का उपयोग करके सूक्ष्मनलिकाएं अलग-अलग लेबल करके उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करना संभव है। इसी तरह, क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन में फ्लोरोसेंट लेबल जोड़ना हमेशा संभव या फायदेमंद नहीं हो सकता है। इस स्थिति में, क्रॉसलिंकर एकाग्रता या स्थानीयकरण जैसी कुछ प्रयोगात्मक जानकारी सुलभ नहीं होगी, लेकिन सूक्ष्मनलिका ओवरलैप लंबाई जैसे मापदंडों का निर्धारण अभी भी किया जा सकता है। हम अनुमान लगाते हैं कि यह प्रोटोकॉल कई अलग-अलग प्रकारों और सूक्ष्मनलिका क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन के संयोजन के लिए अत्यधिक अनुकूलनीय है। कई क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन की शुरूआत से या तो प्रोटीन में से एक से फ्लोरेसेंस टैग को हटाने या उचित बैंडविड्थ में इमेजिंग क्षमताओं को मुक्त करने के लिए दो सूक्ष्मनलिका प्रकारों में से एक से फ्लोरोसेंट लेबल के बहिष्करण की आवश्यकता होगी (उदाहरण के लिए, क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन के लिए लाल या दूर-लाल प्रोटीन-एन्कोडेड लेबल का उपयोग करना)। यह संभावना नहीं है कि इस टीआईआरएफ-आधारित परख के साथ तीन से अधिक फ्लोरोसेंट चैनलों को नियोजित किया जा सकता है, हालांकि निश्चित रूप से लचीलापन है कि वे कैसे वितरित किए जाते हैं, जिसे प्रयोग की योजना बनाते समय सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए। अंत में, यह संभावना है कि इस परख को विभिन्न नेटवर्क ज्यामिति और साइटोस्केलेटल फिलामेंट के प्रकारों का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। ऑगमिन और गामा-ट्यूबुलिन रिंग कॉम्प्लेक्स द्वारा मध्यस्थता में सूक्ष्मनलिका शाखाओं के यांत्रिकी का विश्लेषण आसानी से जांच और छवि बनाई जा सकती है। इसके अलावा, अन्य क्रॉसलिंक्ड साइटोस्केलेटल नेटवर्क, जैसे कि एक्टिन, सेप्टिन, या मध्यवर्ती फिलामेंट्स शामिल हैं, इन उपकरणों के साथ अध्ययन करने के लिए काफी उत्तरदायी होंगे, यह मानते हुए कि कवरस्लिप और ट्रैपिंग बीड के लिए उचित संशोधन और ऑर्थोगोनल अटैचमेंट रणनीतियां बनाई गई हैं।

अंत में, हमने सक्रिय बल-उत्पन्न माइक्रोट्यूबुल्स नेटवर्क के पुनर्गठन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है, जिसे एकल-अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी उपकरणों का उपयोग करके चित्रित किया जा सकता है और एकल-बीम ऑप्टिकल ट्रैप के माध्यम से हेरफेर किया जा सकता है। हमने डेटासेट के साथ इस विधि की उपयोगिता का प्रदर्शन किया है जो माइटोटिक मोटर और गैर-मोटर प्रोटीन दोनों के पहनावा यांत्रिकी को प्रकट करता है। हम अनुमान लगाते हैं कि कई प्रकार के अत्यधिक संगठित सूक्ष्मनलिका नेटवर्क, जैसे कि न्यूरॉन्स, उपकला ऊतक, या कार्डियोमायोसाइट्स में पाए जाते हैं, का विश्लेषण इन उपकरणों के साथ किया जा सकता है, जो गतिशील साइटोस्केलेटन के लिए बायोफिज़िकल फ़ंक्शन के नए सिद्धांतों का खुलासा करते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक आर 21 एजी 067436 (जेपी और एसएफ के लिए), टी 32 एजी 057464 (ईटी के लिए), और रेनसेलर पॉलिटेक्निक इंस्टीट्यूट स्कूल ऑफ साइंस स्टार्टअप फंड्स (एसएफ के लिए) से समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nm IPG Photonics YLR-10-1064-LP
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applications Chroma TRF89901v2
6x His Tag Antibody, Biotin Conjugate Invitrogen #MA1-21315-BTIN
Acetone, HPLC grade Fisher Scientific 18-608-395
Alpha casein from bovine milk Sigma 1002484390
ATP Fisher Scientific BP413-25
Benzonase Novagen 70746-3
Biotin-PEG-SVA-5000 Laysan Bio, Inc. NC0479433
BL21 (DE3) Rosetta Cells Millipore Sigma 71-400-3
Catalase MP Biomedicals LLC 190311
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objective Nikon N/A
Chloramphenicol ACROS Organics 227920250
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips Fisher Scientific C14784
Delicate Task Wipers Kimberly-Clark 34120
Dextrose Anhydrous Fisher Scientific BP3501
D-Sucrose Fisher Scientific BP220-1
DTT Fisher Scientific BP172-25
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 Bath LAUDA-Brinkmann 27709
EDTA Fisher Scientific BP118-500
EGTA Millipore Corporation 32462-25GM
FIJI / Image J https://fiji.sc/ N/A
Frosted Microscope Slides Corning 12-553-10 75mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm
Glucose Oxidase MP Biomedicals LLC 195196 Type VII, without added oxygen
GMPCPP Jena Biosciences JBS-NU-405S Can be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C
Gold Seal-Cover Glass Thermo Scientific 3405
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Imidazole Fisher Scientific 03196-500
IPTG Fisher Scientific BP1755-10
Laboratory dessicator Bel-Art 999320237 190mm plate size
Kanamycin Sulfate Fischer Scientific BP906-5
KIF5A K439 (aa:1-439)-6His Gilbert Lab, RPI N/A doi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
Kimwipe Kimberley Clark Z188956 lint-free tissue
Immersion Oil, Type B Cargille 16484
Lens Tissue ThorLabs MC-5
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm) Nikon N/A
Lysozyme MP Biomedicals LLC 100834
Magnesium Acetate Tetrahydrate Fisher Scientific BP215-500
Microfuge 18 Beckman Coulter 367160
MPEG-SVA MW-5000 Laysan Bio, Inc. NC0107576
Neutravadin Invitrogen PI31000
Nikon Ti-E inverted microscope Nikon N/A Nikon LuN4 Laser
Ni-NTA Resin Thermo Scientific 88221
Oligonucleotide - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA
GAACTTTCAAAGGC		 IDT N/A
Oligonucleotide - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA
ACTCAGAATAGGTG		 IDT N/A
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mm Beckman Coulter 343755
Optima-TLX Ultracentrifuge Beckman Coulter 361544
Paclitaxel (Taxol equivalent) Thermo Fisher Scientific P3456
PIPES ACROS Organics 172615000
PMSF Millipore 7110-5GM
Porcine Tubulin, biotin label Cytoskeleton, Inc. T333P
Porcine Tubulin, HiLyte 647 Fluor Cytoskeleton, Inc. TL670M far red labelled
Porcine Tubulin, Rhodamine Cytoskeleton, Inc. TL590M
Porcine Tubulin, Tubulin Protein Cytoskeleton, Inc. T240
Potassium Acetate Fisher Scientific BP364-500
Prime 95B sCMOS camera Photometric N/A
Quadrant Detector Sensor Head ThorLabs PDQ80A
Quikchange Lightning Kit Agilent Technologies 210518
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Square Cover Glasses Corning 12-553-450 18 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm
Streptavidin Microspheres Polysciences Inc. 24162-1
Superose-6 Column GE Healthcare 29-0915--96
TCEP Thermo Scientific 77720
TLA-100 Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter 343840
Ultrasonic Cleaner (Sonicator) Vevor JPS-08A(DD) 304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power
Vectabond APTES solution Vector Laboratories SP-1800-7
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-D S.C. Johnson SJN695237

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References

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पुनर्गठित सक्रिय सूक्ष्मनलिका बंडलों के भीतर सीधे बलों को मापना
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Palumbo, J., Tai, E., Forth, S. Directly Measuring Forces Within Reconstituted Active Microtubule Bundles. J. Vis. Exp. (183), e63819, doi:10.3791/63819 (2022).

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