Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Непосредственное измерение сил в восстановленных активных пучках микротрубочек

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63819
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biological Sciences and Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies, Rensselaer Polytechnic Institute
* These authors contributed equally

Summary

Здесь мы представляем протокол восстановления пучков микротрубочек in vitro и непосредственной количественной оценки сил, оказываемых внутри них, с помощью одновременного оптического улавливания и флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения. Этот анализ позволяет измерять на наноуровневом уровне силы и смещения, генерируемые белковыми ансамблями в активных сетях микротрубочек.

Abstract

Сети микротрубочек используются в клетках для выполнения широкого круга задач, начиная от действия в качестве треков для переноса пузырьков до работы в качестве специализированных массивов во время митоза для регулирования сегрегации хромосом. Белки, которые взаимодействуют с микротрубочками, включают такие двигатели, как кинезины и динеин, которые могут генерировать активные силы и направленное движение, а также немоторные белки, которые сшивают нити в сети более высокого порядка или регулируют динамику нитей. На сегодняшний день биофизические исследования белков, связанных с микротрубочками, в подавляющем большинстве случаев сосредоточены на роли одиночных моторных белков, необходимых для переноса пузырьков, и был достигнут значительный прогресс в выяснении силообразующих свойств и механохимической регуляции кинезинов и динеинов. Однако для процессов, в которых микротрубочки действуют как груз, так и как путь, например, во время скольжения нити внутри митотического веретена, гораздо меньше понимается о биофизической регуляции ансамблей вовлеченных сшивающих белков. Здесь мы подробно описываем нашу методологию непосредственного зондирования генерации силы и реакции в сшитых минимальных сетях микротрубочек, восстановленных из очищенных микротрубочек и митотических белков. Пары микротрубочек сшиваются интересующими белками, одна микротрубочка иммобилизуется в крышку микроскопа, а вторая микротрубочка управляется оптической ловушкой. Одновременная флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения позволяет осуществлять многоканальную визуализацию всех компонентов этой сети микротрубочек, поскольку нити раздвигаются для создания силы. Мы также демонстрируем, как эти методы могут быть использованы для зондирования толкающих сил, оказываемых ансамблями кинезин-5, и как вязкие тормозные силы возникают между скользящими парами микротрубочек, сшитыми митотическим MAP PRC1. Эти анализы дают представление о механизмах сборки и функционирования веретена и могут быть более широко адаптированы для изучения плотной сетевой механики микротрубочек в различных контекстах, таких как аксон и дендриты нейронов и полярных эпителиальных клеток.

Introduction

Клетки используют сети микротрубочек для выполнения широкого спектра механических задач, начиная от переносапузырьков 1,2,3 до сегрегации хромосом во время митоза 4,5,6. Многие из белков, которые взаимодействуют с микротрубочками, такие как молекулярные моторные белки кинезин и динеин, генерируют силы и регулируются механическими нагрузками. Чтобы лучше понять, как функционируют эти критические молекулы, исследователи использовали одномолекулярные биофизические методы, такие как оптическое улавливание и микроскопия TIRF, для непосредственного мониторинга критических параметров, таких как скорость разгруженного шага, качучесть и отношения силы-скорости для отдельных белков. Наиболее часто используемой экспериментальной геометрией было прикрепление моторных белков непосредственно к улавливающим шарикам, сферическая геометрия и размер которых имитируют везикулы, подвергающиеся моторному транспорту. Многочисленные кинезины, в том числе кинезин-1 7,8,9, кинезин-2 10,11,12, кинезин-3 13,14,15,16 кинезин-5 17,18, кинезин-819,20, а также динеиновые и динеиновые комплексы21,22, 23,24,25 были изучены с помощью этих методов.

Однако во многих клеточных процессах моторные и немоторные белки используют микротрубочки как в качестве трека, так и в качестве груза26,27. Более того, в этих сценариях, где нити микротрубочек сшиваются в пучки более высокого порядка, эти белки функционируют как ансамбли, а не отдельные единицы. Например, внутри делящихся соматических клеток плотные нитевидные сети самоорганизуются для построения митотического веретенообразного аппарата 28,29,30. Межполярная сеть микротрубочек шпинделя очень динамична и в значительной степени расположена с минусовыми концами, указывающими на полюса шпинделя, и плюс-концами, перекрывающимися вблизи экватора шпинделя. Нити внутри веретена сшиты моторными белками, такими как кинезин-5 31,32,33, кинезин-12 34,35,36 и кинезин-14 37,38,39, или немоторными белками, такими как PRC1 40,41,42,43 или NuMA 44,45, 46. Они часто перемещаются или испытывают механическое напряжение во время таких процессов, как поток в направлении полюса или при координации центрирования хромосом во время метафазы или сегрегации хромосом во время анафазы 47,48,49,50,51,52. Таким образом, целостность аппарата веретена микронного масштаба посредством митоза зависит от тщательно регулируемого баланса сил толкания и притяжения, создаваемых и поддерживаемых этой сетью взаимодействующих нитей. Тем не менее, инструменты, необходимые для исследования этой механической регуляции и объяснения того, как белковые ансамбли работают согласованно, чтобы координировать движения микротрубочек и производить силы, необходимые для правильной сборки веретена, были разработаны только недавно, и мы только начинаем понимать биофизические правила, которые определяют динамические сети микротрубочек.

Цель этой рукописи состоит в том, чтобы продемонстрировать шаги, необходимые для воссоздания сшитых пар микротрубочек in vitro, иммобилизации этих пучков в камере микроскопии, которая позволяет одновременно флуоресцентную визуализацию как микротрубочек, так и сшивающих белков и наноразмерного измерения силы, и надежно обрабатывать эти данные. Мы подробно описываем шаги, необходимые для стабильной полимеризации флуоресцентных меченых микротрубочек, подготовки крышек микроскопа к прикреплению, подготовки полистирольных шариков для экспериментов по оптическому улавливанию и сборки сшитых нитевидных сетей, которые сохраняют свою функциональность in vivo , позволяя проводить прямые биофизические манипуляции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка микротрубочек

ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании меченых GFP сшивающих белков красный (например, родамин) и дальний красный (например, биотинилированный HiLyte647, называемый биотинилированным дальним красным цветом в остальной части текста) органическая флуорофорная маркировка микротрубочек работает хорошо. Минимальные перекрестные помехи между всеми тремя каналами могут быть достигнуты во время визуализации с помощью высококачественного четырехдиапазонного фильтра полной внутренней флуоресценции внутреннего отражения (TIRF).

  1. Подготовка семян микротрубочек GMPCPP
    1. Суспендировать 1 мг немаркированного лиофилизированного тубулина в 84 мкл ледяного 1x BRB80 (80 мМ PIPES, 1 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA; рН 6,8), с добавлением DTT к конечной концентрации 1 мМ непосредственно перед использованием. Суспендировать 60 мкг меченого флуорофором лиофилизированного тубулина в 6 мкл холодного 1x BRB80 с 1 мМ DTT. Суспендировать 60 мкг меченого биотином лиофилизированного тубулина в 6 мкл холодного 1x BRB80 с 1 мМ DTT.
    2. Для получения небиотинилированного семенного материала тубулина, меченного родамином, с коэффициентом маркировки 1:10, добавляют 84 мкл немаркированного тубулина, 6 мкл флуорофорного меченого тубулина и 10 мкл 10 мМ раствора GMPCPP в пробирку объемом 0,5 мл. Хорошо перемешать, аккуратно пипетировав, и держать на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полимеризация GMPCPP является предпочтительной для этих анализов, поскольку микротрубочки более стабильны и поддаются прямым манипуляциям с оптической ловушкой, чем при полимеризации с ГТФ или если таксол опущен.
    3. Для получения биотинилированного семенного материала тубулина с меткой красного цвета с флуоресцентным коэффициентом маркировки 1:10 добавляют 80 мкл немаркированного тубулина, 6 мкл флуорофорного меченого тубулина, 4 мкл биотин-меченого тубулина и 10 мкл 10 мМ раствора GMPCPP в пробирке объемом 0,5 мл. Хорошо перемешать, аккуратно пипетировав, и держать на льду. Высиживать семенной материал на льду в течение 5 мин.
    4. Перенесите раствор тубулина в поликарбонатную трубку, подходящую для высокоскоростного центрифугирования. Центрифугируйте семенной материал при ~350 000 х г в течение 5 мин при 2 °C, чтобы предотвратить полимеризацию микротрубочек и восстановить супернатант для аликотирования. Конечная расчетная концентрация тубулина на этой стадии составляет ~50 мкМ.
    5. Используя ПЦР-пробирки по 0,2 мл, подготовьте 2 мкл аликвоты семенного материала и заморозьте жидким азотом. Аликвоты могут храниться при -80 °C до 6 месяцев.
  2. Полимеризация микротрубочек
    1. Приготовить 500 мкл 1x BRB80 и выложить на лед. Поместите по одной из биотинилированных далеко красных и небиотинилированных аликвот родаминового семенного материала на лед для оттаивания.
    2. Высиживать семенной материал на льду в течение 5 мин. В конце инкубационного периода немедленно добавляют 26 мкл 1x BRB80 в каждую пробирку. Если желательны более длинные микротрубочки, увеличьте объем BRB80 на 5-10 мкл, тогда как для более коротких микротрубочек уменьшите объем для полимеризации на 5 мкл.
    3. Инкубировать семена микротрубочек в течение 1 ч при 37 °C на водяной бане. Объедините 298,5 мкл раствора таксола при комнатной температуре 1x BRB80 и 1,5 мкл таксольного раствора 4 мМ для получения таксольного раствора 20 мкМ. Приготовьте 300 мкл 1x BRB80 и держите обе трубки при комнатной температуре.
    4. Нагрейте соответствующий высокоскоростной ротор до 30 °C. Это можно сделать в настольной ультрацентрифуге, установленной на 30 °C. Снимите микротрубочки с водяной бани и держите при комнатной температуре на столешнице в течение 10-15 мин.
  3. Осветление микротрубочек
    1. Добавьте 100 мкл комнатной температуры 1x BRB80 в раствор для роста микротрубочек и перемешайте, щелкнув трубкой ~10 раз или осторожно пипетировав. Перенесите раствор для роста микротрубочек в поликарбонатную центрифужную трубку.
    2. Отметьте одну сторону поликарбонатной трубки, которая будет обращена наружу относительно вращения центрифуги. Это поможет в обнаружении гранулы микротрубочки, которая будет едва заметна из-за небольшого объема материала.
    3. Центрифугируйте раствор микротрубочек при ~350 000 х г в течение 10 мин при 30 °C. После центрифугирования осмотрите трубку, содержащую микротрубочки, на наличие гранулы, если это возможно. Удалите все, кроме последних нескольких микролитров жидкости, осторожно, не нарушая гранулу. Если гранула не видна четко, используйте маркировку, сделанную в качестве ориентира, чтобы не нарушать область, где находится гранула.
    4. Немедленно добавьте 100 мкл 1x BRB80 + 20 мкМ таксола в трубку микротрубочки. Это может быть добавлено непосредственно на гранулу; Нарушение работы гранул на этом этапе существенно не влияет на процесс осветления.
    5. Центрифугируйте микротрубочки снова при ~350 000 х г в течение 10 мин, следя за тем, чтобы отмеченный участок трубки снова был ориентирован наружу относительно вращения центрифуги.
    6. Удалите все, кроме нескольких микролитров раствора, как и раньше, снова соблюдая осторожность, чтобы не нарушить гранулу микротрубочки. Повторите шаги 1.3.4.-1.3.5. а затем повторно суспендировать гранулу микротрубочки в 20-50 мкл 1x BRB80 + 20 мкМ таксола.
    7. Повторное суспендирование путем пипетирования большей части объема повторного суспензии и осторожного выброса его непосредственно на гранулу, повторяя 20-30x или до тех пор, пока гранула не будет полностью повторно суспендирована. Делать это нужно с осторожностью, чтобы не порезать микротрубочки чрезмерно энергичной пипеткой. Разрезание наконечника пипетки для увеличения размера отверстия также может быть полезно для уменьшения сдвига микротрубочек.
    8. Храните микротрубочки при комнатной температуре, обернув трубку в фольгу, чтобы защитить флуорофоры от света и держа на столешнице. Микротрубочки, как правило, можно использовать в течение 2-3 дней после осветления.
  4. Оценка микротрубочек с помощью микроскопии
    1. Готовят разведение 1:10 осветленного раствора микротрубочек путем смешивания 1 мкл микротрубочек и 9 мкл комнатной температуры 1x BRB80. Немедленно визуализируйте этот раствор, пипетируя 10 мкл на предметное стекло микроскопа, а затем помещая крышку поверх капли, чтобы сформировать кабачок.
    2. Убедитесь, что микротрубочки длиной от 8 до 25 мкм при высокой плотности (несколько сотен на полное поле зрения, слоистое в плотной сетке) видны при визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии и 100-кратного объектива, сфокусированного на поверхности покрова, контактирующей с разбавлением микротрубочек.

2. Подготовка пассивированных обложек

  1. Моющиеся крышки
    1. Поместите крышки размером 18 мм x 18 мм в нереактивные пластиковые стойки, затем поместите каждую стойку в стакан емкостью 100 мл. Поместите по одному чехловому срезу на слот в стойках, так как необходима очистка обеих сторон чехлов.
    2. Соникат с помощью ультразвукового аппарата для ванны в течение 5 мин, используя 50 мл следующих растворов в порядке, заданном для каждого цикла обработки ультразвуком: (1) деионизированная вода (с удельным сопротивлением 18,3 МОм-см), (2) 2% раствора Micro-90, (3) деионизированная вода, (4) свежеприготовленная 0,1 М КОН, (5) деионизированная вода (рисунок 1А). Убедитесь, что крышки полностью покрыты жидкостью. Между циклами обработки ультразвуком промойте каждую стойку крышки в деионизированной воде, используя пинцет, чтобы окунуть стойку вверх и вниз в 10-20 раз в деионизированную воду, заменить воду и повторить процесс промывки 2 раза.
    3. Промойте крышки в 3 раза в воде, затем наполните стаканы 100% этанолом и верните стойки в стаканы. Переместите стаканы в вытяжной капюшон и разложите достаточно салфеток, чтобы освободить место для всех стеллажей для чехлов. Затем снимите стойки пинцетом и поместите на ткань салфетки.
    4. Используя сухую струю газообразного азота, сдувайте этанол с крышек и их стоек до высыхания. Утилизируйте оставшийся этанол из стаканов и аналогичным образом высушите их, используя сухой поток газообразного азота (рисунок 1А).
  2. Функционализация поверхности аминосилана на покровных листах
    1. Готовят (3-аминопропил)тиэтоксисилан (APTES) раствор реагента, добавляя 40 мл ацетона и 400 мкл реагента APTES в коническую трубку объемом 50 мл, плотно закрывая и перемешивая путем инвертирования 10x.
    2. Переместите одну стойку с крышками в соответствующий сухой стакан, а затем полностью погрузитесь в раствор APTES. Инкубировать в течение 5 мин (рисунок 1А). Переместите обработанную APTES стойку на новый сухой стакан и переместите новую стойку в APTES для инкубации в течение 5 м.
    3. Промыть обработанную стойку деионизированной водой, окунув стойку в 10-20 раз, как описано в Шаге 2.1.2., заменив воду 5x. Повторяйте до тех пор, пока все крышки не будут обработаны и вымыты.
  3. ПЭГилирование аминосилановой поверхности
    1. Готовят два раствора ПЭГ, один из ~100 мкл с 25% мас./об ПЭГ и другой ~10 мкл с 10% мас./об.биотин-ПЭГ, оба суспендированы в свежеприготовленных 0,1 М NaHCO3, достаточных для покрытия 24 обложек. Центрифугировать 25% раствор ПЭГ при 3 000 х г в течение 20 с после добавления 0,1 М NaHCO3 для полного растворения ПЭГ; решение может оставаться облачным. Смешайте биотин-ПЭГ путем щадящей пипетки (рисунок 1В).
    2. Готовят смесь растворов ПЭГ и биотин-ПЭГ с объемом ПЭГ в 33,3 раза больше на 1 объем биотин-ПЭГ (например, 100 мкл раствора ПЭГ и 3 мкл раствора биотин-ПЭГ).
    3. В вытяжной капюшон разложите несколько стерильных и безворсовых салфеток. Переместите стойки для обшивки на салфетки и высушите феном сухим потоком газообразного азота, как и раньше. На нескольких новых и сухих салфетках выложите теперь уже полностью высохшие крышки, расположенные попарно, и пометьте каждый в правом нижнем углу асимметричным символом, таким как «b». Эта маркировка будет находиться напротив поверхности образца крышки и не будет мешать эксперименту (рисунок 1B).
    4. Переверните по одному чехлуку в каждой паре пинцетом. На каждый перевернутый облицовочный лист поместите 6 мкл смеси ПЭГ/биотин-ПЭГ и поместите второй крышку сверху так, чтобы обе этикетки «b» были обращены наружу.
    5. Выровняйте края крышки и поместите в увлажненную и герметичную камеру, чтобы предотвратить высыхание. Инкубировать крышки в камере влажности при комнатной температуре в течение 3 ч.
    6. После инкубации извлеките крышки из камеры влажности, аккуратно отделите пары чехлов и поместите их обратно в стойки. Мойте каждую стойку в деионизированной воде, как и раньше, погружая стойки с помощью пинцета в 10-20 раз и заменяя воду в общей сложности в 5 раз.
    7. Поместите все PEGylated стороны чехлов лиц лицом в одном направлении, чтобы не было двух покрытых PEGylats поверхностей лицом друг к другу. PeGylated поверхность будет очень липкой, пока она полностью не высохнет, поэтому будьте особенно осторожны, чтобы предотвратить прикосновение к чехлам. Высушите каждую стойку и крышки, как и перед использованием сухого потока газообразного азота (рисунок 1B).
    8. После того, как крышки и их стеллажи полностью высохнут, храните в вакуумном осушителе, чтобы предотвратить деградацию поверхностного покрытия. Правильно хранить в вакууме и с осушителем, чтобы предотвратить разрушение влагой покрытия ПЭГ; чехлы можно использовать в течение примерно 1 недели.

3. Приготовление бисера с кинезиновым покрытием

  1. Подбор и подготовка конструкции строгого кинезина
    1. Экспрессия и очистка строгости кинезиновых конструкций в соответствии с опубликованными протоколами53,54. Мгновенно замораживают 5 мкл аликвот 0,02 мг/мл растворов кинезина и хранят при -80 °C до 1 года.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Белки rigor kinesin имеют точечную мутацию G234A, которая предотвращает гидролиз АТФ. При сопряжении с микрошариками высокие сродственные взаимодействия с микротрубочками позволяют шарикам выдерживать нагрузки 10-20 пН в течение нескольких минут. Ригор мутировавшие версии как широко используемого гомодимера кинезин-1 K56053, так и дополнительно оптимизированной конструкции K43955 также были успешно использованы в этих анализах54. Эта улучшенная конструкция K439 содержит домен димеризации EB1 для повышения стабильности и метку C-терминала 6-His для специфического связывания с антителом 6-His, как описано ниже.
  2. Связывание 6-Его антитела с шариками, покрытыми стрептавидином
    1. Добавьте 50 мкл полистирольных шариков диаметром 1 мкм, покрытых стрептавидином, в центрифужную трубку объемом 0,5 мл. Ультразвук в течение 30 с.
    2. Добавьте 10 мкл 200 мМ DTT к 790 мкл 1x BRB80. Добавьте 10 мкл бусин, обработанных ультразвуком, к 40 мкл этого 1x BRB80 + 2,5 мМ DTT буфера.
    3. Соединить 1 мкл биотинилированного 6-его антитела и 49 мкл 1x BRB80 + 2,5 мМ DTT; вихрь ненадолго перемешать.
    4. Смешайте 50 мкл разбавленной смеси шариков и 50 мкл разведения антител в новой пробирке. Поместите трубку в ротатор трубки при 4 °C и поверните в течение 1 ч. Открутите смесь шариков в течение 10 мин при 3 000 х г при 4 °C.
    5. Пипетка удаляется от надосадочного вещества и повторно суспендирует гранулу в 100 мкл 2 мг/мл раствора казеина в 1x BRB80. Повторите это центрифугирование и повторное суспендирование 2x.
  3. Добавление строгого кинезина
    1. Повторно суспендировать конечную гранулу в 100 мкл 2 мг/мл раствора казеина. В центрифужной трубке объемом 0,5 мл соедините 5 мкл 0,02 мг/мл строгого кинезина и 5 мкл шариков, осторожно перемешивая, слегка щелкнув трубкой ~10x.
    2. Держите как подвеску K439 G234A, так и оставшиеся бусины 6-His на роторе при 4 °C, когда они не используются. Бусины должны быть приготовлены свежими и использоваться в тот же день для экспериментов, так как они, как правило, сливаются и теряют активность после этого времени.

4. Сборка микроскопической камеры

  1. Подготовка стеклянных горок и конструкции камер
    1. Промойте стеклянные стекла микроскопа размером 75 мм x 25 мм сначала сверхчистой водой, затем очистителем стекла без полос аммиака D, а затем еще раз сверхчистой водой. Встряхните, чтобы удалить лишние капли воды. Высушите горки с помощью потока азота, чтобы не осталось разводов, и положите слайды вниз на бумажное полотенце (рисунок 2А).
    2. Ножницами нарежьте двухстороннюю ленту на полоски размером ~2-3 мм х 2,5 см (2 полосы на одну камеру и 3 на двойную камеру).
    3. Используя щипцы, положите две полоски ленты на один стеклянный слайд так, чтобы между ними было ~ 0,5 см пространства для строительства одной камеры. Для двойных камер используйте тот же интервал, но с тремя полосками ленты (рисунок 2B). Объем канала образца при использовании этого метода составляет приблизительно 10 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чем шире камера (камеры), тем больше вероятность того, что пузырьки будут образовываться при поступлении растворов; однако камеры шириной менее 0,5 см могут быть сложными в использовании из-за уменьшенной площади для визуализации.
    4. Соскоблите по всей длине каждую полоску ленты с помощью щипцов так, чтобы лента прочно приклеилась к стеклянной горке.
    5. Снимите давление с осушителя и используйте щипцы, чтобы удалить одну биотинилированную крышку из стеллажа для хранения. Поместите одну биотинилированную крышку поверх стеклянной горки с помощью щипцов. Убедитесь, что биотинилированная сторона обращена внутрь, к стеклянному слайду.
    6. Используя плоский задний конец щипцов, осторожно надавите на стекло, где крышка касается ленты, чтобы надежно запечатать камеры. Световое давление должно использоваться для обеспечения того, чтобы крышка не трескалась (рисунок 2C).
    7. Храните готовые камеры микроскопии в герметичном контейнере, вдали от прямого света, до использования (рисунок 2D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать камеры в тот же день, когда они изготовлены, так как биотинилированные крышки разлагаются при воздействии воздуха.
  2. Поступление реагентов микроскопии
    1. Постройте камеру влажности, поместив сложенную безворсовую ткань, смоченную сверхчистой водой, на дно пустого ящика для пипетки. Камеры для отбора проб должны храниться в этой коробке между стадиями вливания, чтобы уменьшить испарение растворов из канала.
    2. Введите все реагенты, пипетируя жидкость на одном конце канала и выводя жидкость на противоположный конец. Для фитиля скрутите один конец ткани и аккуратно поместите его на выходную сторону камеры, что позволит капиллярному действию равномерно распределить реагент (рисунок 3А). Доведите все реагенты до комнатной температуры непосредственно перед вливанием, чтобы предотвратить деполимеризацию микротрубочек.
    3. Используя наклонный наконечник пипетки объемом 20 мкл так, чтобы он касался входной стороны одной камеры, медленно течь в 10 мкл 0,5 мг/мл стрептавидина или нейтравидина. Используйте меньшие наконечники пипеток и медленное, постоянное поступление реагентов, чтобы уменьшить вероятность получения пузырьков в камере (рисунок 3B).
    4. Высиживайте горку в камере влажности в течение 4 мин, закрывая крышку камеры лицом вниз. Такая ориентация позволит более крупным объектам, таким как микротрубочки или бусины, погружаться вблизи ПЭГилированной поверхности.
    5. Промывайте камеру, используя 20 мкл 1x BRB80, используя безворсовую ткань для вытягивания жидкостей. Если в камере присутствует утечка, отбросьте слайд и начните с другого; небольшие пузырьки, которые возникают в камере, не будут пагубно влиять на визуализацию.
    6. Повторите этапы вливания, инкубации и промывки с 10 мкл раствора для блокировки казеина 0,5 мг/мл (рисунок 3C). Разбавляют биотинилированные дальние красные микротрубочки ~1:20 и вводят в камеру 10 мкл. Инкубировать в течение 5 мин и промыть камеру 20 мкл 1x BRB80 (рисунок 3D). Оптимальная плотность этих микротрубочек в пределах поля зрения изображения 100 мкм х 100 мкм должна составлять 10-20; и разбавление на этом этапе должно быть скорректировано для достижения этого коэффициента поверхностного связывания.
    7. Повторите этапы вливания, инкубации и промывки с 10 мкл соответствующей концентрации (обычно 1-10 нМ) сшивающего моторного или немоторного белка, подлежащего изучению (рисунок 3Е).
    8. Поток в 10 мкл микротрубочек родамина разбавлен до такой же концентрации, как и у предыдущих биотинилированных дальних красных микротрубочек. Повторите этапы инкубации и промывки (рисунок 3F).
    9. Объедините 1 мкл шариков с кинезиновым покрытием и 19 мкл реакционного буфера, оптимизированного для сшивки белковой активности. Например, для анализа активности кинезина-5 используйте реакционный буфер с разрывом связи TCEP 1 мМ, альфа-казеином 0,2 мг/мл, 70 мМ KCl, системой очистки кислорода (4,5 мг/мл глюкозы, 350 единиц/мл глюкозооксидазы, 34 ед/мл каталазы), 1 мМ DTT и АТФ при желаемой концентрации (например, 1 мМ для условий максимальной скорости кинезина) в 1x BRB80 (рисунок 3G) ). Для анализа немоторных белков опускают АТФ и изменяют концентрацию KCl для модуляции силы взаимодействия белка с микротрубочками в этих анализах.
    10. Запечатайте оба края камеры прозрачным лаком для ногтей и подождите, пока лак высохнет перед визуализацией (рисунок 3H). Успешно построенная камера не будет иметь утечки и минимальных пузырьков.

5. Визуализация пучков микротрубочек с 3-цветным TIRF

  1. Используйте инструмент инвертированного микроскопа, который имеет возможности визуализации TIRF и в котором была построена однолучевая оптическая ловушка (рисунок 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для исследований, описанных здесь, использовался инвертированный микроскоп с масляной объективной линзой 100x/NA1.49, модулем TIRF и тремя лазерами на 488 нм, 561 нм и 640 нм для помеченных GFP белков, меченых родамином микротрубочек и биотинилированных микротрубочек с дальней красной меткой, соответственно.
    1. Добавьте одну каплю погружного масла на крышку камеры для отбора проб. Чрезмерное количество масла может повредить объектив микроскопа. Стороной крышки камеры для образцов, обращенной вниз, поместите образец для изображения на платформу микроскопа.
    2. Медленно поднимите цель вверх, чтобы был контакт между крышкой и объективом через масло. Отрегулируйте высоту объектива таким образом, чтобы поверхность крышки камеры для отбора проб находилась в фокусе.
    3. Записывайте однокадровые изображения образца во всех трех каналах. Для экспериментов здесь используйте 100-200 мс экспозиции в качестве оптимальной продолжительности изображения по всем трем каналам; более длительное время экспозиции может привести к усилению фотоотбеливания.
    4. Отрегулируйте мощность лазера для достижения хорошего соотношения сигнал/шум от образцов, сводя к минимуму фотоотбеливание в течение 2-5 минут при анализе отдельного пучка. Для лазера, используемого здесь (рисунок 4 и рисунок 5), используйте лазер мощностью 5 мВт для канала GFP и 3 мВт для обоих каналов микротрубочек в качестве оптимального.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Успешно собранные пучки должны состоять из одной поверхностно-иммобилизованной микротрубочки в дальне-красном канале, коэкстензивной области в несколько микрон со значительным сигналом GFP-белка и микротрубочки родамина, перекрывающей эти области, а затем простирающейся на несколько микрон от пучка (рисунок 5B, C и рисунок 6 ). Живая визуализация микротрубочки родамина должна выявить тонкие колебания на несшитом конце микротрубочки, указывающие на то, что эта нить не прикреплена к поверхности или другим белкам в камере.
    5. Наблюдайте за частотой пучков микротрубочек в каждом поле зрения. Для успешно подготовленного образца на поле зрения 100 мкл х 100 мкл на камеру должно приходиться приблизительно 3-4 пучка микротрубочек.

6. Проведение экспериментов с оптической ловушкой на пучках микротрубочек

  1. Предэкспериментальная калибровка условий
    1. Для выполнения этих экспериментов используют однолучевую оптическую ловушку с жесткостью 0,05-0,1 пН/нм. Включите улавливающую оптику и чувствительный к положению фотоприемник в инвертированный микроскоп с поддержкой TIRF путем введения фильтров коротких частот чуть ниже объектива и над конденсатором, соответственно (рисунок 4).
    2. Кроме того, добавьте этап нанопозиционирования, на котором находится образец, чтобы позволить пользователю перемещать микротрубочки с нанометровой точностью контролируемым образом во время этих анализов. Система, используемая здесь для получения репрезентативных данных, была описана в опубликованной работе 27,53,54,56,57.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя это выходит за рамки данного протокола, имеется множество ресурсов, которые подробно описывают конструкцию и калибровку однолучевойоптической ловушки 58,59,60.
    3. Наблюдайте плотность шариков в образце, используя канал яркого поля или DIC и 100-кратный объектив на микроскопе. Используйте яркую микроскопию только для идентификации и манипулирования бусинами, а не для одновременной записи с флуоресцентным получением изображения. Разместите бусины на расстоянии не менее 10 мкм друг от друга в среднем и убедитесь, что они свободны от какого-либо поверхностного удержания или прикрепления и не прикреплены друг к другу или иным образом не группируются.
    4. Убедитесь, что биотинилированные дальние красные микротрубочки прочно прикреплены к поверхности покровного листа без видимого броуновского движения, такого как движения вдоль оси микротрубочек или свободные концы микротрубочек, колеблющихся в растворе.
    5. Убедитесь, что микротрубочки родамина прикреплены к биотинилированным микротрубочкам через сшивающий MAP и заметно колеблются на своих свободных концах. Поверхностное прикрепление небиотинилированных микротрубочек часто указывает на то, что ПЭГилирование, возможно, было неудачным или что покрытие ПЭГ деградировало.
  2. Измерения скольжения микротрубочек с приводом двигателя
    1. Экспрессируйте и очищайте интересующий двигательный белок в соответствии с опубликованными протоколами. Например, полноразмерные GFP-меченые белки кинезин-5 были успешно очищены и использованы в этих анализах53,61, а также немаркированные кинезин-1262 и кинезин-1463. Соберите и визуализируйте сшитые пучки моторного белка, как описано выше на этапах 4 и 5.
    2. Захватите с помощью оптической ловушки свободную одиночную бусину в растворе, который демонстрирует броуновское движение. Отрегулируйте оптику ловушки по мере необходимости, чтобы переместить бусину в середину поля зрения. Убедитесь, что отраженная интерференционная картина от луча ловушки симметрична, и отрегулируйте оптику ловушки для разрешения любых асимметрий луча.
    3. Переместите стадию образца так, чтобы свободный конец микротрубочки родамина в пучке находился непосредственно под шариком, а шарик находился на расстоянии нескольких микрон от области перекрытия, содержащей сшивающие белки, чтобы свести к минимуму фотоотбеливание, вызванное пучком ловушки. Опустите шарик по оси Z до тех пор, пока он не столкнется с микротрубочкой. Позаботьтесь о том, чтобы аккуратно опустить бусину и не прижимать бусину к поверхности крышки, так как это может привести к прилипанию к поверхности крышки.
    4. Ненадолго выключите ловушку, чтобы наблюдать с помощью канала яркого поля подвижность бусины, прикрепленной к скользящей микротрубочке. При выполнении анализа моторного белка прикрепленная шарика будет двигаться направленно, поскольку микротрубочки раздвигаются. Повторно активируйте ловушку и снова захватите бусину.
    5. Начните запись флуоресцентных данных в трех (488 нм, 561 нм, 640 нм) каналах со скоростью 1-2 кадра в с, используя мощность лазера и время экспозиции, которые были оптимизированы на шаге 5 выше.
    6. С помощью компьютерного программного обеспечения для захвата записывайте данные о напряжении от чувствительного к положению фотоприемника (сигналы интенсивности X, Y и SUM), стадии нанопозиционирования (координаты X, Y и Z) и состояния затвора камеры TIRF. Начните оцифровку этих значений напряжения ловушки с помощью специальной платы сбора входных данных напряжения, управляемой соответствующим программным обеспечением (например, специально написанным кодом LabView) со скоростью 1-10 кГц, в зависимости от экспериментальных требований.
    7. Отслеживайте сигнал силы по мере получения данных и обращайте пристальное внимание на любые аномалии, которые могут помешать успешному сбору данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аномалии включают, но не ограничиваются ими, (1) другие бусины, движущиеся в ловушку, (2) бусину, преждевременно выходящую из ловушки, и (3) внезапные падения силы и последующую неспособность восстановить силу против ловушки, что указывает на проблемы с молекулами кинезина на поверхности бусины.
    8. После измерения деактивируйте ловушку, чтобы освободить шарик и повторяйте с новой бусиной и новой микротрубочкой до тех пор, пока не будет достигнуто необходимое количество экспериментальных повторов.
  3. Пассивные измерения сопротивления сшиванию
    1. Экспрессируйте и очищайте немоторные сшивающие белки, представляющие интерес, следуя опубликованным протоколам. Например, в этих анализах были успешно использованы полноразмерная GFP-маркированная PRC1 43,54,57 и димерная NuMA усеченная конструкция56. Соберите и визуализируйте сшитые пучки, как описано выше на шагах 4 и 5.
    2. Определить подходящий пучок микротрубочек, который содержит только две микротрубочки, одну биотинилированную с полным поверхностным прикреплением и одну небиотинилированную микротрубочку, которая частично свободна в растворе; это дает свободный конец для прикрепления бусины и гарантирует, что шарик не прикреплен к поверхностной микротрубочке и выровнен по оси X или Y, так что движение ступени будет происходить только вдоль одной оси.
    3. Используйте оптическую ловушку, чтобы захватить свободную бусину, подвергающуюся броуновскому движению. После того, как бусина была поймана в ловушку, осторожно переместите бусину в выбранный пучок микротрубочек, гарантируя, что другие бусины не будут втянуты в ловушку в процессе. Убедитесь, что шарик находится на расстоянии нескольких микрон от области перекрытия, содержащей сшивающие белки, чтобы свести к минимуму фотоотбеливание метки GFP.
    4. Осторожно опустите шарик по оси Z, пока он не соприкоснется с краем свободного сегмента микротрубочки родамина. Осторожно подтяните вверх и двигайтесь перпендикулярно оси микротрубочек, чтобы проверить наличие прикрепления, наблюдая за изгибом микротрубочки родамина и следуя положению шарика. Если он не прикреплен, повторите мягкое наложение шарика на микротрубочку до тех пор, пока она не будет прикреплена.
    5. Тщательно выровняйте микротрубочку родамина вдоль оси микротрубочек поверхностно-прикрепленной микротрубочки, переместив стадию нанопозиционирования и настроив параметры для автоматического вытягивания пучка микротрубочек. Установите направление вдоль параллельной оси микротрубочек, установите желаемую скорость тяги (25-200 нм/с — полезный диапазон скоростей) и желаемое время вытягивания (примерно от 30 с до 2 мин) в зависимости от длины перекрытия.
    6. Начните запись флуоресцентных данных в трех (488 нм, 561 нм, 640 нм) каналах со скоростью 1-2 кадра в секунду. Используйте мощность лазера и время экспозиции, оптимизированные на шаге 5 выше.
    7. Инициируйте автоматическое движение ступени и записывайте данные захвата из чувствительного к положению детектора, сцены и состояния камеры TIRF. Мониторинг любых факторов, которые могут помешать сбору данных, которые включают, но не ограничиваются ими, (1) еще одну бусину, входящую в ловушку, (2) преждевременную потерю сшивки микротрубочек или (3) отслоение шарика от микротрубочки родамина.
    8. Деактивируйте ловушку, чтобы освободить бусину, и повторите эксперимент по своему желанию. Типичная камера для отбора проб может быть использована в течение приблизительно 30 мин, прежде чем произойдет деградация пучков и потеря активности белка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эффекты деградации будут варьироваться в зависимости от используемого сшивки, но могут проявляться в виде образования статической пункты на микротрубочках или поверхности, потери флуктуаций микротрубочек, указывающих на неспецифическое связывание, или неспособности стабильно прикреплять шарики к микротрубочкам.

7. Анализ данных и корреляция флуоресцентных изображений с записями оптической ловушки

ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимизации сбора данных целесообразно использовать две отдельные компьютерные системы управления: одну для программного обеспечения для оптического улавливания, а другую для флуоресцентной визуализации. Эта настройка позволяет осуществлять высокоскоростной сбор данных как в экспериментальных модальностях, так и исключает нано- и микросекундные задержки в выполнении операций, вводимые в данные, которые могут возникнуть при использовании одного процессора.

  1. Оцифруйте данные оптического улавливания со скоростью, оптимизированной для используемых моторных или немоторных сшивающих белков и их ожидаемых скоростей шага (например, обычно между 1-10 кГц).
  2. Записывайте сигналы напряжения X, Y и SUM от позиционно-чувствительного фотоприемника, а также позиционные данные X, Y и Z ступени нанопозиционирования с помощью специального программного обеспечения для управления оптической ловушкой и выборки цифровых сигналов напряжения от этих компонентов.
  3. Запишите цифровой сигнал с открытым затвором от камеры с помощью дополнительного входного канала напряжения на плате сбора данных оптического захвата. Это позволяет соотнести данные флуоресцентной визуализации с оптическими следами времени захвата. Начните сбор данных с оптической ловушки до начала съемки, чтобы сигнал камеры с первого кадра был правильно записан.
  4. Усредните необработанные данные временных рядов, полученные с высокой частотой дискретизации, используя соответствующий метод фильтрации, такой как скользящее окно, медианный фильтр или гауссовский фильтр, в зависимости от потребностей.
  5. Количественное определение данных временных рядов флуоресцентного изображения с использованием таких методов, как анализ линейного сканирования, в котором вычисляется значение интенсивности пикселей по длине области микротрубочек. По этим линиям могут быть определены траектории микротрубочек, а, следовательно, и перекрывающиеся области. Кроме того, используйте интенсивность флуоресценции из сшивающего белкового канала для расчета локализации, концентрации и плотности белка.
  6. Корреляция силовых и имиджевых данных является важным выходом этой экспериментальной системы. Например, выберите и усредните все точки данных о силе в пределах заданной области экспозиции камеры (обозначенные соответствующим всплеском цифрового сигнала в канале камеры) для непосредственного сравнения с соответствующим кадром флуоресцентного изображения. Затем извлеките отношения между величиной силы и количеством сшивающих белков, длиной перекрытия или распределением сшивающих веществ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Подготовка пучков микротрубочек, пригодных для биофизического анализа, считается успешной при соблюдении нескольких ключевых критериев. Во-первых, визуализация в трех цветах должна выявить две выровненные микротрубочки с концентрацией сшивающего белка, предпочтительно украшающего область перекрытия (рисунок 5B, C и рисунок 6B). В идеале расстояние между перекрывающимся краем и свободным концом микротрубочки родамина должно составлять не менее 5 мкм, чтобы обеспечить достаточное физическое пространство между улавливающим пучком и флуоресцентно-мечеными белками. Во-вторых, должен быть минимальный фоновый флуоресцентный сигнал в областях, где отсутствуют биотинилированные дальние красные микротрубочки, особенно из того же канала, которым маркируется сшивающий белок. Высокая фоновая флуоресценция свидетельствует о плохой пассивации покрова и высокой концентрации связанных со стеклом белков, которые, вероятно, будут взаимодействовать неспецифически с микротрубочками или улавливающей бусиной. Кроме того, наличие небольших круглых пункт или коротких фрагментов, наблюдаемых в любом из каналов визуализации микротрубочек, предполагает, что полимеризация и осветление микротрубочек были неудачными или что микротрубочки были состарены или повреждены.

В-третьих, бусины, используемые для улавливания, должны выглядеть как одиночные бусины, а не внутри комков, содержащих много бусин. Вполне вероятно, что небольшая часть бусин будет необратимо прилипать к поверхности, но значительную долю следует наблюдать в виде отдельных частиц, рассеянных в камере образца. Чрезмерное слипание часто может быть облегчено путем обработки шариков ультразвуком в течение не менее 10 минут перед поступлением в камеру. В-четвертых, прикрепление шарика к микротрубочке должно привести к хорошему прикреплению, при этом шарик остается связанным, когда улавливающий лазерный свет закрывается. Бусины не должны прилипать неспецифично при контакте с поверхностью, и, как только шарик прикреплен к микротрубочке, должна быть возможность легко манипулировать (например, сгибать или сгибать) нитью накала до измерения. Наконец, должна быть возможность наблюдать изменения в длине перекрытия при приложении силы или разрешении двигательной активности. Например, при наблюдении моторного скольжения, управляемого белком, длина перекрытия должна уменьшаться со скоростью, соответствующей скорости шага моторного белка. При исследовании пассивных сшивающих устройств применение силы должно привести к изменению длины перекрытия. Эти выходы указывают на то, что микротрубочка родамина прикреплена только к поверхностно связанной микротрубочке через сшивающие белки, а не неспецифически прилипает к поверхности крышки.

Когда все эти критерии соблюдены, можно выполнить широкий спектр экспериментов для извлечения основных биофизических параметров, которые определяют механику ансамбля. Этот анализ или аналогичные анализы широко использовались для изучения митотических сшивающих белков в предыдущих исследованиях. Например, мы показали, что ансамбли существенного митотического моторного белка кинезин-5 могут регулировать скольжение микротрубочек, генерируя как толкающие, так и тормозящие силы, которые линейно масштабируются с длиной перекрытия64 (рисунок 5). Микротрубочки в антипараллельной или параллельной геометрии были сшиты небольшим ансамблем молекул кинезина-5. Когда эти моторные белки шагали к микротрубочкам плюс-концы, нити либо раздвигались (антипараллель), либо быстро колебались вперед-назад (параллельно). Наблюдая за механикой в этой геометрии мини-шпинделя, мы обнаружили величину силы, масштабируемой как с длиной перекрытия нити, так и с количеством сшивающих моторных белков. Когда микротрубочки двигались со скоростью, превышающей скорость ненагруженного шага кинезина-5, моторные белки обеспечивали резистивную тормозную силу. Было также установлено, что хвостовой домен C-терминала необходим для эффективного сшивания и генерации силы61 (рисунок 5B, C). Полноразмерный белок способен генерировать устойчивые силы, которые плато, когда все моторные белки достигают своей индивидуальной силы сваливания (рисунок 5D). Тем не менее, двигатель кинезин-5, не имеющий своего C-концевого хвоста, генерирует максимальные силы, которые почти в пять раз меньше по величине (рисунок 5E, F). Вместе эти результаты показывают, как белки кинезин-5 работают в ансамблях, чтобы подтолкнуть микротрубочки к полюсу во время сборки веретена и прояснить биофизическую функцию основных регуляторных белковых доменов внутри молекулы.

Мы также продемонстрировали, что ансамбли немоторного митотического белка PRC1 работают как механический дашпот, чтобы противостоять скольжению микротрубочек в анафазных шпиндельных средних зонах54 (рисунок 6A-C). PRC1 генерирует сопротивление трению, которое линейно масштабируется со скоростью вытягивания, так же, как механический дашпот создает зависящие от скорости резистивные силы. Эти резистивные силы не зависят от длины перекрывающихся областей между парами микротрубочек или локальной плотности сшивателя, но они сильно зависят от общей концентрации вовлеченных молекул PRC1 (рисунок 6D, E). Исходя из этих результатов, предполагается, что ансамбли PRC1 действуют как протекающий поршень, в котором сжатие диффузных сшивающих устройств создает зависящее от скорости сопротивление, но потеря сшивающих устройств на концах микротрубочек облегчает большие силы сжатия.

Подобные геометрии анализа были также использованы для изучения белка митотика кинезин-12 Kif1562. Измеряя силу, возникающую при раздвигании микротрубочек, Reinemann et al.62 обнаружили, что ансамбли Kif15 могут раздвигать нити до критической силы плато и требуют С-концевой области хвостового троса белка для эффективного сшивания микротрубочек и создания устойчивых нагрузок. Reinemann et al. также элегантно продемонстрировали, что кинезин-14 HSET, направленный кинезин с минусовым концом, может аналогичным образом раздвигать антипараллельные микротрубочки63. При смешивании с равными количествами белка с плюс-концом направленного кинезина-5 Eg5 HSET служит для ингибирования скользящей активности Eg5, участвуя в перетягивании каната для скользящего движения микротрубочек в области перекрытия. Вместе эти результаты демонстрируют силу измерения прямой силы в активных пучках микротрубочек и проясняют необходимость характеристики функции белка в биологически приемлемой геометрии сети.

Figure 1
Рисунок 1: Пассивация стеклянных облицовок. (А) Схема, изображающая последовательные этапы промывки, сушки и сопряжения стеклянных крышек No 1.5 для аминосиланового сопряжения. (B) Схема, изображающая протокол ковалентного связывания групп ПЭГ и биотин-ПЭГ со стеклянным покровным листом, промывкой и сушкой и герметизации покровных пластин под вакуумом для краткосрочного хранения. Некоторые части схемы являются модифицированными изображениями из 65. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Сборка камеры для отбора проб. (A) Схема, изображающая сборку камеры потока образца с использованием пассивированных обложек и стандартного слайда 3 в микроскопе. (B) Сборка и типичные размеры одно- и двухканальных проточных камер, оптимизированных для оптического улавливания и флуоресцентной визуализации пучков микротрубочек. Некоторые части схемы являются модифицированными изображениями из 65. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Генерация поверхностных иммобилизованных пучков микротрубочек для оптического улавливания и визуализации на основе TIRF. Схемы, изображающие ступенчатую сборку оптически улавливаемых пучков микротрубочек. (A) Реагенты поступают из входного отверстия камеры, а жидкость выводится из выходного канала. (B) Стрептавидин (синий) сначала связывается с участками биотин-ПЭГ на покровном листе, а (C) казеин (красный) вводится в качестве дополнительного блокирующего агента. (D) Биотинилированные дальнекрасные микротрубочки (пурпурные) вводят и позволяют инкубировать в течение ~5 мин с последующим добавлением (E) сшивающего белка (зеленый), (F) небиотинилированных микротрубочек, меченых родамином (красный), и, наконец, (G) микросфер, покрытых кинезиновым покрытием, взвешенных в соответствующем реакционном буфере для прикрепления к пучку и оптических манипуляций на основе ловушки. (H) Камера герметизирована прозрачным лаком для ногтей для предотвращения испарения буфера образца во время экспериментов. Некоторые части схемы являются модифицированными изображениями из 65. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Схема оптической системы пинцета/микроскопа TIRF. Однолучевая оптическая ловушка вводится в оптический путь объективной системы визуализации TIRF в перевернутом микроскопе. Короткопроходный фильтр, вставленный чуть ниже объектива, позволяет направить луч ловушки в заднюю апертуру объектива, где он будет сфокусирован чуть выше поверхности крышки образца, образуя оптическую ловушку. Чувствительный к положению фотоприемник будет собирать проходящий свет, позволяя определять положение и силу шарика. Несколько каналов флуоресцентных данных могут быть получены с помощью TIRF-визуализации и записаны на высокочувствительную камеру EMCCD или sCMOS. Источник света широкого спектра используется для изображения улавливающих шариков во время установки экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Репрезентативный пример измерения производства силы кинезином-5. (А) Схема, изображающая экспериментальную геометрию, показывающая микротрубочки, сшитые моторными белками кинезин-5, которые генерируют силу, когда они раздвигают нити, что измеряется с помощью оптической ловушки. Репрезентативные флуоресцентные изображения пучков, состоящих из поверхностно-иммобилизованных микротрубочек, GFP-кинезин-5 и меченых родамином транспортных микротрубочек. (B) Были использованы полноразмерные и (C) C-концевые хвостовые усеченные кинезин-5 конструкции. Шкала стержней = 5 мкм. Показаны образцы записей о производстве силы для (D) полноразмерных и (E) бесхвостых, при этом средняя сила строится как функция времени. (F) Показаны графики максимальной силы плато и соответствующей длины перекрытия для обеих конструкций, показывающие, что конструкция кинезина полной длины генерирует зависимые от перекрывающейся длины силы, которые значительно больше по величине, чем конструкция бесхвостого кинезина. Эта цифра была изменена с61. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Репрезентативный пример измерения сил трения с помощью PRC1. (A) Схема, изображающая экспериментальную геометрию, показывающая микротрубочки, сшитые GFP-PRC1 (белковым регулятором цитокинеза) сшивающими белками, которые генерируют сопротивление, когда нити раздвигаются, перемещая покров с постоянной скоростью. (B) Репрезентативные флуоресцентные изображения временных рядов, показывающие движущуюся поверхностно-иммобилизованную дальнюю красную микротрубочку, молекулы GFP-PRC1, конденсирующиеся в уменьшающемся перекрытии, и свободную микротрубочку родамина, удерживаемую шариком. Временной интервал между кадрами = 6 с; Шкала бара = 5 мкм. (C) Пример силовой трассировки, показывающий силу трения во время события скольжения, с событием разрушения и падением силы до нуля (~ 55 сек), как только перекрытие достигло 0 мкм. (D) Корреляция средней силы и интегральной интенсивности GFP внутри перекрытия при четырех различных скоростях скольжения. (E) Средние наклоны и рассчитанные погрешности подгонки следов в (D) показывают, что сила на молекулу PRC1 увеличивается линейно в зависимости от скорости скольжения. Эта цифра была изменена с66. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Сети микротрубочек используются множеством типов клеток для выполнения широкого круга задач, которые по своей природе являются механическими. Чтобы описать, как клетки функционируют как в здоровом, так и в болезненном состоянии, важно понять, как эти микронные сети организованы и регулируются белками нанометрового размера, которые в совокупности их строят. Биофизические инструменты, такие как оптический пинцет, хорошо подходят для исследования механохимии ключевых белков в этом масштабе. Отражая разнообразие функций сети микротрубочек, были исследованы сложные экспериментальные геометрии, использующие оптический пинцет, включая силозависимый анализ динамики наконечника микротрубочки 67,68, генерации сил кинетохорными компонентами 69,70,71 и двухлучевой геометрии ловушки гантелей для исследования механики нитей микротрубочек72,73 . В этом протоколе мы описали новые методы восстановления фундаментальных мотивов сети микротрубочек, таких как пучки, и применения биофизических инструментов одномолекулярной флуоресцентной микроскопии и оптического улавливания для оценки критической информации о клеточной функции.

Хотя большинство отдельных шагов в этом протоколе технически просты, вместе взятые существуют многочисленные потенциальные точки отказа, которые могут возникнуть, и в каждой точке необходимо проявлять существенную осторожность для обеспечения успешных измерений. Во-первых, как и во многих одномолекулярных экспериментальных анализах на основе микроскопа, правильная пассивация поверхности является ключевой, поскольку неспецифическое связывание белков или шариков с поверхностью покрова почти всегда препятствует успешному завершению этих экспериментов. Во-вторых, экспрессия и очистка интересующего сшивающего белка (сшивающих белков) должна быть оптимизирована для обеспечения высокого качества одновидовых продуктов, поскольку загрязняющие вещества могут мешать анализу различными способами, такими как индуцирование избыточного объединения нитей или вмешательство в прикрепление шариков и микротрубочек, не говоря уже о сложностях в интерпретации данных о силе. В-третьих, для поддержания прочного крепления шариково-микротрубочек требуются высококачественные двигатели строгости кинезина, связанные с высокой плотностью с улавливающей шарикой, так что можно сделать несколько точек крепления кинезиновой нити. Эти связи могут выдерживать 10 с пН силы в течение нескольких минут, что подходит для широкого спектра потенциальных систем исследования, использующих этот метод.

Мы также отмечаем, что существует множество способов, с помощью которых этот протокол может быть изменен в соответствии с потребностями конечного пользователя в приборах или биологических системах. Хотя мы описали эксперименты, в которых используются меченые GFP сшивающие белки и микротрубочки с красными / красными метками, также можно менять флуоресцентную маркировку по мере необходимости. Например, если у пользователя недостаточно лазерных линий для выполнения трехцветной TIRF-микроскопии, можно получить высококачественные данные путем дифференциальной маркировки микротрубочек одним и тем же флуорофором, но с использованием разных концентраций (например, тусклых и ярких) для каждого вида микротрубочек. Аналогичным образом, не всегда может быть возможно или выгодно добавить флуоресцентную метку к сшивающему белку. В этой ситуации определенная экспериментальная информация, такая как концентрация сшивания или локализация, будет недоступна, но определение таких параметров, как длина перекрытия микротрубочек, все еще может быть сделано. Мы ожидаем, что этот протокол хорошо адаптируется для многих различных типов и комбинаций белков, сшивающих микротрубочки. Введение нескольких сшивающих белков, вероятно, потребует либо удаления флуоресцентных меток с одного из белков, либо исключения флуоресцентных меток из одного из двух типов микротрубочек, чтобы освободить возможности визуализации в соответствующей полосе пропускания (например, использование красной или дально красной белковой кодированной метки для сшивающего белка). Маловероятно, что с этим анализом на основе TIRF можно использовать более трех флуоресцентных каналов, хотя, безусловно, существует гибкость в том, как они распределяются, что следует тщательно учитывать при планировании эксперимента. Наконец, вполне вероятно, что этот анализ может быть модифицирован для изучения различных геометрий сети и типов цитоскелетной нити. Анализ механики ветвления микротрубочек, опосредованный авгмином и гамма-тубулиновым кольцевым комплексом, может быть легко исследован и визуализирован. Кроме того, другие сшитые цитоскелетные сети, такие как те, которые включают актин, септины или промежуточные нити, будут вполне поддающимися изучению с помощью этих инструментов, при условии, что будут сделаны надлежащие модификации и ортогональные стратегии прикрепления к чехловому и улавливающему шарику.

В заключение мы описали протокол восстановления активных силовых микротрубочек, которые могут быть отображены с помощью инструментов флуоресцентной микроскопии с одной молекулой и манипулировать с помощью однолучевой оптической ловушки. Мы продемонстрировали полезность этого метода с помощью наборов данных, которые раскрывают ансамблевую механику как митотического моторного, так и немоторного белка. Мы ожидаем, что многие типы высокоорганизованных сетей микротрубочек, таких как те, которые обнаружены в нейронах, эпителиальной ткани или кардиомиоцитах, могут быть проанализированы с помощью этих инструментов, раскрывая новые принципы биофизической функции динамического цитоскелета.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы отметить поддержку со стороны R21 AG067436 (JP и SF), T32 AG057464 (et) и Rensselaer Polytechnic Institute School of Science Startup Funds (sF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nm IPG Photonics YLR-10-1064-LP
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applications Chroma TRF89901v2
6x His Tag Antibody, Biotin Conjugate Invitrogen #MA1-21315-BTIN
Acetone, HPLC grade Fisher Scientific 18-608-395
Alpha casein from bovine milk Sigma 1002484390
ATP Fisher Scientific BP413-25
Benzonase Novagen 70746-3
Biotin-PEG-SVA-5000 Laysan Bio, Inc. NC0479433
BL21 (DE3) Rosetta Cells Millipore Sigma 71-400-3
Catalase MP Biomedicals LLC 190311
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objective Nikon N/A
Chloramphenicol ACROS Organics 227920250
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips Fisher Scientific C14784
Delicate Task Wipers Kimberly-Clark 34120
Dextrose Anhydrous Fisher Scientific BP3501
D-Sucrose Fisher Scientific BP220-1
DTT Fisher Scientific BP172-25
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 Bath LAUDA-Brinkmann 27709
EDTA Fisher Scientific BP118-500
EGTA Millipore Corporation 32462-25GM
FIJI / Image J https://fiji.sc/ N/A
Frosted Microscope Slides Corning 12-553-10 75mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm
Glucose Oxidase MP Biomedicals LLC 195196 Type VII, without added oxygen
GMPCPP Jena Biosciences JBS-NU-405S Can be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C
Gold Seal-Cover Glass Thermo Scientific 3405
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Imidazole Fisher Scientific 03196-500
IPTG Fisher Scientific BP1755-10
Laboratory dessicator Bel-Art 999320237 190mm plate size
Kanamycin Sulfate Fischer Scientific BP906-5
KIF5A K439 (aa:1-439)-6His Gilbert Lab, RPI N/A doi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
Kimwipe Kimberley Clark Z188956 lint-free tissue
Immersion Oil, Type B Cargille 16484
Lens Tissue ThorLabs MC-5
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm) Nikon N/A
Lysozyme MP Biomedicals LLC 100834
Magnesium Acetate Tetrahydrate Fisher Scientific BP215-500
Microfuge 18 Beckman Coulter 367160
MPEG-SVA MW-5000 Laysan Bio, Inc. NC0107576
Neutravadin Invitrogen PI31000
Nikon Ti-E inverted microscope Nikon N/A Nikon LuN4 Laser
Ni-NTA Resin Thermo Scientific 88221
Oligonucleotide - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA
GAACTTTCAAAGGC		 IDT N/A
Oligonucleotide - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA
ACTCAGAATAGGTG		 IDT N/A
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mm Beckman Coulter 343755
Optima-TLX Ultracentrifuge Beckman Coulter 361544
Paclitaxel (Taxol equivalent) Thermo Fisher Scientific P3456
PIPES ACROS Organics 172615000
PMSF Millipore 7110-5GM
Porcine Tubulin, biotin label Cytoskeleton, Inc. T333P
Porcine Tubulin, HiLyte 647 Fluor Cytoskeleton, Inc. TL670M far red labelled
Porcine Tubulin, Rhodamine Cytoskeleton, Inc. TL590M
Porcine Tubulin, Tubulin Protein Cytoskeleton, Inc. T240
Potassium Acetate Fisher Scientific BP364-500
Prime 95B sCMOS camera Photometric N/A
Quadrant Detector Sensor Head ThorLabs PDQ80A
Quikchange Lightning Kit Agilent Technologies 210518
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Square Cover Glasses Corning 12-553-450 18 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm
Streptavidin Microspheres Polysciences Inc. 24162-1
Superose-6 Column GE Healthcare 29-0915--96
TCEP Thermo Scientific 77720
TLA-100 Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter 343840
Ultrasonic Cleaner (Sonicator) Vevor JPS-08A(DD) 304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power
Vectabond APTES solution Vector Laboratories SP-1800-7
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-D S.C. Johnson SJN695237

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bentley, M., Banker, G. The cellular mechanisms that maintain neuronal polarity. Nature Reviews Neuroscience. 17 (10), 611-622 (2016).
  2. Yang, R., et al. A novel strategy to visualize vesicle-bound kinesins reveals the diversity of kinesin-mediated transport. Traffic. 20 (11), 851-866 (2019).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: Transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  4. Helmke, K. J., Heald, R., Wilbur, J. D. Interplay between spindle architecture and function. International Review of Cell and Molecular Biology. 306, (2013).
  5. Elting, M. W., Suresh, P., Dumont, S. The spindle: integrating architecture and mechanics across scales. Trends in Cell Biology. 28 (11), 896-910 (2018).
  6. Kapoor, T. Metaphase spindle assembly. Biology. 6 (1), 8 (2017).
  7. Svoboda, K., Block, S. M. Force and velocity measured for single kinesin molecules. Cell. 77 (5), 773-784 (1994).
  8. Svoboda, K., Schmidt, C. F., Schnapp, B. J., Block, S. M. Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry. Nature. 365 (6448), 721-727 (1993).
  9. Schnitzer, M. J., Visscher, K., Block, S. M. Force production by single kinesin motors. Nature Cell Biology. 2 (10), 718-723 (2000).
  10. Andreasson, J. O. L., Shastry, S., Hancock, W. O., Block, S. M. The mechanochemical cycle of mammalian kinesin-2 KIF3A/B under load. Current Biology. 25 (9), 1166-1175 (2015).
  11. Bensel, B. M. The mechanochemistry of the kinesin-2 kif3ac heterodimer is related to strain-dependent kinetic properties of kif3a and kif3c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15632-15641 (2020).
  12. Gilbert, S. P., Guzik-Lendrun, S., Rayment, I. Kinesin-2 motors: kinetics and biophysics. Journal of Biological Chemistry. 293 (12), 4510-4518 (2018).
  13. Okada, Y., Higuchi, H., Hirokawa, N. Processivity of the single-headed kinesin KIF1A through binding to tubulin. Nature. 424 (6948), 574-577 (2003).
  14. Budaitis, B. G., et al. Pathogenic mutations in the kinesin-3 motor KIF1A diminish force generation and movement through allosteric mechanisms. Journal of Cell Biology. 220 (4), 202004227 (2021).
  15. Tomishige, M., Klopfenstein, D. R., Vale, R. D. Conversion of Unc104/KIF1A kinesin into a processive motor after dimerization. Science. 297 (5590), 2263-2267 (2002).
  16. Siddiqui, N., et al. Force generation of KIF1C is impaired by pathogenic mutations. bioRxiv. , (2021).
  17. Valentine, M. T., Fordyce, P. M., Krzysiak, T. C., Gilbert, S. P., Block, S. M. Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro. Nature Cell Biology. 8 (5), 470-476 (2006).
  18. Valentine, M. T., Gilbert, S. P. To step or not to step? How biochemistry and mechanics influence processivity in Kinesin and Eg5. Current Opinion in Cell Biology. 19 (1), 75-81 (2007).
  19. Jannasch, A., Bormuth, V., Storch, M., Howard, J., Schäffer, E. Kinesin-8 is a low-force motor protein with a weakly bound slip state. Biophysical Journal. 104 (11), 2456-2464 (2013).
  20. Bormuth, V., Varga, V., Howard, J., Schäffer, E. Protein friction limits diffusive and directed movements of kinesin motors on microtubules. Science. 325 (5942), 870-873 (2009).
  21. Gennerich, A., Carter, A. P., Reck-Peterson, S. L., Vale, R. D. Force-induced bidirectional stepping of cytoplasmic dynein. Cell. 131 (5), 952-965 (2007).
  22. Mallik, R., Carter, B. C., Lex, S. A., King, S. J., Gross, S. P. Cytoplasmic dynein functions as a gear in response to load. Nature. 427 (6975), 649-652 (2004).
  23. Redwine, W. B., et al. The human cytoplasmic dynein interactome reveals novel activators of motility. eLife. 6, 28257 (2017).
  24. Belyy, V., Hendel, N. L., Chien, A., Yildiz, A. Cytoplasmic dynein transports cargos via load-sharing between the heads. Nature Communications. 5 (1), 5544 (2014).
  25. Belyy, V., et al. The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition. Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).
  26. Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
  27. Forth, S., Kapoor, T. M. The mechanics of microtubule networks in cell division. Journal of Cell Biology. 216 (6), 1525-1531 (2017).
  28. Dumont, S., Mitchison, T. J. Force and length in the mitotic spindle. Current Biology. 19 (17), 749-761 (2009).
  29. McIntosh, J. R., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I. Biophysics of mitosis. Quarterly Reviews of Biophysics. 45 (2), 147-207 (2012).
  30. McIntosh, J., Hays, T. A brief history of research on mitotic mechanisms. Biology. 5 (4), 55 (2016).
  31. Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. Mitotic functions of kinesin-5. Seminars in Cell and Developmental Biology. 21 (3), 255-259 (2010).
  32. Kapitein, L. C., et al. The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks. Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).
  33. Vukušić, K., Ponjavić, I., Buđa, R., Risteski, P., Tolić, I. M. Microtubule-sliding modules based on kinesins EG5 and PRC1-dependent KIF4A drive human spindle elongation. Developmental Cell. 56 (9), 1253-1267 (2021).
  34. Sturgill, E. G., Ohi, R. Kinesin-12 differentially affects spindle assembly depending on its microtubule substrate. Current Biology. 23 (14), 1280-1290 (2013).
  35. Drechsler, H., McHugh, T., Singleton, M. R., Carter, N. J., McAinsh, A. D. The Kinesin-12 Kif15 is a processive track-switching tetramer. eLife. 3, 01724 (2014).
  36. Tanenbaum, M. E., et al. Kif15 Cooperates with Eg5 to promote bipolar spindle assembly. Current Biology. 19 (20), 1703-1711 (2009).
  37. Mountain, V., et al. Cross-links microtubules in the mammalian mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 147 (2), 351-365 (1999).
  38. Norris, S. R., et al. Microtubule minus-end aster organization is driven by processive HSET-tubulin clusters. Nature Communications. 9 (1), 2659 (2018).
  39. Cai, S., Weaver, L. N., Ems-McClung, S. C., Walczak, C. E. Proper organization of microtubule minus ends is needed for midzone stability and cytokinesis. Current Biology. 20 (9), 880-885 (2010).
  40. Pamula, M. C., et al. High-resolution imaging reveals how the spindle midzone impacts chromosome movement. Journal of Cell Biology. 218 (8), 2529-2544 (2019).
  41. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  42. Zhu, C., Lau, E., Schwarzenbacher, R., Bossy-Wetzel, E., Jiang, W. Spatiotemporal control of spindle midzone formation by PRC1 in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6196-6201 (2006).
  43. Subramanian, R., et al. Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein. Cell. 142 (3), 433-443 (2010).
  44. Elting, M. W., Prakash, M., Udy, D. B., Dumont, S. Mapping load-bearing in the mammalian spindle reveals local kinetochore fiber anchorage that provides mechanical isolation and redundancy. Current Biology. 27 (14), 2112-2122 (2017).
  45. Fant, X., Merdes, A., Haren, L. Cell and molecular biology of spindle poles and NuMA. International Review of Cytology. 238, 1-57 (2004).
  46. Merdes, A., Heald, R., Samejima, K., Earnshaw, W. C., Cleveland, D. W. Formation of spindle poles by dynein/dynactin-dependent transport of NuMA). Journal of Cell Biology. 149 (4), 851-861 (2000).
  47. Maddox, P., Straight, A., Coughlin, P., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Direct observation of microtubule dynamics at kinetochores in Xenopus extract spindles: Implications for spindle mechanics. Journal of Cell Biology. 162 (3), 377-382 (2003).
  48. Maddox, P., Desai, A., Oegema, K., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Poleward microtubule flux is a major component of spindle dynamics and anaphase A in mitotic Drosophila embryos. Current Biology. 12 (19), 1670-1674 (2002).
  49. LaFountain, J. R., Cohan, C. S., Siegel, A. J., LaFountain, D. J. Direct visualization of microtubule flux during metaphase and anaphase in crane-fly spermatocytes. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5724-5732 (2004).
  50. Pavin, N., Tolić, I. M. Mechanobiology of the mitotic spindle. Developmental Cell. 56 (2), 192-201 (2021).
  51. Vukušić, K., Tolić, I. M. Anaphase B: Long-standing models meet new concepts. Seminars in Cell and Developmental Biology. 117, 127-139 (2021).
  52. Vukušić, K., et al. Microtubule sliding within the bridging fiber pushes kinetochore fibers apart to segregate chromosomes. Developmental Cell. 43 (1), 11-23 (2017).
  53. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  54. Gaska, I., Armstrong, M. E., Alfieri, A., Forth, S. The mitotic crosslinking protein PRC1 acts like a mechanical dashpot to resist microtubule sliding. Developmental Cell. 54 (3), 367-378 (2020).
  55. Woll, K. A., et al. An allosteric propofol-binding site in kinesin disrupts kinesin-mediated processive movement on microtubules. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11283-11295 (2018).
  56. Forth, S., Hsia, K. C., Shimamoto, Y., Kapoor, T. M. Asymmetric friction of nonmotor MAPs can lead to their directional motion in active microtubule networks. Cell. 157 (2), 420-432 (2014).
  57. Alfieri, A., Gaska, I., Forth, S. Two modes of PRC1-mediated mechanical resistance to kinesin-driven microtubule network disruption. Current Biology. 31 (12), 2495-2506 (2021).
  58. Koch, M. D., Shaevitz, J. W. Introduction to optical tweezers. Methods in Molecular Biology. 1486, 3-24 (2017).
  59. Sarshar, M., Wong, W. T., Anvari, B. Comparative study of methods to calibrate the stiffness of a single-beam gradient-force optical tweezers over various laser trapping powers. Journal of Biomedical Optics. 19 (11), 115001 (2014).
  60. Van Mameren, J., Wuite, G. J. L., Heller, I. Introduction to optical tweezers: Background, system designs, and commercial solutions. Methods in Molecular Biology. 783, 1-20 (2011).
  61. Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9, 51131 (2020).
  62. Reinemann, D. N., et al. Collective force regulation in anti-parallel microtubule gliding by dimeric Kif15 kinesin motors. Current Biology. 27 (18), 2810-2820 (2017).
  63. Reinemann, D. N., Norris, S. R., Ohi, R., Lang, M. J. Processive kinesin-14 HSET exhibits directional flexibility depending on motor traffic. Current Biology:CB. 28 (14), 2356-2362 (2018).
  64. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  65. SMART - Servier Medical ART. , Available from: https://smart.servier.com/ (2022).
  66. Gaska, I., Armstrong, M., Alfieri, A., Forth, S. The mitotic crosslinking protein PRC1 acts as a mechanical dashpot to resist microtubule sliding. Developmental Cell. 54 (3), 1-14 (2020).
  67. Janson, M. E., De Dood, M. E., Dogterom, M. Dynamic instability of microtubules is regulated by force. Journal of Cell Biology. 161 (6), 1029-1034 (2003).
  68. Kerssemakers, J. W. J., et al. Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution. Nature. 442 (7103), 709-712 (2006).
  69. Powers, A. F., et al. The Ndc80 kinetochore complex forms load-bearing attachments to dynamic microtubule tips via biased diffusion. Cell. 136 (5), 865-875 (2009).
  70. Akiyoshi, B., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
  71. Fong, K. K., et al. Direct measurement of the strength of microtubule attachment to yeast centrosomes. Molecular Biology of the Cell. 28 (14), 1853-1861 (2017).
  72. Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps. Biophysical Journal. 90 (5), 1687-1696 (2006).
  73. Memet, E., et al. Microtubules soften due to cross-sectional flattening. eLife. 7, 34695 (2018).

Tags

Биология выпуск 183 микротрубочки оптический захват митоз одна молекула веретено механика кинезин микротрубочки-ассоциированные белки флуоресцентная микроскопия
Непосредственное измерение сил в восстановленных активных пучках микротрубочек
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Palumbo, J., Tai, E., Forth, S.… More

Palumbo, J., Tai, E., Forth, S. Directly Measuring Forces Within Reconstituted Active Microtubule Bundles. J. Vis. Exp. (183), e63819, doi:10.3791/63819 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter