Summary
在这里，我们提出了一种在 体外 重建微管束并使用同时光学捕获和全内反射荧光显微镜直接量化施加在其中的力的方案。该测定允许对活性微管网络中蛋白质集合产生的力和位移进行纳米级测量。
Abstract
微管网络在细胞中用于完成广泛的任务，从充当囊泡运输的轨道到在有丝分裂期间作为专门的阵列来调节染色体分离。与微管相互作用的蛋白质包括驱动蛋白和动力蛋白等运动，它们可以产生主动力和方向运动，以及将细丝交联成高阶网络或调节细丝动力学的非运动蛋白。迄今为止，微管相关蛋白的生物物理研究主要集中在囊泡转运所需的单个运动蛋白的作用上，并且在阐明驱动蛋白和动力蛋白的力产生特性和机械化学调节方面取得了重大进展。然而，对于微管既充当货物又作为跟踪的过程，例如在有丝分裂纺锤体内的细丝滑动过程中，对所涉及的交联蛋白集合的生物物理调节知之甚少。在这里，我们详细介绍了我们直接探测从纯化的微管和有丝分裂蛋白重建的交联微管最小网络中的力产生和响应的方法。微管对由感兴趣的蛋白质交联，一个微管固定在显微镜盖玻片上，第二个微管由光学陷阱操纵。同时全内反射荧光显微镜允许在细丝滑开以产生力时对该微管网络的所有组件进行多通道可视化。我们还演示了如何使用这些技术来探测驱动蛋白-5集合施加的推动力，以及有丝分裂MAP PRC1交联的滑动微管对之间如何产生粘性制动力。这些测定提供了对纺锤体组装和功能的机制的见解，并且可以更广泛地适用于在不同情况下研究致密微管网络力学，例如神经元和极性上皮细胞的轴突和树突。
Introduction
细胞利用微管网络执行各种机械任务，从囊泡转运1，2，3到有丝分裂期间的染色体分离4，5，6。许多与微管相互作用的蛋白质，如分子运动蛋白驱动蛋白和动力蛋白，会产生力并受到机械载荷的调节。为了更好地了解这些关键分子的功能，研究人员采用了单分子生物物理方法，如光学捕获和TIRF显微镜，直接监测关键参数，如单个蛋白质的卸载步进速率，合成能力和力-速度关系。最常用的实验几何形状是将运动蛋白直接附着在捕获磁珠上，其球形几何形状和大小模仿经历运动驱动运输的囊泡。许多驱动蛋白，包括驱动蛋白-17，8，9，驱动蛋白-2 10，11，12，驱动蛋白-3 13，14，15，16 驱动蛋白-5 17，18，驱动蛋白-8 19，20，以及动力蛋白和动力蛋白复合物21，22，23，24，25，已经用这些方法进行了研究。
然而，在许多细胞过程中，运动蛋白和非运动蛋白使用微管作为轨道和货物26，27。此外，在这些微管细丝交联成高阶束的情况下，这些蛋白质作为集合而不是单个单元起作用。例如，在分裂的体细胞内，致密的细丝网络自组织以构建有丝分裂纺锤体装置28、29、30。极间主轴微管网络是高度动态的，主要排列为负端指向主轴两极，正端在主轴赤道附近重叠。纺锤体内的细丝由驱动蛋白（例如驱动蛋白-5 31，32，33、驱动蛋白-12 34，35，36 和驱动蛋白-14 37，38，39）或非运动蛋白（例如PRC1 40，41，42，43或NuMA44，45）交联，46.它们在极向通量或中期协调染色体居中或后期47，48，49，50，51，52期间的染色体分离等过程中经常移动或经历机械应力。因此，微米级纺锤体装置通过有丝分裂的完整性依赖于由该相互作用的细丝网络产生和维持的推拉力的精心调节平衡。然而，探测这种机械调节并解释蛋白质集合如何协同工作以协调微管运动并产生正确组装纺锤体所需的力所需的工具最近才被开发出来，我们才刚刚开始了解定义动态微管网络的生物物理规则。
本手稿的目的是展示在 体外重建交联微管对所需的步骤，将这些束固定在显微镜室中，允许同时对微管和交联蛋白进行荧光可视化以及纳米级力测量，并稳健地处理这些数据。我们详细介绍了稳定聚合荧光标记微管所需的步骤，准备用于附着的显微镜盖玻片，制备用于光学捕获实验的聚苯乙烯珠，以及组装交联长丝网络以保持其 体内 功能，同时允许直接生物物理操作。
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Protocol
1. 微管的制备
注意：当使用GFP标记的交联蛋白时，微管的红色（例如，罗丹明）和远红色（例如，生物素化的HiLyte647，在文本的其余部分中称为生物素化的远红色）有机荧光团标记效果很好。通过使用高质量的四波段全内反射荧光（TIRF）滤光片，可以在成像过程中实现所有三个通道之间的最小串扰。
- 制备GMPCPP微管种子原液
- 将 1 mg 未标记的冻干微管蛋白悬浮在 84 μL 冰冷的 1x BRB80（80 mM PIPES、1 mM MgCl2、1 mM EGTA;pH 6.8）中，在使用前加入 DTT 至终浓度 1 mM。将 60 μg 荧光团标记的冻干微管蛋白悬浮在 6 μL 具有 1 mM DTT 的冷 1x BRB80 中。将 60 μg 生物素标记的冻干微管蛋白悬浮在 6 μL 冷 1x BRB80 和 1 mM DTT 中。
- 要制备标记比例为 1：10 的非生物素化罗丹明标记的微管蛋白种子原液，请将 84 μL 未标记的微管蛋白、6 μL 荧光团标记的微管蛋白和 10 μL 10 mM GMPCPP 储备溶液加入 0.5 mL 管中。轻轻移液混合均匀，并保持在冰上。
注意：GMPCPP聚合是这些测定的首选，因为与用GTP聚合或省略紫杉醇相比，微管更稳定并且易于用光学陷阱直接操作。 - 要制备荧光标记比例为 1：10 的生物素化远红标记微管蛋白种子原液，请在 0.5 mL 管中加入 80 μL 未标记的微管蛋白、6 μL 荧光团标记的微管蛋白、4 μL 生物素标记的微管蛋白和 10 μL 10 mM GMPCPP 储备溶液。轻轻移液混合均匀，并保持在冰上。将种子在冰上孵育5分钟。
- 将微管蛋白溶液转移到适合高速离心的聚碳酸酯管中。将种子原液在2°C下以~350，000× g 离心5分钟，以防止微管聚合并回收上清液以等分试样。该阶段微管蛋白的最终估计浓度为~50μM。
- 使用 0.2 mL PCR 管制备 2 μL 等分试样的种子原液，并用液氮快速冷冻。等分试样可在-80°C下储存长达6个月。
- 微管聚合
- 准备 500 μL 的 1x BRB80 并放在冰上。将生物素化的远红和非生物素化的罗丹明种子原液各放在冰上解冻。
- 将种子在冰上孵育5分钟。在孵育期结束时，立即向每个试管中加入 26 μL 的 1x BRB80。如果需要更长的微管，将BRB80的体积增加5-10μL，而对于较短的微管，将聚合体积减少5μL。
- 将微管种子储备液在37°C的水浴中孵育1小时。将 298.5 μL 室温 1x BRB80 和 1.5 μL 4 mM 紫杉醇储备溶液混合，制成 20 μM 紫杉醇溶液。准备 300 μL 的 1x BRB80，并将两个试管保持在室温下。
- 将适当的高速转子加热至30°C。 这可以在设置为30°C的台式超速离心机中完成。 从水浴中取出微管，并在室温下在工作台上保持10-15分钟。
- 微管的澄清
- 向微管生长溶液中加入 100 μL 室温 1x BRB80，并通过轻弹试管 ~10 次或轻轻移液混合。将微管生长溶液转移到聚碳酸酯离心管中。
- 标记聚碳酸酯管的一侧，相对于离心机的旋转，该侧将朝外。这将有助于定位微管颗粒，由于材料体积小，微管颗粒几乎不可见。
- 在30°C下以~350，000× g 离心微管溶液10分钟。 离心后，如果可能，检查装有微管的管是否有沉淀。小心地取出除最后几微升液体以外的所有液体，不要干扰沉淀。如果颗粒不清晰可见，请使用标记作为指南，以避免干扰颗粒所在的区域。
- 立即向微管管中加入 100 μL 1x BRB80 + 20 μM 紫杉醇。这可以直接添加到颗粒上;在此阶段，颗粒的破坏不会显着影响澄清过程。
- 再次以~350，000× g 离心微管10分钟，注意确保管的标记部分相对于离心机的旋转再次向外定向。
- 像以前一样取出除几微升以外的所有溶液，再次小心避免破坏微管沉淀。重复步骤 1.3.4.-1.3.5。然后将微管沉淀重悬于20-50μL的1x BRB80 + 20μM紫杉醇中。
- 通过移取大部分重悬体积并将其直接轻轻喷射到沉淀上来重悬，重复 20-30 次或直到沉淀完全重悬。这应该小心完成，以免因过度剧烈的移液而剪切微管。切割移液器吸头以增加开口的大小也有助于减少微管剪切。
- 将微管在室温下储存，方法是将试管包裹在箔纸中，以保护荧光团免受光照并保持在工作台上。微管通常在澄清后可以使用2-3天。
- 通过显微镜评估微管
- 通过混合 1 μL 微管和 9 μL 室温 1x BRB80，制备 1：10 稀释的澄清微管溶液。通过将 10 μL 移液到显微镜载玻片上，然后将盖玻片放在液滴上以形成南瓜，立即对该溶液进行成像。
- 确保在使用荧光显微镜和聚焦在与微管稀释液接触的盖玻片表面的100倍物镜上可视化时，在高密度下长度为8-25μm的微管（每个全视场在密集网状中分层数百个）是可见的。
2. 钝化盖玻片的制备
- 清洗盖玻片
- 将 18 mm x 18 mm 盖玻片放入非反应性塑料架中，然后将每个盖玻片放入 100 mL 烧杯中。在机架中的每个插槽中放置一个盖玻片，因为需要清洁盖玻片的两侧。
- 使用浴超声仪超声处理5分钟，按照每个超声循环给定的顺序使用以下50mL溶液：（1）去离子水（电阻率为18.3MΩ-cm），（2）2%Micro-90溶液，（3）去离子水，（4）新鲜制备的0.1M KOH，（5）去离子水（图1A）。确保盖玻片完全被液体覆盖。在超声循环之间，用镊子将盖玻片架在去离子水中上下浸泡 10-20 倍，更换水，然后重复冲洗过程 2 倍，用去离子水冲洗每个盖玻片架。
- 用水冲洗盖玻片 3 次，然后用 100% 乙醇重新填充烧杯并将架子放回烧杯。将烧杯移入通风橱，并铺上足够的纸巾，为所有盖玻片架腾出空间。然后，用镊子取下架子并放在纸巾上。
- 使用干燥的氮气流，从盖玻片及其架子上吹出乙醇，直到干燥。处理烧杯中剩余的乙醇，并使用干燥的氮气流同样干燥它们（图1A）。
- 盖玻片上的氨基硅烷表面官能化
- 将 40 mL 丙酮和 400 μL APTES 试剂加入 50 mL 锥形管中，密闭盖住，倒置 10 倍混合，制备 （3-氨丙基）噻乙氧基硅烷 （APTES） 试剂溶液。
- 将一排盖玻片移动到相应的干烧杯中，然后完全浸没在APTES溶液中。孵育5分钟（图1A）。将APTES处理的架子移到新的干烧杯中，然后将新架子移入APTES中孵育5米。
- 按照步骤2.1.2.所述将架子浸泡10-20倍，更换水5倍，用去离子水冲洗处理过的架子。重复直到所有盖玻片都经过处理和清洗。
- 氨基硅烷表面的聚乙二醇化
- 制备两种PEG溶液，一种是~100 μL，含25%w/v peg，另一种是~10 μL含10%w/v生物素-PEG，均悬浮在新制备的0.1 M NaHCO3中，足以涂覆24张盖玻片。一旦加入0.1M NaHCO 3，将25%PEG溶液以3 ，000 x g 离心20秒以完全溶解PEG;解决方案可能仍然多云。通过轻柔移液混合生物素-PEG（图1B）。
- 制备 PEG 和生物素-PEG 溶液的混合物，将 33.3 倍体积的 PEG 与 1 体积的生物素-PEG 溶液（例如，100 μL PEG 溶液和 3 μL 生物素-PEG 溶液）。
- 在通风橱中，摆放几张无菌和不起毛的湿巾。将盖玻片架移到湿巾上，然后像以前一样用干燥的氮气流吹干。在几张新的干纸巾上，将现在已经完全干燥的盖玻片成对排列，并在右下角用不对称符号（如“b”）标记每个盖玻片。该标记将与盖玻片的样品表面相对，并且不会干扰实验（图1B）。
- 用镊子翻转每对盖玻片中的一张盖玻片。在每个翻转的盖玻片上，放置 6 μL PEG/生物素-PEG 混合物，并将第二个盖玻片放在顶部，使两个“b”标签朝外。
- 对齐盖玻片边缘，并放入加湿和密封的房间以防止干燥。将盖玻片在室温下在湿度室中孵育3小时。
- 孵育后，从湿度室中取出盖玻片，小心地分离盖玻片对，然后将它们放回架子中。像以前一样用去离子水清洗每个架子，用镊子浸泡架子 10-20 倍，总共更换 5 倍的水。
- 将盖玻片的所有聚乙二醇化面朝同一方向放置，这样就不会有两个聚乙二醇化盖玻片表面彼此面对。聚乙二醇化的表面在完全干燥之前会非常粘，因此要格外小心，以防止盖玻片接触。像以前一样使用干燥的氮气流干燥每个架子和盖玻片（图1B）。
- 盖玻片及其架子完全干燥后，存放在真空干燥器中，以防止表面涂层降解。在真空和干燥剂下妥善储存，以防止水分破坏PEG涂层;盖玻片可以使用约1周。
3. 驱动蛋白包被磁珠的制备
- 严谨性驱动蛋白构建体的选择与制备
- 根据公布的方案表达和纯化严格的驱动蛋白构建体53，54。快速冷冻 5 μL 等分试样的 0.02 mg/mL 驱动蛋白溶液，并在 -80 °C 下储存长达 1 年。
注意：严谨的驱动蛋白具有G234A点突变，可阻止ATP水解。当与微珠偶联时，与微管的高亲和力相互作用使微球能够维持10-20pN的负载几分钟。常用的驱动蛋白-1同源二聚体K56053 和进一步优化的K439构建体55 的严格突变版本也已在这些测定中成功使用54。这种改进的K439构建体包含一个EB1二聚化结构域以增强稳定性，以及一个C末端6-He标签，用于与6-He抗体特异性结合，如下所述。
- 根据公布的方案表达和纯化严格的驱动蛋白构建体53，54。快速冷冻 5 μL 等分试样的 0.02 mg/mL 驱动蛋白溶液，并在 -80 °C 下储存长达 1 年。
- 将6-His抗体与链霉亲和素包被的磁珠结合
- 将 50 μL 直径为 1 μm 的链霉亲和素包被的聚苯乙烯珠加入 0.5 mL 离心管中。超声处理30秒。
- 将 10 μL 的 200 mM DTT 添加到 790 μL 的 1x BRB80 中。将 10 μL 超声处理珠加入 40 μL 的 1x BRB80 + 2.5 mM DTT 缓冲液中。
- 混合 1 μL 生物素化的 6-His 抗体和 49 μL 的 1x BRB80 + 2.5 mM DTT;短暂涡旋混合。
- 将 50 μL 稀释微球混合物和 50 μL 抗体稀释液合并到新试管中。将管置于4°C的管旋转器中并旋转1小时。在4°C下以3，000× g 旋转珠子混合物10分钟。
- 移取上清液并将沉淀重悬于 100 μL 2 mg/mL 酪蛋白溶液中的 1x BRB80 中。重复此离心并重悬2次。
- 添加严谨的驱动蛋白
- 将最终沉淀重悬于 100 μL 2 mg/mL 酪蛋白溶液中。在 0.5 mL 离心管中，混合 5 μL 0.02 mg/mL 严谨性驱动蛋白和 5 μL 磁珠，轻轻轻弹试管 ~10x，轻轻混合。
- 不使用时，将K439 G234A珠悬浮液和转子上剩余的6-He磁珠保持在4°C。珠子必须新鲜制备并在同一天用于实验，因为它们往往会结块并失去活性超过这段时间。
4. 显微镜室的组装
- 载玻片的制备和腔室结构
- 首先用超纯水冲洗75 mm x 25 mm显微镜载玻片，然后用无条纹氨-d玻璃清洁剂冲洗，然后再次用超纯水冲洗。摇晃以去除多余的水滴。使用氮气流干燥载玻片，使其没有条纹残留，然后将载玻片放在纸巾上（图2A）。
- 用剪刀将双面胶带切成~2-3毫米x 2.5厘米的条状（每个单室2条，每个双室3条）。
- 使用镊子，将两条胶带放在一个载玻片上，以便在它们之间有~0.5厘米的空间以构建一个腔室。对于双腔室，使用相同的间距，但使用三条胶带（图2B）。使用这种方法的样品通道体积约为10 μL。
注意：腔室越宽，溶液流入时形成气泡的可能性就越大;然而，由于成像面积减小，小于 0.5 cm 宽的腔室使用起来可能具有挑战性。 - 使用镊子刮过每条胶带的长度，使胶带牢固地粘附在载玻片上。
- 释放干燥器的压力，用镊子从存储架上取出一个生物素化的盖玻片。使用镊子将一个生物素化的盖玻片放在载玻片的顶部。确保生物素化的一面朝内，朝向载玻片。
- 使用镊子的平坦后端，轻轻按压盖玻片接触胶带的玻璃，以牢固地密封腔室。必须使用轻压以确保盖玻片不会破裂（图2C）。
- 将完成的显微镜室存放在密封容器中，远离直射光，直到使用（图2D）。
注意：建议在制造腔室的同一天使用腔室，因为生物素化的盖玻片在暴露在空气中时会降解。
- 显微镜试剂的流入
- 通过在空移液器吸头盒的底部放置一个折叠起来的无绒纸巾，用超纯水润湿来构建湿度室。样品室应在流入步骤之间保存在该盒子中，以减少溶液从通道中蒸发。
- 通过在通道的一端移液液体并在另一端吸出液体来引入所有试剂。吸芯吸芯，扭转组织的一端并将其轻轻放置在腔室的出口侧，允许毛细管作用以均匀分布试剂（图3A）。在流入之前将所有试剂置于室温，以防止微管解聚。
- 使用 20 μL 倾斜移液器吸头使其接触一个腔室的入口侧，缓慢流入 10 μL 0.5 mg/mL 链霉亲和素或中性粒细胞亲和素。使用较小的移液器吸头和缓慢、恒定的试剂流入，以减少在腔室中获得气泡的可能性（图 3B）。
- 将载玻片在湿度室中孵育4分钟，室的盖玻片侧朝下。这种取向将允许较大的物体，如微管或珠子，在聚乙二醇化表面附近下沉。
- 使用 20 μL 的 1x BRB80 冲洗腔室，使用不起毛的纸巾抽出液体。如果腔室中存在泄漏，请丢弃载玻片并从另一张载玻片开始;腔室中出现的小气泡不会对成像产生不利影响。
- 用 10 μL 0.5 mg/mL 酪蛋白封闭溶液重复流入、孵育和冲洗步骤（图 3C）。稀释生物素化的远红微管~1：20，并将10μL流入腔室。孵育 5 分钟，并用 20 μL 的 1x BRB80 冲洗腔室（图 3D）。这些微管在100μm x 100μm成像视野内的最佳密度应为10-20;并且应调整此阶段的稀释度以达到此表面结合比例。
- 用 10 μL 适当浓度（通常为 1-10 nM）交联运动蛋白或待研究的非运动蛋白重复流入、孵育和冲洗步骤（图 3E）。
- 将 10 μL 罗丹明微管稀释至与先前生物素化的远红微管相似的浓度。重复孵育和冲洗步骤（图3F）。
- 将 1 μL 严谨的驱动蛋白包被微球和 19 μL 针对交联蛋白活性优化的反应缓冲液混合。例如，为了分析驱动蛋白-5活性，使用反应缓冲液和1 mM TCEP键断裂剂，0.2 mg/mLα酪蛋白，70 mM KCl，除氧系统（4.5 mg/mL葡萄糖，350单位/mL葡萄糖氧化酶，34单位/mL过氧化氢酶），1 mM DTT和ATP，在1x BRB80中以所需浓度（例如，1 mM表示最大驱动蛋白速度条件）（图3G）).对于非运动蛋白的分析，省略ATP并改变KCl的浓度以调节这些测定中的蛋白质 - 微管相互作用强度。
- 用透明的指甲油密封腔室的两边缘，并等待抛光剂干燥后再成像（图3H）。成功建造的腔室将不存在泄漏和最小的气泡。
5. 具有 3 色 TIRF 的成像微管束
- 采用具有TIRF成像功能的倒置显微镜仪器，并在其中构建了单光束光学陷阱（图4）。
注意：对于此处描述的研究，倒置显微镜与100x/NA1.49油物镜，TIRF模块和三个488 nm，561 nm和640 nm的激光器分别用于GFP标记的蛋白质，罗丹明标记的微管和生物素化的远红色标记微管。- 在样品室的盖玻片上加入一滴浸油。过多的油可能会损坏显微镜物镜。样品室的盖玻片面朝下，将要成像的样品放在显微镜平台上。
- 慢慢抬起物镜，使盖玻片和物镜之间通过油接触。调整物镜高度，使样品室的盖玻片表面聚焦。
- 在所有三个通道中记录样品的单帧图像。对于此处的实验，使用100-200毫秒的曝光作为所有三个通道的最佳成像持续时间;较长的曝光时间可能导致光漂白增加。
- 调整激光功率以从样品中获得良好的信噪比，同时在测定单个束时在2-5分钟内最大限度地减少光漂白。对于此处使用的激光器（图4和图 5），GFP通道使用 5 mW的激光功率，两个微管通道的激光功率为3 mW作为最佳选择。
注意：成功组装的束应由远红色通道中的一个表面固定微管、具有显着 GFP 蛋白信号的几微米共宽区域以及重叠这些区域的罗丹明微管组成，然后从束延伸几微米（图 5B、C 和 图 6).罗丹明微管的实时成像应显示非交联微管末端的细微波动，表明该细丝未附着在腔室中的表面或其他蛋白质上。 - 观察每个视野的微管束的频率。对于成功制备的样品，每个腔室每 100 μL x 100 μL 视场中应存在大约 3-4 个微管束。
6. 对微管束进行光学陷阱实验
- 条件的实验前校准
- 为了进行这些实验，请使用刚度为0.05-0.1 pN / nm的单光束光学陷阱。通过分别在物镜下方和聚光镜上方引入短通滤光片，将捕获光学元件和位置敏感光电探测器集成到具有TIRF功能的倒置显微镜中（图4）。
- 此外，添加样品所在的纳米定位平台，以允许用户在这些测定过程中以受控方式以纳米级精度移动微管。这里用于获取代表性数据的系统已在已发表的著作27，53，54，56，57中描述。
注意：虽然超出了本协议的范围，但有多种资源可用，详细说明单光束光学陷阱58，59，60的构造和校准。 - 使用明场或DIC通道以及显微镜上的100倍物镜观察样品中珠子的密度。仅使用明场显微镜来识别和操作磁珠，而不能同时记录荧光图像采集。将磁珠平均间隔至少为10μm，并确保它们不受任何类型的表面限制或附着，并且不会相互附着或以其他方式聚集。
- 确保生物素化的远红色微管牢固地附着在盖玻片的表面上，没有可见的布朗运动，例如沿微管轴的运动或微管的自由端在溶液中波动。
- 确保罗丹明微管通过交联MAP连接到生物素化的微管上，并且在其自由端明显波动。非生物素化微管的表面附着通常表明聚乙二醇化可能不成功或PEG涂层已降解。
- 电机驱动微管滑动测量
- 按照公布的方案表达和纯化感兴趣的运动蛋白。例如，全长GFP标记的驱动蛋白-5蛋白已成功纯化并用于这些测定53，61，以及未标记的驱动蛋白-12 62和驱动蛋白-14 63。组装和可视化运动蛋白交联束，如上述步骤4和5中所述。
- 用光学陷阱捕获溶液中表现出布朗运动的游离单个珠子。根据需要调整陷印光学元件，将磁珠移动到视野中间。确保来自捕获光束的反射干涉图案是对称的，并调整捕获光学器件以解决任何光束不对称问题。
- 移动样品台，使束内罗丹明微管的自由端直接位于磁珠下方，并且磁珠距离含有交联蛋白的重叠区域几微米，以最大限度地减少捕获束诱导的光漂白。降低Z轴上的珠子，直到它与微管碰撞。注意轻轻降低珠子，不要将珠子推到盖玻片表面，因为这会导致粘附在盖玻片表面。
- 短暂关闭陷阱，用明场通道观察附着在滑动微管上的珠子的运动性。在进行运动蛋白测定时，附着的磁珠将随着微管滑动而定向移动。重新激活陷阱并再次捕获珠子。
- 使用上述步骤5中优化的激光功率和曝光时间，以每秒1-2帧的速率开始在三个（488 nm，561 nm，640 nm）通道中记录荧光数据。
- 使用捕获计算机软件，记录来自位置敏感光电探测器（X，Y和SUM强度信号），纳米定位平台（X，Y和Z坐标）和TIRF相机快门状态的电压数据。根据实验要求，使用由适当软件（如自定义编写的LabView代码）控制的专用电压输入数据采集板，以1-10 kHz的速率开始对这些陷阱电压值进行数字化。
- 在获取数据时监控力信号，并密切注意任何可能干扰成功数据收集的异常情况。
注意：异常包括但不限于（1）其他珠子移动到陷阱中，（2）珠子过早逃离陷阱，以及（3）力突然骤降，随后无法重新对陷阱发起力，表明磁珠表面的严谨驱动蛋白分子存在问题。 - 测量后，停用陷阱以释放磁珠并用新珠子和新微管重复，直到达到所需的实验重复次数。
- 被动交联电阻测量
- 按照公布的方案表达和纯化感兴趣的非运动交联蛋白。例如，全长GFP标记的PRC143，54，57和二聚体NuMA截短构建体56已成功用于这些测定。按照上述步骤4和5中所述组装和可视化交联束。
- 确定一个合适的微管束，该微管束仅包含两个微管，一个具有全表面附着的生物素化，另一个非生物素化的微管在溶液中部分游离;这提供了连接磁珠的自由端，并保证磁珠不附着在表面结合的微管上，并且在X轴或Y轴上对齐，使得载物台运动仅沿一个轴。
- 使用光学陷阱捕获经历布朗运动的自由珠子。一旦磁珠被捕获，小心地将磁珠移动到选定的微管束上，确保在此过程中没有其他磁珠被拉入陷阱。确保磁珠距离含有交联蛋白的重叠区域几微米，以尽量减少GFP标签的光漂白。
- 小心地降低Z轴上的珠子，直到它与罗丹明微管的自由段的边缘接触。轻轻向上拉并垂直于微管轴移动，通过观察罗丹明微管弯曲并跟随珠子位置来检查附着。如果未附着，则重复珠子在微管上的轻轻撞击，直到附着。
- 通过移动纳米定位平台，沿着表面附着微管的微管轴小心地重新对齐罗丹明微管，并设置自动拉动微管束的参数。沿微管平行轴设置方向，根据重叠长度设置所需的拉动速度（25-200 nm / s是有用的速度范围）和所需的拉力时间（约30 s至2分钟）。
- 开始以每秒1-2帧的速度在三个（488 nm，561 nm，640 nm）通道中记录荧光数据。使用上述步骤5中优化的激光功率和曝光时间。
- 启动自动载物台运动，并记录来自位置敏感探测器、载物台和 TIRF 相机状态的捕获数据。监测可能干扰数据收集的任何因素，包括但不限于（1）另一个珠子进入陷阱，（2）微管交联过早丢失，或（3）磁珠从罗丹明微管中脱离。
- 停用陷阱以释放珠子并根据需要重复实验。典型的样品室可以使用约30分钟，然后束降解并发生蛋白质活性损失。
注意：降解效果因使用的交联剂而异，但可以表现为在微管或表面上形成静态点，微管波动的丧失表明非特异性结合，或无法稳定地将珠子附着到微管上。
7. 数据分析和荧光图像与光学陷阱记录的相关性
注意：为了优化数据收集，最好使用两个独立的计算机控制系统：一个用于光学捕获软件，另一个用于荧光成像。此设置允许在两种实验模式下进行高速数据采集，并消除了在操作执行中引入数据的纳秒和微秒延迟，这些延迟在使用单个CPU时可能出现。
- 以针对所采用的电机或非运动交联蛋白及其预期的步进速率（例如，通常在 1-10 kHz 之间）优化的速率数字化光学捕获数据。
- 使用专用软件记录来自位置敏感光电探测器的 X、Y 和 SUM 电压信号，以及纳米定位平台的 X、Y 和 Z 位置数据，用于控制光阱并对来自这些组件的数字电压信号进行采样。
- 使用光学捕获数据采集板上的附加电压输入通道记录来自相机的快门打开状态数字信号。这允许荧光成像数据与光学捕获时间轨迹相关联。在开始成像之前，使用光学陷阱开始数据收集，以便正确记录来自第一帧的相机信号。
- 根据需要，使用适当的滤波方法（如滑动窗口、中值滤波器或高斯滤波器）对以高采样率采集的原始时间序列数据求平均值。
- 使用诸如线扫描分析的方法量化荧光图像时间序列数据，其中沿微管区域的长度计算像素强度值。从这些线扫描轨迹中，识别微管边缘，从而识别重叠区域。此外，使用交联剂蛋白质通道的荧光强度来计算蛋白质定位、浓度和密度。
- 力和图像数据的相关性是该实验系统的基本输出。例如，选择并平均给定相机曝光区域内的所有力数据点（由相机通道中相应的数字信号尖峰指示），以直接与相应的荧光图像帧进行比较。随后，提取力大小与交联蛋白数量、重叠长度或交联剂分布之间的关系。
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Representative Results
如果满足几个关键标准，则认为制备适合生物物理分析的微管束是成功的。首先，三种颜色的成像应显示两个排列的微管，其中交联蛋白的浓度优先装饰重叠区域（图5B，C和图6B）。理想情况下，罗丹明微管的重叠边缘和自由端之间的距离应至少为5μm，以便在捕获束和荧光标记的蛋白质之间提供足够的物理空间。其次，在缺乏生物素化的远红微管的区域应该有最小的背景荧光信号，特别是来自标记交联蛋白的同一通道。高背景荧光表明盖玻片钝化不良和高浓度的玻璃结合蛋白，这些蛋白可能与微管或捕获珠非特异性相互作用。此外，在任一微管成像通道中观察到的小圆形点或短片段的存在表明微管聚合和澄清不成功，或者微管老化或受损。
第三，用于捕获的珠子应显示为单个珠子，而不是在包含许多珠子的团块中。一小部分珠子可能会不可逆地粘附在表面上，但当单个颗粒在样品室中扩散时，应观察到相当一部分。在流入腔室之前对磁珠进行超声处理至少 10 分钟，通常可以缓解过度结块。第四，将磁珠附着在微管上应该导致良好的附着，当捕获激光关闭时，珠子保持结合。当珠子与表面接触时，不应非特异性地粘附，并且一旦珠子附着在微管上，就可以在测量前轻轻操作（例如，弯曲或弯曲）灯丝。最后，当施加力或允许运动活动进行时，应该可以观察到重叠长度的变化。例如，如果观察运动蛋白驱动的滑动，则重叠长度应以与运动蛋白步进速率一致的速率减小。如果检查钝化交联剂，施加力应导致重叠长度的变化。这些输出表明罗丹明微管仅通过交联蛋白附着在表面结合的微管上，而不是非特异性地粘附在盖玻片表面。
当所有标准都满足时，就可以进行广泛的实验来提取定义集成力学的基本生物物理参数。在以前的研究中，该测定或类似测定已被广泛用于检查有丝分裂交联蛋白。例如，我们已经证明，必需有丝分裂运动蛋白驱动蛋白-5的集合可以通过产生与重叠长度64 线性缩放的推动力和制动力来调节微管滑动（图5）。反平行或平行几何形状的微管由驱动蛋白-5分子的小集合交联。当这些运动蛋白走向微管正端时，细丝要么滑开（反平行），要么来回快速波动（平行）。通过监测这种微型主轴几何形状内的力学，我们发现力的大小与灯丝重叠的长度以及交联运动蛋白的数量成比例。当微管以比驱动蛋白-5的卸载步进速率快的速度移动时，运动蛋白提供了阻力制动力。还发现C端尾域是有效交联和力产生所必需的61 （图5B，C）。全长蛋白质能够产生持续的力，当所有运动蛋白达到其各自的失速力时，该力就会停滞不前（图5D）。然而，没有C端尾部的驱动蛋白-5电机产生的最大力小了近五倍（图5E，F）。总之，这些结果揭示了驱动蛋白-5蛋白如何在纺锤体组装过程中协同工作，将微管推向极地，并阐明分子内基本调节蛋白结构域的生物物理功能。
我们还证明，非运动有丝分裂蛋白PRC1的集合作为机械仪表板运行，以抵抗微管在后期纺锤体中间区域54中的滑动（图6A-C）。PRC1产生的摩擦阻力随拉速线性缩放，就像机械仪表盘产生与速度相关的阻力一样。这些电阻力不取决于微管对之间重叠区域的长度或局部交联剂密度，但它们确实强烈依赖于参与的PRC1分子的总浓度（图6D，E）。从这些结果中，提出PRC1集合充当泄漏活塞，其中扩散交联剂的压缩产生速度依赖性阻力，但微管正端交联剂的损失减轻了较大的压缩力。
类似的测定几何形状也用于检查有丝分裂驱动蛋白-12蛋白Kif1562。通过测量微管被推开时产生的力，Reinemann等人62 发现Kif15集合可以将细丝推开到临界平台力，并且需要蛋白质的C端尾系区域才能有效地交联微管并建立持续的负荷。Reinemann等人还优雅地证明了驱动蛋白-14 HSET，一种负端定向驱动蛋白，同样可以滑开反平行微管63。当与等量的加端定向驱动蛋白-5 Eg5蛋白混合时，HSET用于抑制Eg5滑动活动，参与重叠区域内微管滑动运动的拉锯战。总之，这些结果都证明了跨活性微管束的直接力测量的力量，并明确了在生物学上适当的网络几何中表征蛋白质功能的必要性。
图 1：玻璃盖玻片的钝化。 （A） 描述用于氨基硅烷共轭的 1.5 号玻璃盖玻片的顺序洗涤步骤、干燥和共轭的示意图。（B）描述将PEG和生物素-PEG基团共价连接到玻璃盖玻片，洗涤和干燥以及在真空下密封盖玻片以进行短期储存的方案的示意图。原理图的某些部分是65的修改图像。请点击此处查看此图的大图。
图 2：样品室的组装。 （A） 使用钝化盖玻片和显微镜载玻片中的标准 3 组装样品流动室的示意图。（B）单通道和双通道流动室的组装和典型尺寸，这些流动室针对微管束的光学捕获和荧光成像进行了优化。原理图的某些部分是65的修改图像。请点击此处查看此图的大图。
图 3：用于光学捕获和基于 TIRF 的成像的表面固定化微管束的生成。 示意图描述了光学捕获微管束的逐步组装。（A）试剂从腔室的入口流入，液体从出口通道排出。（B）链霉亲和素（蓝色）首先与盖玻片上的生物素-PEG位点结合，（C）酪蛋白（红色）作为额外的封闭剂被引入。（D）引入生物素化的远红标记微管（洋红色）并孵育~5分钟，然后加入（E）交联蛋白（绿色），（F）非生物素化罗丹明标记的微管（红色），最后，（G）严格的驱动蛋白包被微球悬浮在适当的反应缓冲液中，以附着在束上和基于光学陷阱的操作。（H）用透明指甲油密封腔室，以防止实验过程中样品缓冲液蒸发。原理图的某些部分是 65的修改图像。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：光学镊子/TIRF 显微镜系统的示意图。 在倒置显微镜内，将单光束光学陷阱引入基于物镜的TIRF成像系统的光路中。插入物镜正下方的短通滤光片允许捕获光束被引导到物镜的后孔径中，在那里它将聚焦在样品盖玻片表面上方，形成光学陷阱。位置敏感光电探测器将收集透射光，从而可以对磁珠进行位置和力检测。可以通过TIRF成像采集多个通道的荧光数据，并将其记录在高灵敏度EMCCD或sCMOS相机上。在实验设置期间，广谱光源用于对捕获珠子进行成像。 请点击此处查看此图的大图。
图5：通过驱动蛋白-5测量力产生的代表性示例。 （A）描述实验几何形状的示意图，显示由驱动蛋白-5运动蛋白交联的微管，这些微管在将细丝滑开时产生力，这是用光学陷阱测量的。由表面固定化微管、GFP-驱动蛋白-5 和罗丹明标记的转运微管组成的束的代表性荧光图像。（B）采用全长和（C）C端尾截断驱动蛋白-5结构。比例尺 = 5 μm。显示了（D）全长和（E）无尾的力产生的样本记录，平均力绘制为时间的函数。（F）显示了两种结构的最大平台力和相应的重叠长度图，表明全长驱动蛋白构建体产生的重叠长度依赖力的大小比无尾驱动蛋白构建体大得多。这个数字是从61修改的。请点击此处查看此图的大图。
图 6：通过 PRC1 测量摩擦力的代表性示例。 （A）描述实验几何形状的示意图，显示由GFP-PRC1（细胞分裂的蛋白质调节剂）交联的微管交联，当细丝通过以恒定速度移动盖玻片滑开时产生阻力。（B）代表性时间序列荧光图像，显示移动表面固定的远红色微管，GFP-PRC1分子在收缩重叠内凝结，以及与磁珠保持的游离罗丹明微管。帧之间的时间间隔 = 6 秒;比例尺 = 5 μm。 （C）示例力迹线显示滑动事件期间的摩擦力，一旦重叠达到0μm，破坏事件和力下降到零（~55秒）。 （D）四种不同滑动速度下重叠内平均力和积分GFP强度的相关性。（E）（D）中迹线的平均斜率和计算的拟合误差表明，每个PRC1分子的力随滑动速度呈线性增加。这个数字是从66修改的。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
微管网络被无数细胞类型用于完成广泛的任务，这些任务本质上基本上是机械的。为了描述细胞在健康和疾病状态下的功能，了解这些微米级网络如何由共同构建它们的纳米级蛋白质组织和调节至关重要。光学镊子等生物物理工具非常适合以这种规模探测关键蛋白质的机械化学。为了反映微管网络功能的多样性，已经探索了使用光学镊子的复杂实验几何形状，包括微管尖端动力学的力依赖性分析67，68、动粒组件产生的力 69、70、71 和双束哑铃陷阱几何形状以探测微管细丝力学72，73.在该协议中，我们描述了重建基本微管网络基序（例如束）的新方法，并应用单分子荧光显微镜和光学捕获的生物物理工具来评估有关细胞功能的关键信息。
虽然该协议中的大多数单个步骤在技术上都很简单，但总的来说，可能会出现许多潜在的故障点，并且必须在每个点上非常小心以确保成功的测量。首先，与许多基于显微镜的单分子实验测定一样，适当的表面钝化是关键，因为蛋白质或磁珠与盖玻片表面的非特异性结合几乎总是会阻止这些实验的成功完成。其次，必须优化目标交联蛋白的表达和纯化，以确保高质量的单物种产品，因为污染物会以多种方式干扰测定，例如诱导细丝过度捆绑或干扰磁珠和微管附着，更不用说在力数据的解释中引入复杂性。第三，保持强大的磁珠-微管附着需要高质量的严格驱动蛋白马达以高密度结合到捕获珠上，以便可以制造多个驱动蛋白-细丝附着点。这些键可以承受10 s的pN力几分钟，这适用于采用该技术的各种潜在研究系统。
我们还注意到，可以通过多种方式修改该协议以最好地满足最终用户的仪器或生物系统需求。虽然我们已经描述了使用GFP标记的交联蛋白和红色/远红色标记的微管的实验，但也可以根据需要交换荧光标记。例如，如果用户没有足够的激光线来进行三色TIRF显微镜检查，则可以通过对具有相同荧光团但对每种微管使用不同浓度（例如，暗淡与明亮）的差异标记微管来获得高质量的数据。类似地，向交联蛋白中添加荧光标记可能并不总是可能或有利的。在这种情况下，某些实验信息（例如交联剂浓度或定位）将无法获得，但仍可以确定诸如微管重叠长度之类的参数。我们预计该协议高度适用于许多不同类型和组合的微管交联蛋白。引入多种交联蛋白可能需要从其中一种蛋白质中去除荧光标签或从两种微管类型之一中排除荧光标记，以释放适当带宽的成像能力（例如，对交联蛋白使用红色或远红色蛋白质编码标记）。这种基于TIRF的测定不太可能使用三个以上的荧光通道，尽管这些通道的分布方式肯定具有灵活性，在计划实验时应仔细考虑这一点。最后，可以修改该测定法以研究不同的网络几何形状和细胞骨架丝的类型。由augmin和γ-微管蛋白环复合物介导的微管分支机制分析可以很容易地进行探测和成像。此外，其他交联的细胞骨架网络，例如涉及肌动蛋白、隔膜素或中间丝的网络，将非常适合使用这些工具进行研究，前提是对盖玻片和捕获珠进行了适当的修饰和正交附着策略。
总之，我们已经描述了一种重建主动力产生微管网络的协议，该协议可以使用单分子荧光显微镜工具成像并通过单光束光学陷阱进行操作。我们已经通过揭示有丝分裂运动和非运动蛋白的集成机制的数据集证明了这种方法的有用性。我们预计，许多类型的高度组织的微管网络，例如在神经元，上皮组织或心肌细胞中发现的微管网络，可以用这些工具进行分析，揭示动态细胞骨架的生物物理功能的新原理。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者希望感谢R21 AG067436（对JP和SF），T32 AG057464（对ET）和伦斯勒理工学院科学学院启动基金（对SF）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nm | IPG Photonics | YLR-10-1064-LP | |
| 405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applications | Chroma | TRF89901v2 | |
| 6x His Tag Antibody, Biotin Conjugate | Invitrogen | #MA1-21315-BTIN | |
| Acetone, HPLC grade | Fisher Scientific | 18-608-395 | |
| Alpha casein from bovine milk | Sigma | 1002484390 | |
| ATP | Fisher Scientific | BP413-25 | |
| Benzonase | Novagen | 70746-3 | |
| Biotin-PEG-SVA-5000 | Laysan Bio, Inc. | NC0479433 | |
| BL21 (DE3) Rosetta Cells | Millipore Sigma | 71-400-3 | |
| Catalase | MP Biomedicals LLC | 190311 | |
| CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objective | Nikon | N/A | |
| Chloramphenicol | ACROS Organics | 227920250 | |
| Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips | Fisher Scientific | C14784 | |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Dextrose Anhydrous | Fisher Scientific | BP3501 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-25 | |
| Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 Bath | LAUDA-Brinkmann | 27709 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| EGTA | Millipore Corporation | 32462-25GM | |
| FIJI / Image J | https://fiji.sc/ | N/A | |
| Frosted Microscope Slides | Corning | 12-553-10 | 75mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm |
| Glucose Oxidase | MP Biomedicals LLC | 195196 | Type VII, without added oxygen |
| GMPCPP | Jena Biosciences | JBS-NU-405S | Can be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C |
| Gold Seal-Cover Glass | Thermo Scientific | 3405 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Imidazole | Fisher Scientific | 03196-500 | |
| IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| Laboratory dessicator | Bel-Art | 999320237 | 190mm plate size |
| Kanamycin Sulfate | Fischer Scientific | BP906-5 | |
| KIF5A K439 (aa:1-439)-6His | Gilbert Lab, RPI | N/A | doi.org/10.1074/jbc.RA118.002182 |
| Kimwipe | Kimberley Clark | Z188956 | lint-free tissue |
| Immersion Oil, Type B | Cargille | 16484 | |
| Lens Tissue | ThorLabs | MC-5 | |
| LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm) | Nikon | N/A | |
| Lysozyme | MP Biomedicals LLC | 100834 | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher Scientific | BP215-500 | |
| Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
| MPEG-SVA MW-5000 | Laysan Bio, Inc. | NC0107576 | |
| Neutravadin | Invitrogen | PI31000 | |
| Nikon Ti-E inverted microscope | Nikon | N/A | Nikon LuN4 Laser |
| Ni-NTA Resin | Thermo Scientific | 88221 | |
| Oligonucleotide - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA GAACTTTCAAAGGC |
IDT | N/A | |
| Oligonucleotide - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA ACTCAGAATAGGTG |
IDT | N/A | |
| Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mm | Beckman Coulter | 343755 | |
| Optima-TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 361544 | |
| Paclitaxel (Taxol equivalent) | Thermo Fisher Scientific | P3456 | |
| PIPES | ACROS Organics | 172615000 | |
| PMSF | Millipore | 7110-5GM | |
| Porcine Tubulin, biotin label | Cytoskeleton, Inc. | T333P | |
| Porcine Tubulin, HiLyte 647 Fluor | Cytoskeleton, Inc. | TL670M | far red labelled |
| Porcine Tubulin, Rhodamine | Cytoskeleton, Inc. | TL590M | |
| Porcine Tubulin, Tubulin Protein | Cytoskeleton, Inc. | T240 | |
| Potassium Acetate | Fisher Scientific | BP364-500 | |
| Prime 95B sCMOS camera | Photometric | N/A | |
| Quadrant Detector Sensor Head | ThorLabs | PDQ80A | |
| Quikchange Lightning Kit | Agilent Technologies | 210518 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Square Cover Glasses | Corning | 12-553-450 | 18 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm |
| Streptavidin Microspheres | Polysciences Inc. | 24162-1 | |
| Superose-6 Column | GE Healthcare | 29-0915--96 | |
| TCEP | Thermo Scientific | 77720 | |
| TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
| Ultrasonic Cleaner (Sonicator) | Vevor | JPS-08A(DD) | 304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power |
| Vectabond APTES solution | Vector Laboratories | SP-1800-7 | |
| Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-D | S.C. Johnson | SJN695237 |
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