Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Direct meten van krachten binnen gereconstitueerde actieve microtubulibundels

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63819
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biological Sciences and Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies, Rensselaer Polytechnic Institute
* These authors contributed equally

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het reconstitueren van microtubulibundels in vitro en het direct kwantificeren van de krachten die erin worden uitgeoefend met behulp van gelijktijdige optische vangmethoden en totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie. Deze test maakt het mogelijk om op nanoschaal de krachten en verplaatsingen te meten die worden gegenereerd door eiwitensembles binnen actieve microtubulinetwerken.

Abstract

Microtubule-netwerken worden in cellen gebruikt om een breed scala aan taken uit te voeren, variërend van het fungeren als sporen voor blaasjestransport tot het werken als gespecialiseerde arrays tijdens mitose om chromosoomsegregatie te reguleren. Eiwitten die interageren met microtubuli omvatten motoren zoals kinesines en dyneïne, die actieve krachten en directionele beweging kunnen genereren, evenals niet-motorische eiwitten die filamenten kruisen in netwerken van hogere orde of de filamentdynamica reguleren. Tot op heden hebben biofysische studies van microtubule-geassocieerde eiwitten zich overweldigend gericht op de rol van enkelvoudige motoreiwitten die nodig zijn voor vesikeltransport, en er is aanzienlijke vooruitgang geboekt bij het ophelderen van de krachtgenererende eigenschappen en mechanochemische regulatie van kinesines en dyneinen. Voor processen waarbij microtubuli zowel als lading als spoor fungeren, zoals tijdens het glijden van filamenten in de mitotische spil, wordt echter veel minder begrepen over de biofysische regulatie van ensembles van de betrokken crosslinking-eiwitten. Hier beschrijven we onze methodologie voor het direct onderzoeken van krachtgeneratie en respons binnen crosslinked microtubule minimale netwerken gereconstitueerd uit gezuiverde microtubuli en mitotische eiwitten. Microtubule-paren worden gekruist door eiwitten van belang, één microtubuli wordt geïmmobiliseerd tot een microscoopdeksel en de tweede microtubuli worden gemanipuleerd door een optische val. Gelijktijdige totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie maakt meerkanaals visualisatie van alle componenten van dit microtubulinetwerk mogelijk terwijl de filamenten uit elkaar glijden om kracht te genereren. We laten ook zien hoe deze technieken kunnen worden gebruikt om duwkrachten van kinesine-5 ensembles te onderzoeken en hoe viskeuze remkrachten ontstaan tussen glijdende microtubuliparen die door de mitotische MAP PRC1 worden gekruist. Deze testen bieden inzicht in de mechanismen van spindelassemblage en -functie en kunnen breder worden aangepast om dichte microtubule-netwerkmechanica in verschillende contexten te bestuderen, zoals het axon en dendrieten van neuronen en polaire epitheelcellen.

Introduction

Cellen maken gebruik van microtubule-netwerken om een breed scala aan mechanische taken uit te voeren, variërend van blaasjestransport 1,2,3 tot chromosoomsegregatie tijdens mitose 4,5,6. Veel van de eiwitten die interageren met microtubuli, zoals de moleculaire motoreiwitten kinesine en dyneïne, genereren krachten en worden gereguleerd door mechanische belastingen. Om beter te begrijpen hoe deze kritieke moleculen functioneren, hebben onderzoekers biofysische methoden met één molecuul gebruikt, zoals optische vangst en TIRF-microscopie, om kritieke parameters zoals onbelaste stapsnelheden, processiviteit en krachtsnelheidsrelaties voor individuele eiwitten direct te controleren. De meest gebruikte experimentele geometrie is geweest om motoreiwitten rechtstreeks aan vangkralen te bevestigen waarvan de bolvormige geometrie en grootte blaasjes nabootsen die motorisch transport ondergaan. Talrijke kinesines, waaronder kinesine-1 7,8,9, kinesine-2 10,11,12, kinesine-3 13,14,15,16 kinesine-5 17,18, kinesine-819,20, evenals dyneïne- en dyneïnecomplexen21,22, 23,24,25, zijn bestudeerd met deze methoden.

In veel cellulaire processen gebruiken motorische en niet-motorische eiwitten echter microtubuli zowel als spoor en lading 26,27. Bovendien, in deze scenario's waarin microtubule filamenten worden gekruist in bundels van hogere orde, functioneren deze eiwitten als ensembles in plaats van enkele eenheden. Binnen delende somatische cellen organiseren dichte filamentnetwerken zich bijvoorbeeld zelf om het mitotische spindelapparaat 28,29,30 te bouwen. Het interpolaire spindelmicrotubulinetwerk is zeer dynamisch en is grotendeels gerangschikt met min-uiteinden die naar de spindelpolen wijzen en pluseinden die overlappen in de buurt van de spindelequator. Filamenten in de spil worden verknoopt door motoreiwitten zoals kinesine-5 31,32,33, kinesine-12 34,35,36 en kinesine-14 37,38,39, of door niet-motorische eiwitten zoals PRC1 40,41,42,43 of NuMA44,45, 46. Ze bewegen vaak of ervaren mechanische stress tijdens processen zoals poolwaartse flux of tijdens het coördineren van chromosoomcentrering tijdens metafase of chromosoomsegregatie tijdens anafase 47,48,49,50,51,52. De integriteit van het spindelapparaat op micronschaal door mitose is daarom afhankelijk van een zorgvuldig gereguleerde balans van duw- en trekkrachten die worden gegenereerd en ondersteund door dit netwerk van interagerende filamenten. De hulpmiddelen die nodig zijn om deze mechanische regulatie te onderzoeken en uit te leggen hoe eiwitensembles samenwerken om microtubulibewegingen te coördineren en de krachten te produceren die nodig zijn om de spindel goed te assembleren, zijn echter pas onlangs ontwikkeld en we beginnen nog maar net de biofysische regels te begrijpen die dynamische microtubule-netwerken definiëren.

Het doel van dit manuscript is om de stappen te demonstreren die nodig zijn om crosslinked microtubule-paren in vitro te reconstrueren, deze bundels te immobiliseren in een microscopiekamer die gelijktijdige fluorescentievisualisatie van zowel de microtubuli als crosslinking-eiwitten en nanoschaalkrachtmeting mogelijk maakt, en deze gegevens robuust te verwerken. We beschrijven de stappen die nodig zijn om fluorescentie-gelabelde microtubuli stabiel te polymeriseren, microscoop coverslips voor bevestiging voor te bereiden, polystyreenparels voor optische vangexperimenten voor te bereiden en verknoopte filamentnetwerken samen te stellen die hun in vivo functionaliteit behouden terwijl directe biofysische manipulatie mogelijk is.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bereiding van microtubuli

OPMERKING: Bij het gebruik van GFP-gelabelde crosslinking-eiwitten, rood (bijv. Rhodamine) en verrood (bijv. Gebiotinyleerd HiLyte647, in de rest van de tekst veel rood gebiotinyleerd) werkt organische fluorofooretikettering van de microtubuli goed. Minimale overspraak tussen alle drie de kanalen kan worden bereikt tijdens de beeldvorming door gebruik te maken van een hoogwaardig quad-band total internal reflection fluorescence (TIRF) filter.

  1. Bereid GMPCPP microtubule zaadvoorraden voor
    1. Suspensie 1 mg ongelabeld gelyofiliseerd tubuline in 84 μL ijskoude 1x BRB80 (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA; pH 6,8), met DTT toegevoegd aan een eindconcentratie van 1 mM vlak voor gebruik. Suspensie 60 μg fluorofoor-gelabelde gelyofiliseerde tubuline in 6 μL koud 1x BRB80 met 1 mM DTT. Suspensie 60 μg biotine-gelabelde gelyofiliseerde tubuline in 6 μL koude 1x BRB80 met 1 mM DTT.
    2. Om niet-gebiotinyleerde rhodamine-gelabelde tubulinezaadbouillon met een etiketteringsverhouding van 1:10 te bereiden, voegt u 84 μL ongelabelde tubuline, 6 μL fluorofoor-gelabelde tubuline en 10 μL 10 mM GMPCPP-stamoplossing toe aan een buis van 0,5 ml. Meng goed door voorzichtig te pipetteren en houd op ijs.
      OPMERKING: GMPCPP-polymerisatie heeft de voorkeur voor deze testen omdat de microtubuli stabieler zijn en vatbaarder voor directe manipulatie met de optische val dan wanneer ze worden gepolymeriseerd met GTP of als taxol wordt weggelaten.
    3. Om gebiotinyleerde ver rood gelabelde tubulinezaadvoorraad met een fluorescerende etiketteringsverhouding van 1:10 te bereiden, voegt u 80 μL ongelabelde tubuline, 6 μL fluorofoor-gelabelde tubuline, 4 μL biotine-gelabeld tubuline en 10 μL GMPCPP-stamoplossing toe in een buis van 0,5 ml. Meng goed door voorzichtig te pipetteren en houd op ijs. Incubeer de zaadbouillon op ijs gedurende 5 min.
    4. Breng de tubuline-oplossing over in een polycarbonaatbuis die geschikt is voor snelle centrifugatie. Centrifugeer de zaadvoorraad bij ~ 350.000 x g gedurende 5 minuten bij 2 ° C om microtubulepolymerisatie te voorkomen en het supernatant terug te winnen voor aliquoting. De uiteindelijke geschatte concentratie tubuline in dit stadium is ~50 μM.
    5. Bereid met behulp van 0,2 ml PCR-buizen 2 μL aliquots van de zaadvoorraad en flash freeze met vloeibare stikstof. Aliquots kunnen tot 6 maanden bij -80 °C worden bewaard.
  2. Polymerisatie van microtubuli
    1. Bereid 500 μL van 1x BRB80 en leg op ijs. Leg een van de gebiotinyleerde verrode en niet-gebiotinyleerde rhodaminezaadolie aliquots op ijs om te ontdooien.
    2. Incubeer de zaadvoorraden gedurende 5 minuten op ijs. Voeg aan het einde van de incubatietijd onmiddellijk 26 μL 1x BRB80 toe aan elke buis. Als langere microtubuli gewenst zijn, verhoog dan het volume van BRB80 met 5-10 μL, terwijl, voor kortere microtubuli, het volume voor polymerisatie met 5 μL wordt verminderd.
    3. Incubeer de microtubulizaadvoorraden gedurende 1 uur bij 37 °C in een waterbad. Combineer 298,5 μL kamertemperatuur 1x BRB80 en 1,5 μL 4 mM taxol stockoplossing om een 20 μM taxoloplossing te produceren. Bereid 300 μL van 1x BRB80 en houd beide buisjes op kamertemperatuur.
    4. Verwarm een geschikte rotor met hoge snelheid tot 30 °C. Dit kan in een tafelmodel ultracentrifuge ingesteld op 30 °C. Verwijder de microtubuli uit het waterbad en bewaar op kamertemperatuur op een benchtop gedurende 10-15 minuten.
  3. Zuivering van microtubuli
    1. Voeg 100 μL kamertemperatuur 1x BRB80 toe aan de microtubule groeioplossing en meng door ~10 keer met de buis te vegen of voorzichtig te pipetteren. Breng de microtubuligroeioplossing over in een polycarbonaatcentrifugebuis.
    2. Markeer één kant van de polycarbonaatbuis, die naar buiten gericht is ten opzichte van de rotatie van de centrifuge. Dit zal helpen bij het lokaliseren van de microtubulikorrel, die nauwelijks zichtbaar zal zijn vanwege het kleine volume materiaal.
    3. Centrifugeer de microtubulioplossing bij ~350.000 x g gedurende 10 minuten bij 30 °C. Inspecteer na het centrifugeren indien mogelijk de buis met de microtubuli op een pellet. Verwijder alles behalve de laatste paar microliter vloeistof voorzichtig, zonder de pellet te verstoren. Als de pellet niet duidelijk zichtbaar is, gebruik dan de markering als leidraad om te voorkomen dat het gebied waar de pellet zich bevindt, wordt verstoord.
    4. Voeg onmiddellijk 100 μL 1x BRB80 + 20 μM taxol toe aan de microtubulibuis. Dit kan direct aan de pellet worden toegevoegd; verstoring van de pellet in dit stadium heeft geen significante invloed op het zuiveringsproces.
    5. Centrifugeer de microtubuli opnieuw bij ~ 350.000 x g gedurende 10 minuten, waarbij u ervoor zorgt dat het gemarkeerde gedeelte van de buis opnieuw naar buiten is gericht ten opzichte van de rotatie van de centrifuge.
    6. Verwijder alle microliter oplossing op een paar microliter na zoals voorheen, wees opnieuw voorzichtig om te voorkomen dat de microtubulikorrel wordt verstoord. Herhaal stap 1.3.4.-1.3.5. en resuspenseer vervolgens de microtubulipellet in 20-50 μL van 1x BRB80 + 20 μM taxol.
    7. Resuspenderen door het grootste deel van het resuspensievolume op te pipetteren en voorzichtig rechtstreeks op de pellet uit te werpen, 20-30x te herhalen of totdat de pellet volledig geresuspendeerd is. Dit moet met zorg worden gedaan om de microtubuli niet te scheren door te krachtig pipetteren. Het snijden van de pipetpunt om de grootte van de opening te vergroten, kan ook nuttig zijn om het afschuiven van microtubuli te verminderen.
    8. Bewaar de microtubuli bij kamertemperatuur door de buis in folie te wikkelen om de fluoroforen tegen licht te beschermen en op de benchtop te houden. Microtubuli zijn over het algemeen bruikbaar gedurende 2-3 dagen na klaring.
  4. Beoordeling van microtubuli door middel van microscopie
    1. Bereid een 1:10 verdunning van de geklaarde microtubulioplossing door 1 μL microtubuli en 9 μL kamertemperatuur 1x BRB80 te mengen. Breng deze oplossing onmiddellijk in beeld door 10 μL op een microscoopglaasje te pipetteren en vervolgens een coverslip over de druppel te plaatsen om een pompoen te vormen.
    2. Zorg ervoor dat microtubuli met een lengte van 8-25 μm bij een hoge dichtheid (enkele honderden per volledig gezichtsveld gelaagd in een dicht gaaswerk) zichtbaar zijn wanneer ze worden gevisualiseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie en een 100x-objectief gericht op het coverslipoppervlak in contact met de microtubuleverdunning.

2. Bereiding van gepassiveerde dekzeilen

  1. Washoezen
    1. Plaats 18 mm x 18 mm afdekplaten in niet-reactieve plastic rekken en plaats elk rek in een bekerglas van 100 ml. Plaats één coverslip per gleuf in de rekken, omdat het reinigen van beide zijden van de coverslips noodzakelijk is.
    2. Soniceren met behulp van een bad sonicator gedurende 5 minuten, met behulp van 50 ml van de volgende oplossingen in de volgorde die is opgegeven voor elke ultrasoonapparaatcyclus: (1) gedeïoniseerd water (met 18,3 MΩ-cm weerstand), (2) 2% Micro-90-oplossing, (3) gedeïoniseerd water, (4) vers bereid 0,1 M KOH, (5) gedeïoniseerd water (figuur 1A). Zorg ervoor dat de coverslips volledig bedekt zijn met vloeistof. Spoel tussen ultrasoonapparaatcycli elk rek met coverslips in gedeïoniseerd water door een pincet te gebruiken om het rek 10-20x in gedeïoniseerd water op en neer te dopen, het water te vervangen en het spoelproces 2x te herhalen.
    3. Spoel de coverslips 3x in water, vul vervolgens de bekers opnieuw met 100% ethanol en breng de rekken terug naar de bekers. Verplaats de bekers in een zuurkast en leg voldoende doekjes om ruimte te maken voor alle coverslip-rekken. Verwijder vervolgens de rekken met een pincet en plaats ze op de doekjes.
    4. Blaas met behulp van een droge stikstofgasstroom de ethanol van de coverslips en hun rekken tot ze droog zijn. Verwijder de resterende ethanol uit de bekers en droog ze op dezelfde manier met behulp van de droge stikstofgasstroom (figuur 1A).
  2. Aminosilane oppervlakte functionalisatie op coverslips
    1. Bereid (3-aminopropyl)tiethoxysilaan (APTES) reagensoplossing door 40 ml aceton en 400 μL APTES-reagens toe te voegen aan een conische buis van 50 ml, goed af te sluiten en te mengen door 10x om te keren.
    2. Verplaats een rek met coverslips in het bijbehorende droge bekerglas en dompel vervolgens volledig onder in aptes-oplossing. Incubeer gedurende 5 minuten (figuur 1A). Verplaats het met APTES behandelde rek naar een nieuw droog bekerglas en verplaats een nieuw rek naar de APTES om gedurende 5 m te incuberen.
    3. Spoel het behandelde rack af met gedeïoniseerd water door het rek 10-20x onder te dompelen zoals beschreven in stap 2.1.2., waarbij het water 5x wordt vervangen. Herhaal dit totdat alle coverslips zijn behandeld en gewassen.
  3. PEGylering van aminosilaanoppervlak
    1. Bereid twee PEG-oplossingen, een van ~ 100 μL met 25% w / v PEG en een andere van ~ 10 μL met 10% w / v biotine-PEG, beide gesuspendeerd in vers bereide 0,1 M NaHCO3, voldoende om 24 coverslips te coaten. Centrifugeer de 25% PEG-oplossing bij 3.000 x g gedurende 20 s zodra 0,1 M NaHCO3 is toegevoegd om de PEG volledig op te lossen; de oplossing kan troebel blijven. Meng de biotine-PEG door voorzichtig pipetteren (figuur 1B).
    2. Bereid een mengsel van de PEG- en biotine-PEG-oplossingen, met 33,3 keer het volume PEG tot 1 volume biotine-PEG (bijv. 100 μL PEG-oplossing en 3 μL biotine-PEG-oplossing).
    3. Leg in een zuurkast verschillende steriele en pluisvrije doekjes. Verplaats de afdekrekken op de doekjes en föhn droog met een droge stikstofgasstroom zoals voorheen. Leg op verschillende nieuwe en droge doekjes de nu volledig gedroogde coverslips in paren gerangschikt en label elk in de rechterbenedenhoek met een asymmetrisch symbool zoals "b". Deze markering bevindt zich tegenover het monsteroppervlak van de coverslip en zal het experiment niet verstoren (figuur 1B).
    4. Draai een coverslip in elk paar met een pincet. Plaats op elke omgedraaide coverslip 6 μL PEG/biotine-PEG-mengsel en plaats de tweede coverslip erop zodat beide "b" -labels naar buiten gericht zijn.
    5. Lijn de randen van de afdekranden uit en plaats ze in een bevochtigde en luchtdichte kamer om uitdroging te voorkomen. Incubeer de coverslips in de vochtigheidskamer bij kamertemperatuur gedurende 3 uur.
    6. Verwijder na incubatie de coverslips uit de vochtigheidskamer, scheid de coverslipparen voorzichtig en plaats ze terug in hun rekken. Was elk rek in gedeïoniseerd water zoals voorheen, dompel de rekken 10-20x onder met een pincet en vervang het water in totaal 5x.
    7. Plaats alle PEGylated zijden van de coverslips in dezelfde richting, zodat er geen twee PEGylated coverslip-oppervlakken tegenover elkaar staan. Het PEGylated oppervlak zal erg plakkerig zijn totdat het volledig droogt, dus wees extra voorzichtig om te voorkomen dat de coverslips elkaar raken. Droog elk rek en de deksels zoals voorheen met behulp van een droge stikstofgasstroom (figuur 1B).
    8. Zodra de coverslips en hun rekken volledig zijn gedroogd, bewaart u deze in een vacuümdesiccator om degradatie van de oppervlaktecoating te voorkomen. Op de juiste manier opgeslagen onder vacuüm en met droogmiddel om te voorkomen dat vocht de PEG-coating verstoort; coverslips kunnen ongeveer 1 week worden gebruikt.

3. Bereiding van met kinesine beklede kralen

  1. Selectie en voorbereiding van rigor kinesin construct
    1. Express en zuiveren rigor kinesine constructen volgens gepubliceerde protocollen53,54. Flash bevries 5 μL aliquots van 0,02 mg/ml kinesineoplossingen en bewaar bij -80 °C gedurende maximaal 1 jaar.
      OPMERKING: Rigor kinesine-eiwitten hebben een G234A-puntmutatie die ATP-hydrolyse voorkomt. Wanneer geconjugeerd aan microbeads, zorgen interacties met hoge affiniteit met de microtubule ervoor dat kralen gedurende enkele minuten belastingen van 10-20 pN kunnen ondersteunen. Rigor gemuteerde versies van zowel het veelgebruikte kinesine-1 homodimeer K56053 als een verder geoptimaliseerde K439 construct55 zijn ook met succes gebruikt in deze assays54. Dit verbeterde K439-construct bevat een EB1-dimerisatiedomein om de stabiliteit te verbeteren en een C-terminal 6-His-tag voor specifieke binding aan een 6-His-antilichaam, zoals hieronder beschreven.
  2. Binding 6-His antilichaam aan streptavidin-gecoate kralen
    1. Voeg 50 μL streptavidin-gecoate polystyreenparels met een diameter van 1 μm toe aan een centrifugebuis van 0,5 ml. Sonicate voor 30 s.
    2. Voeg 10 μL van 200 mM DTT toe aan 790 μL van 1x BRB80. Voeg 10 μL gesonificeerde kralen toe aan 40 μL van deze 1x BRB80 + 2,5 mM DTT buffer.
    3. Combineer 1 μL gebiotinyleerd 6-His antilichaam en 49 μL 1x BRB80 + 2,5 mM DTT; vortex kort te mengen.
    4. Combineer de 50 μL verdunde kraalmengsel en 50 μL antilichaamverdunning in een nieuwe buis. Plaats de buis in een buisrotator op 4 °C en draai gedurende 1 uur. Draai het kraalmengsel gedurende 10 minuten bij 3.000 x g bij 4 °C.
    5. Pipetteer het supernatant en resuspendeer de pellet in 100 μL van 2 mg/ml caseïneoplossing in 1x BRB80. Herhaal deze centrifugatie en resuspensie 2x.
  3. Toevoeging van rigor kinesine
    1. Resuspendeer de uiteindelijke pellet in 100 μL 2 mg/ml caseïneoplossing. Combineer in een centrifugebuis van 0,5 ml 5 μL van 0,02 mg / ml rigor kinesine en 5 μL kralen, meng zachtjes door de buis lichtjes te vegen ~ 10x.
    2. Houd zowel de K439 G234A kraalophanging als de resterende 6-His kralen op de rotor bij 4 °C wanneer deze niet in gebruik zijn. Kralen moeten vers worden bereid en dezelfde dag worden gebruikt voor de experimenten, omdat ze de neiging hebben om te klonteren en activiteit te verliezen na deze tijd.

4. Montage van de microscopiekamer

  1. Voorbereiding van glasglijbanen en kamerconstructie
    1. Spoel 75 mm x 25 mm microscoopglasglaasjes eerst af met ultrapuur water, gevolgd door niet-gestreepte ammoniakglasreiniger en vervolgens nogmaals met ultrapuur water. Schud om overtollige waterdruppels te verwijderen. Droog de dia's met behulp van een stikstofstroom zodat er geen strepen achterblijven en leg de glijpartijen neer op een papieren handdoek (figuur 2A).
    2. Knip met een schaar dubbelzijdige tape in stroken van ~ 2-3 mm x 2,5 cm (2 stroken per enkele kamer en 3 per dubbele kamer).
    3. Leg met behulp van een tang twee stroken tape op één glazen schuif, zodat er ~ 0,5 cm ruimte tussen zit om een enkele kamer te construeren. Gebruik voor dubbele kamers dezelfde afstand, maar met drie stroken tape (figuur 2B). Het volume van het monsterkanaal met behulp van deze methode is ongeveer 10 μL.
      OPMERKING: Hoe breder de kamer(s), hoe waarschijnlijker het is dat er bellen ontstaan wanneer oplossingen worden binnengestroomd; kamers die minder dan 0,5 cm breed zijn, kunnen echter een uitdaging zijn om te gebruiken vanwege het beperkte gebied voor beeldvorming.
    4. Schraap over de lengte van elke strook tape met behulp van een tang, zodat de tape stevig aan de glasplaat is bevestigd.
    5. Laat de druk los van de exsiccator en gebruik een tang om één gebiotinyleerde coverslip uit een opslagrek te verwijderen. Plaats een gebiotinyleerde afdekplaat op de glazen glijbaan met behulp van een tang. Zorg ervoor dat de gebiotinyleerde kant naar binnen is gericht, in de richting van de glazen schuif.
    6. Druk met behulp van de platte achterkant van de tang voorzichtig op het glas waar de afdekplaat de tape raakt om de kamers veilig af te dichten. Er moet lichte druk worden uitgeoefend om ervoor te zorgen dat de afdekplaat niet barst (figuur 2C).
    7. Bewaar de afgewerkte microscopiekamers in een luchtdichte container, uit de buurt van direct licht, tot gebruik (figuur 2D).
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om kamers te gebruiken op dezelfde dag dat ze worden gemaakt, omdat de gebiotinyleerde coverslips afbreken wanneer ze aan lucht worden blootgesteld.
  2. Instroom van microscopiereagentia
    1. Bouw een vochtigheidskamer door een opgevouwen pluisvrij weefsel te plaatsen dat is bevochtigd met ultrapuur water op de bodem van een lege pipetpuntdoos. De monsterkamers moeten in deze doos tussen de instroomstappen worden bewaard om de verdamping van oplossingen uit het kanaal te verminderen.
    2. Breng alle reagentia aan door de vloeistof aan het ene uiteinde van het kanaal te pipetteren en vloeistof aan het andere uiteinde af te voeren. Om te lonken, draait u het ene uiteinde van het weefsel en plaatst u het voorzichtig aan de uitgangszijde van de kamer, zodat de capillaire werking het reagens homogeen verdeelt (figuur 3A). Breng alle reagentia op kamertemperatuur vlak voordat ze naar binnen stromen om microtubuli-depolymerisatie te voorkomen.
    3. Met behulp van een schuine pipetpunt van 20 μL, zodat deze de ingangszijde van een kamer raakt, stroomt langzaam 10 μL van 0,5 mg / ml streptavidin of Neutravidine. Gebruik kleinere pipetpunten en een langzame, constante stroom van reagentia om de kans op het verkrijgen van bellen in de kamer te verkleinen (figuur 3B).
    4. Incubeer de glijbaan in de vochtigheidskamer gedurende 4 minuten met de afdekselzijde van de kamer naar beneden gericht. Deze oriëntatie zorgt ervoor dat grotere objecten, zoals microtubuli of kralen, in de buurt van het PEGylated-oppervlak kunnen zinken.
    5. Spoel de kamer uit met 20 μL van 1x BRB80, met behulp van een pluisvrij weefsel om vloeistoffen eruit te halen. Als er een lek in de kamer aanwezig is, gooit u de dia weg en begint u met een andere; kleine bubbels die in de kamer voorkomen, zullen de beeldvorming niet nadelig beïnvloeden.
    6. Herhaal de instroom-, incubatie- en spoelstappen met 10 μL 0,5 mg/ml caseïneblokkeringsoplossing (figuur 3C). Verdun gebiotinyleerde verrode microtubuli ~1:20 en stroom 10 μL in de kamer. Incubeer gedurende 5 minuten en spoel de kamer met 20 μL van 1x BRB80 (figuur 3D). De optimale dichtheid van deze microtubuli binnen een beeldveld van 100 μm x 100 μm moet 10-20 zijn; en de verdunning in dit stadium moet worden aangepast om deze oppervlaktebindingsverhouding te bereiken.
    7. Herhaal de flow-in, incubatie- en spoelstappen met 10 μL van een geschikte concentratie (meestal 1-10 nM) crosslinking motor of niet-motorisch eiwit dat moet worden bestudeerd (figuur 3E).
    8. Stroom in 10 μL rhodamine microtubuli verdund tot een vergelijkbare concentratie als de vorige gebiotinyleerde verrode microtubuli. Herhaal de incubatie- en spoelstappen (figuur 3F).
    9. Combineer 1 μL rigor kinesine-gecoate kralen en 19 μL reactiebuffer geoptimaliseerd voor crosslinking eiwitactiviteit. Gebruik bijvoorbeeld voor de analyse van kinesine-5-activiteit de reactiebuffer met 1 mM TCEP-bindingsbreker, 0,2 mg/ml alfacaseïne, 70 mM KCl, zuurstofopruimsysteem (4,5 mg/ml glucose, 350 eenheden/ml glucoseoxidase, 34 eenheden/ml catalase), 1 mM DTT en ATP bij de gewenste concentratie (bijv. 1 mM voor maximale kinesinesnelheidsomstandigheden) in 1x BRB80 (figuur 3G ). Voor de analyse van niet-motorische eiwitten, laat ATP weg en varieer de concentratie van KCl om de interactiesterkte tussen eiwit en microtubuli in deze testen te moduleren.
    10. Sluit beide randen van de kamer af met heldere nagellak en wacht tot de lak droogt voordat de afbeelding wordt gemaakt (figuur 3H). Een succesvol geconstrueerde kamer heeft geen lekkage en minimale bubbels.

5. Imaging microtubule bundels met 3-kleuren TIRF

  1. Gebruik een omgekeerd microscoopinstrument dat TIRF-beeldvormingsmogelijkheden heeft en waarin een optische val met één bundel is geconstrueerd (figuur 4).
    OPMERKING: Voor de hier beschreven studies werd een omgekeerde microscoop gebruikt met een 100x / NA1.49 olieobjectieven, TIRF-module en drie lasers bij respectievelijk 488 nm, 561 nm en 640 nm voor het GFP-gelabelde eiwit, rhodamine-gelabelde microtubuli en gebiotinyleerde ver rood gelabelde microtubuli.
    1. Voeg één druppel dompelolie toe aan de afdeksel van de monsterkamer. Overmatige olie kan het doel van de microscoop beschadigen. Plaats het monster op het microscoopplatform met de coverlipzijde van de monsterkamer naar beneden gericht.
    2. Breng het doel langzaam omhoog zodat er contact is tussen zowel de coverslip als het doel via de olie. Pas de hoogte van het objectief zo aan dat het oppervlak van de afdeksel van de monsterkamer scherp is.
    3. Neem afbeeldingen met één frame van het monster op in alle drie de kanalen. Gebruik voor de experimenten hier 100-200 ms blootstelling als een optimale beeldduur over alle drie de kanalen; langere belichtingstijden kunnen leiden tot meer fotobleaching.
    4. Pas het laservermogen aan om een goede signaal-ruisverhouding van de monsters te bereiken en minimaliseer fotobleaching gedurende de 2-5 minuten wanneer de individuele bundel wordt getest. Gebruik voor de laser die hier wordt gebruikt (figuur 4 en figuur 5) een laservermogen van 5 mW voor het GFP-kanaal en 3 mW voor beide microtubulikanalen als optimaal.
      OPMERKING: Succesvol samengestelde bundels moeten bestaan uit één oppervlakte-geïmmobiliseerde microtubuli in het verrode kanaal, een co-extensief gebied van verschillende micron met een significant GFP-eiwitsignaal, en een rhodaminemicrotubuli die deze gebieden overlapt en zich vervolgens enkele microns van de bundel uitstrekt (figuur 5B, C en figuur 6 ). Live beeldvorming van de rhodamine microtubuli moet subtiele fluctuaties aan het niet-verknoopte microtubuli-uiteinde onthullen, wat aangeeft dat dit filament niet is losgemaakt van het oppervlak of andere eiwitten in de kamer.
    5. Observeer de frequentie van microtubulibundels per gezichtsveld. Voor een succesvol bereid monster moeten er ongeveer 3-4 microtubulebundels aanwezig zijn per gezichtsveld van 100 μL x 100 μL per kamer.

6. Uitvoeren van optische valexperimenten op microtubulibundels

  1. Pre-experimentele kalibratie van omstandigheden
    1. Om deze experimenten uit te voeren, gebruikt u een optische val met één bundel met een stijfheid van 0,05-0,1 pN / nm. Integreer de vangoptiek en positiegevoelige fotodetector in een TIRF-geschikte omgekeerde microscoop door respectievelijk kortdoorlaatfilters net onder het objectief en boven de condensor te introduceren (figuur 4).
    2. Voeg bovendien een nanopositioneringsfase toe waarop het monster zit, zodat de gebruiker de microtubuli met precisie op nanometerschaal op een gecontroleerde manier kan verplaatsen tijdens deze testen. Het systeem dat hier wordt gebruikt om representatieve gegevens te verkrijgen, is beschreven in gepubliceerd werk 27,53,54,56,57.
      OPMERKING: Hoewel buiten het bereik van dit protocol, zijn er meerdere bronnen beschikbaar die de constructie en kalibratie van een optische val met één bundel 58,59,60 beschrijven.
    3. Observeer de dichtheid van kralen in het monster met behulp van een brightfield- of DIC-kanaal en het 100x-objectief op de microscoop. Gebruik brightfield-microscopie alleen om kralen te identificeren en te manipuleren en niet om tegelijkertijd op te nemen met fluorescentiebeeldacquisitie. Plaats de kralen op een minimum van minimaal 10 μm van elkaar gemiddeld, en zorg ervoor dat ze vrij zijn van elke vorm van oppervlakte-opsluiting of bevestiging en niet aan elkaar zijn bevestigd of anderszins clusteren.
    4. Zorg ervoor dat de gebiotinyleerde verrode microtubuli stevig aan het oppervlak van de coverslip zijn bevestigd, zonder zichtbare Brownse beweging, zoals bewegingen langs de microtubule-as of vrije uiteinden van microtubuli die in oplossing fluctueren.
    5. Zorg ervoor dat de rhodamine microtubuli via de crosslinking MAP aan gebiotinyleerde microtubuli zijn bevestigd en zichtbaar fluctueren aan hun vrije uiteinden. Oppervlakteaanhechting van niet-gebiotinyleerde microtubuli geeft vaak aan dat PEGylation mogelijk niet succesvol is geweest of dat de PEG-coating is afgebroken.
  2. Motor-aangedreven microtubule glijdende metingen
    1. Druk het motoreiwit van belang uit en zuiver het volgens gepubliceerde protocollen. Bijvoorbeeld, volledige GFP-gelabelde kinesine-5-eiwitten zijn met succes gezuiverd en gebruikt in deze testen53,61, evenals ongelabelde kinesine-1262 en kinesine-1463. Verzamel en visualiseer motor-eiwit crosslinked bundels zoals hierboven beschreven in stap 4 en 5.
    2. Vang met de optische val een gratis enkele kraal in oplossing die Brownse beweging vertoont. Pas de valoptiek zo nodig aan om de kraal naar het midden van het gezichtsveld te verplaatsen. Zorg ervoor dat het gereflecteerde interferentiepatroon van de valbundel symmetrisch is en pas de valoptiek aan om eventuele bundelasymmetrieën op te lossen.
    3. Verplaats het monsterstadium zodat het vrije uiteinde van een rhodamine-microtubuli in een bundel zich direct onder de kraal bevindt en de kraal enkele micron verwijderd is van het overlapgebied met crosslinking-eiwitten om door de valstraal geïnduceerde fotobleaching te minimaliseren. Laat de kraal in de Z-as zakken totdat deze botst met de microtubuli. Zorg ervoor dat u de kraal voorzichtig laat zakken en duw de kraal niet tegen het oppervlak van de deklip, omdat dit kan leiden tot kleven aan het oppervlak van de deklip.
    4. Schakel de val kort uit om met het brightfield-kanaal de beweeglijkheid van de kraal te observeren die aan de glijdende microtubuli is bevestigd. Bij het uitvoeren van motoreiwittests zal de bijgevoegde kraal richting bewegen terwijl de microtubuli uit elkaar glijden. Activeer de val opnieuw en vang de kraal opnieuw.
    5. Begin met het opnemen van fluorescentiegegevens in de drie (488 nm, 561 nm, 640 nm) kanalen met een snelheid van 1-2 frames per s met behulp van het laservermogen en de belichtingstijden die in stap 5 hierboven zijn geoptimaliseerd.
    6. Registreer met behulp van de trapping-computersoftware spanningsgegevens van de positiegevoelige fotodetector (X-, Y- en SUM-intensiteitssignalen), de nanopositioneringsfase (X-, Y- en Z-coördinaten) en de sluiterstatus van de TIRF-camera. Begin met het digitaliseren van deze valspanningswaarden met behulp van een speciaal voltage input data acquisition board dat wordt bestuurd door geschikte software (zoals op maat geschreven LabView-code) met een snelheid van 1-10 kHz, afhankelijk van de experimentele vereisten.
    7. Controleer het krachtsignaal wanneer gegevens worden verkregen en let goed op eventuele anomalieën die een succesvolle gegevensverzameling kunnen verstoren.
      OPMERKING: De anomalieën omvatten, maar zijn niet beperkt tot (1) andere kralen die in de val bewegen, (2) de kraal die voortijdig uit de val ontsnapt, en (3) plotselinge dalingen van kracht en daaropvolgende falen om de kracht tegen de val opnieuw in te zetten, wat wijst op problemen met de rigor kinesinemoleculen op het oppervlak van de kraal.
    8. Deactiveer na de meting de val om de kraal vrij te maken en herhaal met een nieuwe kraal en nieuwe microtubuli totdat het vereiste aantal experimentele herhalingen is bereikt.
  3. Passieve crosslinking weerstandsmetingen
    1. Druk de niet-motorische crosslinking-eiwitten van belang uit en zuiver deze volgens gepubliceerde protocollen. Bijvoorbeeld, volledige GFP-gelabelde PRC1 43,54,57 en een dimerische NuMA afgeknotte constructie 56 zijn met succes gebruikt in deze assays. Stel de crosslinked bundels samen en visualiseer ze zoals hierboven beschreven in stap 4 en 5.
    2. Identificeer een geschikte microtubule-bundel die slechts twee microtubuli bevat, één gebiotinyleerd met volledige oppervlakteaanhechting en één niet-gebiotinyleerde microtubuli die gedeeltelijk vrij is in oplossing; dit geeft een vrij uiteinde om een kraal te bevestigen en garandeert dat de kraal niet aan de oppervlaktegebonden microtubuli is bevestigd en is uitgelijnd op de X- of Y-as, zodat de podiumbeweging langs slechts één as zal zijn.
    3. Gebruik de optische val om een vrije kraal vast te leggen die Brownse beweging ondergaat. Zodra de kraal is gevangen, verplaatst u de kraal voorzichtig naar de geselecteerde microtubulebundel, zodat er tijdens het proces geen andere kralen in de val worden getrokken. Zorg ervoor dat de kraal zich enkele micron verwijderd is van het overlapgebied dat crosslinking-eiwitten bevat om fotobleaching van de GFP-tag te minimaliseren.
    4. Laat de kraal voorzichtig in de Z-as zakken totdat deze contact maakt met de rand van het vrije segment van de rhodaminemicrotubuli. Trek voorzichtig omhoog en beweeg loodrecht op de microtubule-as om te controleren op bevestiging door de rhodamine microtubule te observeren die buigt en de kraalpositie volgt. Als het niet is bevestigd, herhaalt u het zachte stoten van de kraal op de microtubuli totdat deze is bevestigd.
    5. Lijn de rhodaminemicrotubuli zorgvuldig opnieuw uit langs de microtubule-as van de aan het oppervlak bevestigde microtubule door de nanopositioneringsfase te verplaatsen en stel de parameters in voor het automatisch trekken van de microtubulebundel. Stel de richting in langs de parallelle as van de microtubuli, stel de gewenste treksnelheid in (25-200 nm / s is een nuttig bereik van snelheden) en de gewenste trektijd (ongeveer 30 s tot 2 min) afhankelijk van de overlaplengte.
    6. Begin met het opnemen van fluorescentiegegevens in de drie (488 nm, 561 nm, 640 nm) kanalen met een snelheid van 1-2 frames per seconde. Gebruik laservermogens en belichtingstijden die zijn geoptimaliseerd in stap 5 hierboven.
    7. Start geautomatiseerde fasebeweging en neem overvulgegevens op van de positiegevoelige detector, fase en TIRF-camerastatus. Controleer op factoren die de gegevensverzameling kunnen verstoren, waaronder maar niet beperkt tot (1) een andere kraal die de val binnendringt, (2) voortijdig verlies van microtubule crosslinking of (3) kraalontlading van de rhodamine microtubule.
    8. Deactiveer de val om de kraal los te laten en herhaal het experiment naar wens. Een typische monsterkamer kan ongeveer 30 minuten worden gebruikt voordat de afbraak van de bundels en verlies van eiwitactiviteit optreedt.
      OPMERKING: Degradatie-effecten variëren per gebruikte crosslinker, maar kunnen zich manifesteren als de vorming van statische puncta op de microtubuli of het oppervlak, het verlies van microtubulefluctuaties die wijzen op niet-specifieke binding, of het onvermogen om geloofwaardig kralen aan microtubuli te hechten.

7. Analyse van gegevens en correlatie van fluorescentiebeelden met optische valrecords

OPMERKING: Om de gegevensverzameling te optimaliseren, is het nuttig om twee afzonderlijke computerbesturingssystemen te gebruiken: een voor de optische vangsoftware en een andere voor de fluorescentiebeeldvorming. Deze opstelling maakt snelle gegevensverzameling mogelijk in zowel experimentele modaliteiten als elimineert nano- en microsecondevertragingen in de uitvoering van de werking die in de gegevens worden geïntroduceerd, die kunnen optreden bij het gebruik van een enkele CPU.

  1. Digitaliseer de optische vanggegevens met een snelheid die is geoptimaliseerd voor de gebruikte motorische of niet-motorische crosslinking-eiwitten en hun verwachte stappensnelheden (bijvoorbeeld meestal tussen 1-10 kHz).
  2. Registreer X-, Y- en SUM-spanningssignalen van de positiegevoelige fotodetector, evenals de X-, Y- en Z-positiegegevens van de nanopositioneringsfase met behulp van speciale software voor het besturen van de optische val en het bemonsteren van de digitale spanningssignalen van deze componenten.
  3. Neem het digitale signaal van de camera op met een extra spanningsingangskanaal op het optische data-acquisitiebord. Dit maakt correlatie mogelijk van de fluorescentiebeeldvormingsgegevens met de optische vangtijdsporen. Begin met het verzamelen van gegevens met de optische val voordat de beeldvorming wordt gestart, zodat het camerasignaal van het eerste frame correct wordt opgenomen.
  4. Gemiddelde van de onbewerkte tijdreeksgegevens die zijn verkregen bij hoge bemonsteringsfrequenties met behulp van een geschikte filtermethode, zoals schuifvenster, mediaanfilter of Gaussisch filter, afhankelijk van de behoeften.
  5. Kwantificeer de fluorescentiebeeldtijdreeksgegevens met behulp van methoden zoals linescan-analyse, waarbij de pixelintensiteitswaarde over de lengte van het microtubulegebied wordt berekend. Identificeer uit deze linescan-trajecten de randen van de microtubuli en dus de overlapgebieden. Gebruik bovendien de fluorescentie-intensiteit van het crosslinker-eiwitkanaal om eiwitlokalisatie, concentratie en dichtheid te berekenen.
  6. Correlatie van kracht en beeldgegevens is een essentiële output van dit experimentele systeem. Selecteer en gemiddelde bijvoorbeeld alle krachtgegevenspunten binnen een bepaald camerabelichtingsgebied (aangegeven door de bijbehorende digitale signaalpiek in het camerakanaal) om direct te vergelijken met het overeenkomstige fluorescentiebeeldframe. Extraheer vervolgens de relaties tussen krachtgrootte en het aantal crosslinking-eiwitten, overlaplengte of crosslinkerverdeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De bereiding van microtubulibundels die geschikt zijn voor biofysische analyse wordt als succesvol beschouwd als aan een aantal van de belangrijkste criteria wordt voldaan. Ten eerste moet beeldvorming in drie kleuren twee uitgelijnde microtubuli onthullen met een concentratie van crosslinking-eiwit dat bij voorkeur het overlapgebied versiert (figuur 5B, C en figuur 6B). Idealiter moet de afstand tussen de overlaprand en het vrije uiteinde van de rhodaminemicrotubuli ten minste 5 μm zijn om voldoende fysieke ruimte te bieden tussen de vangbundel en de met fluorescentie gelabelde eiwitten. Ten tweede moet er een minimaal achtergrondfluorescentiesignaal zijn in regio's zonder gebiotinyleerde verrode microtubuli, met name uit hetzelfde kanaal waarmee het crosslinking-eiwit is gelabeld. Hoge achtergrondfluorescentie is indicatief voor slechte dekkingslippassivering en een hoge concentratie van glasgebonden eiwitten, die waarschijnlijk niet-specifiek zullen interageren met de microtubuli of vangkraal. Bovendien suggereert de aanwezigheid van kleine ronde puncta of korte fragmenten in een van de microtubule-beeldvormingskanalen dat microtubule-polymerisatie en -verduidelijking niet succesvol waren of dat de microtubuli verouderd of beschadigd waren.

Ten derde moeten de kralen die worden gebruikt voor het vangen verschijnen als enkele kralen en niet in klonten die veel kralen bevatten. Het is waarschijnlijk dat een klein deel van de kralen onomkeerbaar aan het oppervlak zal hechten, maar een aanzienlijk deel moet worden waargenomen als individuele deeltjes die in de monsterkamer diffuus zijn. Overmatig klonteren kan vaak worden verlicht door de kralen minstens 10 minuten te soniceren voordat ze in de kamer stromen. Ten vierde zou het bevestigen van een kraal aan een microtubule moeten resulteren in een goede hechting, waarbij de kraal gebonden blijft wanneer het vanglaserlicht wordt gesloten. De kralen mogen niet niet-specifiek blijven plakken wanneer ze in contact worden gebracht met het oppervlak, en zodra een kraal aan de microtubuli is bevestigd, moet het mogelijk zijn om het filament licht te manipuleren (bijvoorbeeld buigen of buigen) voorafgaand aan de meting. Ten slotte moet het mogelijk zijn om veranderingen in de overlaplengte waar te nemen wanneer kracht wordt uitgeoefend of motorische activiteit wordt toegestaan. Als u bijvoorbeeld motoreiwitgestuurd glijden observeert, moet de overlaplengte afnemen met een snelheid die consistent is met de snelheid waarmee motoreiwitten worden getrapt. Bij het onderzoeken van passieve crosslinkers zou de toepassing van kracht moeten resulteren in een verandering in de overlaplengte. Deze outputs geven aan dat de rhodamine microtubule alleen aan de oppervlaktegebonden microtubuli is bevestigd via crosslinking-eiwitten, in plaats van niet-specifiek aan het coverslipoppervlak te kleven.

Wanneer aan deze criteria is voldaan, is het mogelijk om een breed scala aan experimenten uit te voeren om de essentiële biofysische parameters te extraheren die de ensemblemechanica definiëren. Deze assay of soortgelijke assays zijn uitgebreid gebruikt om mitotische crosslinking-eiwitten in eerdere studies te onderzoeken. We hebben bijvoorbeeld aangetoond dat ensembles van het essentiële mitotische motoreiwit kinesine-5 microtubuli-glijden kunnen reguleren door zowel duw- als remkrachten te genereren die lineair schalen met overlaplengte64 (figuur 5). Microtubuli in een antiparallel of parallelle geometrie werden verknoopt door een klein ensemble van kinesine-5-moleculen. Terwijl deze motoreiwitten naar de pluspunten van de microtubule stapten, werden de filamenten uit elkaar geschoven (antiparallel) of snel heen en weer gefluctueerd (parallel). Door de mechanica binnen deze mini-spindelgeometrie te monitoren, vonden we de grootte van de kracht geschaald, zowel met de lengte van de filamentoverlapping, als met het aantal crosslinking motoreiwitten. Wanneer microtubuli sneller werden verplaatst dan de onbelaste stapsnelheid van kinesine-5, zorgden de motoreiwitten voor een resistieve remkracht. Er werd ook vastgesteld dat het C-terminal staartdomein nodig is voor efficiënte crosslinking en krachtgeneratie61 (figuur 5B, C). Het eiwit over de volledige lengte is in staat om aanhoudende krachten te genereren die plateau wanneer alle motoreiwitten hun individuele stalkracht bereiken (figuur 5D). De kinesine-5-motor die zijn C-terminale staart mist, genereert echter maximale krachten die bijna vijf keer kleiner van omvang zijn (figuur 5E, F). Samen onthullen deze resultaten hoe kinesine-5-eiwitten in ensembles werken om microtubuli polewaarts te duwen tijdens de spindelassemblage en de biofysische functie van essentiële regulerende eiwitdomeinen binnen het molecuul op te helderen.

We hebben ook aangetoond dat ensembles van het niet-motorische mitotische eiwit PRC1 werken als een mechanische dashpot om microtubuli te weerstaan die glijden in anafase spindel midzones54 (figuur 6A-C). PRC1 genereert wrijvingsweerstand die lineair schaalt met treksnelheid, net zoals een mechanische dashpot snelheidsafhankelijke weerstandskrachten produceert. Deze resistieve krachten zijn niet afhankelijk van de lengte van overlappende gebieden tussen microtubuliparen of de lokale crosslinkerdichtheid, maar ze zijn wel sterk afhankelijk van de totale concentratie van geëngageerde PRC1-moleculen (figuur 6D, E). Op basis van deze resultaten wordt voorgesteld dat PRC1-ensembles fungeren als een lekkende zuiger, waarbij compressie van diffusieve crosslinkers een snelheidsafhankelijke weerstand produceert, maar het verlies van crosslinkers bij microtubule plus-ends verlicht grote drukkrachten.

Vergelijkbare testgeometrieën werden ook gebruikt om het mitotische kinesine-12-eiwit Kif1562 te onderzoeken. Door de kracht te meten die werd geproduceerd toen microtubuli uit elkaar werden geduwd, ontdekten Reinemann et al.62 dat Kif15-ensembles filamenten uit elkaar kunnen duwen tot een kritische plateaukracht en het C-terminale staarttethergebied van het eiwit nodig hebben om microtubuli efficiënt te kruislinken en aanhoudende belastingen op te bouwen. Reinemann et al. toonden ook elegant aan dat de kinesine-14 HSET, een minus-end gerichte kinesine, op dezelfde manier antiparallel microtubuli uit elkaar kan schuiven63. Wanneer gemengd met gelijke hoeveelheden van het plus-end gerichte kinesine-5 Eg5-eiwit, dient HSET om Eg5-glijdende activiteit te remmen, waarbij een touwtrekken wordt uitgevoerd voor microtubule glijdende beweging binnen het overlapgebied. Samen tonen deze resultaten allemaal de kracht van directe krachtmeting over actieve microtubulibundels en maken ze duidelijk de noodzaak van het karakteriseren van de eiwitfunctie in de biologisch geschikte netwerkgeometrie.

Figure 1
Figuur 1: Passivering van glazen afdekplaten. (A) Schematische weergave van de opeenvolgende wasstappen, drogen en conjugatie van nr. 1.5 glazen afdekplaten voor amino-silaanconjugatie. (B) Schematische weergave van het protocol voor het covalent koppelen van PEG- en biotine-PEG-groepen aan de glazen afdekplaat, wassen en drogen, en het afdichten van de coverslips onder vacuüm voor kortdurende opslag. Sommige delen van het schema zijn aangepaste afbeeldingen van 65. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Samenstelling van een monsterkamer. (A) Schematische weergave van de assemblage van een monsterstroomkamer met behulp van gepassiveerde coverslips en een standaard 3 in microscoopglaasje. (B) Assemblage en typische afmetingen van een- en tweekanaals stroomkamers die zijn geoptimaliseerd voor optische vang- en fluorescentiebeeldvorming van microtubulibundels. Sommige delen van het schema zijn aangepaste afbeeldingen van 65. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Generatie van oppervlakte-geïmmobiliseerde microtubulibundels voor optische vangst en TIRF-gebaseerde beeldvorming. Schema's die de stapsgewijze assemblage van optisch vangbare microtubulibundels weergeven. (A) Reagentia worden binnengestroomd vanuit de toegangspoort van de kamer en vloeistof wordt afgevoerd uit het uitgangskanaal. (B) Streptavidin (blauw) bindt eerst aan de biotine-PEG-locaties op de coverslip en (C) caseïne (rood) wordt geïntroduceerd als een extra blokkerend middel. (D) Gebiotinyleerde ver rood gelabelde microtubuli (magenta) worden geïntroduceerd en mogen gedurende ~ 5 minuten incuberen, gevolgd door de toevoeging van (E) crosslinking eiwit (groen), (F) niet-gebiotinyleerde rhodamine-gelabelde microtubuli (rood), en, ten slotte, (G) rigor kinesine-gecoate microsferen gesuspendeerd in de juiste reactiebuffer voor bevestiging aan de bundel en optische trap-gebaseerde manipulatie. (H) De kamer is afgesloten met heldere nagellak om verdamping van de monsterbuffer tijdens experimenten te voorkomen. Sommige delen van het schema zijn aangepaste afbeeldingen van 65. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Schema van het optische pincet/TIRF microscoopsysteem. Een optische val met één bundel wordt geïntroduceerd in het optische pad van een op objectieven gebaseerd TIRF-beeldvormingssysteem in een omgekeerde microscoop. Een kortdoorlaatfilter dat net onder het objectief wordt geplaatst, maakt het mogelijk om de valstraal naar de achteropening van het objectief te leiden, waar deze net boven het oppervlak van de monsterdeksellip wordt scherpgesteld en een optische val vormt. Een positiegevoelige fotodetector verzamelt het doorgelaten licht, waardoor positie- en krachtdetectie van de kraal mogelijk is. Meerdere kanalen van fluorescentiegegevens kunnen worden verkregen via TIRF-beeldvorming en worden vastgelegd op een zeer gevoelige EMCCD- of sCMOS-camera. Een breedspectrumlichtbron wordt gebruikt om vangkralen in beeld te brengen tijdens het opzetten van de experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Representatief voorbeeld van het meten van krachtproductie door kinesine-5. (A) Schematische weergave van de experimentele geometrie, met microtubuli die door kinesine-5-motoreiwitten zijn verknoopt en die kracht genereren terwijl ze de filamenten uit elkaar schuiven, die wordt gemeten met een optische val. Representatieve fluorescentiebeelden van bundels bestaande uit oppervlakte-geïmmobiliseerde microtubuli, GFP-kinesine-5 en rhodamine-gelabelde transportmicrotubuli. (B) Volledige lengte en (C) C-terminale staart afgeknotte kinesine-5 constructies werden gebruikt. Schaalstaven = 5 μm. Monsterrecords van krachtproductie voor (D) volledige lengte en (E) staartloos worden weergegeven, met gemiddelde kracht uitgezet als functie van de tijd. (F) Plots van de maximale plateaukracht en de bijbehorende overlaplengte voor beide constructen worden getoond, waaruit blijkt dat het kinesineconstruct over de volledige lengte overlap-lengte afhankelijke krachten genereert die aanzienlijk groter in omvang zijn dan het staartloze kinesineconstruct. Dit cijfer is gewijzigd van61. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Representatief voorbeeld van het meten van wrijvingskrachten door PRC1. (A) Schematische weergave van de experimentele geometrie, met microtubuli die door GFP-PRC1 (eiwitregulator van cytokinese) crosslinking-eiwitten worden gekruist die weerstand genereren terwijl de filamenten uit elkaar worden geschoven door de coverslip met constante snelheid te verplaatsen. (B) Representatieve tijdreeksfluorescentiebeelden die de bewegende oppervlakte-geïmmobiliseerde verrode microtubuli, GFP-PRC1-moleculen die condenseren binnen de krimpende overlap en de vrije rhodaminemicrotubuli die met de kraal worden vastgehouden, tonen. Tijdsinterval tussen frames = 6 s; Schaalbalk = 5 μm. (C) Voorbeeld krachtspoor dat wrijvingskracht toont tijdens de glijdende gebeurtenis, met verstoringsgebeurtenis en krachtval tot nul (~ 55 sec) zodra de overlap 0 μm bereikte. (D) Correlatie van gemiddelde kracht en geïntegreerde GFP-intensiteit binnen de overlap bij vier verschillende glijdende snelheden. (E) Gemiddelde hellingen en berekende pasvormfouten van sporen in (D) laten zien dat de kracht per PRC1-molecuul lineair toeneemt als functie van de glijdende snelheid. Dit cijfer is gewijzigd van66. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Microtubule-netwerken worden gebruikt door talloze celtypen om een breed scala aan taken uit te voeren die fundamenteel mechanisch van aard zijn. Om te beschrijven hoe cellen functioneren in zowel gezonde als ziektetoestanden, is het van cruciaal belang om te begrijpen hoe deze netwerken op micronschaal worden georganiseerd en gereguleerd door de eiwitten ter grootte van een nanometer die ze gezamenlijk bouwen. Biofysische hulpmiddelen zoals een optisch pincet zijn zeer geschikt om de mechanochemie van belangrijke eiwitten op deze schaal te onderzoeken. Als gevolg van de diversiteit van de microtubule-netwerkfunctie zijn complexe experimentele geometrieën onderzocht die optische pincetten gebruiken, waaronder krachtafhankelijke analyses van microtubule tipdynamica67,68, het genereren van krachten door kinetochore componenten 69,70,71, en dumbbell trap-geometrieën met twee stralen om microtubule filamentmechanica te onderzoeken 72,73 . In dit protocol hebben we nieuwe methoden beschreven voor het reconstitueren van fundamentele microtubulinetwerkmotieven zoals bundels en het toepassen van de biofysische hulpmiddelen van fluorescentiemicroscopie met één molecuul en optische vangmethoden om kritieke informatie over cellulaire functie te beoordelen.

Hoewel de meeste individuele stappen in dit protocol technisch eenvoudig zijn, zijn er samen tal van potentiële faalpunten die zich kunnen voordoen, en er moet op elk punt aanzienlijke zorg worden besteed aan succesvolle metingen. Ten eerste, zoals bij veel microscoopgebaseerde experimentele testen met één molecuul, is een goede oppervlaktepassivering de sleutel, omdat niet-specifieke binding van eiwitten of kralen aan het coverslipoppervlak bijna altijd de succesvolle voltooiing van deze experimenten verhindert. Ten tweede moet de expressie en zuivering van de crosslinking-eiwitten van belang worden geoptimaliseerd om hoogwaardige single-species producten te garanderen, omdat verontreinigingen de test op verschillende manieren kunnen verstoren, zoals het induceren van overmatige bundeling van filamenten of interfereren met de aanhechting van kralen en microtubuli, om nog maar te zwijgen van het introduceren van complexiteiten in de interpretatie van krachtgegevens. Ten derde vereist het handhaven van een robuuste bead-microtubule-bevestiging hoogwaardige rigor kinesinemotoren die met hoge dichtheid aan de vangkraal zijn gebonden, zodat meerdere kinesine-filamentbevestigingspunten kunnen worden gemaakt. Deze bindingen kunnen gedurende enkele minuten 10 s pN kracht weerstaan, wat geschikt is voor een breed scala aan potentiële studiesystemen die deze techniek gebruiken.

We merken ook op dat er veel manieren zijn waarop dit protocol kan worden aangepast aan de instrumentatie- of biologische systeembehoeften van de eindgebruiker. Hoewel we experimenten hebben beschreven die GFP-gelabelde crosslinking-eiwitten en rood / ver rood gelabelde microtubuli gebruiken, is het ook mogelijk om fluorescerende etikettering indien nodig te verwisselen. Als de gebruiker bijvoorbeeld niet genoeg laserlijnen heeft om driekleurige TIRF-microscopie uit te voeren, is het mogelijk om gegevens van hoge kwaliteit te verkrijgen door microtubuli differentieel te labelen met dezelfde fluorofoor, maar met verschillende concentraties (bijv. Dim versus helder) voor elke soort microtubule. Evenzo is het misschien niet altijd mogelijk of voordelig om een fluorescerend label toe te voegen aan het crosslinking-eiwit. In deze situatie zou bepaalde experimentele informatie zoals crosslinkerconcentratie of lokalisatie niet toegankelijk zijn, maar de bepaling van parameters zoals microtubule overlaplengte zou nog steeds kunnen worden gemaakt. We verwachten dat dit protocol zeer aanpasbaar is voor veel verschillende soorten en combinaties van microtubule crosslinking eiwitten. De introductie van meerdere crosslinking-eiwitten zou waarschijnlijk de verwijdering van fluorescentietags uit een van de eiwitten of de uitsluiting van fluorescerende labels van een van de twee microtubulitypen vereisen om beeldvormingsmogelijkheden in een geschikte bandbreedte vrij te maken (bijvoorbeeld met behulp van een rood of verrood eiwitgecodeerd label voor het crosslinking-eiwit). Het is onwaarschijnlijk dat meer dan drie fluorescerende kanalen kunnen worden gebruikt met deze op TIRF gebaseerde test, hoewel er zeker flexibiliteit is in hoe die worden verdeeld, wat zorgvuldig moet worden overwogen bij het plannen van een experiment. Ten slotte is het waarschijnlijk dat deze test kan worden aangepast om verschillende netwerkgeometrieën en soorten cytoskeletale filamenten te bestuderen. De analyse van de mechanica van microtubule vertakking, gemedieerd door augmin en het gamma-tubuline ringcomplex, kon gemakkelijk worden onderzocht en in beeld gebracht. Bovendien zouden andere verknoopte cytoskeletale netwerken, zoals die met actine, septines of intermediaire filamenten, heel goed vatbaar zijn om met deze hulpmiddelen te bestuderen, ervan uitgaande dat de juiste modificaties en orthogonale hechtingsstrategieën aan de coverslip en vangkraal worden gemaakt.

Tot slot hebben we een protocol beschreven voor de reconstitutie van actieve krachtgenererende microtubulenetwerken, die kunnen worden afgebeeld met behulp van fluorescentiemicroscopietools met één molecuul en kunnen worden gemanipuleerd via een optische val met één bundel. We hebben het nut van deze methode aangetoond met datasets die de ensemblemechanica van zowel een mitotische motor als een niet-motorisch eiwit onthullen. We verwachten dat veel soorten sterk georganiseerde microtubule-netwerken, zoals die in neuronen, epitheelweefsel of cardiomyocyten, met deze hulpmiddelen kunnen worden geanalyseerd, waardoor nieuwe principes van biofysische functie voor het dynamische cytoskelet worden onthuld.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs willen steun erkennen van R21 AG067436 (naar JP en SF), T32 AG057464 (naar ET) en Rensselaer Polytechnic Institute School of Science Startup Funds (naar SF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nm IPG Photonics YLR-10-1064-LP
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applications Chroma TRF89901v2
6x His Tag Antibody, Biotin Conjugate Invitrogen #MA1-21315-BTIN
Acetone, HPLC grade Fisher Scientific 18-608-395
Alpha casein from bovine milk Sigma 1002484390
ATP Fisher Scientific BP413-25
Benzonase Novagen 70746-3
Biotin-PEG-SVA-5000 Laysan Bio, Inc. NC0479433
BL21 (DE3) Rosetta Cells Millipore Sigma 71-400-3
Catalase MP Biomedicals LLC 190311
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objective Nikon N/A
Chloramphenicol ACROS Organics 227920250
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips Fisher Scientific C14784
Delicate Task Wipers Kimberly-Clark 34120
Dextrose Anhydrous Fisher Scientific BP3501
D-Sucrose Fisher Scientific BP220-1
DTT Fisher Scientific BP172-25
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 Bath LAUDA-Brinkmann 27709
EDTA Fisher Scientific BP118-500
EGTA Millipore Corporation 32462-25GM
FIJI / Image J https://fiji.sc/ N/A
Frosted Microscope Slides Corning 12-553-10 75mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm
Glucose Oxidase MP Biomedicals LLC 195196 Type VII, without added oxygen
GMPCPP Jena Biosciences JBS-NU-405S Can be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C
Gold Seal-Cover Glass Thermo Scientific 3405
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Imidazole Fisher Scientific 03196-500
IPTG Fisher Scientific BP1755-10
Laboratory dessicator Bel-Art 999320237 190mm plate size
Kanamycin Sulfate Fischer Scientific BP906-5
KIF5A K439 (aa:1-439)-6His Gilbert Lab, RPI N/A doi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
Kimwipe Kimberley Clark Z188956 lint-free tissue
Immersion Oil, Type B Cargille 16484
Lens Tissue ThorLabs MC-5
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm) Nikon N/A
Lysozyme MP Biomedicals LLC 100834
Magnesium Acetate Tetrahydrate Fisher Scientific BP215-500
Microfuge 18 Beckman Coulter 367160
MPEG-SVA MW-5000 Laysan Bio, Inc. NC0107576
Neutravadin Invitrogen PI31000
Nikon Ti-E inverted microscope Nikon N/A Nikon LuN4 Laser
Ni-NTA Resin Thermo Scientific 88221
Oligonucleotide - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA
GAACTTTCAAAGGC		 IDT N/A
Oligonucleotide - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA
ACTCAGAATAGGTG		 IDT N/A
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mm Beckman Coulter 343755
Optima-TLX Ultracentrifuge Beckman Coulter 361544
Paclitaxel (Taxol equivalent) Thermo Fisher Scientific P3456
PIPES ACROS Organics 172615000
PMSF Millipore 7110-5GM
Porcine Tubulin, biotin label Cytoskeleton, Inc. T333P
Porcine Tubulin, HiLyte 647 Fluor Cytoskeleton, Inc. TL670M far red labelled
Porcine Tubulin, Rhodamine Cytoskeleton, Inc. TL590M
Porcine Tubulin, Tubulin Protein Cytoskeleton, Inc. T240
Potassium Acetate Fisher Scientific BP364-500
Prime 95B sCMOS camera Photometric N/A
Quadrant Detector Sensor Head ThorLabs PDQ80A
Quikchange Lightning Kit Agilent Technologies 210518
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Square Cover Glasses Corning 12-553-450 18 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm
Streptavidin Microspheres Polysciences Inc. 24162-1
Superose-6 Column GE Healthcare 29-0915--96
TCEP Thermo Scientific 77720
TLA-100 Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter 343840
Ultrasonic Cleaner (Sonicator) Vevor JPS-08A(DD) 304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power
Vectabond APTES solution Vector Laboratories SP-1800-7
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-D S.C. Johnson SJN695237

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bentley, M., Banker, G. The cellular mechanisms that maintain neuronal polarity. Nature Reviews Neuroscience. 17 (10), 611-622 (2016).
  2. Yang, R., et al. A novel strategy to visualize vesicle-bound kinesins reveals the diversity of kinesin-mediated transport. Traffic. 20 (11), 851-866 (2019).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: Transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  4. Helmke, K. J., Heald, R., Wilbur, J. D. Interplay between spindle architecture and function. International Review of Cell and Molecular Biology. 306, (2013).
  5. Elting, M. W., Suresh, P., Dumont, S. The spindle: integrating architecture and mechanics across scales. Trends in Cell Biology. 28 (11), 896-910 (2018).
  6. Kapoor, T. Metaphase spindle assembly. Biology. 6 (1), 8 (2017).
  7. Svoboda, K., Block, S. M. Force and velocity measured for single kinesin molecules. Cell. 77 (5), 773-784 (1994).
  8. Svoboda, K., Schmidt, C. F., Schnapp, B. J., Block, S. M. Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry. Nature. 365 (6448), 721-727 (1993).
  9. Schnitzer, M. J., Visscher, K., Block, S. M. Force production by single kinesin motors. Nature Cell Biology. 2 (10), 718-723 (2000).
  10. Andreasson, J. O. L., Shastry, S., Hancock, W. O., Block, S. M. The mechanochemical cycle of mammalian kinesin-2 KIF3A/B under load. Current Biology. 25 (9), 1166-1175 (2015).
  11. Bensel, B. M. The mechanochemistry of the kinesin-2 kif3ac heterodimer is related to strain-dependent kinetic properties of kif3a and kif3c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15632-15641 (2020).
  12. Gilbert, S. P., Guzik-Lendrun, S., Rayment, I. Kinesin-2 motors: kinetics and biophysics. Journal of Biological Chemistry. 293 (12), 4510-4518 (2018).
  13. Okada, Y., Higuchi, H., Hirokawa, N. Processivity of the single-headed kinesin KIF1A through binding to tubulin. Nature. 424 (6948), 574-577 (2003).
  14. Budaitis, B. G., et al. Pathogenic mutations in the kinesin-3 motor KIF1A diminish force generation and movement through allosteric mechanisms. Journal of Cell Biology. 220 (4), 202004227 (2021).
  15. Tomishige, M., Klopfenstein, D. R., Vale, R. D. Conversion of Unc104/KIF1A kinesin into a processive motor after dimerization. Science. 297 (5590), 2263-2267 (2002).
  16. Siddiqui, N., et al. Force generation of KIF1C is impaired by pathogenic mutations. bioRxiv. , (2021).
  17. Valentine, M. T., Fordyce, P. M., Krzysiak, T. C., Gilbert, S. P., Block, S. M. Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro. Nature Cell Biology. 8 (5), 470-476 (2006).
  18. Valentine, M. T., Gilbert, S. P. To step or not to step? How biochemistry and mechanics influence processivity in Kinesin and Eg5. Current Opinion in Cell Biology. 19 (1), 75-81 (2007).
  19. Jannasch, A., Bormuth, V., Storch, M., Howard, J., Schäffer, E. Kinesin-8 is a low-force motor protein with a weakly bound slip state. Biophysical Journal. 104 (11), 2456-2464 (2013).
  20. Bormuth, V., Varga, V., Howard, J., Schäffer, E. Protein friction limits diffusive and directed movements of kinesin motors on microtubules. Science. 325 (5942), 870-873 (2009).
  21. Gennerich, A., Carter, A. P., Reck-Peterson, S. L., Vale, R. D. Force-induced bidirectional stepping of cytoplasmic dynein. Cell. 131 (5), 952-965 (2007).
  22. Mallik, R., Carter, B. C., Lex, S. A., King, S. J., Gross, S. P. Cytoplasmic dynein functions as a gear in response to load. Nature. 427 (6975), 649-652 (2004).
  23. Redwine, W. B., et al. The human cytoplasmic dynein interactome reveals novel activators of motility. eLife. 6, 28257 (2017).
  24. Belyy, V., Hendel, N. L., Chien, A., Yildiz, A. Cytoplasmic dynein transports cargos via load-sharing between the heads. Nature Communications. 5 (1), 5544 (2014).
  25. Belyy, V., et al. The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition. Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).
  26. Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
  27. Forth, S., Kapoor, T. M. The mechanics of microtubule networks in cell division. Journal of Cell Biology. 216 (6), 1525-1531 (2017).
  28. Dumont, S., Mitchison, T. J. Force and length in the mitotic spindle. Current Biology. 19 (17), 749-761 (2009).
  29. McIntosh, J. R., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I. Biophysics of mitosis. Quarterly Reviews of Biophysics. 45 (2), 147-207 (2012).
  30. McIntosh, J., Hays, T. A brief history of research on mitotic mechanisms. Biology. 5 (4), 55 (2016).
  31. Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. Mitotic functions of kinesin-5. Seminars in Cell and Developmental Biology. 21 (3), 255-259 (2010).
  32. Kapitein, L. C., et al. The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks. Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).
  33. Vukušić, K., Ponjavić, I., Buđa, R., Risteski, P., Tolić, I. M. Microtubule-sliding modules based on kinesins EG5 and PRC1-dependent KIF4A drive human spindle elongation. Developmental Cell. 56 (9), 1253-1267 (2021).
  34. Sturgill, E. G., Ohi, R. Kinesin-12 differentially affects spindle assembly depending on its microtubule substrate. Current Biology. 23 (14), 1280-1290 (2013).
  35. Drechsler, H., McHugh, T., Singleton, M. R., Carter, N. J., McAinsh, A. D. The Kinesin-12 Kif15 is a processive track-switching tetramer. eLife. 3, 01724 (2014).
  36. Tanenbaum, M. E., et al. Kif15 Cooperates with Eg5 to promote bipolar spindle assembly. Current Biology. 19 (20), 1703-1711 (2009).
  37. Mountain, V., et al. Cross-links microtubules in the mammalian mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 147 (2), 351-365 (1999).
  38. Norris, S. R., et al. Microtubule minus-end aster organization is driven by processive HSET-tubulin clusters. Nature Communications. 9 (1), 2659 (2018).
  39. Cai, S., Weaver, L. N., Ems-McClung, S. C., Walczak, C. E. Proper organization of microtubule minus ends is needed for midzone stability and cytokinesis. Current Biology. 20 (9), 880-885 (2010).
  40. Pamula, M. C., et al. High-resolution imaging reveals how the spindle midzone impacts chromosome movement. Journal of Cell Biology. 218 (8), 2529-2544 (2019).
  41. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  42. Zhu, C., Lau, E., Schwarzenbacher, R., Bossy-Wetzel, E., Jiang, W. Spatiotemporal control of spindle midzone formation by PRC1 in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6196-6201 (2006).
  43. Subramanian, R., et al. Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein. Cell. 142 (3), 433-443 (2010).
  44. Elting, M. W., Prakash, M., Udy, D. B., Dumont, S. Mapping load-bearing in the mammalian spindle reveals local kinetochore fiber anchorage that provides mechanical isolation and redundancy. Current Biology. 27 (14), 2112-2122 (2017).
  45. Fant, X., Merdes, A., Haren, L. Cell and molecular biology of spindle poles and NuMA. International Review of Cytology. 238, 1-57 (2004).
  46. Merdes, A., Heald, R., Samejima, K., Earnshaw, W. C., Cleveland, D. W. Formation of spindle poles by dynein/dynactin-dependent transport of NuMA). Journal of Cell Biology. 149 (4), 851-861 (2000).
  47. Maddox, P., Straight, A., Coughlin, P., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Direct observation of microtubule dynamics at kinetochores in Xenopus extract spindles: Implications for spindle mechanics. Journal of Cell Biology. 162 (3), 377-382 (2003).
  48. Maddox, P., Desai, A., Oegema, K., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Poleward microtubule flux is a major component of spindle dynamics and anaphase A in mitotic Drosophila embryos. Current Biology. 12 (19), 1670-1674 (2002).
  49. LaFountain, J. R., Cohan, C. S., Siegel, A. J., LaFountain, D. J. Direct visualization of microtubule flux during metaphase and anaphase in crane-fly spermatocytes. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5724-5732 (2004).
  50. Pavin, N., Tolić, I. M. Mechanobiology of the mitotic spindle. Developmental Cell. 56 (2), 192-201 (2021).
  51. Vukušić, K., Tolić, I. M. Anaphase B: Long-standing models meet new concepts. Seminars in Cell and Developmental Biology. 117, 127-139 (2021).
  52. Vukušić, K., et al. Microtubule sliding within the bridging fiber pushes kinetochore fibers apart to segregate chromosomes. Developmental Cell. 43 (1), 11-23 (2017).
  53. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  54. Gaska, I., Armstrong, M. E., Alfieri, A., Forth, S. The mitotic crosslinking protein PRC1 acts like a mechanical dashpot to resist microtubule sliding. Developmental Cell. 54 (3), 367-378 (2020).
  55. Woll, K. A., et al. An allosteric propofol-binding site in kinesin disrupts kinesin-mediated processive movement on microtubules. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11283-11295 (2018).
  56. Forth, S., Hsia, K. C., Shimamoto, Y., Kapoor, T. M. Asymmetric friction of nonmotor MAPs can lead to their directional motion in active microtubule networks. Cell. 157 (2), 420-432 (2014).
  57. Alfieri, A., Gaska, I., Forth, S. Two modes of PRC1-mediated mechanical resistance to kinesin-driven microtubule network disruption. Current Biology. 31 (12), 2495-2506 (2021).
  58. Koch, M. D., Shaevitz, J. W. Introduction to optical tweezers. Methods in Molecular Biology. 1486, 3-24 (2017).
  59. Sarshar, M., Wong, W. T., Anvari, B. Comparative study of methods to calibrate the stiffness of a single-beam gradient-force optical tweezers over various laser trapping powers. Journal of Biomedical Optics. 19 (11), 115001 (2014).
  60. Van Mameren, J., Wuite, G. J. L., Heller, I. Introduction to optical tweezers: Background, system designs, and commercial solutions. Methods in Molecular Biology. 783, 1-20 (2011).
  61. Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9, 51131 (2020).
  62. Reinemann, D. N., et al. Collective force regulation in anti-parallel microtubule gliding by dimeric Kif15 kinesin motors. Current Biology. 27 (18), 2810-2820 (2017).
  63. Reinemann, D. N., Norris, S. R., Ohi, R., Lang, M. J. Processive kinesin-14 HSET exhibits directional flexibility depending on motor traffic. Current Biology:CB. 28 (14), 2356-2362 (2018).
  64. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  65. SMART - Servier Medical ART. , Available from: https://smart.servier.com/ (2022).
  66. Gaska, I., Armstrong, M., Alfieri, A., Forth, S. The mitotic crosslinking protein PRC1 acts as a mechanical dashpot to resist microtubule sliding. Developmental Cell. 54 (3), 1-14 (2020).
  67. Janson, M. E., De Dood, M. E., Dogterom, M. Dynamic instability of microtubules is regulated by force. Journal of Cell Biology. 161 (6), 1029-1034 (2003).
  68. Kerssemakers, J. W. J., et al. Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution. Nature. 442 (7103), 709-712 (2006).
  69. Powers, A. F., et al. The Ndc80 kinetochore complex forms load-bearing attachments to dynamic microtubule tips via biased diffusion. Cell. 136 (5), 865-875 (2009).
  70. Akiyoshi, B., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
  71. Fong, K. K., et al. Direct measurement of the strength of microtubule attachment to yeast centrosomes. Molecular Biology of the Cell. 28 (14), 1853-1861 (2017).
  72. Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps. Biophysical Journal. 90 (5), 1687-1696 (2006).
  73. Memet, E., et al. Microtubules soften due to cross-sectional flattening. eLife. 7, 34695 (2018).

Tags

Biologie Nummer 183 microtubuli optische vallen mitose enkel molecuul spindel mechanica kinesine microtubule-geassocieerde eiwitten fluorescentie microsopy
Direct meten van krachten binnen gereconstitueerde actieve microtubulibundels
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Palumbo, J., Tai, E., Forth, S.… More

Palumbo, J., Tai, E., Forth, S. Directly Measuring Forces Within Reconstituted Active Microtubule Bundles. J. Vis. Exp. (183), e63819, doi:10.3791/63819 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter