Summary
여기에서는 시험관 내에서 미세소관 다발을 재구성하고 동시 광학 트래핑 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 그 안에 가해지는 힘을 직접 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 활성 미세소관 네트워크 내에서 단백질 앙상블에 의해 생성된 힘과 변위의 나노스케일 수준 측정을 허용합니다.
Abstract
미세소관 네트워크는 소포 수송을 위한 트랙 역할을 하는 것부터 유사분열 동안 염색체 분리를 조절하기 위한 특수 어레이로 작동하는 것까지 광범위한 작업을 수행하기 위해 세포에 사용됩니다. 미세소관과 상호작용하는 단백질에는 활성력과 방향 운동을 생성할 수 있는 키네신 및 다인(dynein)과 같은 모터뿐만 아니라 필라멘트를 고차 네트워크로 가교결합하거나 필라멘트 역학을 조절하는 비모터 단백질이 포함됩니다. 현재까지 미세소관 관련 단백질에 대한 생물물리학적 연구는 소포 수송에 필요한 단일 운동 단백질의 역할에 압도적으로 초점을 맞추었으며, 키네신 및 다인인의 힘 생성 특성 및 기계화학적 조절을 밝히는 데 상당한 진전이 있었습니다. 그러나 유사분열 방추 내에서 필라멘트가 미끄러지는 동안과 같이 미세소관이 화물과 트랙 모두에서 작용하는 공정의 경우 관련된 가교 단백질 앙상블의 생물물리학적 조절에 대해서는 훨씬 덜 이해됩니다. 여기에서는 정제된 미세소관과 유사분열 단백질로 구성된 가교 미세소관 최소 네트워크 내에서 힘 생성 및 반응을 직접 프로빙하는 방법론에 대해 자세히 설명합니다. 미세소관 쌍은 관심 단백질에 의해 가교되고, 하나의 미세소관은 현미경 커버슬립에 고정되고, 두 번째 미세소관은 광학 트랩에 의해 조작됩니다. 동시 전반사 형광 현미경을 사용하면 필라멘트가 떨어져 힘을 생성할 때 이 미세소관 네트워크의 모든 구성 요소를 다채널 시각화할 수 있습니다. 또한 이러한 기술을 사용하여 키네신-5 앙상블이 가하는 미는 힘을 조사하는 방법과 유사분열 MAP PRC1에 의해 가교된 슬라이딩 미세소관 쌍 사이에서 점성 제동력이 어떻게 발생하는지 보여줍니다. 이러한 분석은 스핀들 조립 및 기능의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하며 뉴런 및 극성 상피 세포의 축삭 및 수상 돌기와 같은 다양한 맥락에서 조밀 한 미세 소관 네트워크 역학을 연구하는 데 더 광범위하게 적용될 수 있습니다.
Introduction
세포는 미세소관 네트워크를 사용하여 소포 수송 1,2,3에서 유사분열 4,5,6 동안 염색체 분리에 이르기까지 다양한 기계적 작업을 수행합니다. 분자 운동 단백질 키네신 및 다인(dynein)과 같이 미세소관과 상호 작용하는 많은 단백질은 힘을 생성하고 기계적 부하에 의해 조절됩니다. 이러한 중요한 분자가 어떻게 기능하는지 더 잘 이해하기 위해 연구자들은 광학 트래핑 및 TIRF 현미경과 같은 단일 분자 생물 물리학 적 방법을 사용하여 무부하 스테핑 속도, 처리 성 및 개별 단백질에 대한 힘-속도 관계와 같은 중요한 매개 변수를 직접 모니터링했습니다. 가장 일반적으로 사용되는 실험 기하학은 구형 기하학과 크기가 모터 구동 수송을 받는 소포를 모방한 트래핑 비드에 모터 단백질을 직접 부착하는 것이었습니다. 키네신 -1 7,8,9, 키네신 -2 10,11,12, 키네 신 -313,14,15,16 키네신 -517,18, 키네 신 -8 19,20, 다인 및 다인 복합체21,22, 23,24,25, 이러한 방법으로 연구되었습니다.
그러나 많은 세포 과정에서 운동 및 비 운동 단백질은 트랙 및화물26,27로 미세 소관을 사용합니다. 또한, 미세 소관 필라멘트가 고차 다발로 가교 결합되는 이러한 시나리오에서 이러한 단백질은 단일 단위가 아닌 앙상블로 기능합니다. 예를 들어, 분열하는 체세포 내에서, 조밀한 필라멘트 네트워크는 유사분열 방추 장치(28,29,30)를 구축하기 위해 자기 조직화된다. 극간 스핀들 미세 소관 네트워크는 매우 역동적이며 스핀들 극을 가리키는 마이너스 엔드와 스핀들 적도 근처에서 겹치는 플러스 엔드로 크게 배열됩니다. 스핀들 내의 필라멘트는 운동 단백질, 예컨대 키네신-5 31,32,33, 키네신-12 34,35,36 및 키네신-1437,38,39 또는 PRC140,41,42,43 또는 NuMA 44,45와 같은 비-운동 단백질에 의해 가교되고, 46. 그들은 극 플럭스와 같은 과정에서 또는 중기 동안 염색체 중심을 조정하는 동안 또는 아나 페이즈 47,48,49,50,51,52 동안 염색체 분리를 조정하는 동안 자주 움직이거나 기계적 스트레스를 경험합니다. 따라서 유사 분열을 통한 미크론 규모의 스핀들 장치의 무결성은이 상호 작용하는 필라멘트 네트워크에 의해 생성되고 유지되는 밀고 당기는 힘의 신중하게 조절 된 균형에 의존합니다. 그러나 이 기계적 조절을 조사하고 단백질 앙상블이 어떻게 함께 작동하여 미세소관 운동을 조정하고 스핀들을 적절하게 조립하는 데 필요한 힘을 생성하는지 설명하는 데 필요한 도구는 최근에야 개발되었으며 동적 미세소관 네트워크를 정의하는 생물물리학적 규칙을 이해하기 시작했습니다.
이 원고의 목표는 시험관 내에서 가교결합된 미세소관 쌍을 재구성하고, 미세소 관과 가교 단백질의 동시 형광 시각화 및 나노스케일 힘 측정을 허용하는 현미경 챔버에서 이러한 번들을 고정하고, 이러한 데이터를 강력하게 처리하는 데 필요한 단계를 시연하는 것입니다. 형광 표지 미세소관을 안정적으로 중합하고, 부착용 현미경 커버슬립을 준비하고, 광학 트래핑 실험을 위한 폴리스티렌 비드를 준비하고, 직접적인 생물물리학적 조작을 허용하면서 생체 내 기능을 보존하는 가교 필라멘트 네트워크를 조립하는 데 필요한 단계를 자세히 설명합니다.
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Protocol
1. 미세소관의 제조
참고: GFP 표지된 가교 단백질을 사용할 때 미세소관의 적색(예: 로다민) 및 원적색(예: 비오티닐화된 HiLyte647, 텍스트의 나머지 부분에서 비오티닐화된 원적색이라고 함)이 잘 작동합니다. 고품질 쿼드 밴드 전반사 형광(TIRF) 필터를 사용하여 이미징 중에 세 채널 간의 누화를 최소화할 수 있습니다.
- GMPCPP 미세소관 종자 재고 준비
- 84 μL의 얼음처럼 차가운 1x BRB80 (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA; pH 6.8)에 표지되지 않은 동결 건조 튜불린 1 mg을 현탁시키고, DTT를 사용 직전에 최종 농도 1 mM에 첨가합니다. 60 μg의 형광단 표지된 동결건조된 튜불린을 1 mM DTT의 차가운 1x BRB80 6 μL에 현탁합니다. 60 μg의 비오틴 표지 동결건조된 튜불린을 1 mM DTT와 함께 6 μL의 차가운 1x BRB80에 현탁합니다.
- 표지 비율이 1:10인 비오티닐화 로다민 표지 튜불린 종자 스톡을 준비하려면 표지되지 않은 튜불린 84μL, 형광단 표지된 튜불린 6μL 및 10mM GMPCPP 스톡 용액 10μL를 0.5mL 튜브에 추가합니다. 부드럽게 피펫팅하여 잘 섞고 얼음에 계속 올려 놓습니다.
참고: GMPCPP 중합은 미세소관이 GTP로 중합되거나 탁솔이 생략된 경우보다 광학 트랩으로 직접 조작할 수 있는 더 안정적이고 용이하기 때문에 이러한 분석에 선호됩니다. - 형광 표지 비율이 1:10인 비오티닐화된 원적색 표지 튜불린 종자 스톡을 제조하려면 0.5mL 튜브에 표지되지 않은 튜불린 80μL, 형광단 표지된 튜불린 6μL, 비오틴 표지된 튜불린 4μL 및 10mM GMPCPP 원액 10μL를 추가합니다. 부드럽게 피펫팅하여 잘 섞고 얼음에 계속 올려 놓습니다. 종자를 얼음에 5 분 동안 배양하십시오.
- 튜불린 용액을 고속 원심분리에 적합한 폴리카보네이트 튜브로 옮깁니다. 종자 스톡을 ~350,000 x g 에서 2°C에서 5분 동안 원심분리하여 미세소관 중합을 방지하고 분취를 위해 상청액을 회수합니다. 이 단계에서 튜불린의 최종 추정 농도는 ~50μM입니다.
- 0.2mL PCR 튜브를 사용하여 종자 스톡 2μL 분취량을 준비하고 액체 질소로 급속 동결합니다. 분취량은 -80°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.
- 미세 소관의 중합
- 500μL의 1x BRB80을 준비하고 얼음 위에 놓습니다. 비오티닐화된 원적색 및 비비오티닐화 로다민 종자 스톡 분취량을 얼음 위에 각각 하나씩 놓아 해동시킨다.
- 종자를 얼음에 5 분 동안 배양하십시오. 배양 기간이 끝나면 즉시 각 튜브에 26μL의 1x BRB80을 추가합니다. 더 긴 미세소관이 필요한 경우 BRB80의 부피를 5-10μL 늘리고, 더 짧은 미세소관의 경우 중합을 위한 부피를 5μL 줄입니다.
- 미세소관 종자 스톡을 수조에서 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션합니다. 298.5μL의 실온 1x BRB80과 1.5μL의 4mM 탁솔 원액을 결합하여 20μM 탁솔 용액을 생성합니다. 300μL의 1x BRB80을 준비하고 두 튜브를 실온에 보관하십시오.
- 적절한 고속 로터를 30°C로 예열합니다. 이것은 30 ° C로 설정된 탁상용 초 원심 분리기에서 수행 할 수 있습니다. 수조에서 미세소관을 제거하고 실온에서 벤치탑에 10-15분 동안 보관합니다.
- 미세 소관의 정화
- 미세소관 성장 용액에 실온 1x BRB80 100μL를 넣고 튜브를 ~10회 튕기거나 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 미세소관 성장 용액을 폴리카보네이트 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
- 원심 분리기의 회전에 대해 바깥 쪽을 향하게되는 폴리 카보네이트 튜브의 한쪽을 표시하십시오. 이것은 재료의 양이 적기 때문에 거의 보이지 않는 미세소관 펠릿을 찾는 데 도움이 됩니다.
- 미세소관 용액을 ~350,000 x g 에서 30°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 가능하면 미세소관이 들어 있는 튜브에 펠릿이 있는지 검사합니다. 펠릿을 방해하지 않고 마지막 몇 마이크로리터의 액체를 제외한 모든 액체를 조심스럽게 제거하십시오. 펠릿이 명확하게 보이지 않으면 펠릿이 있는 영역을 방해하지 않도록 가이드로 만든 표시를 사용하십시오.
- 즉시 100μL의 1x BRB80 + 20μM 탁솔을 미세소관 튜브에 추가합니다. 이것은 펠릿에 직접 첨가 될 수 있습니다. 이 단계에서 펠릿의 파괴는 정화 과정에 큰 영향을 미치지 않습니다.
- ~350,000 x g 에서 10분 동안 미세소관을 다시 원심분리하고 튜브의 표시된 부분이 원심분리기의 회전에 대해 다시 바깥쪽으로 향하도록 주의하십시오.
- 이전과 같이 몇 마이크로리터의 용액을 제외한 모든 용액을 제거하고 미세소관 펠릿이 손상되지 않도록 다시 주의하십시오. 1.3.4.-1.3.5단계를 반복합니다. 그런 다음 미세소관 펠렛을 20-50μL의 1x BRB80 + 20μM 탁솔에 재현탁합니다.
- 대부분의 재현탁 부피를 피펫팅하고 펠릿에 직접 부드럽게 배출하여 20-30배 또는 펠릿이 완전히 재부유될 때까지 반복하여 재부유시킵니다. 이것은 지나치게 격렬한 피펫팅에 의해 미세소관이 전단되지 않도록 주의해서 수행해야 합니다. 피펫 팁을 절단하여 개구부의 크기를 늘리는 것도 미세소관 전단을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.
- 형광단을 빛으로부터 보호하고 벤치 탑에 유지하기 위해 튜브를 호일로 싸서 실온에서 미세 소관을 보관하십시오. 미세 소관은 일반적으로 정화 후 2-3 일 동안 사용할 수 있습니다.
- 현미경을 통한 미세소관 평가
- 1μL의 미세소관과 9μL의 실온 1x BRB80을 혼합하여 정화된 미세소관 용액의 1:10 희석액을 준비합니다. 현미경 슬라이드에 10μL를 피펫팅한 다음 액적 위에 커버슬립을 놓아 스쿼시를 형성하여 이 용액을 즉시 이미지화합니다.
- 형광 현미경과 미세소관 희석액과 접촉하는 커버슬립 표면에 초점을 맞춘 100x 대물렌즈를 사용하여 시각화할 때 고밀도(조밀한 메쉬워크에 겹쳐진 전체 시야당 수백 개)에서 8-25μm 길이의 미세소관이 보이는지 확인합니다.
2. 부동태화 커버슬립의 제조
- 커버슬립 세척
- 18mm x 18mm 커버슬립을 비반응성 플라스틱 랙에 넣은 다음 각 랙을 100mL 비커에 넣습니다. 커버슬립의 양쪽을 청소해야 하므로 랙에 슬롯당 하나의 커버슬립을 배치합니다.
- 각 초음파 처리 사이클에 대해 주어진 순서대로 다음 용액 50mL를 사용하여 5 분 동안 목욕 초음파 처리기를 사용하여 초음파 처리합니다 : (1) 탈 이온수 (18.3 MΩ-cm 저항률), (2) 2 % Micro-90 용액, (3) 탈 이온수, (4) 새로 준비된 0.1 M KOH, (5) 탈 이온수 (그림 1A). 커버 슬립이 액체로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. 초음파 처리 주기 사이에 핀셋을 사용하여 탈이온수에 랙을 10-20x 위아래로 담그고 물을 교체하고 헹굼 과정을 2x 반복하여 탈이온수로 커버슬립의 각 랙을 헹굽니다.
- 커버 슬립을 물에 3 번 헹구고 비커를 100 % 에탄올로 다시 채우고 랙을 비커로 되돌립니다. 비커를 흄 후드로 옮기고 모든 커버슬립 랙을 위한 공간을 확보하기에 충분한 티슈 물티슈를 배치합니다. 그런 다음 핀셋으로 랙을 제거하고 티슈 물티슈 위에 놓습니다.
- 건조 질소 가스 스트림을 사용하여 건조 될 때까지 커버 슬립과 랙에서 에탄올을 날려 버립니다. 비커에서 남은 에탄올을 폐기하고 건조 질소 가스 스트림을 사용하여 유사하게 건조시킵니다 (그림 1A).
- 커버슬립의 아미노실란 표면 기능화
- 50mL 원뿔형 튜브에 아세톤 40mL와 APTES 시약 400μL를 넣고 단단히 캡핑한 다음 10배 뒤집어 혼합하여 (3-아미노프로필)티에톡시실란(APTES) 시약 용액을 준비합니다.
- 커버슬립 랙 하나를 해당 드라이 비커로 옮긴 다음 APTES 용액에 완전히 담그십시오. 5분 동안 배양합니다(그림 1A). APTES 처리된 랙을 새 드라이 비커로 옮기고 새 랙을 APTES로 옮겨 5m 동안 배양합니다.
- 단계 10에 설명된 대로 랙을 20-2.1.2배에 담그고 물을 5배 교체하여 처리된 랙을 탈이온수로 헹굽니다. 모든 커버 슬립이 처리되고 세척 될 때까지 반복하십시오.
- 아미노실란 표면의 PEG화
- 25% w/v PEG가 있는 ~100μL와 10% w/v 비오틴-PEG가 있는 ~10μL의 두 PEG 용액을 준비하고, 둘 다 새로 준비된 0.1M NaHCO3에 현탁되어 24개의 커버슬립을 코팅하기에 충분합니다. 25% PEG 용액을 3,000 x g에서 20초 동안 원심분리하여 0.1 M NaHCO3가 첨가되면 PEG를 완전히 용해시키고; 용액이 흐려질 수 있습니다. 비오틴-PEG를 부드러운 피펫팅으로 혼합합니다(그림 1B).
- PEG 및 비오틴-PEG 용액의 혼합물을 33.3배 부피의 PEG 대 1 부피의 비오틴-PEG(예를 들어, 100μL의 PEG 용액 및 3μL의 비오틴-PEG 용액)와 함께 준비한다.
- 흄 후드에 멸균되고 보푸라기가없는 물티슈를 여러 개 배치하십시오. 커버슬립 랙을 물티슈로 옮기고 이전과 같이 건조한 질소 가스 흐름으로 불어 건조시킵니다. 여러 개의 새 물티슈와 마른 물티슈에 이제 완전히 건조된 커버슬립을 쌍으로 배열하고 오른쪽 하단 모서리에 각각 "b"와 같은 비대칭 기호로 레이블을 지정합니다. 이 표시는 커버슬립의 샘플 표면 반대편에 있으며 실험을 방해하지 않습니다(그림 1B).
- 핀셋으로 각 쌍에서 하나의 커버 슬립을 뒤집습니다. 뒤집힌 각 커버슬립에 6μL의 PEG/비오틴-PEG 혼합물을 놓고 두 번째 커버슬립을 위에 올려 두 "b" 라벨이 바깥쪽을 향하도록 합니다.
- 커버슬립 가장자리를 정렬하고 건조를 방지하기 위해 가습되고 밀폐된 챔버에 넣습니다. 커버 슬립을 실온의 습도 챔버에서 3 시간 동안 배양하십시오.
- 배양 후 습도 챔버에서 커버슬립을 제거하고 커버슬립 쌍을 조심스럽게 분리한 다음 랙에 다시 넣습니다. 이전과 같이 탈이온수로 각 랙을 세척하고 핀셋을 사용하여 랙을 10-20배 담그고 물을 총 5배 교체합니다.
- 두 개의 PEG화된 커버슬립 표면이 서로 마주지지 않도록 커버슬립의 모든 PEG화된 면을 같은 방향을 향하도록 배치합니다. PEG화 된 표면은 완전히 건조 될 때까지 매우 끈적 거리므로 커버 슬립이 닿지 않도록 각별히주의하십시오. 건조 질소 가스 스트림을 사용하기 전과 같이 각 랙과 커버슬립을 건조시킵니다(그림 1B).
- 커버슬립과 랙이 완전히 건조되면 표면 코팅의 열화를 방지하기 위해 진공 데시케이터에 보관하십시오. 습기가 PEG 코팅을 방해하는 것을 방지하기 위해 진공 상태에서 건조제와 함께 적절하게 보관합니다. 커버슬립은 약 1주일 동안 사용할 수 있습니다.
3. 키네신 코팅 비드의 제조
- 엄격한 키네신 구조물의 선택 및 준비
- 공개된 프로토콜53,54에 따라 엄격한 키네신 구축물을 발현하고 정제한다. 0.02 mg/mL 키네신 용액의 분취량 5 μL를 급속 동결하고 -80°C에서 최대 1년 동안 보관합니다.
참고: 리고르 키네신 단백질에는 ATP 가수분해를 방지하는 G234A 점 돌연변이가 있습니다. 마이크로비드에 접합될 때, 마이크로소관과의 높은 친화도 상호 작용을 통해 비드는 몇 분 동안 10-20pN의 하중을 유지할 수 있습니다. 일반적으로 사용되는 키네신-1 동종이량체 K560(53 ) 및 추가적으로 최적화된 K439 구축물(55 ) 모두의 엄격한 돌연변이 버전이 또한 이들 분석(54)에서 성공적으로 사용되었다. 이러한 개선된 K439 구축물은 안정성을 향상시키기 위한 EB1 이량체화 도메인 및 하기에 기재된 바와 같이 6-His 항체에 특이적으로 결합하기 위한 C-말단 6-His 태그를 함유한다.
- 공개된 프로토콜53,54에 따라 엄격한 키네신 구축물을 발현하고 정제한다. 0.02 mg/mL 키네신 용액의 분취량 5 μL를 급속 동결하고 -80°C에서 최대 1년 동안 보관합니다.
- 스트렙타비딘 코팅 비드에 6-His 항체 결합
- 1μm 직경의 스트렙타비딘 코팅 폴리스티렌 비드 50μL를 0.5mL 원심분리 튜브에 추가합니다. 30 초 동안 초음파 처리하십시오.
- 10μL의 200mM DTT를 790μL의 1x BRB80에 추가합니다. 이 1x BRB80 + 2.5 mM DTT 버퍼의 40 μL에 초음파 처리 된 비드 10 μL를 추가하십시오.
- 1 μL의 비오티닐화된 6-His 항체 및 49 μL의 1x BRB80 + 2.5 mM DTT를 조합하고; 소용돌이 잠깐 섞는다.
- 50μL의 희석된 비드 혼합물과 50μL의 항체 희석액을 새 튜브에 결합합니다. 튜브를 4°C의 튜브 회전 장치에 넣고 1시간 동안 회전합니다. 비드 혼합물을 4°C에서 3,000 x g 로 10분 동안 스핀다운합니다.
- 상청액을 피펫팅하고 1x BRB80의 2mg/mL 카제인 용액 100μL에 펠릿을 재현탁합니다. 이 원심분리와 재현탁을 2배 반복합니다.
- 엄격한 키네신 첨가
- 최종 펠릿을 2mg/mL 카제인 용액 100μL에 재현탁합니다. 0.5mL 원심분리 튜브에 5μL의 0.02mg/mL 리고르 키네신과 5μL의 비드를 결합하고 튜브를 ~10배 가볍게 튕겨 부드럽게 혼합합니다.
- K439 G234A 비드 현탁액과 나머지 6-His 비드를 모두 사용하지 않을 때는 로터의 4°C에 보관하십시오. 구슬은 신선하게 준비해야 하며 이 시간이 지나면 뭉쳐서 활동을 잃는 경향이 있으므로 실험에 같은 날 사용해야 합니다.
4. 현미경 챔버의 조립
- 유리 슬라이드 및 챔버 구성 준비
- 75mm x 25mm 현미경 유리 슬라이드를 먼저 초순수로 헹구고 줄무늬가 없는 암모니아-d 유리 세정제로 헹군 다음 초순수로 다시 한 번 헹굽니다. 흔들어 과도한 물방울을 제거하십시오. 줄무늬가 남지 않도록 질소 흐름을 사용하여 슬라이드를 말리고 슬라이드를 종이 타월 위에 놓습니다(그림 2A).
- 가위로 양면 테이프를 ~ 2-3mm x 2.5cm (단일 챔버 당 2 스트립 및 이중 챔버 당 3 스트립)의 스트립으로 자릅니다.
- 집게를 사용하여 하나의 유리 슬라이드에 두 개의 테이프 스트립을 놓아 그 사이에 ~0.5cm의 공간이 있어 단일 챔버를 구성합니다. 이중 챔버의 경우 동일한 간격을 사용하지만 세 개의 테이프 스트립을 사용합니다 (그림 2B). 이 방법을 사용하는 샘플 채널의 부피는 약 10 μL입니다.
알림: 챔버가 넓을수록 용액이 유입될 때 기포가 형성될 가능성이 높아집니다. 그러나 너비가 0.5cm 미만인 챔버는 이미징 면적이 줄어들기 때문에 사용하기 어려울 수 있습니다. - 테이프가 유리 슬라이드에 단단히 부착되도록 집게를 사용하여 각 테이프 스트립의 길이를 긁습니다.
- 데시케이터의 압력을 해제하고 집게를 사용하여 보관 랙에서 비오티닐화 커버슬립 하나를 제거합니다. 집게를 사용하여 유리 슬라이드 위에 하나의 비오티닐화 커버슬립을 놓습니다. 비오티닐화된 면이 유리 슬라이드 쪽으로 안쪽을 향하고 있는지 확인하십시오.
- 집게의 평평한 뒤쪽 끝을 사용하여 커버 슬립이 테이프에 닿는 유리를 부드럽게 눌러 챔버를 단단히 밀봉합니다. 커버슬립이 깨지지 않도록 가벼운 압력을 사용해야 합니다(그림 2C).
- 완성된 현미경 챔버는 사용할 때까지 직사광선을 피해 밀폐 용기에 보관하십시오(그림 2D).
알림: 챔버는 공기에 노출되면 비오티닐화된 커버슬립이 분해되므로 챔버를 만든 당일에 사용하는 것이 좋습니다.
- 현미경 시약의 유입
- 빈 피펫 팁 상자의 바닥에 초순수로 적신 보푸라기가 없는 접힌 티슈를 놓아 습도 챔버를 구성합니다. 샘플 챔버는 채널에서 용액의 증발을 줄이기 위해 유입 단계 사이에 이 상자에 보관해야 합니다.
- 채널의 한쪽 끝에서 액체를 피펫팅하고 반대쪽 끝에서 액체를 배출하여 모든 시약을 주입합니다. 심지하려면 조직의 한쪽 끝을 비틀어 챔버의 출구 쪽에 부드럽게 놓아 모세관 작용이 시약을 균일하게 분배할 수 있도록 합니다(그림 3A). 미세소관 해중합을 방지하기 위해 모든 시약을 유입하기 직전에 실온으로 가져옵니다.
- 한 챔버의 입구면에 닿도록 20μL 각진 피펫 팁을 사용하여 0.5mg/mL 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘 10μL를 천천히 흘립니다. 더 작은 피펫 팁과 느리고 일정한 시약 유입을 사용하여 챔버에서 기포가 발생할 가능성을 줄입니다(그림 3B).
- 챔버의 커버슬립 쪽이 아래를 향하도록 하여 습도 챔버에서 슬라이드를 4분 동안 배양합니다. 이 방향은 미세 소관 또는 비드와 같은 더 큰 물체가 PEG화 된 표면 근처에 가라 앉을 수있게합니다.
- 보푸라기가 없는 티슈를 사용하여 20μL의 1x BRB80을 사용하여 챔버를 플러시하여 액체를 꺼냅니다. 챔버에 누출이 있으면 슬라이드를 폐기하고 다른 슬라이드로 시작하십시오. 챔버에서 발생하는 작은 기포는 이미징에 해로운 영향을 미치지 않습니다.
- 유입, 배양 및 플러시 단계를 반복하여 0.5mg/mL 카제인 차단 용액 10μL를 사용합니다(그림 3C). 비오티닐화된 원적색 미세소관을 ~1:20으로 희석하고 10μL를 챔버로 흘립니다. 5분 동안 배양하고 20μL의 1x BRB80으로 챔버를 플러시합니다(그림 3D). 100 μm x 100 μm 이미징 시야 내에서 이러한 미세 소관의 최적 밀도는 10-20이어야합니다. 그리고 이 단계에서의 희석은 이 표면 결합 비율을 달성하기 위해 조정되어야 합니다.
- 연구할 적절한 농도(일반적으로 1-10nM) 가교결합 모터 또는 비모터 단백질 10μL로 유입, 인큐베이션 및 플러시 단계를 반복합니다(그림 3E).
- 10μL의 로다민 미세소관을 이전의 비오티닐화된 원적색 미세소관과 유사한 농도로 희석하여 흘립니다. 배양 및 플러시 단계를 반복합니다(그림 3F).
- 1μL의 리고르 키네신 코팅 비드와 19μL의 반응 버퍼를 결합하여 단백질 활성을 가교합니다. 예를 들어, 키네신-5 활성 분석을 위해 1mM TCEP 결합 차단기, 0.2mg/mL 알파 카제인, 70mM KCl, 산소 소거 시스템(4.5mg/mL 포도당, 350단위/mL 포도당 산화효소, 34단위/mL 카탈라아제), 1mM DTT 및 ATP와 함께 1x BRB80에서 원하는 농도(예: 최대 키네신 속도 조건의 경우 1mM)와 함께 반응 완충액을 사용합니다(그림 3G ). 비운동 단백질 분석의 경우 ATP를 생략하고 KCl의 농도를 변경하여 이러한 분석에서 단백질-미세소관 상호 작용 강도를 조절합니다.
- 투명한 매니큐어로 챔버의 양쪽 가장자리를 밀봉하고 이미징하기 전에 광택제가 마를 때까지 기다립니다(그림 3H). 성공적으로 구성된 챔버는 누출이없고 기포가 최소화됩니다.
5. 3색 TIRF가 있는 이미징 미세소관 번들
- TIRF 이미징 기능이 있고 단일 빔 광학 트랩이 구성된 도립 현미경 기기를 사용합니다(그림 4).
참고: 여기에 설명된 연구를 위해 GFP 태그 단백질, 로다민 표지 미세소관 및 비오티닐화된 원적외선 표지 미세소관에 대해 각각 100x/NA1.49 오일 대물 렌즈, TIRF 모듈 및 488nm, 561nm 및 640nm의 레이저 3개와 함께 도립 현미경을 사용했습니다.- 샘플 챔버의 커버 슬립에 침지 오일 한 방울을 추가합니다. 과도한 오일은 현미경 대물렌즈를 손상시킬 수 있습니다. 샘플 챔버의 커버슬립 쪽이 아래를 향하도록 하여 이미징할 샘플을 현미경 플랫폼에 놓습니다.
- 오일을 통해 커버슬립과 대물렌즈 사이에 접촉이 있도록 대물렌즈를 천천히 들어 올립니다. 샘플 챔버의 커버슬립 표면에 초점이 맞춰지도록 대물 높이를 조정합니다.
- 세 채널 모두에서 샘플의 단일 프레임 이미지를 기록합니다. 여기 실험의 경우 세 채널 모두에서 최적의 이미징 지속 시간으로 100-200ms의 노출을 사용하십시오. 노출 시간이 길어지면 광퇴색이 증가할 수 있습니다.
- 레이저 출력을 조정하여 샘플에서 우수한 신호 대 잡음비를 달성하는 동시에 개별 번들을 분석할 때 2-5분 동안 광퇴색을 최소화합니다. 여기에 사용된 레이저(그림 4 및 그림 5)의 경우 GFP 채널에 5mW, 두 미세소관 채널에 3mW의 레이저 출력을 최적으로 사용합니다.
참고: 성공적으로 조립된 번들은 원적색 채널에 있는 하나의 표면 고정 미세소관, 상당한 GFP-단백질 신호를 갖는 수 미크론의 공확장 영역, 이러한 영역과 겹친 다음 다발에서 수 미크론 멀리 확장되는 로다민 미세소관으로 구성되어야 합니다(그림 5B, C 및 그림 6 ). 로다민 미세소관의 라이브 이미징은 비가교된 미세소관 말단에서 미묘한 변동을 나타내야 하며, 이는 이 필라멘트가 챔버의 표면이나 다른 단백질에 부착되지 않았음을 나타냅니다. - 시야당 미세소관 다발의 빈도를 관찰합니다. 성공적으로 준비된 샘플의 경우 챔버당 100μL x 100μL 시야당 약 3-4개의 미세소관 다발이 존재해야 합니다.
6. 미세소관 다발에 대한 광학 트랩 실험 수행
- 조건의 사전 실험 교정
- 이러한 실험을 수행하려면 강성이 0.05-0.1 pN/nm인 단일 빔 광학 트랩을 사용하십시오. 대물렌즈 바로 아래와 콘덴서 위에 각각 단역 통과 필터를 도입하여 트래핑 광학 장치와 위치 감지 광검출기를 TIRF 가능 도립 현미경에 통합합니다(그림 4).
- 또한 샘플이 놓이는 나노포지셔닝 단계를 추가하여 사용자가 이러한 분석 중에 제어된 방식으로 나노미터 규모의 정밀도로 미세소관을 이동할 수 있도록 합니다. 대표 데이터를 획득하기 위해 여기에서 사용된 시스템은 공개된 작업 27,53,54,56,57에 설명되어 있습니다.
참고: 이 프로토콜의 범위를 벗어나지만, 단일 빔 광학 트랩(58,59,60)의 구성 및 교정을 상세히 설명하는 다수의 자원이 이용가능하다. - 명시야 또는 DIC 채널과 현미경의 100x 대물렌즈를 사용하여 샘플의 비드 밀도를 관찰합니다. 명시야 현미경은 비드를 식별하고 조작하는 데만 사용하고 형광 이미지 획득과 동시에 기록하지 마십시오. 비드를 평균적으로 서로 최소 10μm의 간격을 두고 어떤 종류의 표면 구속 또는 부착물도 없고 서로 부착되거나 클러스터링되지 않도록 합니다.
- 비오티닐화된 원적색 미세소관이 커버슬립 표면에 단단히 부착되어 있는지 확인하고, 미세소관 축을 따라 움직이는 움직임이나 용액에서 변동하는 미세소관의 자유 끝과 같은 눈에 띄는 브라운 움직임이 없는지 확인합니다.
- 로다민 미세소관이 가교 MAP를 통해 비오틴화된 미세소관에 부착되고 자유 말단에서 눈에 띄게 변동하는지 확인합니다. 비오티닐화 미세소관의 표면 부착은 종종 PEG화가 실패했거나 PEG 코팅이 분해되었음을 나타냅니다.
- 모터 구동 미세소관 슬라이딩 측정
- 발표된 프로토콜에 따라 관심 있는 운동 단백질을 발현하고 정제합니다. 예를 들어, 전장 GFP-태그된 키네신-5 단백질은 성공적으로 정제되어 이들 분석법 53,61뿐만 아니라 표지되지 않은 키네신-1262 및 키네신-1463에 사용되었다. 4단계와 5단계에서 위에서 설명한 대로 모터-단백질 가교결합된 번들을 조립하고 시각화합니다.
- 광학 트랩으로 브라운 운동을 나타내는 용액에서 자유 단일 비드를 캡처합니다. 필요에 따라 트랩 광학 장치를 조정하여 비드를 시야의 중앙으로 이동합니다. 트랩 빔에서 반사된 간섭 패턴이 대칭인지 확인하고 트랩 옵틱을 조정하여 빔 비대칭을 해결합니다.
- 다발 내의 로다민 미세소관의 자유 단부가 비드 바로 아래에 있고 비드가 가교 단백질을 포함하는 중첩 영역에서 수 마이크론 떨어져 있어 트랩 빔 유도 광퇴색을 최소화하도록 샘플 스테이지를 이동합니다. 미세소관과 충돌할 때까지 Z축의 비드를 내립니다. 비드를 부드럽게 내리고 커버슬립 표면에 달라붙을 수 있으므로 비드를 커버슬립 표면에 밀어 넣지 마십시오.
- 트랩을 잠시 끄고 명시야 채널로 슬라이딩 미세 소관에 부착 된 비드의 운동성을 관찰하십시오. 운동 단백질 분석을 수행할 때 부착된 비드는 미세소관이 분리될 때 방향으로 이동합니다. 함정을 다시 활성화하고 구슬을 다시 잡으십시오.
- 위의 5단계에서 최적화된 레이저 출력 및 노출 시간을 사용하여 3개(488nm, 561nm, 640nm, 640nm) 채널에서 초당 1-2프레임의 속도로 형광 데이터 기록을 시작합니다.
- 트래핑 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 위치 감지 광 검출기 (X, Y 및 SUM 강도 신호), 나노 포지셔닝 단계 (X, Y 및 Z 좌표) 및 TIRF 카메라 셔터 상태의 전압 데이터를 기록합니다. 실험 요건에 따라 적절한 소프트웨어 (사용자 정의된 LabView 코드 등)로 제어되는 전용 전압 입력 데이터 수집 보드를 사용하여 트랩 전압 값을 1-10 kHz 속도로 디지털화하십시오.
- 데이터가 수집될 때 힘 신호를 모니터링하고 성공적인 데이터 수집을 방해할 수 있는 이상에 세심한 주의를 기울입니다.
참고: 이상에는 (1) 트랩으로 이동하는 다른 비드, (2) 비드가 트랩을 조기에 탈출하는 것, (3) 갑작스러운 힘의 급락 및 트랩에 대한 힘을 다시 시작하지 못하는 경우가 포함되며 이에 국한되지 않으며, 이는 비드 표면의 엄격한 키네신 분자에 문제가 있음을 나타냅니다. - 측정 후 트랩을 비활성화하여 비드를 해제하고 필요한 실험 반복 횟수에 도달할 때까지 새 비드와 새 미세소관으로 반복합니다.
- 수동 가교 저항 측정
- 공개된 프로토콜에 따라 관심 있는 비운동 가교 단백질을 발현하고 정제합니다. 예를 들어, 전장 GFP-표지된 PRC1 43,54,57 및 이량체 NuMA 절단된 구축물 56이 이들 분석에 성공적으로 사용되었다. 가교된 번들을 위의 4단계 및 5단계에서 설명한 대로 조합하고 시각화합니다.
- 두 개의 미세소관만 포함하는 적합한 미세소관 다발을 식별하고, 하나는 전체 표면 부착으로 비오티닐화되고 다른 하나는 용액에 부분적으로 없는 비오티닐화된 미세소관을 식별합니다. 이것은 비드를 부착할 수 있는 자유 끝을 제공하고 비드가 표면 결합된 미세소관에 부착되지 않고 X축 또는 Y축에 정렬되어 스테이지 운동이 하나의 축을 따라서만 이루어지도록 보장합니다.
- 광학 트랩을 사용하여 브라운 운동을 하는 자유 비드를 캡처합니다. 비드가 트랩되면 비드를 선택한 미세소관 다발로 조심스럽게 옮겨 공정에서 다른 비드가 트랩으로 당겨지지 않도록 합니다. 비드가 GFP 태그의 광퇴색을 최소화하기 위해 가교 단백질을 포함하는 중첩 영역에서 수 마이크론 떨어져 있는지 확인합니다.
- 로다민 미세소관의 자유 세그먼트의 가장자리와 접촉할 때까지 Z축의 비드를 조심스럽게 내립니다. 부드럽게 위로 당기고 미세소관 축에 수직으로 이동하여 로다민 미세소관이 구부러지는 것을 관찰하고 비드 위치를 따라 부착 여부를 확인합니다. 부착되지 않은 경우 부착될 때까지 미세소관에 비드를 부드럽게 부딪히는 것을 반복합니다.
- 나노포지셔닝 단계를 이동하여 표면 부착 미세소관의 미세소관 축을 따라 로다민 미세소관을 조심스럽게 재정렬하고 미세소관 다발을 자동으로 당기기 위한 매개변수를 설정합니다. 미세소관의 평행축을 따라 방향을 설정하고, 중첩 길이에 따라 원하는 당김 속도(25-200nm/s는 유용한 속도 범위) 및 원하는 당김 시간(약 30초에서 2분)을 설정합니다.
- 초당 1-2 프레임의 속도로 3개(488nm, 561nm, 640nm) 채널에 형광 데이터 기록을 시작합니다. 위의 5단계에서 최적화된 레이저 출력과 노출 시간을 사용합니다.
- 자동화된 스테이지 모션을 시작하고 위치 감지 검출기, 스테이지 및 TIRF 카메라 상태에서 트래핑 데이터를 기록합니다. (1) 트랩으로 들어가는 다른 비드, (2) 미세소관 가교결합의 조기 손실 또는 (3) 로다민 미세소관에서 비드 분리를 포함하되 이에 국한되지 않는 데이터 수집을 방해할 수 있는 모든 요인을 모니터링합니다.
- 트랩을 비활성화하여 비드를 해제하고 원하는 대로 실험을 반복합니다. 일반적인 샘플 챔버는 번들의 분해 및 단백질 활성 손실이 발생하기 전에 약 30분 동안 사용할 수 있습니다.
참고: 분해 효과는 사용되는 가교제에 따라 다르지만 미세소관 또는 표면에 정적 반점이 형성되거나, 비특이적 결합을 나타내는 미세소관 변동이 손실되거나, 비드를 미세소관에 안정적으로 부착할 수 없는 것으로 나타날 수 있습니다.
7. 데이터 분석 및 형광 이미지와 광학 트랩 기록의 상관 관계
참고: 데이터 수집을 최적화하려면 광학 트래핑 소프트웨어용 시스템과 형광 이미징용 두 개의 개별 컴퓨터 제어 시스템을 사용하는 것이 좋습니다. 이 설정은 두 실험 방식 모두에서 고속 데이터 수집을 허용하고 단일 CPU를 사용할 때 발생할 수 있는 데이터에 도입되는 작업 실행의 나노초 및 마이크로초 지연을 제거합니다.
- 사용된 모터 또는 비모터 가교 단백질과 이들의 예상 스테핑 속도(예: 일반적으로 1-10kHz 사이)에 최적화된 속도로 광학 트래핑 데이터를 디지털화합니다.
- 광학 트랩을 제어하고 이러한 구성 요소에서 디지털 전압 신호를 샘플링하기 위한 전용 소프트웨어를 사용하여 위치 감지 광검출기의 X, Y 및 SUM 전압 신호와 나노 포지셔닝 스테이지의 X, Y 및 Z 위치 데이터를 기록합니다.
- 카메라의 셔터 열림 상태 디지털 신호를 광학 트래핑 데이터 수집 보드의 추가 전압 입력 채널로 기록합니다. 이를 통해 형광 이미징 데이터와 광학 트래핑 시간 트레이스의 상관 관계를 파악할 수 있습니다. 이미징을 시작하기 전에 광학 트랩으로 데이터 수집을 시작하여 첫 번째 프레임의 카메라 신호가 올바르게 기록되도록 합니다.
- 필요에 따라 슬라이딩 윈도우, 중앙값 필터 또는 가우스 필터와 같은 적절한 필터링 방법을 사용하여 높은 샘플링 속도로 수집된 원시 시계열 데이터의 평균을 구합니다.
- 라인스캔 분석과 같은 방법을 사용하여 형광 이미지 시계열 데이터를 정량화하고, 여기서 미세소관 영역의 길이에 따른 픽셀 강도 값이 계산됩니다. 이 선궤적에서 미세 소관 가장자리를 식별하고 따라서 겹치는 영역을 식별합니다. 또한 가교제 단백질 채널의 형광 강도를 사용하여 단백질 위치, 농도 및 밀도를 계산합니다.
- 힘과 이미지 데이터의 상관 관계는이 실험 시스템의 필수 출력입니다. 예를 들어, 주어진 카메라 노출 영역(카메라 채널의 해당 디지털 신호 스파이크로 표시됨) 내의 모든 힘 데이터 포인트를 선택하고 평균화하여 해당 형광 이미지 프레임과 직접 비교합니다. 이어서, 힘의 크기와 가교 단백질의 수, 중첩 길이 또는 가교결합 분포 사이의 관계를 추출한다.
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Representative Results
생물 물리학 적 분석에 적합한 미세 소관 번들의 준비는 몇 가지 주요 기준이 충족되면 성공한 것으로 간주됩니다. 첫째, 세 가지 색상의 이미징은 중첩 영역을 우선적으로 장식하는 가교 단백질 농도를 가진 두 개의 정렬 된 미세 소관을 나타내야합니다 (그림 5B, C 및 그림 6B). 이상적으로, 로다민 미세소관의 중첩 가장자리와 자유 단부 사이의 거리는 트래핑 빔과 형광 표지된 단백질 사이에 충분한 물리적 공간을 제공하기 위해 최소 5μm여야 합니다. 둘째, 비오티닐화된 원적색 미세소관이 없는 영역, 특히 가교 단백질이 표지된 동일한 채널에서 배경 형광 신호가 최소화되어야 합니다. 높은 배경 형광은 커버슬립 패시베이션이 불량하고 유리 결합 단백질의 농도가 높음을 나타내며, 이는 미세소관 또는 트래핑 비드와 비특이적으로 상호 작용할 가능성이 높습니다. 또한, 미세소관 이미징 채널 중 하나에서 볼 수 있는 작은 원형 반점 또는 짧은 조각의 존재는 미세소관 중합 및 정화가 실패했거나 미세소관이 노화되거나 손상되었음을 시사합니다.
셋째, 트래핑에 사용되는 비드는 단일 비드로 나타나야 하며 많은 비드를 포함하는 덩어리 내에 나타나지 않아야 합니다. 비드의 작은 부분이 표면에 비가역적으로 부착될 가능성이 있지만 샘플 챔버에서 개별 입자가 확산됨에 따라 상당한 부분이 관찰되어야 합니다. 과도한 응집은 종종 챔버로 유입되기 전에 최소 10분 동안 비드를 초음파 처리하여 완화할 수 있습니다. 넷째, 비드를 미세소관에 부착하면 트래핑 레이저 광이 닫힐 때 비드가 바인딩된 상태로 유지되어 부착이 양호해야 합니다. 비드는 표면과 접촉할 때 비특이적으로 달라붙지 않아야 하며, 비드가 미세소관에 부착되면 측정 전에 필라멘트를 가볍게 조작(예: 굽힘 또는 굴곡)할 수 있어야 합니다. 마지막으로, 힘이 가해지거나 운동 활동이 진행될 때 중첩 길이의 변화를 관찰 할 수 있어야합니다. 예를 들어, 운동 단백질 구동 슬라이딩을 관찰하는 경우 오버랩 길이는 운동 단백질 스테핑 속도와 일치하는 속도로 감소해야 합니다. 수동 가교제를 검사하는 경우 힘을 가하면 겹침 길이가 변경되어야 합니다. 이러한 결과는 로다민 미세소관이 커버슬립 표면에 비특이적으로 달라붙는 것이 아니라 가교 단백질을 통해 표면 결합된 미세소관에만 부착된다는 것을 나타냅니다.
이러한 기준이 모두 충족되면 앙상블 역학을 정의하는 필수 생물 물리학 적 매개 변수를 추출하기 위해 광범위한 실험을 수행 할 수 있습니다. 이 분석 또는 유사한 분석은 이전 연구에서 유사분열 가교 단백질을 검사하기 위해 광범위하게 사용되었습니다. 예를 들어, 우리는 필수 유사분열 운동 단백질 키네신-5의 앙상블이 중첩 길이64로 선형적으로 확장되는 미는 힘과 제동력을 모두 생성하여 미세소관 미끄러짐을 조절할 수 있음을 보여주었습니다(그림 5). 역평행 또는 평행 기하학의 미세소관은 키네신-5 분자의 작은 앙상블에 의해 가교결합되었습니다. 이러한 운동 단백질이 미세소관 플러스 말단을 향해 나아갈 때 필라멘트는 미끄러지거나(역평행) 앞뒤로 빠르게 변동했습니다(평행). 이 미니 스핀들 형상 내의 역학을 모니터링함으로써 우리는 필라멘트 겹침의 길이와 가교 결합 모터 단백질의 수에 따라 조정되는 힘의 크기를 발견했습니다. 미세소관이 키네신-5의 무부하 스테핑 속도보다 빠른 속도로 움직일 때 모터 단백질은 저항성 제동력을 제공했습니다. 또한 C- 말단 꼬리 도메인은 효율적인 가교 결합 및 힘 생성 (61)을 위해 필요하다는 것을 밝혀 냈습니다 (그림 5B, C). 전장 단백질은 모든 운동 단백질이 개별 실속 력에 도달할 때 정체되는 지속적인 힘을 생성할 수 있습니다(그림 5D). 그러나 C-단자 테일이 없는 키네신-5 모터는 크기가 거의 5배 더 작은 최대 힘을 생성합니다(그림 5E,F). 함께, 이러한 결과는 키네신-5 단백질이 앙상블에서 어떻게 작용하여 스핀들 조립 중에 미세소관을 극쪽으로 밀고 분자 내 필수 조절 단백질 도메인의 생물물리학적 기능을 해명하는지 보여줍니다.
우리는 또한 비 운동 유사 분열 단백질 PRC1의 앙상블이 아나 페이즈 스핀들 중간 구역54 (그림 6A-C)에서 미세 소관 슬라이딩에 저항하는 기계적 대시 포트로 작동한다는 것을 입증했습니다. PRC1은 기계식 대시포트가 속도 의존적 저항력을 생성하는 것처럼 당기는 속도에 따라 선형적으로 확장되는 마찰 저항을 생성합니다. 이러한 저항력은 미세소관 쌍 사이의 중첩 영역 길이 또는 국소 가교제 밀도에 의존하지 않지만 결합된 PRC1 분자의 총 농도에 크게 의존합니다(그림 6D,E). 이러한 결과로부터, PRC1 앙상블은 누출 피스톤으로 작용하며, 여기서 확산 가교제의 압축은 속도 의존적 저항을 생성하지만, 미세소관 플러스 말단에서의 가교결합제의 손실은 큰 압축력을 완화시킨다.
유사분열 키네신-12 단백질 Kif1562를 조사하기 위해 유사한 분석 기하학이 또한 사용되었다. Reinemann et al.62 는 미세소관이 밀려날 때 생성되는 힘을 측정함으로써 Kif15 앙상블이 필라멘트를 임계 고원 힘까지 밀어낼 수 있고 미세소관을 효율적으로 가교하고 지속적인 하중을 생성하기 위해 단백질의 C-말단 꼬리 밧줄 영역이 필요하다는 것을 발견했습니다. Reinemann 등은 또한 마이너스 말단 지향 키네신인 키네신-14 HSET가 유사하게 역평행 미세소관(63)을 분리할 수 있음을 우아하게 입증하였다. 동일한 양의 플러스 말단 지시 키네신 -5 Eg5 단백질과 혼합 될 때, HSET는 Eg5 슬라이딩 활성을 억제하여 중첩 영역 내에서 미세 소관 슬라이딩 운동을위한 줄다리기에 관여합니다. 이러한 결과는 모두 활성 미세소관 다발에 걸친 직접적인 힘 측정의 힘을 입증하고 생물학적으로 적절한 네트워크 기하학에서 단백질 기능을 특성화해야 할 필요성을 분명히 합니다.
그림 1: 유리 커버슬립의 패시베이션. (A) 아미노-실란 접합을 위한 No. 1.5 유리 커버슬립의 순차적 세척 단계, 건조 및 접합을 묘사한 개략도. (B) PEG 및 비오틴-PEG 그룹을 유리 커버슬립에 공유결합적으로 연결하고, 세척 및 건조하고, 단기 보관을 위해 진공 하에서 커버슬립을 밀봉하기 위한 프로토콜을 묘사하는 개략도. 회로도의 일부는 65에서 수정 된 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 샘플 챔버의 조립. (A) 부동태화 커버슬립과 표준 3인치 현미경 슬라이드를 사용한 샘플 흐름 챔버의 조립을 묘사한 개략도. (B) 미세 소관 다발의 광학 트래핑 및 형광 이미징에 최적화 된 단일 및 이중 채널 유동 챔버의 조립 및 일반적인 치수. 회로도의 일부는 65에서 수정 된 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 광학 트래핑 및 TIRF 기반 이미징을 위한 표면 고정 미세소관 다발 생성. 광학적으로 포획 가능한 미세 소관 다발의 단계적 조립을 묘사하는 회로도. (A) 시약은 챔버의 입구 포트에서 유입되고 유체는 출구 채널에서 사악합니다. (B) 스트렙타비딘(파란색)은 먼저 커버슬립의 비오틴-PEG 부위에 결합하고, (C) 카제인(적색)은 추가 차단제로 도입된다. (D) 비오티닐화된 원적색 표지된 미세소관(마젠타색)을 도입하고 ~5분 동안 배양한 다음, (E) 가교 단백질(녹색), (F) 비오티닐화 로다민 표지된 미세소관(적색)을 첨가하고, 마지막으로 (G) 리고르 키네신-코팅된 마이크로스피어를 번들에 부착하고 광학 트랩 기반 조작을 위해 적절한 반응 완충액에 현탁시킨다. (H) 챔버는 실험 중 샘플 버퍼의 증발을 방지하기 위해 투명 매니큐어로 밀봉됩니다. 회로도의 일부는 65에서 수정 된 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 광학 핀셋/TIRF 현미경 시스템의 개략도. 단일 빔 광학 트랩은 도립 현미경 내에서 대물 렌즈 기반 TIRF 이미징 시스템의 광학 경로에 도입됩니다. 대물렌즈 바로 아래에 삽입된 쇼트 패스 필터를 사용하면 트랩 빔이 대물렌즈의 후면 조리개로 향하게 되어 샘플 커버슬립 표면 바로 위에 초점을 맞춰 광학 트랩을 형성할 수 있습니다. 위치 감지 광 검출기는 투과 된 빛을 수집하여 비드의 위치 및 힘 감지를 허용합니다. TIRF 이미징을 통해 여러 채널의 형광 데이터를 획득하고 고감도 EMCCD 또는 sCMOS 카메라에 기록할 수 있습니다. 광범위한 스펙트럼의 광원은 실험 설정 중에 트래핑 비드를 이미지화하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: kinesin-5에 의한 힘 생성 측정의 대표적인 예. (A) 광학 트랩으로 측정되는 필라멘트를 밀어낼 때 힘을 생성하는 키네신-5 모터 단백질에 의해 가교된 미세소관을 보여주는 실험 기하학을 묘사한 개략도. 표면 고정 미세소관, GFP-키네신-5 및 로다민 표지된 수송 미세소관으로 구성된 다발의 대표적인 형광 이미지. (B) 전장 및 (C) C-말단 꼬리 절단된 키네신-5 구축물을 사용하였다. 스케일 바 = 5 μm. (D) 전장 및 (E) 테일리스에 대한 힘 생성의 샘플 기록이 표시되며 평균 힘은 시간의 함수로 표시됩니다. (f) 두 구축물에 대한 최대 평탄력 및 상응하는 중첩 길이의 플롯이 도시되어, 전장 키네신 구축물이 테일리스 키네신 구축물보다 크기가 실질적으로 더 큰 중첩-길이 의존력을 생성한다는 것을 나타낸다. 이 수치는61에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: PRC1에 의한 마찰력 측정의 대표적인 예. (A) 커버슬립을 일정한 속도로 움직여 필라멘트가 미끄러질 때 저항을 생성하는 GFP-PRC1(세포질 분열의 단백질 조절자) 가교 단백질에 의해 가교된 미세소관을 보여주는 실험 기하학을 묘사한 개략도. (B) 이동 표면 고정화 원적색 미세소관, 수축 중첩 내에서 응축되는 GFP-PRC1 분자, 및 비드와 함께 유지되는 유리 로다민 미세소관을 보여주는 대표적인 시계열 형광 이미지. 프레임 사이의 시간 간격 = 6초; 스케일 바 = 5 μm. (C) 중첩이 55μm에 도달하면 중단 이벤트 및 힘 강하가 0(~0초)으로 미끄럼 이벤트 중 마찰력을 보여주는 힘 추적의 예. (D) 4개의 서로 다른 슬라이딩 속도에서 중첩 내에서 평균 힘과 통합된 GFP 강도의 상관 관계. (E) (D)의 평균 기울기와 계산된 트레이스 피팅 오차는 PRC1 분자당 힘이 슬라이딩 속도의 함수로 선형적으로 증가한다는 것을 보여줍니다. 이 수치는66에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
미세소관 네트워크는 본질적으로 근본적으로 기계적인 광범위한 작업을 수행하기 위해 무수한 세포 유형에 사용됩니다. 세포가 건강한 상태와 질병 상태 모두에서 어떻게 기능하는지 설명하려면 이러한 미크론 규모의 네트워크가 집합적으로 구축하는 나노미터 크기의 단백질에 의해 어떻게 구성되고 조절되는지 이해하는 것이 중요합니다. 광학 핀셋과 같은 생물물리학적 도구는 이 규모에서 주요 단백질의 기계화학을 조사하는 데 매우 적합합니다. 미세소관 네트워크 기능의 다양성을 반영하여, 미세소관 팁 역학67,68의 힘 의존적 분석, 키네토코어 성분에 의한 힘 생성 69,70,71, 미세소관 필라멘트 역학을 조사하기 위한 2빔 덤벨 트랩 기하학72,73을 포함하여 광학 핀셋을 사용하는 복잡한 실험 기하학이 탐구되었습니다. . 이 프로토콜에서 우리는 번들과 같은 기본 미세소관 네트워크 모티프를 재구성하고 단일 분자 형광 현미경 및 광학 트래핑의 생물물리학적 도구를 적용하여 세포 기능에 대한 중요한 정보를 평가하는 새로운 방법을 설명했습니다.
이 프로토콜의 대부분의 개별 단계는 기술적으로 간단하지만 함께 사용하면 발생할 수 있는 수많은 잠재적 실패 지점이 있으며 성공적인 측정을 위해 각 지점에서 상당한 주의를 기울여야 합니다. 첫째, 많은 현미경 기반 단일 분자 실험 분석과 마찬가지로 커버슬립 표면에 대한 단백질 또는 비드의 비특이적 결합은 거의 항상 이러한 실험의 성공적인 완료를 방해하기 때문에 적절한 표면 패시베이션이 중요합니다. 둘째, 관심 있는 가교 단백질의 발현 및 정제는 고품질 단일 종 제품을 보장하기 위해 최적화되어야 하는데, 이는 오염 물질이 필라멘트의 과도한 번들링을 유도하거나 비드 및 미세소관 부착을 방해하는 등 다양한 방식으로 분석을 방해할 수 있기 때문입니다. 셋째, 견고한 비드-미세소관 부착을 유지하려면 트래핑 비드에 고밀도로 결합된 고품질의 엄격한 키네신 모터가 필요하므로 여러 키네신-필라멘트 부착 지점을 만들 수 있습니다. 이 결합은 몇 분 동안 10s의 pN의 힘을 견딜 수 있으며, 이는 이 기술을 사용하는 광범위한 잠재적 연구 시스템에 적합합니다.
또한 이 프로토콜을 최종 사용자의 기기 또는 생물학적 시스템 요구에 가장 적합하도록 수정할 수 있는 여러 가지 방법이 있습니다. GFP 표지 가교 단백질과 적색/원적색 표지 미세소관을 사용하는 실험을 설명했지만 필요에 따라 형광 표지를 교체할 수도 있습니다. 예를 들어, 사용자가 3색 TIRF 현미경을 수행하기에 충분한 레이저 라인을 가지고 있지 않은 경우, 동일한 형광단으로 미세소관을 차별적으로 라벨링하지만 미세소관의 각 종에 대해 다른 농도(예: 희미한 대 밝음)를 사용하여 고품질 데이터를 얻을 수 있습니다. 유사하게, 형광 표지를 가교결합 단백질에 첨가하는 것이 항상 가능하거나 유리한 것은 아닐 수 있다. 이 상황에서는 가교제 농도 또는 국소화와 같은 특정 실험 정보에 액세스 할 수 없지만 미세 소관 중첩 길이와 같은 매개 변수를 결정할 수 있습니다. 우리는 이 프로토콜이 미세소관 가교 단백질의 다양한 유형 및 조합에 대해 매우 적응력이 있을 것으로 예상합니다. 다중 가교 단백질의 도입은 적절한 대역폭에서 이미징 기능을 확보하기 위해 단백질 중 하나에서 형광 태그를 제거하거나 두 미세소관 유형 중 하나에서 형광 표지를 배제해야 할 것입니다(예: 가교 결합 단백질에 적색 또는 원적색 단백질 암호화 표지 사용). 이 TIRF 기반 분석에 3개 이상의 형광 채널을 사용할 가능성은 거의 없지만 배포 방법에는 확실히 유연성이 있으므로 실험을 계획할 때 신중하게 고려해야 합니다. 마지막으로,이 분석은 다양한 네트워크 기하학과 세포 골격 필라멘트 유형을 연구하기 위해 수정 될 수 있습니다. augmin과 감마-튜불린 고리 복합체에 의해 매개되는 미세소관 분지의 역학 분석은 쉽게 프로빙되고 이미지화될 수 있습니다. 또한, 액틴, 셉틴 또는 중간 필라멘트를 포함하는 것과 같은 다른 가교 세포 골격 네트워크는 커버 슬립 및 트래핑 비드에 대한 적절한 수정 및 직교 부착 전략이 만들어 졌다고 가정하면 이러한 도구로 연구하기에 상당히 적합합니다.
결론적으로, 우리는 단일 분자 형광 현미경 도구를 사용하여 이미지화하고 단일 빔 광학 트랩을 통해 조작할 수 있는 능동력 생성 미세소관 네트워크의 재구성을 위한 프로토콜을 설명했습니다. 우리는 유사분열 운동과 비운동 단백질의 앙상블 역학을 드러내는 데이터 세트를 통해 이 방법의 유용성을 입증했습니다. 우리는 뉴런, 상피 조직 또는 심근 세포에서 발견되는 것과 같은 고도로 조직화 된 미세 소관 네트워크의 많은 유형을 이러한 도구로 분석하여 동적 세포 골격에 대한 생물 물리학 적 기능의 새로운 원리를 밝힐 수있을 것으로 기대합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 R21 AG067436 (JP 및 SF), T32 AG057464 (ET) 및 Rensselaer Polytechnic Institute School of Science Startup Funds (SF)의 지원을 인정하고자합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nm | IPG Photonics | YLR-10-1064-LP | |
| 405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applications | Chroma | TRF89901v2 | |
| 6x His Tag Antibody, Biotin Conjugate | Invitrogen | #MA1-21315-BTIN | |
| Acetone, HPLC grade | Fisher Scientific | 18-608-395 | |
| Alpha casein from bovine milk | Sigma | 1002484390 | |
| ATP | Fisher Scientific | BP413-25 | |
| Benzonase | Novagen | 70746-3 | |
| Biotin-PEG-SVA-5000 | Laysan Bio, Inc. | NC0479433 | |
| BL21 (DE3) Rosetta Cells | Millipore Sigma | 71-400-3 | |
| Catalase | MP Biomedicals LLC | 190311 | |
| CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objective | Nikon | N/A | |
| Chloramphenicol | ACROS Organics | 227920250 | |
| Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips | Fisher Scientific | C14784 | |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Dextrose Anhydrous | Fisher Scientific | BP3501 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| DTT | Fisher Scientific | BP172-25 | |
| Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 Bath | LAUDA-Brinkmann | 27709 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| EGTA | Millipore Corporation | 32462-25GM | |
| FIJI / Image J | https://fiji.sc/ | N/A | |
| Frosted Microscope Slides | Corning | 12-553-10 | 75mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm |
| Glucose Oxidase | MP Biomedicals LLC | 195196 | Type VII, without added oxygen |
| GMPCPP | Jena Biosciences | JBS-NU-405S | Can be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C |
| Gold Seal-Cover Glass | Thermo Scientific | 3405 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Imidazole | Fisher Scientific | 03196-500 | |
| IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| Laboratory dessicator | Bel-Art | 999320237 | 190mm plate size |
| Kanamycin Sulfate | Fischer Scientific | BP906-5 | |
| KIF5A K439 (aa:1-439)-6His | Gilbert Lab, RPI | N/A | doi.org/10.1074/jbc.RA118.002182 |
| Kimwipe | Kimberley Clark | Z188956 | lint-free tissue |
| Immersion Oil, Type B | Cargille | 16484 | |
| Lens Tissue | ThorLabs | MC-5 | |
| LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm) | Nikon | N/A | |
| Lysozyme | MP Biomedicals LLC | 100834 | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher Scientific | BP215-500 | |
| Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
| MPEG-SVA MW-5000 | Laysan Bio, Inc. | NC0107576 | |
| Neutravadin | Invitrogen | PI31000 | |
| Nikon Ti-E inverted microscope | Nikon | N/A | Nikon LuN4 Laser |
| Ni-NTA Resin | Thermo Scientific | 88221 | |
| Oligonucleotide - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA GAACTTTCAAAGGC |
IDT | N/A | |
| Oligonucleotide - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA ACTCAGAATAGGTG |
IDT | N/A | |
| Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mm | Beckman Coulter | 343755 | |
| Optima-TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 361544 | |
| Paclitaxel (Taxol equivalent) | Thermo Fisher Scientific | P3456 | |
| PIPES | ACROS Organics | 172615000 | |
| PMSF | Millipore | 7110-5GM | |
| Porcine Tubulin, biotin label | Cytoskeleton, Inc. | T333P | |
| Porcine Tubulin, HiLyte 647 Fluor | Cytoskeleton, Inc. | TL670M | far red labelled |
| Porcine Tubulin, Rhodamine | Cytoskeleton, Inc. | TL590M | |
| Porcine Tubulin, Tubulin Protein | Cytoskeleton, Inc. | T240 | |
| Potassium Acetate | Fisher Scientific | BP364-500 | |
| Prime 95B sCMOS camera | Photometric | N/A | |
| Quadrant Detector Sensor Head | ThorLabs | PDQ80A | |
| Quikchange Lightning Kit | Agilent Technologies | 210518 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Square Cover Glasses | Corning | 12-553-450 | 18 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm |
| Streptavidin Microspheres | Polysciences Inc. | 24162-1 | |
| Superose-6 Column | GE Healthcare | 29-0915--96 | |
| TCEP | Thermo Scientific | 77720 | |
| TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
| Ultrasonic Cleaner (Sonicator) | Vevor | JPS-08A(DD) | 304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power |
| Vectabond APTES solution | Vector Laboratories | SP-1800-7 | |
| Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-D | S.C. Johnson | SJN695237 |
References
- Bentley, M., Banker, G. The cellular mechanisms that maintain neuronal polarity. Nature Reviews Neuroscience. 17 (10), 611-622 (2016).
- Yang, R., et al. A novel strategy to visualize vesicle-bound kinesins reveals the diversity of kinesin-mediated transport. Traffic. 20 (11), 851-866 (2019).
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: Transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
- Helmke, K. J., Heald, R., Wilbur, J. D. Interplay between spindle architecture and function. International Review of Cell and Molecular Biology. 306, (2013).
- Elting, M. W., Suresh, P., Dumont, S. The spindle: integrating architecture and mechanics across scales. Trends in Cell Biology. 28 (11), 896-910 (2018).
- Kapoor, T.
- Svoboda, K., Block, S. M. Force and velocity measured for single kinesin molecules. Cell. 77 (5), 773-784 (1994).
- Svoboda, K., Schmidt, C. F., Schnapp, B. J., Block, S. M. Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry. Nature. 365 (6448), 721-727 (1993).
- Schnitzer, M. J., Visscher, K., Block, S. M. Force production by single kinesin motors. Nature Cell Biology. 2 (10), 718-723 (2000).
- Andreasson, J. O. L., Shastry, S., Hancock, W. O., Block, S. M. The mechanochemical cycle of mammalian kinesin-2 KIF3A/B under load. Current Biology. 25 (9), 1166-1175 (2015).
- Bensel, B. M. The mechanochemistry of the kinesin-2 kif3ac heterodimer is related to strain-dependent kinetic properties of kif3a and kif3c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15632-15641 (2020).
- Gilbert, S. P., Guzik-Lendrun, S., Rayment, I. Kinesin-2 motors: kinetics and biophysics. Journal of Biological Chemistry. 293 (12), 4510-4518 (2018).
- Okada, Y., Higuchi, H., Hirokawa, N. Processivity of the single-headed kinesin KIF1A through binding to tubulin. Nature. 424 (6948), 574-577 (2003).
- Budaitis, B. G., et al. Pathogenic mutations in the kinesin-3 motor KIF1A diminish force generation and movement through allosteric mechanisms. Journal of Cell Biology. 220 (4), 202004227 (2021).
- Tomishige, M., Klopfenstein, D. R., Vale, R. D. Conversion of Unc104/KIF1A kinesin into a processive motor after dimerization. Science. 297 (5590), 2263-2267 (2002).
- Siddiqui, N., et al. Force generation of KIF1C is impaired by pathogenic mutations. bioRxiv. , (2021).
- Valentine, M. T., Fordyce, P. M., Krzysiak, T. C., Gilbert, S. P., Block, S. M. Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro. Nature Cell Biology. 8 (5), 470-476 (2006).
- Valentine, M. T., Gilbert, S. P. To step or not to step? How biochemistry and mechanics influence processivity in Kinesin and Eg5. Current Opinion in Cell Biology. 19 (1), 75-81 (2007).
- Jannasch, A., Bormuth, V., Storch, M., Howard, J., Schäffer, E. Kinesin-8 is a low-force motor protein with a weakly bound slip state. Biophysical Journal. 104 (11), 2456-2464 (2013).
- Bormuth, V., Varga, V., Howard, J., Schäffer, E. Protein friction limits diffusive and directed movements of kinesin motors on microtubules. Science. 325 (5942), 870-873 (2009).
- Gennerich, A., Carter, A. P., Reck-Peterson, S. L., Vale, R. D. Force-induced bidirectional stepping of cytoplasmic dynein. Cell. 131 (5), 952-965 (2007).
- Mallik, R., Carter, B. C., Lex, S. A., King, S. J., Gross, S. P. Cytoplasmic dynein functions as a gear in response to load. Nature. 427 (6975), 649-652 (2004).
- Redwine, W. B., et al. The human cytoplasmic dynein interactome reveals novel activators of motility. eLife. 6, 28257 (2017).
- Belyy, V., Hendel, N. L., Chien, A., Yildiz, A. Cytoplasmic dynein transports cargos via load-sharing between the heads. Nature Communications. 5 (1), 5544 (2014).
- Belyy, V., et al. The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition. Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).
- Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
- Forth, S., Kapoor, T. M. The mechanics of microtubule networks in cell division. Journal of Cell Biology. 216 (6), 1525-1531 (2017).
- Dumont, S., Mitchison, T. J. Force and length in the mitotic spindle. Current Biology. 19 (17), 749-761 (2009).
- McIntosh, J. R., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I.
- McIntosh, J., Hays, T. A brief history of research on mitotic mechanisms. Biology. 5 (4), 55 (2016).
- Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P.
- Kapitein, L. C., et al. The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks. Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).
- Vukušić, K., Ponjavić, I., Buđa, R., Risteski, P., Tolić, I. M. Microtubule-sliding modules based on kinesins EG5 and PRC1-dependent KIF4A drive human spindle elongation. Developmental Cell. 56 (9), 1253-1267 (2021).
- Sturgill, E. G., Ohi, R. Kinesin-12 differentially affects spindle assembly depending on its microtubule substrate. Current Biology. 23 (14), 1280-1290 (2013).
- Drechsler, H., McHugh, T., Singleton, M. R., Carter, N. J., McAinsh, A. D. The Kinesin-12 Kif15 is a processive track-switching tetramer. eLife. 3, 01724 (2014).
- Tanenbaum, M. E., et al. Kif15 Cooperates with Eg5 to promote bipolar spindle assembly. Current Biology. 19 (20), 1703-1711 (2009).
- Mountain, V., et al. Cross-links microtubules in the mammalian mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 147 (2), 351-365 (1999).
- Norris, S. R., et al. Microtubule minus-end aster organization is driven by processive HSET-tubulin clusters. Nature Communications. 9 (1), 2659 (2018).
- Cai, S., Weaver, L. N., Ems-McClung, S. C., Walczak, C. E. Proper organization of microtubule minus ends is needed for midzone stability and cytokinesis. Current Biology. 20 (9), 880-885 (2010).
- Pamula, M. C., et al. High-resolution imaging reveals how the spindle midzone impacts chromosome movement. Journal of Cell Biology. 218 (8), 2529-2544 (2019).
- Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
- Zhu, C., Lau, E., Schwarzenbacher, R., Bossy-Wetzel, E., Jiang, W. Spatiotemporal control of spindle midzone formation by PRC1 in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6196-6201 (2006).
- Subramanian, R., et al. Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein. Cell. 142 (3), 433-443 (2010).
- Elting, M. W., Prakash, M., Udy, D. B., Dumont, S. Mapping load-bearing in the mammalian spindle reveals local kinetochore fiber anchorage that provides mechanical isolation and redundancy. Current Biology. 27 (14), 2112-2122 (2017).
- Fant, X., Merdes, A., Haren, L. Cell and molecular biology of spindle poles and NuMA. International Review of Cytology. 238, 1-57 (2004).
- Merdes, A., Heald, R., Samejima, K., Earnshaw, W. C., Cleveland, D. W. Formation of spindle poles by dynein/dynactin-dependent transport of NuMA). Journal of Cell Biology. 149 (4), 851-861 (2000).
- Maddox, P., Straight, A., Coughlin, P., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Direct observation of microtubule dynamics at kinetochores in Xenopus extract spindles: Implications for spindle mechanics. Journal of Cell Biology. 162 (3), 377-382 (2003).
- Maddox, P., Desai, A., Oegema, K., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Poleward microtubule flux is a major component of spindle dynamics and anaphase A in mitotic Drosophila embryos. Current Biology. 12 (19), 1670-1674 (2002).
- LaFountain, J. R., Cohan, C. S., Siegel, A. J., LaFountain, D. J. Direct visualization of microtubule flux during metaphase and anaphase in crane-fly spermatocytes. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5724-5732 (2004).
- Pavin, N., Tolić, I. M.
- Vukušić, K., Tolić, I. M. Anaphase B: Long-standing models meet new concepts. Seminars in Cell and Developmental Biology. 117, 127-139 (2021).
- Vukušić, K., et al. Microtubule sliding within the bridging fiber pushes kinetochore fibers apart to segregate chromosomes. Developmental Cell. 43 (1), 11-23 (2017).
- Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
- Gaska, I., Armstrong, M. E., Alfieri, A., Forth, S. The mitotic crosslinking protein PRC1 acts like a mechanical dashpot to resist microtubule sliding. Developmental Cell. 54 (3), 367-378 (2020).
- Woll, K. A., et al. An allosteric propofol-binding site in kinesin disrupts kinesin-mediated processive movement on microtubules. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11283-11295 (2018).
- Forth, S., Hsia, K. C., Shimamoto, Y., Kapoor, T. M. Asymmetric friction of nonmotor MAPs can lead to their directional motion in active microtubule networks. Cell. 157 (2), 420-432 (2014).
- Alfieri, A., Gaska, I., Forth, S. Two modes of PRC1-mediated mechanical resistance to kinesin-driven microtubule network disruption. Current Biology. 31 (12), 2495-2506 (2021).
- Koch, M. D., Shaevitz, J. W.
- Sarshar, M., Wong, W. T., Anvari, B. Comparative study of methods to calibrate the stiffness of a single-beam gradient-force optical tweezers over various laser trapping powers. Journal of Biomedical Optics. 19 (11), 115001 (2014).
- Van Mameren, J., Wuite, G. J. L., Heller, I. Introduction to optical tweezers: Background, system designs, and commercial solutions. Methods in Molecular Biology. 783, 1-20 (2011).
- Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9, 51131 (2020).
- Reinemann, D. N., et al. Collective force regulation in anti-parallel microtubule gliding by dimeric Kif15 kinesin motors. Current Biology. 27 (18), 2810-2820 (2017).
- Reinemann, D. N., Norris, S. R., Ohi, R., Lang, M. J. Processive kinesin-14 HSET exhibits directional flexibility depending on motor traffic. Current Biology:CB. 28 (14), 2356-2362 (2018).
- Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
- SMART - Servier Medical ART. , Available from: https://smart.servier.com/ (2022).
- Gaska, I., Armstrong, M., Alfieri, A., Forth, S. The mitotic crosslinking protein PRC1 acts as a mechanical dashpot to resist microtubule sliding. Developmental Cell. 54 (3), 1-14 (2020).
- Janson, M. E., De Dood, M. E., Dogterom, M. Dynamic instability of microtubules is regulated by force. Journal of Cell Biology. 161 (6), 1029-1034 (2003).
- Kerssemakers, J. W. J., et al. Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution. Nature. 442 (7103), 709-712 (2006).
- Powers, A. F., et al. The Ndc80 kinetochore complex forms load-bearing attachments to dynamic microtubule tips via biased diffusion. Cell. 136 (5), 865-875 (2009).
- Akiyoshi, B., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
- Fong, K. K., et al. Direct measurement of the strength of microtubule attachment to yeast centrosomes. Molecular Biology of the Cell. 28 (14), 1853-1861 (2017).
- Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps. Biophysical Journal. 90 (5), 1687-1696 (2006).
- Memet, E., et al. Microtubules soften due to cross-sectional flattening. eLife. 7, 34695 (2018).
