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Biology

再構成された活性微小管束内の力を直接測定

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63819
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biological Sciences and Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies, Rensselaer Polytechnic Institute
* These authors contributed equally

Summary

ここでは、微小管束を in vitroで 再構成し、光学トラップと全反射蛍光顕微鏡を同時に使用して、微小管束に及ぼされる力を直接定量化するためのプロトコルを紹介します。このアッセイは、活性微小管ネットワーク内のタンパク質アンサンブルによって生成される力と変位のナノスケールレベルの測定を可能にします。

Abstract

微小管ネットワークは、小胞輸送のトラックとして機能することから、染色体分配を調節するための有糸分裂中の特殊なアレイとして機能することまで、幅広いタスクを実行するために細胞で使用されます。微小管と相互作用するタンパク質には、キネシンやダイニンなどの能動や方向性運動を発生させるモーターや、フィラメントを高次ネットワークに架橋したり、フィラメントのダイナミクスを調節したりする非モータータンパク質などがあります。これまで、微小管関連タンパク質の生物物理学的研究は、小胞輸送に必要な単一モータータンパク質の役割に圧倒的に焦点を当てており、キネシンやダイニンの力発生特性やメカノケミカル制御の解明は大きく進歩してきました。しかしながら、微小管が有糸分裂紡錘体内でのフィラメントスライド中など、貨物およびトラックの両方として作用するプロセスについては、関与する架橋タンパク質のアンサンブルの生物物理学的調節についてはほとんど理解されていない。ここでは、精製された微小管と有糸分裂タンパク質から再構成された架橋微小管最小ネットワーク内の力の生成と応答を直接調査するための方法論について詳しく説明します。微小管対は目的のタンパク質によって架橋され、1つの微小管は顕微鏡カバーガラスに固定化され、2番目の微小管は光トラップによって操作されます。同時全反射蛍光顕微鏡法により、フィラメントがスライドして力を発生させるときに、この微小管ネットワークのすべてのコンポーネントのマルチチャンネル視覚化が可能になります。また、これらの技術を使用して、キネシン-5アンサンブルによって加えられる押し力と、有糸分裂MAP PRC1によって架橋された滑り微小管ペア間で粘性のあるブレーキ力がどのように発生するかを示します。これらのアッセイは、紡錘体の組み立てと機能のメカニズムに関する洞察を提供し、ニューロンや極性上皮細胞の軸索や樹状突起など、さまざまな状況で高密度の微小管ネットワーク力学を研究するために、より広く適応させることができます。

Introduction

細胞は微小管ネットワークを使用して、小胞輸送1,2,3から有糸分裂中の染色体分配4,5,6に至るまで、さまざまな機械的タスクを実行します。分子モータータンパク質のキネシンやダイニンなど、微小管と相互作用するタンパク質の多くは力を発生させ、機械的負荷によって調節されます。これらの重要な分子がどのように機能するかをよりよく理解するために、研究者は光学トラップやTIRF顕微鏡などの単一分子生物物理学的方法を使用して、個々のタンパク質の無負荷ステッピング速度、処理性、力と速度の関係などの重要なパラメーターを直接監視しています。最も一般的に使用されている実験幾何学は、球状の形状とサイズがモーター駆動の輸送を受けている小胞を模倣するトラッピングビーズにモータータンパク質を直接付着させることでした。キネシン-1 7,8,9、キネシン-2 10,11,12、キネシン-313,14,15,16キネシン-517,18、キネシン-8 19,20、ならびにダイニンおよびダイニン錯体21,22を含む多数のキネシン、23、24、25は、これらの方法で検討されている。

しかし、多くの細胞プロセスでは、モータータンパク質と非モータータンパク質は、トラックとカーゴの両方として微小管を使用します26,27。さらに、微小管フィラメントが高次バンドルに架橋されているこれらのシナリオでは、これらのタンパク質は単一のユニットではなくアンサンブルとして機能します。例えば、分裂した体細胞内で、高密度フィラメントネットワークが自己組織化して有糸分裂紡錘体装置28、29、30を構築する。極間紡錘体微小管ネットワークは非常にダイナミックで、マイナス端が紡錘体極を向いており、プラス端が紡錘体赤道付近で重なり合うように大きく配置されています。紡錘体内のフィラメントは、キネシン-5 31,32,33、キネシン-12 34,35,36、およびキネシン-1437,38,39などのモータータンパク質、またはPRC1 40,41,42,43またはNuMA 44,45などの非モータータンパク質によって架橋されています。46。それらは、極方向のフラックスなどのプロセス中、または中期または後期47,48,49,50,51,52中の染色体分離中の染色体中心を調整している間に、頻繁に移動または機械的ストレスを経験します。したがって、有糸分裂によるミクロンスケールのスピンドル装置の完全性は、相互作用するフィラメントのこのネットワークによって生成および維持される押し力と引っ張り力の慎重に調整されたバランスに依存しています。しかし、この機械的制御を調査し、タンパク質アンサンブルがどのように連携して微小管の動きを調整し、紡錘体を適切に組み立てるのに必要な力を生み出すかを説明するために必要なツールは最近開発されたばかりであり、動的微小管ネットワークを定義する生物物理学的規則を理解し始めたばかりです。

この原稿の目的は、架橋微小管ペアを in vitroで再構成し、微小管と架橋タンパク質の両方の蛍光視覚化とナノスケールの力測定を同時に可能にする顕微鏡チャンバーにこれらのバンドルを固定化し、これらのデータを堅牢に処理するために必要な手順を実証することです。蛍光標識された微小管を安定して重合するために必要な手順、取り付け用の顕微鏡カバーガラスの準備、光学トラップ実験用のポリスチレンビーズの準備、および生体 内機能を維持し ながら直接生物物理学的操作を可能にする架橋フィラメントネットワークの組み立てに必要な手順を詳しく説明します。

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Protocol

1.微小管の調製

注:GFP標識架橋タンパク質を使用する場合、微小管の有機フルオロフォア標識は、赤色(ローダミンなど)および遠赤色(ビオチン化HiLyte647など、本文の残りの部分ではビオチン化遠赤色と呼ばれます)が適しています。高品質のクワッドバンド全反射蛍光(TIRF)フィルタを使用することで、イメージング中に3つのチャンネル間のクロストークを最小限に抑えることができます。

  1. GMPCPP微小管種子ストックの準備
    1. 1 mgの非標識凍結乾燥チューブリンを84 μLの氷冷1x BRB80(80 mM PIPES、1 mM MgCl2、1 mM EGTA、pH 6.8)に懸濁し、使用直前にDTTを最終濃度1 mMまで添加します。60 μgの蛍光色素標識凍結乾燥チューブリンを、1 mM DTTを含む6 μLの冷熱1x BRB80に懸濁します。60 μgのビオチン標識凍結乾燥チューブリンを、1 mM DTTを含む6 μLの冷熱1x BRB80に懸濁します。
    2. 標識比1:10の非ビオチン化ローダミン標識チューブリンシードストックを調製するには、非標識チューブリン84 μL、フルオロフォア標識チューブリン6 μL、および10 μLの10 mM GMPCPPストック溶液を0.5 mLチューブに加えます。穏やかにピペッティングしてよく混ぜ、氷の上に保ちます。
      注:これらのアッセイでは、GTPで重合した場合やタキソールを省略した場合よりも微小管が安定しており、光学トラップによる直接操作に適しているため、GMPCPP重合が好ましい。
    3. 蛍光標識比が1:10のビオチン化遠赤色標識チューブリンシードストックを調製するには、0.5 mLチューブに80 μLの非標識チューブリン、6 μLの蛍光色素標識チューブリン、4 μLのビオチン標識チューブリン、および10 μLの10 mM GMPCPPストック溶液を加えます。穏やかにピペッティングしてよく混ぜ、氷の上に保ちます。種子ストックを氷上で5分間インキュベートします。
    4. チューブリン溶液を高速遠心分離に適したポリカーボネートチューブに移します。種ストックを~350,000 x g で2°Cで5分間遠心分離して微小管の重合を防ぎ、上清を回収して分注します。この段階でのチューブリンの最終的な推定濃度は~50μMです。
    5. 0.2 mL PCRチューブを使用して、2 μLのシードストックを調製し、液体窒素で瞬間凍結します。アリコートは-80°Cで最大6ヶ月間保存できます。
  2. 微小管の重合
    1. 1x BRB80を500 μL調製し、氷上に置きます。ビオチン化ファーレッドと非ビオチン化ローダミンシードストックのアリコートをそれぞれ1つずつ氷上に置いて解凍します。
    2. 種子ストックを氷上で5分間インキュベートします。インキュベーション期間の終了時に、直ちに26 μLの1x BRB80を各チューブに加えます。より長い微小管が必要な場合は、BRB80の容量を5〜10μL増加させ、一方、より短い微小管の場合は、重合用の容量を5μL減らします。
    3. 微小管シードストックを水浴中37°Cで1時間インキュベートします。室温1x BRB80 298.5 μLと4 mMタキソールストック溶液1.5 μLを組み合わせて、20 μMタキソール溶液を生成します。300 μLの1x BRB80を準備し、両方のチューブを室温に保ちます。
    4. 適切な高速ローターを30°Cに温めます。 これは、30°Cに設定された卓上超遠心分離機で行うことができます。 微小管を水浴から取り出し、ベンチトップ上で室温で10〜15分間保ちます。
  3. 微小管の解明
    1. 微小管増殖溶液に室温1x BRB80を100 μL加え、チューブを~10回フリックするか、穏やかにピペッティングして混合します。微小管成長溶液をポリカーボネート製遠沈管に移します。
    2. 遠心分離機の回転に対して外側を向くポリカーボネートチューブの片側に印を付けます。これは、少量の材料のためにほとんど見えない微小管ペレットを見つけるのに役立ちます。
    3. 微小管溶液を~350,000 x g で30°Cで10分間遠心分離します。 遠心分離後、可能であれば微小管を含むチューブにペレットがないか検査します。ペレットを乱すことなく、最後の数マイクロリットルの液体を除くすべてを慎重に取り除きます。ペレットがはっきりと見えない場合は、ペレットが配置されている場所を邪魔しないように、ガイドとして作成されたマーキングを使用してください。
    4. 直ちに100 μLの1x BRB80 + 20 μMタキソールを微小管チューブに加えます。これはペレットに直接加えることができます。この段階でのペレットの破壊は、清澄化プロセスに大きな影響を与えません。
    5. 微小管を~350,000 x g で10分間遠心分離し、チューブのマークされた部分が遠心分離機の回転に対して再び外側を向くように注意します。
    6. 以前と同様に、数マイクロリットルを除くすべての溶液を取り除き、微小管ペレットを破壊しないように注意します。手順 1.3.4.-1.3.5 を繰り返します。次に、微小管ペレットを1x BRB80 + 20 μMタキソールの20〜50 μLに再懸濁します。
    7. 再懸濁量の大部分をピペッティングし、ペレットに直接静かに排出し、20〜30倍、またはペレットが完全に再懸濁されるまで繰り返すことにより、再懸濁します。これは、過度に激しいピペッティングによって微小管を剪断しないように注意して行う必要があります。ピペットチップを切断して開口部のサイズを大きくすることも、微小管のせん断を減らすのに役立ちます。
    8. 微小管を室温で保存するには、チューブをホイルで包み、蛍光色素を光から遮蔽し、ベンチトップに置いてください。微小管は、一般に清澄化後2〜3日間使用できます。
  4. 顕微鏡による微小管の評価
    1. 1 μLの微小管と9 μLの室温1x BRB80を混合することにより、清澄化された微小管溶液の1:10希釈液を調製します。10 μLを顕微鏡スライドにピペッティングし、液滴の上にカバーガラスを置いてスカッシュを形成することにより、この溶液をすぐに画像化します。
    2. 蛍光顕微鏡と微小管希釈液と接触するカバーガラス表面に焦点を当てた100倍の対物レンズを使用して視覚化したときに、高密度で8〜25 μmの長さの微小管(高密度メッシュワークで層状に層状にされた全視野あたり数百)が見えることを確認します。

2.不動態化カバーガラスの準備

  1. カバーガラスの洗浄
    1. 18 mm x 18 mmのカバーガラスを非反応性プラスチックラックに入れ、各ラックを100 mLビーカーに入れます。カバースリップの両側をクリーニングする必要があるため、ラックのスロットごとに 1 つのカバーガラスを配置します。
    2. (1)脱イオン水(18.3MΩ-cmの抵抗率)、(2)2%マイクロ90溶液、(3)脱イオン水、(4)新たに調製された0.1M KOH、(5)脱イオン水(図1A)。カバーガラスが液体で完全に覆われていることを確認してください。超音波処理サイクルの間に、ピンセットを使用して脱イオン水でカバーガラスの各ラックをすすぎ、脱イオン水にラックを上下に10〜20倍浸し、水を交換し、すすぎプロセスを2回繰り返します。
    3. カバーガラスを水で3回すすぎ、ビーカーに100%エタノールを補充し、ラックをビーカーに戻します。ビーカーをヒュームフードに移動し、すべてのカバースリップラック用のスペースを確保するのに十分なティッシュワイプを配置します。次に、ピンセットでラックを取り外し、ティッシュワイプの上に置きます。
    4. 乾燥した窒素ガス流を使用して、カバーガラスとそのラックからエタノールを乾くまで吹き飛ばします。ビーカーから残りのエタノールを処分し、同様に乾燥窒素ガス流を使用して乾燥させます(図1A)。
  2. カバーガラス上のアミノシラン表面機能化
    1. 40 mLのアセトンと400 μLのAPTES試薬を50 mLのコニカルチューブに加え、しっかりとキャッピングし、10倍反転させて混合することにより、(3-アミノプロピル)チエトキシシラン(APTES)試薬溶液を調製します。
    2. カバーガラスの1つのラックを対応するドライビーカーに移動し、APTES溶液に完全に沈めます。5分間インキュベートします(図1A)。APTES処理されたラックを新しいドライビーカーに移動し、新しいラックをAPTESに移動して5 mインキュベートします。
    3. ステップ2.1.2の説明に従ってラックを10〜20x浸し、水を5x交換して、処理したラックを脱イオン水ですすぎます。すべてのカバーガラスが処理され、洗浄されるまで繰り返します。
  3. アミノシラン表面のペグ化
    1. 24枚のカバーガラスをコーティングするのに十分な、25%w/v PEGを含む~100 μLと10%w/vビオチン-PEGを含む~10 μLの2つのPEG溶液を調製します。25% PEG溶液を3,000 x gで20秒間遠心分離し、0.1 M NaHCO3を加えてPEGを完全に溶解します。溶液は曇ったままかもしれません。穏やかなピペッティングによってビオチン-PEGを混合します(図1B)。
    2. PEG溶液とビオチン-PEG溶液の混合物を、1容量のビオチン-PEGに対して33.3倍の容量のPEGとともに調製します(例:100 μLのPEG溶液と3 μLのビオチン-PEG溶液)。
    3. ヒュームフードに、滅菌された糸くずの出ないワイプをいくつか配置します。カバースリップラックをワイプに移動し、前と同じように乾燥窒素ガス流でブロードライします。いくつかの新しい乾いたワイプで、完全に乾燥したカバーガラスをペアで配置し、右下隅にそれぞれに「b」などの非対称記号のラベルを付けます。このマーキングはカバーガラスのサンプル表面の反対側にあり、実験を妨げません(図1B)。
    4. ピンセットで各ペアのカバーガラスを1つずつ裏返します。裏返した各カバーガラスに、6 μLのPEG/ビオチン-PEG混合物を置き、両方の「b」ラベルが外側を向くように2番目のカバーガラスを上に置きます。
    5. カバーガラスの端を合わせ、乾燥を防ぐために加湿された気密チャンバーに入れます。カバーガラスを湿度チャンバー内で室温で3時間インキュベートします。
    6. インキュベーション後、湿度チャンバーからカバーガラスを取り外し、カバーガラスペアを慎重に分離して、ラックに戻します。前と同じように各ラックを脱イオン水で洗い、ピンセットを使用してラックを10〜20倍浸し、水を合計5倍交換します。
    7. カバーガラスのすべてのPEG化側面を同じ方向に向けて配置し、2つのPEG化カバーガラス面が互いに向き合わないようにします。PEG化表面は完全に乾くまで非常に粘着性があるため、カバーガラスが触れないように特に注意してください。各ラックとカバーガラスを、前と同じように乾燥窒素ガス流を使用して乾燥させます(図1B)。
    8. カバーガラスとそのラックが完全に乾いたら、表面コーティングの劣化を防ぐために真空デシケーターに保管してください。湿気がPEGコーティングを破壊するのを防ぐために、真空下で乾燥剤で適切に保管されます。カバーガラスは約1週間使用できます。

3. キネシンコートビーズの作製

  1. 厳密キネシン構築物の選択と調製
    1. 公開されたプロトコル53,54に従って厳密キネシン構築物を発現および精製する。0.02 mg/mLのキネシン溶液5 μLアリコートをフラッシュフリーズし、-80°Cで最長1年間保存します。
      注:リゴールキネシンタンパク質には、ATP加水分解を妨げるG234A点変異があります。マイクロビーズに結合させると、微小管との親和性の高い相互作用により、ビーズは10〜20 pNの荷重を数分間維持できます。一般的に使用されるキネシン-1ホモダイマーK56053 およびさらに最適化されたK439構築物55 の両方の厳密な変異バージョンも、これらのアッセイ54において成功裏に採用されている。この改良されたK439構築物は、安定性を高めるEB1二量体化ドメインと、以下に説明するように、6-His抗体に特異的に結合するためのC末端6-Hisタグを含んでいます。
  2. ストレプトアビジンコートビーズへの6-His抗体の結合
    1. 直径1 μmのストレプトアビジン被覆ポリスチレンビーズ50 μLを0.5 mLの遠沈管に加えます。30秒間超音波処理します。
    2. 1x BRB80の790 μLに10 μLの200 mM DTTを追加します。この1x BRB80 + 2.5 mM DTTバッファーの40μLに10μLの超音波処理ビーズを追加します。
    3. 1 μLのビオチン化6-His抗体と49 μLの1x BRB80 + 2.5 mM DTTを組み合わせます。簡単に渦を混ぜます。
    4. 50 μLの希釈ビーズ混合物と50 μLの抗体希釈液を新しいチューブに入れます。チューブを4°Cのチューブローテーターに入れ、1時間回転させます。ビーズ混合物を4°Cで3,000 x g で10分間スピンダウンします。
    5. 上清をピペットで除去し、ペレットを1x BRB80中の2 mg/mLカゼイン溶液100 μLに再懸濁します。この遠心分離と再懸濁を2回繰り返します。
  3. 厳密キネシンの添加
    1. 最終ペレットを100 μLの2 mg/mLカゼイン溶液に再懸濁します。0.5 mLの遠沈管で、0.02 mg/mLのリゴールキネシン5 μLとビーズ5 μLを混ぜ合わせ、チューブを軽くフリック~10倍にして穏やかに混合します。
    2. K439 G234Aビーズ懸濁液と残りの6-Hisビーズの両方を、使用しないときはローターに4°Cで保管してください。ビーズは、この時間を超えると凝集して活動を失う傾向があるため、新鮮に準備し、実験に同じ日に使用する必要があります。

4.顕微鏡チャンバーの組み立て

  1. スライドガラスの準備とチャンバー構造
    1. 75 mm x 25 mmの顕微鏡スライドガラスを最初に超純水で洗い流し、次にノンストリークアンモニアdガラスクリーナー、次にもう一度超純水ですすぎます。振って余分な水滴を取り除きます。窒素気流を使用してスライドを乾燥させ、縞が残らないようにし、スライドをペーパータオルの上に置きます(図2A)。
    2. はさみで両面テープを~2-3 mm x 2.5 cmの短冊状に切ります(1つのチャンバーごとに2つのストリップとダブルチャンバーごとに3つのストリップ)。
    3. 鉗子を使用して、1つのスライドガラスに2本のテープを敷き、それらの間に~0.5cmのスペースを確保して1つのチャンバーを構成します。ダブルチャンバーの場合は、同じ間隔を使用しますが、3本のテープを使用します(図2B)。この方法を使用したサンプルチャネルの容量は約10μLです。
      注意: チャンバーが広いほど、溶液が流入したときに気泡が発生する可能性が高くなります。ただし、幅が0.5 cm未満のチャンバーは、イメージングの面積が小さくなるため、使用が困難な場合があります。
    4. テープがスライドガラスにしっかりと接着されるように、鉗子を使用してテープの各ストリップの長さをこすります。
    5. デシケーターから圧力を解放し、鉗子を使用して、ビオチン化カバーガラスを収納ラックから1つ取り外します。鉗子を使用して、スライドガラスの上にビオチン化カバーガラスを1つ置きます。ビオチン化面がスライドガラスに向かって内側を向いていることを確認してください。
    6. 鉗子の平らな後端を使用して、カバーガラスがテープに触れる場所でガラスをそっと押して、チャンバーをしっかりと密閉します。カバーガラスにひびが入らないように、軽い圧力を使用する必要があります(図2C)。
    7. 完成した顕微鏡チャンバーは、使用するまで直射日光を避けて密閉容器に保管してください(図2D)。
      注:ビオチン化カバーガラスは空気にさらされると劣化するため、チャンバーは製造したのと同じ日に使用することをお勧めします。
  2. 顕微鏡用試薬の流入
    1. 空のピペットチップボックスの底に超純水で湿らせた折りたたまれた糸くずの出ないティッシュを置き、湿度チャンバーを構築します。サンプルチャンバーは、流入ステップの間にこのボックスに保管して、チャネルからの溶液の蒸発を減らす必要があります。
    2. チャネルの一方の端で液体をピペッティングし、もう一方の端で液体を吸い取って、すべての試薬を導入します。ウィックするには、組織の一方の端をひねり、チャンバーの出口側にそっと置き、毛細管現象で試薬を均一に分配させます(図3A)。微小管の解重合を防ぐために、流入する直前にすべての試薬を室温に戻します。
    3. 20 μLの角度付きピペットチップを使用して、1つのチャンバーの入口側に触れるようにし、10 μLの0.5 mg/mLストレプトアビジンまたはニュートラアビジンをゆっくりと流します。より小さなピペットチップと試薬のゆっくりとした一定の流入を使用して、チャンバー内に気泡が発生する可能性を減らします(図3B)。
    4. チャンバーのカバーガラス側を下に向けて、湿度チャンバー内のスライドを4分間インキュベートします。この方向により、微小管やビーズなどのより大きな物体がPEG化表面の近くに沈むことができます。
    5. 20 μLの1x BRB80を使用してチャンバーを洗い流し、糸くずの出ないティッシュを使用して液体を引き出します。チャンバー内に漏れがある場合は、スライドを破棄し、別のスライドから始めます。チャンバー内で発生する小さな気泡は、イメージングに悪影響を与えることはありません。
    6. 10 μLの0.5 mg/mLカゼインブロッキング溶液でフローイン、インキュベーション、およびフラッシュのステップを繰り返します(図3C)。ビオチン化遠赤色微小管を~1:20に希釈し、チャンバー内に10 μLを流入します。5分間インキュベートし、チャンバーを20 μLの1x BRB80で洗い流します(図3D)。100 μm x 100 μmのイメージング視野内のこれらの微小管の最適密度は10〜20である必要があります。そして、この段階での希釈は、この表面結合比を達成するために調整する必要があります。
    7. 研究対象の適切な濃度(通常は1〜10 nM)の架橋モーターまたは非モータータンパク質10 μLを使用して、フローイン、インキュベーション、およびフラッシュのステップを繰り返します(図3E)。
    8. 以前のビオチン化遠赤色微小管と同様の濃度に希釈した10 μLのローダミン微小管を流します。インキュベーションとフラッシュのステップを繰り返します(図3F)。
    9. 1 μLのリゴールキネシンコーティングビーズと、架橋タンパク質活性に最適化された19 μLの反応バッファーを組み合わせます。例えば、キネシン-5活性の分析には、1 mM TCEPボンドブレーカー、0.2 mg/mLアルファカゼイン、70 mM KCl、酸素消去システム(4.5 mg/mLグルコース、350単位/mLグルコースオキシダーゼ、34単位/mLカタラーゼ)、1 mM DTT、およびATPを所望の濃度(例えば、最大キネシン速度条件の場合は1 mM)で1x BRB80(図3G)の反応バッファーを使用します。).非モータータンパク質の分析では、ATPを省略し、KClの濃度を変化させて、これらのアッセイでタンパク質-微小管相互作用強度を調節します。
    10. チャンバーの両端を透明なマニキュアで密封し、ポリッシュが乾くまで待ってからイメージングします(図3H)。正常に構築されたチャンバーは、漏れがなく、気泡が最小限に抑えられます。

5. 3色TIRFによる微小管束のイメージング

  1. TIRFイメージング機能を備えた倒立顕微鏡装置を使用し、その中にシングルビーム光トラップを構築します(図4)。
    注:ここで説明する研究では、GFPタグ付きタンパク質、ローダミン標識微小管、ビオチン化遠赤色標識微小管について、それぞれ100倍/NA1.49油対物レンズ、TIRFモジュール、および488 nm、561 nm、および640 nmの3つのレーザーを備えた倒立顕微鏡を使用しました。
    1. サンプルチャンバーのカバーガラスに液浸オイルを1滴加えます。過度の油は顕微鏡対物レンズを損傷する可能性があります。サンプルチャンバーのカバーガラス側を下に向けて、イメージングするサンプルを顕微鏡プラットフォームに置きます。
    2. カバーガラスと対物レンズの両方がオイルを介して接触するように、対物レンズをゆっくりと持ち上げます。サンプルチャンバーのカバーガラス面に焦点が合うように対物レンズの高さを調整します。
    3. サンプルのシングルフレーム画像を3チャンネルすべてに記録します。ここでの実験では、3つのチャネルすべてで最適なイメージング期間として100〜200ミリ秒の露出を使用します。露光時間を長くすると、光退色が増加する可能性があります。
    4. レーザー出力を調整して、個々のバンドルがアッセイされるときの2〜5分間の光退色を最小限に抑えながら、サンプルからの良好な信号対雑音比を達成します。ここで使用するレーザー(図4および図 5)では、GFPチャネルに 5 mW、両方の微小管チャネルに3 mWのレーザー出力を最適に使用します。
      注:正常に組み立てられたバンドルは、遠赤色チャネルにある1つの表面固定微小管、有意なGFPタンパク質シグナルを持つ数ミクロンの共拡張領域、およびこれらの領域と重なり合い、バンドルから数ミクロン離れたローダミン微小管で構成される必要があります(図5B、C、および図6).ローダミン微小管のライブイメージングは、非架橋微小管末端の微妙な変動を明らかにし、このフィラメントがチャンバー内の表面または他のタンパク質に付着していないことを示しているはずです。
    5. 視野ごとの微小管束の頻度を観察します。正常に調製されたサンプルの場合、チャンバーあたり100 μL x 100 μLの視野あたり約3〜4個の微小管束が存在する必要があります。

6. 微小管束の光トラップ実験

  1. 実験前の条件のキャリブレーション
    1. これらの実験を実行するには、剛性が0.05〜0.1 pN / nmのシングルビーム光トラップを使用します。対物レンズのすぐ下とコンデンサーの上にそれぞれショートパスフィルターを導入することにより、トラップ光学系と位置感度光検出器をTIRF対応の倒立顕微鏡に組み込みます(図4)。
    2. さらに、サンプルが置かれているナノポジショニングステージを追加して、ユーザーがこれらのアッセイ中に制御された方法でナノメートルスケールの精度で微小管を移動できるようにします。代表データを取得するためにここで用いられるシステムは、公開された著作物27、53、54、56、57に記載されている。
      注:このプロトコルの範囲を超えていますが、シングルビーム光トラップ58,59,60の構築とキャリブレーションを詳述する複数のリソースが利用可能です。
    3. 明視野またはDICチャンネルと顕微鏡上の100倍対物レンズを使用して、サンプル中のビーズの密度を観察します。明視野顕微鏡はビーズの識別と操作にのみ使用し、蛍光画像取得と同時に記録することはできません。ビーズを互いに平均10μm以上離して間隔を空け、表面閉じ込めや付着がなく、互いに付着したり、クラスター化したりしないようにします。
    4. ビオチン化遠赤色微小管がカバーガラスの表面にしっかりと付着し、微小管軸に沿った動きや溶液中で変動する微小管の自由端など、目に見えるブラウン運動がないことを確認します。
    5. ローダミン微小管が架橋MAPを介してビオチン化微小管に付着し、自由末端で目に見えて変動していることを確認します。非ビオチン化微小管の表面付着は、PEG化が失敗したか、PEGコーティングが劣化した可能性があることを示すことがよくあります。
  2. モーター駆動微小管摺動測定
    1. 公開されているプロトコルに従って、目的のモータータンパク質を発現および精製します。例えば、完全長GFPタグ付きキネシン-5タンパク質は、これらのアッセイ53,61、ならびに非標識キネシン-1262およびキネシン-1463において首尾よく精製および採用されている。上記のステップ4および5で説明したように、モータータンパク質架橋バンドルを組み立てて視覚化します。
    2. ブラウン運動を示す溶液中の遊離シングルビーズを光学トラップで捕捉する。必要に応じてトラップ光学系を調整して、ビードを視野の中央に移動します。トラップビームからの反射干渉パターンが対称であることを確認し、トラップ光学系を調整してビームの非対称性を解決します。
    3. トラップビームによる光退色を最小限に抑えるために、バンドル内のローダミン微小管の自由端がビーズの真下にあり、ビーズが架橋タンパク質を含むオーバーラップ領域から数ミクロン離れるようにサンプルステージを移動します。微小管に衝突するまでZ軸のビードを下げます。ビードを軽く下げるように注意し、カバーガラスの表面にビードを押し付けないでください。
    4. トラップを短時間オフにして、明視野チャネルでスライド微小管に取り付けられたビーズの運動性を観察します。モータータンパク質アッセイを行う場合、微小管がスライドするにつれて、取り付けられたビーズが方向に移動します。トラップを再度アクティブにして、ビーズを再度キャプチャします。
    5. 上記の手順5で最適化されたレーザー出力と露光時間を使用して、3つのチャネル(488 nm、561 nm、640 nm)で1〜2フレーム/秒の速度で蛍光データの記録を開始します。
    6. トラッピングコンピュータソフトウェアを使用して、位置感知光検出器(X、Y、およびSUM強度信号)、ナノポジショニングステージ(X、Y、およびZ座標)、およびTIRFカメラのシャッター状態からの電圧データを記録します。実験要件に応じて、適切なソフトウェア(カスタム記述のLabViewコードなど)によって制御される専用の電圧入力データ集録ボードを使用して、これらのトラップ電圧値のデジタル化を開始します。
    7. データが取得されるときに力信号を監視し、データ収集の成功を妨げる可能性のある異常に細心の注意を払ってください。
      注:異常には、(1)トラップに移動する他のビーズ、(2)トラップから早期に逃げるビーズ、および(3)突然の力の急降下とその後のトラップに対する力の再開始の失敗が含まれますが、これらに限定されませんビーズの表面の厳密キネシン分子の問題を示します。
    8. 測定後、トラップを無効にしてビーズを解放し、必要な実験反復回数が達成されるまで新しいビーズと新しい微小管で繰り返します。
  3. 受動架橋抵抗測定
    1. 公開されているプロトコルに従って、目的の非モーター架橋タンパク質を発現および精製します。例えば、完全長GFP標識PRC143、54、57および二量体NuMA切断構築物56が、これらのアッセイにおいて首尾よく採用されている。上記のステップ4と5で説明したように、架橋バンドルを組み立てて視覚化します。
    2. 2つの微小管のみを含む適切な微小管束を特定します.1つは全面付着でビオチン化され、もう1つは溶液中に部分的に遊離しているビオチン化されていない微小管です。これにより、ビードを取り付けるための自由端が得られ、ビーズが表面結合微小管に取り付けられず、X軸またはY軸のいずれかに整列し、ステージモーションが1つの軸のみに沿って行われることが保証されます。
    3. 光学トラップを使用して、ブラウン運動を受けているフリービードをキャプチャします。ビーズがトラップされたら、ビーズを選択した微小管束に慎重に移動し、その過程で他のビーズがトラップに引き込まれないようにします。GFPタグの光退色を最小限に抑えるために、架橋タンパク質を含むオーバーラップ領域からビーズが数ミクロン離れていることを確認してください。
    4. ローダミン微小管の自由セグメントの端に接触するまで、Z軸のビーズを慎重に下げます。ゆっくりと引き上げ、微小管軸に対して垂直に動かし、ローダミン微小管の曲がりを観察し、ビードの位置を追跡して、付着を確認します。取り付けられていない場合は、ビーズを微小管に軽くぶつけて取り付けるまで繰り返します。
    5. ナノポジショニングステージを移動して、表面付着微小管の微小管軸に沿ってローダミン微小管を慎重に再調整し、微小管束の自動引っ張りのパラメータを設定します。微小管の平行軸に沿った方向を設定し、オーバーラップの長さに応じて、希望のプル速度(25〜200 nm / sが有用な速度範囲です)、および希望のプル時間(約30秒から2分)を設定します。
    6. 3つのチャンネル(488 nm、561 nm、640 nm)の蛍光データを毎秒1〜2フレームの速度で記録し始めます。上記の手順5で最適化されたレーザー出力と露光時間を使用します。
    7. 自動ステージモーションを開始し、位置感知検出器、ステージ、およびTIRFカメラの状態からトラップデータを記録します。(1)トラップに入る別のビーズ、(2)微小管架橋の早期喪失、または(3)ローダミン微小管からのビーズの剥離を含むがこれらに限定されない、データ収集を妨げる可能性のある要因を監視します。
    8. トラップを無効にしてビードを解放し、必要に応じて実験を繰り返します。一般的なサンプルチャンバーは、バンドルの分解とタンパク質活性の損失が発生する前に、約30分間使用できます。
      注:分解効果は使用する架橋剤によって異なりますが、微小管または表面のいずれかに静的な点状突起が形成されたり、非特異的結合を示す微小管変動が失われたり、ビーズを微小管に安定して付着させたりできないこととして現れる可能性があります。

7. 蛍光画像の解析と光トラップ記録の相関

注:データ収集を最適化するには、光学トラップソフトウェア用と蛍光イメージング用の2つの別々のコンピュータ制御システムを採用することが有益です。このセットアップにより、両方の実験モダリティで高速データ取得が可能になり、単一のCPUを使用する場合に発生する可能性のあるデータに導入される操作実行のナノ秒およびマイクロ秒の遅延が排除されます。

  1. 使用するモーターまたは非モーター架橋タンパク質とそれらの予想されるステッピング速度(通常は1〜10kHz)に最適化されたレートで光学トラップデータをデジタル化します。
  2. 位置検出型光検出器からのX、Y、SUM電圧信号、およびナノ位置決めステージのX、Y、Z位置データを、光トラップを制御し、これらのコンポーネントからのデジタル電圧信号をサンプリングするための専用ソフトウェアを使用して記録します。
  3. カメラからのシャッターオープン状態のデジタル信号を、光トラップデータ収集ボード上の追加の電圧入力チャンネルで記録します。これにより、蛍光イメージングデータと光トラップタイムトレースとの相関が可能になります。最初のフレームからのカメラ信号が適切に記録されるように、イメージングを開始する前に光学トラップでデータ収集を開始します。
  4. 必要に応じて、スライディングウィンドウ、メディアンフィルター、ガウスフィルターなどの適切なフィルタリング方法を使用して、高いサンプリングレートで取得した生の時系列データを平均します。
  5. ラインスキャン解析などの方法を用いて蛍光画像の時系列データを定量し、ここで微小管領域の長さに沿った画素強度値が算出される。これらの線から軌道をスキャンし、微小管のエッジ、したがってオーバーラップ領域を特定します。さらに、架橋剤タンパク質チャネルからの蛍光強度を使用して、タンパク質の局在、濃度、および密度を計算します。
  6. 力と画像データの相関は、この実験システムの重要な出力です。例えば、所与のカメラ露光領域内のすべての力データ点(カメラチャネル内の対応するデジタル信号スパイクによって示される)を選択して平均化し、対応する蛍光画像フレームと直接比較する。続いて、力の大きさと架橋タンパク質の数、オーバーラップ長、または架橋剤分布との関係を抽出します。

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Representative Results

生物物理学的分析に適した微小管束の調製は、いくつかの重要な基準が満たされれば成功したと見なされます。まず、3色でイメージングすると、オーバーラップ領域を優先的に装飾する架橋タンパク質の濃度を持つ2つの整列した微小管が明らかになります(図5B、C、および図6B)。理想的には、ローダミン微小管のオーバーラップエッジと自由末端の間の距離は、トラッピングビームと蛍光標識タンパク質の間に十分な物理的スペースを提供するために少なくとも5μmである必要があります。第二に、ビオチン化遠赤色微小管がない領域、特に架橋タンパク質が標識されているのと同じチャネルからのバックグラウンド蛍光シグナルが最小限である必要があります。高いバックグラウンド蛍光は、カバーガラスのパッシベーションが不十分で、ガラス結合タンパク質の濃度が高いことを示しており、微小管またはトラッピングビーズと非特異的に相互作用する可能性があります。さらに、微小管イメージングチャネルのいずれかに見られる小さな丸い点または短い断片の存在は、微小管の重合と清澄化が失敗したか、微小管が老化または損傷したことを示唆しています。

第三に、トラップに使用されるビーズは、多くのビーズを含む塊の中ではなく、単一のビーズとして表示される必要があります。ビーズのごく一部が不可逆的に表面に付着する可能性がありますが、サンプルチャンバー内に拡散した個々の粒子としてかなりの部分が観察される必要があります。過度の凝集は、チャンバに流入する前に少なくとも10分間ビーズを超音波処理することによって軽減することができる。第四に、ビーズを微小管に取り付けると、トラップレーザー光がシャッターされたときにビーズが結合したままになり、良好な接着が得られるはずです。ビーズは表面に接触したときに非特異的にくっついてはならず、ビーズが微小管に付着すると、測定前にフィラメントを軽く操作(曲げたり曲げたりするなど)できる必要があります。最後に、力が加えられたとき、または運動活動が進行したときの重なりの長さの変化を観察できるはずです。例えば、モータータンパク質駆動のスライディングを観察する場合、オーバーラップ長はモータータンパク質のステッピング速度と一致する速度で減少するはずです。パッシブ架橋剤を調べる場合、力を加えるとオーバーラップ長が変化するはずです。これらの出力は、ローダミン微小管がカバーガラス表面に非特異的に付着するのではなく、架橋タンパク質を介して表面結合微小管にのみ付着していることを示しています。

これらの基準がすべて満たされると、アンサンブル力学を定義する重要な生物物理学的パラメータを抽出するために幅広い実験を実行することが可能です。このアッセイまたは類似のアッセイは、以前の研究において有糸分裂架橋タンパク質を調べるために広く使用されている。例えば、必須の有糸分裂モータータンパク質kinesin-5のアンサンブルは、オーバーラップ長64 に直線的にスケーリングする押圧力と制動力の両方を生成することによって微小管の滑りを調節できることを示しました(図5)。逆平行または平行な形状の微小管は、キネシン-5分子の小さなアンサンブルによって架橋されました。これらのモータータンパク質が微小管プラス末端に向かってステップすると、フィラメントはスライドして離れるか(逆平行)、または前後に急速に変動しました(平行)。このミニスピンドル形状内のメカニズムを監視することにより、フィラメントの重なりの長さと架橋モータータンパク質の数の両方によってスケーリングされる力の大きさを発見しました。微小管がキネシン-5の無負荷ステッピング速度よりも速い速度で移動されると、モータータンパク質が抵抗制動力を提供しました。また、C末端テールドメインが効率的な架橋と力発生に必要であることもわかった61 (図5B、C)。全長タンパク質は、すべてのモータータンパク質が個々の失速力に達すると頭打ちになる持続的な力を生成することができます(図5D)。しかし、C末端テールを持たないキネシン5モーターは、大きさがほぼ5倍小さい最大力を生成します(図5E、F)。これらの結果は、キネシン-5タンパク質がアンサンブル内でどのように働き、紡錘体集合中に微小管を極方向に押し出すかを明らかにし、分子内の必須調節タンパク質ドメインの生物物理学的機能を解明します。

また、非運動有糸分裂タンパク質PRC1のアンサンブルが、後期紡錘体中央ゾーン54での微小管の滑りに抵抗するための機械的ダッシュポットとして機能することも実証しました(図6A-C)。PRC1は、機械式ダッシュポットが速度依存の抵抗力を生成するのと同じように、引っ張り速度に比例する摩擦抵抗を生成します。これらの抵抗力は、微小管対間のオーバーラップ領域の長さや局所的な架橋剤密度には依存しませんが、係合したPRC1分子の総濃度に強く依存します(図6D、E)。これらの結果から、PRC1アンサンブルは漏れピストンとして作用し、拡散性架橋剤の圧縮は速度依存的な抵抗を生成するが、微小管プラス末端での架橋剤の損失は大きな圧縮力を緩和することが示唆された。

同様のアッセイ形状も、有糸分裂キネシン−12タンパク質Kif1562を調べるために使用された。Reinemannら62 は、微小管が押し離されたときに生じる力を測定することにより、Kif15アンサンブルがフィラメントを臨界プラトー力まで押し離すことができ、微小管を効率的に架橋して持続的な負荷を構築するためにタンパク質のC末端尾部テザー領域を必要とすることを発見しました。Reinemannらはまた、マイナス末端指向性キネシンであるキネシン-14 HSETが、同様に逆平行微小管をスライドさせて引き離すことができることをエレガントに実証した63。等量のプラス末端指向性キネシン-5 Eg5タンパク質と混合すると、HSETはEg5摺動活性を阻害し、オーバーラップ領域内の微小管摺動運動の綱引きに従事する。これらの結果はすべて、活性微小管束全体にわたる直接力測定の力を示し、生物学的に適切なネットワーク形状におけるタンパク質機能を特徴付ける必要性を明らかにしています。

Figure 1
図1:ガラスカバーガラスの不動態化 。 (A)アミノ-シラン接合のためのNo.1.5ガラスカバースリップの連続洗浄ステップ、乾燥、および接合を示す概略図。(B)PEGおよびビオチン-PEG基をガラスカバーガラスに共有結合させ、洗浄および乾燥し、短期間保管するためにカバーガラスを真空下で密封するためのプロトコルを示す概略図。回路図の一部は 、65からの修正画像です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:サンプルチャンバーの組み立て 。 (A)不動態化カバーガラスと標準3インチの顕微鏡スライドを使用したサンプルフローチャンバーの組み立てを示す概略図。(B)微小管束の光学トラップおよび蛍光イメージングに最適化されたシングルチャネルおよびデュアルチャネルフローチャンバーのアセンブリおよび典型的な寸法。回路図の一部は 、65からの修正画像です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:光トラップおよびTIRFベースのイメージングのための表面固定化微小管束の生成。 光学的にトラップ可能な微小管束の段階的組み立てを示す概略図。(A)試薬はチャンバーの入口から流入し、流体は出口チャネルから吸い出されます。(B)ストレプトアビジン(青)は最初にカバーガラス上のビオチン-PEG部位に結合し、(C)カゼイン(赤)は追加のブロック剤として導入されます。(D)ビオチン化遠赤色標識微小管(マゼンタ)を導入し、~5分間インキュベートした後、(E)架橋タンパク質(緑色)、(F)非ビオチン化ローダミン標識微小管(赤色)、そして最後に、(G)バンドルへの付着および光学トラップベースの操作のために適切な反応バッファーに懸濁した厳密キネシン被覆ミクロスフェアを添加する。(H)チャンバーは、実験中のサンプルバッファーの蒸発を防ぐために透明なマニキュアで密閉されています。回路図の一部は 、65からの修正画像です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:光学ピンセット/TIRF顕微鏡システムの概略図。シングルビーム光トラップは、倒立顕微鏡内の対物レンズベースのTIRFイメージングシステムの光路に導入されます。対物レンズのすぐ下に挿入されたショートパスフィルターにより、トラップビームを対物レンズの背面開口部に向けることができ、そこでサンプルカバーガラスの表面のすぐ上に集束され、光学トラップを形成します。位置感知光検出器は透過光を収集し、ビーズの位置と力の検出を可能にします。TIRFイメージングを介して複数チャンネルの蛍光データを取得し、高感度EMCCDまたはsCMOSカメラに記録することができます。広域スペクトル光源は、実験のセットアップ中にトラップビーズを画像化するために使用されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:キネシン-5による力生成の測定の代表例。 (A)キネシン-5モータータンパク質によって架橋された微小管がフィラメントをスライドさせて引き離すときに力を発生させ、光トラップで測定される実験形状を示す模式図。表面固定化微小管、GFP-キネシン-5、ローダミン標識輸送微小管からなるバンドルの代表的な蛍光画像。(B)全長および(C)C末端テールトランケート型キネシン-5コンストラクトを採用した。スケールバー= 5μm。(D)全長と(E)テールレスの力生成のサンプル記録が示され、平均力が時間の関数としてプロットされています。(F)両方の構築物についての最大プラトー力および対応するオーバーラップ長のプロットが示され、全長キネシン構築物がテールレスキネシン構築物よりもかなり大きい重なり長依存力を生成することが明らかになる。この数字は61から変更されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:PRC1による摩擦力測定の代表例 。 (A)カバーガラスを等速に動かしてフィラメントを摺動させる際に抵抗を生じるGFP-PRC1(細胞質分裂のタンパク質調節因子)架橋タンパク質によって架橋された微小管を示す実験形状を示す模式図。(B)移動面固定化遠赤色微小管、収縮オーバーラップ内に凝縮するGFP-PRC1分子、ビーズで保持された遊離ローダミン微小管を示す代表的な時系列蛍光画像。フレーム間の時間間隔 = 6 秒;スケールバー= 5μm。 (C)オーバーラップが0μmに達すると破壊イベントとフォースがゼロ(~55秒)に低下する、スライディングイベント中の摩擦力を示すフォーストレースの例。 (D)4つの異なる滑り速度におけるオーバーラップ内の平均力と積分GFP強度の相関。(E)(D)の平均傾きと計算されたトレースのフィット誤差は、PRC1分子あたりの力が滑り速度の関数として直線的に増加することを示しています。この数字は66から変更されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

微小管ネットワークは、本質的に機械的である幅広いタスクを実行するために、無数の細胞タイプによって採用されています。細胞が健康な状態と病気の状態の両方でどのように機能するかを説明するためには、これらのミクロンスケールのネットワークが、それらを集合的に構築するナノメートルサイズのタンパク質によってどのように組織化および制御されているかを理解することが重要です。光ピンセットなどの生物物理学的ツールは、このスケールで重要なタンパク質のメカノケミストリーを調査するのに適しています。微小管ネットワーク機能の多様性を反映して、微小管先端ダイナミクスの力依存解析67,68、動原体成分による力の発生69,70,71、微小管フィラメント機構を調べるための2ビームダンベルトラップ形状など、光ピンセットを用いた複雑な実験形状が検討されています72,73.このプロトコルでは、バンドルなどの基本的な微小管ネットワークモチーフを再構成し、単一分子蛍光顕微鏡と光トラップの生物物理学的ツールを適用して細胞機能に関する重要な情報を評価するための新しい方法について説明しました。

このプロトコルのほとんどの個々のステップは技術的に単純ですが、まとめると、発生する可能性のある障害点が多数あり、測定を成功させるために各ポイントで十分な注意を払う必要があります。第一に、多くの顕微鏡ベースの単一分子実験アッセイと同様に、カバーガラス表面へのタンパク質またはビーズの非特異的結合は、ほとんどの場合、これらの実験の成功を妨げるため、適切な表面パッシベーションが重要です。第二に、目的の架橋タンパク質の発現と精製は、フィラメントの過剰な束ねの誘発やビーズや微小管の付着の妨害など、さまざまな方法でアッセイを妨害する可能性があるため、高品質の単一種製品を確保するために最適化する必要があります力データの解釈に複雑さをもたらすことは言うまでもありません。第三に、堅牢なビーズ-微小管結合を維持するには、複数のキネシン-フィラメント付着点を作成できるように、トラッピングビーズに高密度で結合された高品質の厳密なキネシンモーターが必要です。これらの結合は、数分間10秒のpNの力に耐えることができ、この技術を採用する幅広い潜在的な研究システムに適しています。

また、このプロトコルをエンドユーザーの機器や生物学的システムのニーズに最も合うように変更できる多くの方法があることにも注意してください。GFP標識架橋タンパク質と赤色/遠赤色標識微小管を用いた実験について述べましたが、必要に応じて蛍光標識を交換することも可能です。例えば、3色TIRF顕微鏡を実行するのに十分なレーザーラインがない場合、微小管の種類ごとに同じ蛍光色素で異なる濃度(薄暗いか明るいかなど)を使用して微小管を差動標識することで、高品質のデータを得ることができます。同様に、架橋タンパク質に蛍光標識を付加することが常に可能または有利であるとは限らない。この状況では、架橋剤の濃度や局在などの特定の実験情報にアクセスできませんが、微小管のオーバーラップ長などのパラメータの決定は引き続き可能です。このプロトコルは、微小管架橋タンパク質の多くの異なる種類および組み合わせに非常に適応可能であると予想しています。複数の架橋タンパク質を導入するには、適切な帯域幅でイメージング機能を解放するために、タンパク質の1つから蛍光タグを除去するか、2つの微小管タイプのいずれかから蛍光標識を除外する必要があります(たとえば、架橋タンパク質に赤色または遠赤色のタンパク質コード標識を使用します)。このTIRFベースのアッセイで3つ以上の蛍光チャネルを使用できる可能性は低いですが、それらの分布方法には確かに柔軟性があり、実験を計画する際には慎重に検討する必要があります。最後に、このアッセイは、異なるネットワーク形状および細胞骨格フィラメントのタイプを研究するために改変され得る可能性がある。augminとγ-チューブリン環複合体によって媒介される微小管分岐のメカニズムの解析は、容易に調査および画像化することができた。さらに、アクチン、セプチン、または中間フィラメントを含むものなどの他の架橋細胞骨格ネットワークは、カバーガラスおよびトラッピングビーズへの適切な変更および直交付着戦略が行われていると仮定して、これらのツールを使用して研究するのに非常に適しています。

結論として、1分子蛍光顕微鏡ツールを使用して画像化し、単一ビーム光トラップを介して操作できる、能動的力生成微小管ネットワークの再構成のためのプロトコルについて説明しました。我々は、有糸分裂運動タンパク質と非運動タンパク質の両方のアンサンブル機構を明らかにするデータセットを用いて、この方法の有用性を実証した。これらのツールにより、神経細胞、上皮組織、心筋細胞など、多くの種類の高度に組織化された微小管ネットワークを解析し、動的細胞骨格の生物物理学的機能の新たな原理を明らかにすることが期待されます。

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Disclosures

著者は開示するものは何もありません。

Acknowledgments

著者らは、R21 AG067436(JPおよびSFへ)、T32 AG057464(ETへ)、およびレンセラー工科大学科学学校スタートアップファンド(SFへ)からの支援に感謝したいと思います。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nm IPG Photonics YLR-10-1064-LP
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applications Chroma TRF89901v2
6x His Tag Antibody, Biotin Conjugate Invitrogen #MA1-21315-BTIN
Acetone, HPLC grade Fisher Scientific 18-608-395
Alpha casein from bovine milk Sigma 1002484390
ATP Fisher Scientific BP413-25
Benzonase Novagen 70746-3
Biotin-PEG-SVA-5000 Laysan Bio, Inc. NC0479433
BL21 (DE3) Rosetta Cells Millipore Sigma 71-400-3
Catalase MP Biomedicals LLC 190311
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objective Nikon N/A
Chloramphenicol ACROS Organics 227920250
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips Fisher Scientific C14784
Delicate Task Wipers Kimberly-Clark 34120
Dextrose Anhydrous Fisher Scientific BP3501
D-Sucrose Fisher Scientific BP220-1
DTT Fisher Scientific BP172-25
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 Bath LAUDA-Brinkmann 27709
EDTA Fisher Scientific BP118-500
EGTA Millipore Corporation 32462-25GM
FIJI / Image J https://fiji.sc/ N/A
Frosted Microscope Slides Corning 12-553-10 75mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm
Glucose Oxidase MP Biomedicals LLC 195196 Type VII, without added oxygen
GMPCPP Jena Biosciences JBS-NU-405S Can be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C
Gold Seal-Cover Glass Thermo Scientific 3405
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Imidazole Fisher Scientific 03196-500
IPTG Fisher Scientific BP1755-10
Laboratory dessicator Bel-Art 999320237 190mm plate size
Kanamycin Sulfate Fischer Scientific BP906-5
KIF5A K439 (aa:1-439)-6His Gilbert Lab, RPI N/A doi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
Kimwipe Kimberley Clark Z188956 lint-free tissue
Immersion Oil, Type B Cargille 16484
Lens Tissue ThorLabs MC-5
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm) Nikon N/A
Lysozyme MP Biomedicals LLC 100834
Magnesium Acetate Tetrahydrate Fisher Scientific BP215-500
Microfuge 18 Beckman Coulter 367160
MPEG-SVA MW-5000 Laysan Bio, Inc. NC0107576
Neutravadin Invitrogen PI31000
Nikon Ti-E inverted microscope Nikon N/A Nikon LuN4 Laser
Ni-NTA Resin Thermo Scientific 88221
Oligonucleotide - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA
GAACTTTCAAAGGC		 IDT N/A
Oligonucleotide - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA
ACTCAGAATAGGTG		 IDT N/A
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mm Beckman Coulter 343755
Optima-TLX Ultracentrifuge Beckman Coulter 361544
Paclitaxel (Taxol equivalent) Thermo Fisher Scientific P3456
PIPES ACROS Organics 172615000
PMSF Millipore 7110-5GM
Porcine Tubulin, biotin label Cytoskeleton, Inc. T333P
Porcine Tubulin, HiLyte 647 Fluor Cytoskeleton, Inc. TL670M far red labelled
Porcine Tubulin, Rhodamine Cytoskeleton, Inc. TL590M
Porcine Tubulin, Tubulin Protein Cytoskeleton, Inc. T240
Potassium Acetate Fisher Scientific BP364-500
Prime 95B sCMOS camera Photometric N/A
Quadrant Detector Sensor Head ThorLabs PDQ80A
Quikchange Lightning Kit Agilent Technologies 210518
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Square Cover Glasses Corning 12-553-450 18 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm
Streptavidin Microspheres Polysciences Inc. 24162-1
Superose-6 Column GE Healthcare 29-0915--96
TCEP Thermo Scientific 77720
TLA-100 Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter 343840
Ultrasonic Cleaner (Sonicator) Vevor JPS-08A(DD) 304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power
Vectabond APTES solution Vector Laboratories SP-1800-7
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-D S.C. Johnson SJN695237

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References

  1. Bentley, M., Banker, G. The cellular mechanisms that maintain neuronal polarity. Nature Reviews Neuroscience. 17 (10), 611-622 (2016).
  2. Yang, R., et al. A novel strategy to visualize vesicle-bound kinesins reveals the diversity of kinesin-mediated transport. Traffic. 20 (11), 851-866 (2019).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: Transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  4. Helmke, K. J., Heald, R., Wilbur, J. D. Interplay between spindle architecture and function. International Review of Cell and Molecular Biology. 306, (2013).
  5. Elting, M. W., Suresh, P., Dumont, S. The spindle: integrating architecture and mechanics across scales. Trends in Cell Biology. 28 (11), 896-910 (2018).
  6. Kapoor, T. Metaphase spindle assembly. Biology. 6 (1), 8 (2017).
  7. Svoboda, K., Block, S. M. Force and velocity measured for single kinesin molecules. Cell. 77 (5), 773-784 (1994).
  8. Svoboda, K., Schmidt, C. F., Schnapp, B. J., Block, S. M. Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry. Nature. 365 (6448), 721-727 (1993).
  9. Schnitzer, M. J., Visscher, K., Block, S. M. Force production by single kinesin motors. Nature Cell Biology. 2 (10), 718-723 (2000).
  10. Andreasson, J. O. L., Shastry, S., Hancock, W. O., Block, S. M. The mechanochemical cycle of mammalian kinesin-2 KIF3A/B under load. Current Biology. 25 (9), 1166-1175 (2015).
  11. Bensel, B. M. The mechanochemistry of the kinesin-2 kif3ac heterodimer is related to strain-dependent kinetic properties of kif3a and kif3c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15632-15641 (2020).
  12. Gilbert, S. P., Guzik-Lendrun, S., Rayment, I. Kinesin-2 motors: kinetics and biophysics. Journal of Biological Chemistry. 293 (12), 4510-4518 (2018).
  13. Okada, Y., Higuchi, H., Hirokawa, N. Processivity of the single-headed kinesin KIF1A through binding to tubulin. Nature. 424 (6948), 574-577 (2003).
  14. Budaitis, B. G., et al. Pathogenic mutations in the kinesin-3 motor KIF1A diminish force generation and movement through allosteric mechanisms. Journal of Cell Biology. 220 (4), 202004227 (2021).
  15. Tomishige, M., Klopfenstein, D. R., Vale, R. D. Conversion of Unc104/KIF1A kinesin into a processive motor after dimerization. Science. 297 (5590), 2263-2267 (2002).
  16. Siddiqui, N., et al. Force generation of KIF1C is impaired by pathogenic mutations. bioRxiv. , (2021).
  17. Valentine, M. T., Fordyce, P. M., Krzysiak, T. C., Gilbert, S. P., Block, S. M. Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro. Nature Cell Biology. 8 (5), 470-476 (2006).
  18. Valentine, M. T., Gilbert, S. P. To step or not to step? How biochemistry and mechanics influence processivity in Kinesin and Eg5. Current Opinion in Cell Biology. 19 (1), 75-81 (2007).
  19. Jannasch, A., Bormuth, V., Storch, M., Howard, J., Schäffer, E. Kinesin-8 is a low-force motor protein with a weakly bound slip state. Biophysical Journal. 104 (11), 2456-2464 (2013).
  20. Bormuth, V., Varga, V., Howard, J., Schäffer, E. Protein friction limits diffusive and directed movements of kinesin motors on microtubules. Science. 325 (5942), 870-873 (2009).
  21. Gennerich, A., Carter, A. P., Reck-Peterson, S. L., Vale, R. D. Force-induced bidirectional stepping of cytoplasmic dynein. Cell. 131 (5), 952-965 (2007).
  22. Mallik, R., Carter, B. C., Lex, S. A., King, S. J., Gross, S. P. Cytoplasmic dynein functions as a gear in response to load. Nature. 427 (6975), 649-652 (2004).
  23. Redwine, W. B., et al. The human cytoplasmic dynein interactome reveals novel activators of motility. eLife. 6, 28257 (2017).
  24. Belyy, V., Hendel, N. L., Chien, A., Yildiz, A. Cytoplasmic dynein transports cargos via load-sharing between the heads. Nature Communications. 5 (1), 5544 (2014).
  25. Belyy, V., et al. The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition. Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).
  26. Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
  27. Forth, S., Kapoor, T. M. The mechanics of microtubule networks in cell division. Journal of Cell Biology. 216 (6), 1525-1531 (2017).
  28. Dumont, S., Mitchison, T. J. Force and length in the mitotic spindle. Current Biology. 19 (17), 749-761 (2009).
  29. McIntosh, J. R., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I. Biophysics of mitosis. Quarterly Reviews of Biophysics. 45 (2), 147-207 (2012).
  30. McIntosh, J., Hays, T. A brief history of research on mitotic mechanisms. Biology. 5 (4), 55 (2016).
  31. Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. Mitotic functions of kinesin-5. Seminars in Cell and Developmental Biology. 21 (3), 255-259 (2010).
  32. Kapitein, L. C., et al. The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks. Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).
  33. Vukušić, K., Ponjavić, I., Buđa, R., Risteski, P., Tolić, I. M. Microtubule-sliding modules based on kinesins EG5 and PRC1-dependent KIF4A drive human spindle elongation. Developmental Cell. 56 (9), 1253-1267 (2021).
  34. Sturgill, E. G., Ohi, R. Kinesin-12 differentially affects spindle assembly depending on its microtubule substrate. Current Biology. 23 (14), 1280-1290 (2013).
  35. Drechsler, H., McHugh, T., Singleton, M. R., Carter, N. J., McAinsh, A. D. The Kinesin-12 Kif15 is a processive track-switching tetramer. eLife. 3, 01724 (2014).
  36. Tanenbaum, M. E., et al. Kif15 Cooperates with Eg5 to promote bipolar spindle assembly. Current Biology. 19 (20), 1703-1711 (2009).
  37. Mountain, V., et al. Cross-links microtubules in the mammalian mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 147 (2), 351-365 (1999).
  38. Norris, S. R., et al. Microtubule minus-end aster organization is driven by processive HSET-tubulin clusters. Nature Communications. 9 (1), 2659 (2018).
  39. Cai, S., Weaver, L. N., Ems-McClung, S. C., Walczak, C. E. Proper organization of microtubule minus ends is needed for midzone stability and cytokinesis. Current Biology. 20 (9), 880-885 (2010).
  40. Pamula, M. C., et al. High-resolution imaging reveals how the spindle midzone impacts chromosome movement. Journal of Cell Biology. 218 (8), 2529-2544 (2019).
  41. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  42. Zhu, C., Lau, E., Schwarzenbacher, R., Bossy-Wetzel, E., Jiang, W. Spatiotemporal control of spindle midzone formation by PRC1 in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6196-6201 (2006).
  43. Subramanian, R., et al. Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein. Cell. 142 (3), 433-443 (2010).
  44. Elting, M. W., Prakash, M., Udy, D. B., Dumont, S. Mapping load-bearing in the mammalian spindle reveals local kinetochore fiber anchorage that provides mechanical isolation and redundancy. Current Biology. 27 (14), 2112-2122 (2017).
  45. Fant, X., Merdes, A., Haren, L. Cell and molecular biology of spindle poles and NuMA. International Review of Cytology. 238, 1-57 (2004).
  46. Merdes, A., Heald, R., Samejima, K., Earnshaw, W. C., Cleveland, D. W. Formation of spindle poles by dynein/dynactin-dependent transport of NuMA). Journal of Cell Biology. 149 (4), 851-861 (2000).
  47. Maddox, P., Straight, A., Coughlin, P., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Direct observation of microtubule dynamics at kinetochores in Xenopus extract spindles: Implications for spindle mechanics. Journal of Cell Biology. 162 (3), 377-382 (2003).
  48. Maddox, P., Desai, A., Oegema, K., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Poleward microtubule flux is a major component of spindle dynamics and anaphase A in mitotic Drosophila embryos. Current Biology. 12 (19), 1670-1674 (2002).
  49. LaFountain, J. R., Cohan, C. S., Siegel, A. J., LaFountain, D. J. Direct visualization of microtubule flux during metaphase and anaphase in crane-fly spermatocytes. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5724-5732 (2004).
  50. Pavin, N., Tolić, I. M. Mechanobiology of the mitotic spindle. Developmental Cell. 56 (2), 192-201 (2021).
  51. Vukušić, K., Tolić, I. M. Anaphase B: Long-standing models meet new concepts. Seminars in Cell and Developmental Biology. 117, 127-139 (2021).
  52. Vukušić, K., et al. Microtubule sliding within the bridging fiber pushes kinetochore fibers apart to segregate chromosomes. Developmental Cell. 43 (1), 11-23 (2017).
  53. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  54. Gaska, I., Armstrong, M. E., Alfieri, A., Forth, S. The mitotic crosslinking protein PRC1 acts like a mechanical dashpot to resist microtubule sliding. Developmental Cell. 54 (3), 367-378 (2020).
  55. Woll, K. A., et al. An allosteric propofol-binding site in kinesin disrupts kinesin-mediated processive movement on microtubules. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11283-11295 (2018).
  56. Forth, S., Hsia, K. C., Shimamoto, Y., Kapoor, T. M. Asymmetric friction of nonmotor MAPs can lead to their directional motion in active microtubule networks. Cell. 157 (2), 420-432 (2014).
  57. Alfieri, A., Gaska, I., Forth, S. Two modes of PRC1-mediated mechanical resistance to kinesin-driven microtubule network disruption. Current Biology. 31 (12), 2495-2506 (2021).
  58. Koch, M. D., Shaevitz, J. W. Introduction to optical tweezers. Methods in Molecular Biology. 1486, 3-24 (2017).
  59. Sarshar, M., Wong, W. T., Anvari, B. Comparative study of methods to calibrate the stiffness of a single-beam gradient-force optical tweezers over various laser trapping powers. Journal of Biomedical Optics. 19 (11), 115001 (2014).
  60. Van Mameren, J., Wuite, G. J. L., Heller, I. Introduction to optical tweezers: Background, system designs, and commercial solutions. Methods in Molecular Biology. 783, 1-20 (2011).
  61. Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9, 51131 (2020).
  62. Reinemann, D. N., et al. Collective force regulation in anti-parallel microtubule gliding by dimeric Kif15 kinesin motors. Current Biology. 27 (18), 2810-2820 (2017).
  63. Reinemann, D. N., Norris, S. R., Ohi, R., Lang, M. J. Processive kinesin-14 HSET exhibits directional flexibility depending on motor traffic. Current Biology:CB. 28 (14), 2356-2362 (2018).
  64. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  65. SMART - Servier Medical ART. , Available from: https://smart.servier.com/ (2022).
  66. Gaska, I., Armstrong, M., Alfieri, A., Forth, S. The mitotic crosslinking protein PRC1 acts as a mechanical dashpot to resist microtubule sliding. Developmental Cell. 54 (3), 1-14 (2020).
  67. Janson, M. E., De Dood, M. E., Dogterom, M. Dynamic instability of microtubules is regulated by force. Journal of Cell Biology. 161 (6), 1029-1034 (2003).
  68. Kerssemakers, J. W. J., et al. Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution. Nature. 442 (7103), 709-712 (2006).
  69. Powers, A. F., et al. The Ndc80 kinetochore complex forms load-bearing attachments to dynamic microtubule tips via biased diffusion. Cell. 136 (5), 865-875 (2009).
  70. Akiyoshi, B., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
  71. Fong, K. K., et al. Direct measurement of the strength of microtubule attachment to yeast centrosomes. Molecular Biology of the Cell. 28 (14), 1853-1861 (2017).
  72. Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps. Biophysical Journal. 90 (5), 1687-1696 (2006).
  73. Memet, E., et al. Microtubules soften due to cross-sectional flattening. eLife. 7, 34695 (2018).

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生物学、183号、微小管、光トラップ、有糸分裂、単一分子、紡錘体、力学、キネシン、微小管関連タンパク質、蛍光マイクロソピー
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Palumbo, J., Tai, E., Forth, S. Directly Measuring Forces Within Reconstituted Active Microtubule Bundles. J. Vis. Exp. (183), e63819, doi:10.3791/63819 (2022).

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