Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Direkt mätning av krafter i rekonstituerade aktiva mikrotubulibuntar

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63819
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biological Sciences and Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies, Rensselaer Polytechnic Institute
* These authors contributed equally

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för rekonstituering av mikrotubulibuntar in vitro och direkt kvantifiera de krafter som utövas inom dem med hjälp av samtidig optisk fångst och total intern reflektionsfluorescensmikroskopi. Denna analys möjliggör mätning på nanonivå av de krafter och förskjutningar som genereras av proteinensembler inom aktiva mikrotubulinätverk.

Abstract

Mikrotubuli nätverk används i celler för att utföra ett brett spektrum av uppgifter, allt från att fungera som spår för vesikeltransport till att arbeta som specialiserade arrays under mitos för att reglera kromosomsegregering. Proteiner som interagerar med mikrotubuli inkluderar motorer som kinesiner och dynein, som kan generera aktiva krafter och riktningsrörelse, liksom icke-motoriska proteiner som tvärbinder filament till högre ordningsnätverk eller reglerar filamentdynamik. Hittills har biofysiska studier av mikrotubuliassocierade proteiner överväldigande fokuserat på rollen som enmotoriga proteiner som behövs för vesikeltransport, och betydande framsteg har gjorts för att belysa de kraftgenererande egenskaperna och mekanokemisk reglering av kinesiner och dyneiner. För processer där mikrotubuli fungerar både som last och spår, såsom under filamentglidning i den mitotiska spindeln, förstås mycket mindre om den biofysiska regleringen av ensembler av de tvärbindande proteinerna som är inblandade. Här beskriver vi vår metodik för direkt sonderande kraftgenerering och respons inom tvärbundna mikrotubuli minimala nätverk rekonstituerade från renade mikrotubuli och mitotiska proteiner. Mikrotubulipar är tvärbundna av proteiner av intresse, en mikrotubuli immobiliseras till ett mikroskopskydd och den andra mikrotubulen manipuleras av en optisk fälla. Samtidig total intern reflektionsfluorescensmikroskopi möjliggör flerkanalig visualisering av alla komponenter i detta mikrotubulinätverk när filamenten glider isär för att generera kraft. Vi demonstrerar också hur dessa tekniker kan användas för att undersöka tryckkrafter som utövas av kinesin-5-ensembler och hur viskösa bromskrafter uppstår mellan glidande mikrotubulipar tvärbundna av den mitotiska MAP PRC1. Dessa analyser ger insikter i mekanismerna för spindelmontering och funktion och kan anpassas bredare för att studera tät mikrotubulinätverksmekanik i olika sammanhang, såsom axon och dendriter av neuroner och polära epitelceller.

Introduction

Celler använder mikrotubulinätverk för att utföra en mängd olika mekaniska uppgifter, allt från vesikeltransport 1,2,3 till kromosomsegregering under mitos 4,5,6. Många av de proteiner som interagerar med mikrotubuli, såsom de molekylära motorproteinerna kinesin och dynein, genererar krafter och regleras av mekaniska belastningar. För att bättre förstå hur dessa kritiska molekyler fungerar har forskare använt enmolekylära biofysiska metoder, såsom optisk fångst och TIRF-mikroskopi, för att direkt övervaka kritiska parametrar som lossade steghastigheter, processivitet och krafthastighetsrelationer för enskilda proteiner. Den vanligaste experimentella geometrin har varit att fästa motorproteiner direkt på fångpärlor vars sfäriska geometri och storlek efterliknar vesiklar som genomgår motordriven transport. Många kinesiner, inklusive kinesin-1 7,8,9, kinesin-2 10,11,12, kinesin-3 13,14,15,16 kinesin-517,18, kinesin-8 19,20, samt dynein- och dyneinkomplex21,22, 23,24,25, har studerats med dessa metoder.

I många cellulära processer använder dock motoriska och icke-motoriska proteiner mikrotubuli både som spår och last26,27. Dessutom, i dessa scenarier där mikrotubulifilament är tvärbundna till högre ordningens buntar, fungerar dessa proteiner som ensembler snarare än enskilda enheter. Till exempel, inom delande somatiska celler, organiserar täta filamentnätverk sig själv för att bygga den mitotiska spindelapparaten28,29,30. Det interpolära spindelmikrotubulinätverket är mycket dynamiskt och är till stor del anordnat med minusändar som pekar mot spindelpolerna och plusändarna som överlappar varandra nära spindelekvatorn. Filament i spindeln är tvärbundna av motorproteiner såsom kinesin-5 31,32,33, kinesin-12 34,35,36 och kinesin-1437,38,39, eller av icke-motoriska proteiner såsom PRC1 40,41,42,43 eller NuMA 44,45, 46. De rör sig ofta eller upplever mekanisk stress under processer som polewardflöde eller när de samordnar kromosomcentrering under metafas- eller kromosomsegregering under anafas 47,48,49,50,51,52. Integriteten hos spindelapparaten i mikronskala genom mitos är därför beroende av en noggrant reglerad balans mellan tryck- och dragkrafter som genereras och upprätthålls av detta nätverk av interagerande filament. Men de verktyg som behövs för att undersöka denna mekaniska reglering och förklara hur proteinensembler arbetar tillsammans för att samordna mikrotubulirörelser och producera de krafter som behövs för att korrekt montera spindeln har först nyligen utvecklats, och vi har precis börjat förstå de biofysiska reglerna som definierar dynamiska mikrotubulinätverk.

Målet med detta manuskript är att demonstrera de steg som krävs för att rekonstituera tvärbundna mikrotubulipar in vitro, immobilisera dessa buntar i en mikroskopikammare som möjliggör samtidig fluorescensvisualisering av både mikrotubuli och tvärbindande proteiner och nanoskala kraftmätning och bearbeta dessa data robust. Vi beskriver de steg som behövs för att stabilt polymerisera fluorescensmärkta mikrotubuli, förbereda mikroskopskydd för fastsättning, förbereda polystyrenpärlor för optiska fångstexperiment och montera tvärbundna filamentnätverk som bevarar deras in vivo-funktionalitet samtidigt som de möjliggör direkt biofysisk manipulation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Beredning av mikrotubuli

OBS: Vid användning av GFP-märkta tvärbindningsproteiner fungerar röd (t.ex. rhodamin) och långröd (t.ex. biotinylerad HiLyte647, kallad biotinylerad långt röd i resten av texten) organisk fluoroformärkning av mikrotubuli bra. Minimal överhörning mellan alla tre kanalerna kan uppnås under avbildning med hjälp av ett högkvalitativt TIRF-filter (Total Internal Reflection Fluorescence).

  1. Förbered GMPCPP mikrotubulifrölager
    1. Suspendera 1 mg omärkt frystorkat tubulin i 84 μL iskall 1x BRB80 (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA; pH 6,8), med DTT tillsatt till en slutlig koncentration av 1 mM strax före användning. Suspendera 60 μg fluoroformärkt frystorkad tubulin i 6 μl kallt 1x BRB80 med 1 mM DTT. Suspendera 60 μg biotinmärkt frystorkat tubulin i 6 μl kallt 1x BRB80 med 1 mM DTT.
    2. För att förbereda icke-biotinylerat rhodaminmärkt tubulinfröbestånd med ett märkningsförhållande på 1:10, tillsätt 84 μL omärkt tubulin, 6 μL fluoroformärkt tubulin och 10 μL 10 mM GMPCPP-stamlösning till ett 0,5 ml rör. Blanda väl genom att försiktigt pipettera och håll på is.
      OBS: GMPCPP-polymerisation föredras för dessa analyser eftersom mikrotubuli är mer stabila och mottagliga för direkt manipulation med den optiska fällan än om de polymeriseras med GTP eller om taxol utelämnas.
    3. För att förbereda biotinylerat långt rödmärkt tubulinfröbestånd med ett fluorescerande märkningsförhållande på 1:10, tillsätt 80 μL omärkt tubulin, 6 μL fluoroformärkt tubulin, 4 μL biotinmärkt tubulin och 10 μL 10 mM GMPCPP-stamlösning i ett 0,5 ml rör. Blanda väl genom att försiktigt pipettera och håll på is. Inkubera fröbeståndet på is i 5 min.
    4. Överför tubulinlösningen till ett polykarbonatrör som är lämpligt för höghastighetscentrifugering. Centrifugera frölagret vid ~350 000 x g i 5 minuter vid 2 °C för att förhindra mikrotubulipolymerisation och återvinna supernatanten för alikvotering. Den slutliga uppskattade koncentrationen av tubulin i detta skede är ~ 50 μM.
    5. Bered 2 μL alikvoter av fröbeståndet med 0,2 ml PCR-rör och blixtfrys med flytande kväve. Alikvoter kan förvaras vid -80 °C i upp till 6 månader.
  2. Polymerisation av mikrotubuli
    1. Förbered 500 μL 1x BRB80 och lägg på is. Lägg en var och en av de biotinylerade långt röda och icke-biotinylerade rhodaminfröbeståndens alikvoter på is för att tina.
    2. Inkubera frölagren på is i 5 minuter. Vid slutet av inkubationsperioden tillsätt omedelbart 26 μL 1x BRB80 till varje rör. Om längre mikrotubuli önskas, öka volymen av BRB80 med 5-10 μL, medan för kortare mikrotubuli reducerar volymen för polymerisation med 5 μL.
    3. Inkubera mikrotubulifrölagren i 1 timme vid 37 °C i ett vattenbad. Kombinera 298,5 μL rumstemperatur 1x BRB80 och 1,5 μL 4 mM taxol stamlösning för att producera en 20 μM taxollösning. Förbered 300 μL 1x BRB80 och håll båda rören vid rumstemperatur.
    4. Värm en lämplig höghastighetsrotor till 30 °C. Detta kan göras i en bordsskiva ultracentrifug inställd på 30 °C. Ta bort mikrotubulien från vattenbadet och håll vid rumstemperatur på en bänkskiva i 10-15 min.
  3. Förtydligande av mikrotubuli
    1. Tillsätt 100 μL rumstemperatur 1x BRB80 till mikrotubulitillväxtlösningen och blanda genom att snärta röret ~ 10 gånger eller försiktigt pipettera. Överför mikrotubulitillväxtlösningen till ett polykarbonatcentrifugrör.
    2. Markera ena sidan av polykarbonatröret, som kommer att vända utåt i förhållande till centrifugens rotation. Detta kommer att hjälpa till att lokalisera mikrotubulipelleten, som knappt kommer att synas på grund av den lilla volymen av material.
    3. Centrifugera mikrotubulilösningen vid ~350 000 x g i 10 minuter vid 30 °C. Efter centrifugering, inspektera röret som innehåller mikrotubuli för en pellets om möjligt. Ta bort alla utom de sista mikroliter vätska försiktigt utan att störa pelleten. Om pelleten inte är tydligt synlig, använd markeringen som gjorts som en guide för att undvika att störa området där pelleten är belägen.
    4. Tillsätt omedelbart 100 μL 1x BRB80 + 20 μM taxol till mikrotubuliröret. Detta kan läggas direkt på pelleten; Störning av pelleten i detta skede påverkar inte signifikant förtydligandeprocessen.
    5. Centrifugera mikrotubulierna igen vid ~ 350 000 x g i 10 minuter, var noga med att säkerställa att den markerade delen av röret återigen orienteras utåt i förhållande till centrifugens rotation.
    6. Ta bort alla utom några mikroliter lösning som tidigare, var försiktig så att du inte stör mikrotubulipelleten. Upprepa steg 1.3.4-1.3.5. och sedan återsuspendera mikrotubulipelleten i 20-50 μL av 1x BRB80 + 20 μM taxol.
    7. Återsuspendera genom att pipettera upp det mesta av resuspensionsvolymen och försiktigt mata ut den direkt på pelleten, upprepa 20-30x eller tills pelleten är helt återupplivad. Detta bör göras med försiktighet för att inte skjuva mikrotubuli genom alltför kraftig pipettering. Att skära pipettspetsen för att öka öppningens storlek kan också vara till hjälp för att minska mikrotubuliklippning.
    8. Förvara mikrotubulierna vid rumstemperatur genom att linda in röret i folie för att skydda fluoroforerna från ljus och hålla på bänkskivan. Mikrotubuli är i allmänhet användbara i 2-3 dagar efter förtydligande.
  4. Bedömning av mikrotubuli genom mikroskopi
    1. Bered en 1:10 utspädning av den klarade mikrotubulilösningen genom att blanda 1 μl mikrotubuli och 9 μl rumstemperatur 1x BRB80. Avbilda omedelbart denna lösning genom att pipettera 10 μL på ett mikroskopglas och sedan placera en täckglid över droppen för att bilda en squash.
    2. Se till att mikrotubuli som sträcker sig i längder från 8-25 μm vid hög densitet (flera hundra per fullt synfält skiktat i ett tätt nätverk) är synliga när de visualiseras med fluorescensmikroskopi och ett 100x mål fokuserat på täckytan i kontakt med mikrotubuliutspädningen.

2. Beredning av passiverade täckglas

  1. Tvätta täckglas
    1. Placera 18 mm x 18 mm täckglas i icke-reaktiva plastställ och placera sedan varje rack i en 100 ml bägare. Placera en coverslip per slits i ställen, eftersom rengöring av båda sidor av täckglasen är nödvändig.
    2. Sonicate med hjälp av en bad sonicator för 5 min, med 50 ml av följande lösningar i den ordning som anges för varje ultraljudsbehandling cykel: (1) avjoniserat vatten (med 18.3 MΩ-cm resistivitet), (2) 2% Micro-90 lösning, (3) avjoniserat vatten, (4) nyberedd 0.1 M KOH, (5) avjoniserat vatten (Figur 1A). Se till att täckglasen är helt täckta av vätska. Mellan ultraljudsbehandling cykler, skölj varje rack av coverslips i avjoniserat vatten genom att använda pincett för att doppa stället upp och ner 10-20x i avjoniserat vatten, byt ut vattnet och upprepa sköljprocessen 2x.
    3. Skölj täckglasen 3x i vatten, fyll sedan på bägarna med 100% etanol och sätt tillbaka racken till bägarna. Flytta bägarna i en dragskåp och lägg ut tillräckligt med vävnadsservetter för att göra plats för alla täckglasställ. Ta sedan bort ställen med pincett och placera på vävnadsservetterna.
    4. Använd en torr kvävgasström och blås av etanolen från täckglasen och deras rack tills de är torra. Kassera den återstående etanolen från bägarna och torka dem på liknande sätt med den torra kvävgasströmmen (figur 1A).
  2. Aminosilan ytfunktionalisering på täckglas
    1. Bered (3-aminopropyl)tietoxisilan (APTES) reagenslösning genom att tillsätta 40 ml aceton och 400 μl APTES-reagens till ett 50 ml koniskt rör, täck tätt och blanda genom att invertera 10x.
    2. Flytta ett rack med täckglas till motsvarande torra bägare och sänk sedan ner helt i APTES-lösningen. Inkubera i 5 minuter (figur 1A). Flytta det APTES-behandlade stället till en ny torrbägare och flytta ett nytt rack till APTES för att inkubera i 5 m.
    3. Skölj det behandlade stället med avjoniserat vatten genom att doppa racket 10-20x enligt beskrivningen i steg 2.1.2., byt ut vattnet 5x. Upprepa tills alla täckglas har behandlats och tvättats.
  3. PEGylering av aminosilanyta
    1. Förbered två PEG-lösningar, en på ~ 100 μL med 25% w / v PEG och en annan på ~ 10 μL med 10% w / v biotin-PEG, båda upphängda i nyberedd 0,1 M NaHCO3, tillräckligt för att belägga 24 täckglas. Centrifugera 25% PEG-lösningen vid 3 000 x g i 20 s när 0,1 M NaHCO3 har tillsatts för att helt lösa upp PEG-pinnen. Lösningen kan förbli grumlig. Blanda biotin-PEG genom försiktig pipettering (figur 1B).
    2. Bered en blandning av PEG- och biotin-PEG-lösningarna med 33,3 gånger volymen PEG till 1 volym biotin-PEG (t.ex. 100 μl PEG-lösning och 3 μl biotin-PEG-lösning).
    3. Lägg ut flera sterila och luddfria våtservetter i en draghuv. Flytta täckduksställen på våtservetterna och föna med en torr kvävgasström som tidigare. På flera nya och torra våtservetter, lägg ut de nu helt torkade täckglasen ordnade i par och märk var och en i det nedre högra hörnet med en asymmetrisk symbol som "b". Denna märkning kommer att vara mittemot täckbladets provyta och kommer inte att störa experimentet (figur 1B).
    4. Vänd en täckskiva i varje par med pincett. Placera 6 μl PEG/biotin-PEG-blandningen på varje vänd täckskiva och placera den andra täckglaset ovanpå så att båda "b"-etiketterna vetter utåt.
    5. Rikta in täckglasets kanter och placera i en fuktad och lufttät kammare för att förhindra torkning. Inkubera täckglasen i fuktkammaren vid rumstemperatur i 3 h.
    6. Efter inkubation, ta bort täckglasen från fuktighetskammaren, separera försiktigt täckglasparen och placera dem tillbaka i sina ställen. Tvätta varje rack i avjoniserat vatten som tidigare, doppa racken med pincett 10-20x och byt ut vattnet totalt 5x.
    7. Placera alla PEGylerade sidor av täckglasen mot samma riktning så att inga två PEGylerade täckglasytor vetter mot varandra. Den PEGylerade ytan kommer att vara mycket klibbig tills den torkar helt, så var extra försiktig så att du förhindrar att täckglasen vidrörs. Torka varje ställ och täckglas som tidigare med en torr kvävgasström (figur 1B).
    8. När täckglasen och deras rack är helt torkade, förvara i vakuum för att förhindra nedbrytning av ytbeläggningen. Förvaras korrekt under vakuum och med torkmedel för att förhindra att fukt stör PEG-beläggningen; Coverslips kan användas i cirka 1 vecka.

3. Beredning av kinesinbelagda pärlor

  1. Urval och beredning av rigor kinesinkonstruktion
    1. Expressa och rena rigorkinesinkonstruktioner enligt publicerade protokoll53,54. Frys 5 μL alikvoter av 0,02 mg / ml kinesinlösningar och förvara vid -80 ° C i upp till 1 år.
      OBS: Rigorkinesinproteiner har en G234A-punktmutation som förhindrar ATP-hydrolys. När de konjugeras till mikrober tillåter interaktioner med hög affinitet med mikrotubuli pärlor att upprätthålla belastningar på 10-20 pN i flera minuter. Rigormuterade versioner av både den vanliga kinesin-1 homodimeren K56053 och en ytterligare optimerad K439-konstruktion 55 har också använts med framgång i dessa analyser54. Denna förbättrade K439-konstruktion innehåller en EB1-dimeriseringsdomän för att förbättra stabiliteten och en C-terminal 6-His-tagg för specifik bindning till en 6-Hans antikropp, som beskrivs nedan.
  2. Bindande 6-Hans antikropp mot streptavidinbelagda pärlor
    1. Tillsätt 50 μL streptavidinbelagda polystyrenpärlor med en diameter på 1 μm i ett centrifugrör på 0,5 ml. Sonicate för 30 s.
    2. Tillsätt 10 μl 200 mM DTT till 790 μL 1x BRB80. Tillsätt 10 μL sonikerade pärlor till 40 μL av denna 1x BRB80 + 2,5 mM DTT-buffert.
    3. Kombinera 1 μL biotinylerad 6-Hans antikropp och 49 μL 1x BRB80 + 2,5 mM DTT; virvel kort att blanda.
    4. Kombinera 50 μl utspädd pärlblandning och 50 μl antikroppsutspädning i ett nytt rör. Placera röret i en rörrotator vid 4 °C och rotera i 1 timme. Snurra ner pärlblandningen i 10 minuter vid 3 000 x g vid 4 °C.
    5. Pipettera av supernatanten och återsuspendera pelleten i 100 μl 2 mg/ml kaseinlösning i 1x BRB80. Upprepa denna centrifugering och resuspension 2x.
  3. Tillsats av rigorkinesin
    1. Återsuspendera slutpelleten i 100 μl 2 mg/ml kaseinlösning. I ett 0,5 ml centrifugrör, kombinera 5 μL 0,02 mg / ml rigorkinesin och 5 μL pärlor, blanda försiktigt genom att lätt snärta röret ~ 10x.
    2. Håll både K439 G234A pärlupphängning och de återstående 6-His pärlorna på rotorn vid 4 °C när de inte används. Pärlor måste beredas färska och användas samma dag för experimenten eftersom de tenderar att klumpa sig och förlora aktivitet efter denna tid.

4. Montering av mikroskopikammaren

  1. Förberedelse av glasskivor och kammarkonstruktion
    1. Skölj 75 mm x 25 mm mikroskopglasskivor först med ultrarent vatten, följt av ammoniak-d-glasrengörare utan ränder och sedan en gång till med ultrarent vatten. Skaka för att ta bort överflödiga vattendroppar. Torka rutschkanorna med en kväveström så att inga streck finns kvar och lägg ner rutschkanorna på en pappershandduk (figur 2A).
    2. Med sax, skär dubbelsidig tejp i remsor på ~ 2-3 mm x 2,5 cm (2 remsor per enkelkammare och 3 per dubbelkammare).
    3. Använd pincett och lägg två tejpremsor på en glasskiva så att det finns ~ 0,5 cm utrymme mellan dem för att konstruera en enda kammare. För dubbla kamrar, använd samma avstånd, men med tre tejpremsor (figur 2B). Volymen av provkanalen med användning av denna metod är ungefär 10 μL.
      OBS: Ju bredare kammare (er), desto mer sannolikt är det att bubblor kommer att bildas när lösningar flödas in; Kammare som är mindre än 0,5 cm breda kan dock vara utmanande att använda på grund av det minskade området för avbildning.
    4. Skrapa över längden på varje tejpremsa med pincett så att tejpen är ordentligt fäst vid glasskivan.
    5. Släpp trycket från exsickatorn och använd pincett för att ta bort en biotinylerad täckglas från ett förvaringsställ. Placera en biotinylerad täckskiva ovanpå glasskivan med pincett. Se till att den biotinylerade sidan är vänd inåt, mot glasskivan.
    6. Använd den plana baksidan av pincetten och tryck försiktigt på glaset där täckglaset vidrör tejpen för att täta kamrarna ordentligt. Lätt tryck måste användas för att säkerställa att täckglaset inte spricker (figur 2C).
    7. Förvara de färdiga mikroskopikamrarna i en lufttät behållare, borta från direkt ljus, tills de används (figur 2D).
      OBS: Det rekommenderas att använda kamrar samma dag som de tillverkas, eftersom de biotinylerade täckglasen bryts ned när de utsätts för luft.
  2. Inflöde av mikroskopireagenser
    1. Konstruera en fuktighetskammare genom att placera en uppvikt luddfri vävnad fuktad med ultrarent vatten i botten av en tom pipettspetslåda. Provkamrarna bör förvaras i denna låda mellan inflödesstegen för att minska avdunstningen av lösningar från kanalen.
    2. Introducera alla reagenser genom att pipettera vätskan i ena änden av kanalen och transportera vätska ut i motsatt ände. För att wick, vrid ena änden av vävnaden och placera den försiktigt på kammarens utgångssida, så att kapillärverkan kan fördela reagenset homogent (figur 3A). Ta alla reagenser till rumstemperatur strax innan de flyter in för att förhindra mikrotubulidepolymerisation.
    3. Använd en 20 μL vinklad pipettspets så att den vidrör ingångssidan av en kammare, långsamt flöde i 10 μl 0,5 mg / ml streptavidin eller Neutravidin. Använd mindre pipettspetsar och ett långsamt, konstant inflöde av reagens för att minska sannolikheten för att få bubblor i kammaren (figur 3B).
    4. Inkubera bilden i fuktkammaren i 4 minuter med täckglasets sida nedåt. Denna orientering gör det möjligt för större föremål, såsom mikrotubuli eller pärlor, att sjunka nära den PEGylerade ytan.
    5. Spola ut kammaren med 20 μL 1x BRB80, med hjälp av en luddfri vävnad för att dra ut vätskor. Om det finns en läcka i kammaren, kassera bilden och börja med en annan; Små bubblor som uppstår i kammaren kommer inte att påverka avbildningen negativt.
    6. Upprepa inflödes-, inkubations- och spolningsstegen med 10 μl 0,5 mg/ml kaseinblockerande lösning (figur 3C). Späd biotinylerade fjärrröda mikrotubuli ~ 1:20 och flöde 10 μL in i kammaren. Inkubera i 5 minuter och spola kammaren med 20 μL 1x BRB80 (figur 3D). Den optimala densiteten hos dessa mikrotubuli inom ett 100 μm x 100 μm bildfält bör vara 10-20; Och utspädningen i detta skede bör justeras för att uppnå detta ytbindningsförhållande.
    7. Upprepa inflödes-, inkubations- och spolstegen med 10 μL av en lämplig koncentration (vanligtvis 1-10 nM) tvärbindande motoriskt eller icke-motoriskt protein som ska studeras (figur 3E).
    8. Flöde i 10 μl rhodaminmikrotubuli utspädd till en liknande koncentration som de tidigare biotinylerade fjärrröda mikrotubuli. Upprepa inkubations- och spolstegen (figur 3F).
    9. Kombinera 1 μL rigor kinesinbelagda pärlor och 19 μL reaktionsbuffert optimerad för tvärbindande proteinaktivitet. För analys av kinesin-5-aktivitet, använd till exempel reaktionsbuffert med 1 mM TCEP-bindningsbrytare, 0,2 mg / ml alfakasein, 70 mM KCl, syrerensningssystem (4,5 mg / ml glukos, 350 enheter / ml glukosoxidas, 34 enheter / ml katalas), 1 mM DTT och ATP vid önskad koncentration (t.ex. 1 mM för maximala kinesinhastighetsförhållanden) i 1x BRB80 (figur 3G ). För analys av icke-motoriska proteiner, utelämna ATP och variera koncentrationen av KCl för att modulera protein-mikrotubuliinteraktionsstyrka i dessa analyser.
    10. Försegla kammarens båda kanter med klart nagellack och vänta tills lacket torkar före avbildning (figur 3H). En framgångsrikt konstruerad kammare kommer inte att ha något läckage närvarande och minimala bubblor.

5. Imaging mikrotubuli buntar med 3-färg TIRF

  1. Använd ett inverterat mikroskopinstrument som har TIRF-avbildningsfunktioner och i vilket en optisk fälla med en stråle har konstruerats (figur 4).
    OBS: För de studier som beskrivs här användes ett inverterat mikroskop med en 100x / NA1.49 oljeobjektivlins, TIRF-modul och tre lasrar vid 488 nm, 561 nm och 640 nm för GFP-taggat protein, rhodaminmärkta mikrotubuli respektive biotinylerade långt rödmärkta mikrotubuli.
    1. Tillsätt en droppe nedsänkningsolja på täckglaset i provkammaren. Överdriven olja kan skada mikroskopmålet. Med täcksidan av provkammaren nedåt, placera provet som ska avbildas på mikroskopplattformen.
    2. Ta långsamt upp målet så att det blir kontakt mellan både täckglaset och målet genom oljan. Justera målhöjden så att provkammarens täckbladsyta är i fokus.
    3. Spela in bilder med en bildruta av exemplet i alla tre kanalerna. För experimenten här, använd 100-200 ms exponering som en optimal bildlängd över alla tre kanalerna; Längre exponeringstider kan leda till ökad fotoblekning.
    4. Justera lasereffekten för att uppnå ett bra signal-brusförhållande från proverna samtidigt som fotoblekningen minimeras under 2-5 minuter när den enskilda bunten analyseras. För lasern som används här (figur 4 och figur 5), använd en lasereffekt på 5 mW för GFP-kanalen och 3 mW för båda mikrotubulikanalerna som optimal.
      OBS: Framgångsrikt monterade buntar bör bestå av en yta-immobiliserad mikrotubu i den fjärrröda kanalen, en samextensiv region med flera mikron med signifikant GFP-proteinsignal och en rhodaminmikrotubuli som överlappar dessa regioner och sedan sträcker sig flera mikron bort från bunten (figur 5B, C och figur 6 ). Levande avbildning av rhodaminmikrotubuli bör avslöja subtila fluktuationer vid den icke-tvärbundna mikrotubuliänden, vilket indikerar att detta filament inte är fäst vid ytan eller andra proteiner i kammaren.
    5. Observera frekvensen av mikrotubulibuntar per synfält. För ett framgångsrikt berett prov bör det finnas cirka 3-4 mikrotubulibuntar närvarande per 100 μL x 100 μL synfält per kammare.

6. Utföra optiska fällexperiment på mikrotubulibuntar

  1. Förexperimentell kalibrering av förhållanden
    1. För att utföra dessa experiment, använd en optisk fälla med en stråle med en styvhet på 0,05-0,1 pN / nm. Inkorporera fångstoptiken och positionskänslig fotodetektor i ett TIRF-kompatibelt inverterat mikroskop genom att införa kortpassfilter strax under målet respektive ovanför kondensorn (figur 4).
    2. Lägg dessutom till ett nanopositioneringssteg där provet sitter så att användaren kan flytta mikrotubulierna med nanometerskalaprecision på ett kontrollerat sätt under dessa analyser. Systemet som används här för att få representativa data har beskrivits i publicerat arbete 27,53,54,56,57.
      OBS: Även om det ligger utanför ramen för detta protokoll finns flera resurser tillgängliga som beskriver konstruktionen och kalibreringen av en optisk fälla med en stråle58,59,60.
    3. Observera tätheten av pärlor i provet med hjälp av ett ljusfält eller DIC-kanal och 100x-målet på mikroskopet. Använd endast ljusfältsmikroskopi för att identifiera och manipulera pärlor och inte för att samtidigt spela in med fluorescensbildförvärv. Placera pärlorna så att de i genomsnitt är minst 10 μm från varandra och se till att de är fria från någon form av ytisolering eller fastsättning och inte är fästa vid varandra eller på annat sätt gruppering.
    4. Se till att de biotinylerade fjärrröda mikrotubulierna är ordentligt fästa vid ytan av täckglaset, utan synlig brunisk rörelse, såsom rörelser längs mikrotubuliaxeln eller fria ändar av mikrotubuli som fluktuerar i lösning.
    5. Se till att rhodaminmikrotubuli är fästa vid biotinylerade mikrotubuli via tvärbindnings-MAP och fluktuerar synligt i sina fria ändar. Ytfästning av icke-biotinylerade mikrotubuli indikerar ofta att PEGylation kan ha misslyckats eller att PEG-beläggningen har brutits ned.
  2. Motordrivna mikrotubuliglidande mätningar
    1. Uttrycka och rena motorproteinet av intresse enligt publicerade protokoll. Till exempel har GFP-märkta kinesin-5-proteiner i full längd framgångsrikt renats och använts i dessa analyser 53,61, liksom omärkta kinesin-1262 och kinesin-1463. Montera och visualisera motorprotein-tvärbundna buntar enligt beskrivningen ovan i steg 4 och 5.
    2. Fånga med den optiska fällan en fri enda pärla i lösning som uppvisar brunisk rörelse. Justera svällningsoptiken efter behov för att flytta pärlan till mitten av synfältet. Se till att det reflekterade interferensmönstret från svällningsstrålen är symmetriskt och justera svällningsoptiken för att lösa eventuella strålasymmetrier.
    3. Flytta provsteget så att den fria änden av en rhodaminmikrotubuli i en bunt ligger direkt under pärlan och pärlan är flera mikron bort från överlappningsområdet som innehåller tvärbindande proteiner för att minimera fällstråleinducerad fotoblekning. Sänk pärlan i Z-axeln tills den kolliderar med mikrotubuli. Var noga med att sänka pärlan försiktigt och tryck inte pärlan mot täckglasytan, eftersom det kan orsaka att du fastnar på täckglasytan.
    4. Stäng kort av fällan för att observera med ljusfältkanalen rörligheten hos pärlan som är fäst vid den glidande mikrotubulien. När du utför motorproteinanalyser kommer den bifogade pärlan att röra sig i riktning när mikrotubuli glider isär. Återaktivera fällan och fånga pärlan igen.
    5. Börja spela in fluorescensdata i de tre (488 nm, 561 nm, 640 nm) kanalerna med en hastighet av 1-2 bilder per s med hjälp av lasereffekten och exponeringstiderna som optimerades i steg 5 ovan.
    6. Använd programvaran för svällningsdatorn för att registrera spänningsdata från den positionskänsliga fotodetektorn (X-, Y- och SUM-intensitetssignaler), nanopositioneringssteget (X-, Y- och Z-koordinater) och TIRF-kamerans slutartillstånd. Börja digitalisera dessa svällspänningsvärden med hjälp av ett dedikerat datainsamlingskort för spänningsinmatning som styrs av lämplig programvara (t.ex. specialskriven LabView-kod) med en hastighet av 1-10 kHz, beroende på de experimentella kraven.
    7. Övervaka kraftsignalen när data samlas in och var noga med eventuella avvikelser som kan störa framgångsrik datainsamling.
      OBS: Anomalierna inkluderar men är inte begränsade till (1) andra pärlor som rör sig in i fällan, (2) pärlan som flyr fällan i förtid och (3) plötsliga kraftfall och efterföljande misslyckande med att återuppta kraft mot fällan, vilket indikerar problem med rigorkinesinmolekylerna på pärlans yta.
    8. Efter mätning, inaktivera fällan för att släppa pärlan och upprepa med en ny pärla och ny mikrotubuli tills det önskade antalet experimentella upprepningar uppnås.
  3. Passiva tvärbindningsmotståndsmätningar
    1. Uttrycka och rena de icke-motoriska tvärbindande proteinerna av intresse enligt publicerade protokoll. Till exempel har fullängds GFP-märkt PRC1 43,54,57 och en dimerisk NuMA-trunkerad konstruktion 56 framgångsrikt använts i dessa analyser. Sätt ihop och visualisera de tvärbundna buntarna enligt beskrivningen ovan i steg 4 och 5.
    2. Identifiera en lämplig mikrotubulibunt som endast innehåller två mikrotubuli, en biotinylerad med full ytbindning och en icke-biotinylerad mikrotubuli som är delvis fri i lösning; detta ger en fri ände för att fästa en pärla och garanterar att pärlan inte är fäst vid den ytbundna mikrotubulen och är inriktad på antingen X- eller Y-axeln, så att scenrörelsen bara kommer att vara längs en axel.
    3. Använd den optiska fällan för att fånga en fri pärla som genomgår brunisk rörelse. När pärlan har fångats, flytta försiktigt pärlan över till den valda mikrotubulibunten, så att inga andra pärlor dras in i fällan under processen. Se till att pärlan är flera mikron från överlappningsområdet som innehåller tvärbindande proteiner för att minimera fotoblekning av GFP-taggen.
    4. Sänk försiktigt pärlan i Z-axeln tills den kommer i kontakt med kanten av det fria segmentet av rhodaminmikrotubuli. Dra försiktigt upp och rör dig vinkelrätt mot mikrotubuliaxeln för att kontrollera om det finns fäste genom att observera rhodaminmikrotubululiböjningen och följa pärlpositionen. Om den inte är fastsatt, upprepa den mjuka stötningen av pärlan på mikrotubuli tills den är fastsatt.
    5. Justera försiktigt rhodaminmikrotubuli längs mikrotubuliaxeln för den ytbundna mikrotubulen genom att flytta nanopositioneringssteget och ställa in parametrarna för automatisk dragning av mikrotubulibunten. Ställ in riktningen längs mikrotubuliens parallellaxel, ställ in önskad draghastighet (25-200 nm / s är ett användbart hastighetsområde) och önskad dragtid (cirka 30 s till 2 min) beroende på överlappningslängd.
    6. Börja spela in fluorescensdata i de tre (488 nm, 561 nm, 640 nm) kanalerna med en hastighet av 1-2 bilder per sekund. Använd laserkrafter och exponeringstider optimerade i steg 5 ovan.
    7. Starta automatiserad scenrörelse och spela in svällningsdata från det positionskänsliga detektor-, scen- och TIRF-kameratillståndet. Övervaka för alla faktorer som kan störa datainsamlingen, som inkluderar men inte är begränsade till (1) en annan pärla som kommer in i fällan, (2) för tidig förlust av mikrotubuli-tvärbindning eller (3) pärlavskiljning från rhodaminmikrotubuli.
    8. Inaktivera fällan för att släppa pärlan och upprepa experimentet efter önskemål. En typisk provkammare kan användas i cirka 30 minuter innan nedbrytning av buntarna och förlust av proteinaktivitet inträffar.
      OBS: Nedbrytningseffekter kommer att variera beroende på vilken tvärbindare som används men kan manifesteras som bildandet av statisk puncta på antingen mikrotubuli eller yta, förlusten av mikrotubulifluktuationer som indikerar icke-specifik bindning eller oförmågan att stabilt fästa pärlor på mikrotubuli.

7. Analys av data och korrelation mellan fluorescensbilder och optiska fällposter

OBS: För att optimera datainsamlingen är det fördelaktigt att använda två separata datorstyrsystem: ett för den optiska fångstprogramvaran och ett annat för fluorescensavbildning. Denna inställning möjliggör höghastighetsdatainsamling i båda experimentella modaliteterna och eliminerar nano- och mikrosekundfördröjningar i driftkörning som introduceras till data, vilket kan uppstå när du använder en enda CPU.

  1. Digitalisera optiska fångstdata med en hastighet som är optimerad för de använda motoriska eller icke-motoriska tvärbindningsproteinerna och deras förväntade steghastigheter (t.ex. vanligtvis mellan 1-10 kHz).
  2. Spela in X-, Y- och SUM-spänningssignaler från den positionskänsliga fotodetektorn, liksom X-, Y- och Z-positionsdata från nanopositioneringssteget med hjälp av dedikerad programvara för att styra den optiska fällan och ta prov på de digitala spänningssignalerna från dessa komponenter.
  3. Spela in den digitala signalen för slutaröppet tillstånd från kameran med en extra spänningsingångskanal på det optiska datainsamlingskortet. Detta möjliggör korrelation mellan fluorescensavbildningsdata och spårningar av optisk svällningstid. Börja datainsamlingen med den optiska svällningen innan avbildningen initieras så att kamerasignalen från den första bildrutan spelas in korrekt.
  4. Beräkna medelvärdet för råa tidsseriedata som förvärvats vid höga samplingsfrekvenser med hjälp av en lämplig filtreringsmetod, till exempel skjutfönster, medianfilter eller Gaussiskt filter, beroende på behov.
  5. Kvantifiera fluorescensbildens tidsseriedata med hjälp av metoder som linescan-analys, där pixelintensitetsvärdet längs mikrotubuliregionens längd beräknas. Från dessa linjerkan banor, identifiera mikrotubulikanterna och därmed överlappningsregionerna. Använd dessutom fluorescensintensiteten från tvärbindningsproteinkanalen för att beräkna proteinlokalisering, koncentration och densitet.
  6. Korrelation av kraft och bilddata är en viktig utgång av detta experimentella system. Välj och medelvärde för till exempel alla kraftdatapunkter inom ett visst kameraexponeringsområde (indikeras av motsvarande digitala signalspets i kamerakanalen) för att direkt jämföra med motsvarande fluorescensbildram. Därefter extrahera relationerna mellan kraftstorlek och antalet tvärbindande proteiner, överlappningslängd eller tvärbindningsfördelning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Beredningen av mikrotubulibuntar som är lämpliga för biofysisk analys anses vara framgångsrik om flera av nyckelkriterierna är uppfyllda. För det första bör avbildning i tre färger avslöja två inriktade mikrotubuli med en koncentration av tvärbindande protein som företrädesvis dekorerar överlappningsområdet (figur 5B, C och figur 6B). Helst bör avståndet mellan överlappningskanten och den fria änden av rhodaminmikrotubuli vara minst 5 μm för att ge tillräckligt fysiskt utrymme mellan fångststrålen och de fluorescensmärkta proteinerna. För det andra bör det finnas minimal bakgrundsfluorescenssignal i regioner som saknar biotinylerade fjärrröda mikrotubuli, särskilt från samma kanal som tvärbindningsproteinet är märkt med. Hög bakgrundsfluorescens är ett tecken på dålig coverslip-passivering och en hög koncentration av glasbundna proteiner, som sannolikt kommer att interagera icke-specifikt med mikrotubuli eller fångstpärla. Dessutom tyder närvaron av små runda puncta eller korta fragment som ses i någon av mikrotubuliavbildningskanalerna på att mikrotubulipolymerisation och förtydligande misslyckades eller att mikrotubuli åldrades eller skadades.

För det tredje bör pärlorna som används för fångst visas som enstaka pärlor och inte i klumpar som innehåller många pärlor. Det är troligt att en liten del av pärlorna irreversibelt kommer att fästa vid ytan, men en signifikant fraktion bör observeras som enskilda partiklar diffunderade i provkammaren. Överdriven klumpning kan ofta lindras genom att sonikera pärlorna i minst 10 minuter innan de flyter in i kammaren. För det fjärde bör fästning av en pärla på en mikrotubuli resultera i god fastsättning, med pärlan kvar bunden när det svällande laserljuset är stängt. Pärlorna ska inte fastna ospecifikt när de kommer i kontakt med ytan, och när en pärla är fäst vid mikrotubuli bör det vara möjligt att lätt manipulera (t.ex. böja eller böja) filamentet före mätning. Slutligen bör det vara möjligt att observera förändringar i överlappningslängden när kraft appliceras eller motorisk aktivitet tillåts fortsätta. Till exempel, om man observerar motorproteindriven glidning, bör överlappningslängden minska med en hastighet som överensstämmer med hastigheten för motorproteinstegning. Om man undersöker passiva tvärbindare bör kraftanvändningen leda till en förändring av överlappningslängden. Dessa utgångar indikerar att rhodaminmikrotubuli endast är fäst vid den ytbundna mikrotubuli via tvärbindande proteiner, snarare än att icke-specifikt hålla fast vid täckglasytan.

När alla dessa kriterier är uppfyllda är det möjligt att utföra ett brett spektrum av experiment för att extrahera de väsentliga biofysiska parametrarna som definierar ensemblemekanik. Denna analys eller liknande analyser har använts i stor utsträckning för att undersöka mitotiska tvärbindningsproteiner i tidigare studier. Vi har till exempel visat att ensembler av det essentiella mitotiska motorproteinet kinesin-5 kan reglera mikrotubuliglidning genom att generera både tryck- och bromskrafter som skalas linjärt med överlappningslängd64 (Figur 5). Mikrotubuli i antingen en antiparallell eller parallell geometri tvärbands av ett litet ensemble av kinesin-5-molekyler. När dessa motorproteiner steg mot mikrotubuli-plusändarna, gled filamenten antingen isär (antiparallell) eller fluktuerade snabbt fram och tillbaka (parallellt). Genom att övervaka mekaniken inom denna minispindelgeometri fann vi storleken på kraften skalad både med längden på filamentöverlappningen, liksom antalet tvärbindande motorproteiner. När mikrotubuli flyttades med en hastighet som var snabbare än kinesin-5: s lossade steghastighet, gav motorproteinerna en resistiv bromskraft. Det visade sig också att C-terminal svansdomänen krävs för effektiv tvärbindning och kraftgenerering61 (figur 5B,C). Proteinet i full längd kan generera ihållande krafter som platåerar när alla motorproteiner når sin individuella stallkraft (figur 5D). Kinesin-5-motorn som saknar sin C-terminalsvans genererar dock maximala krafter som är nästan fem gånger mindre i storlek (figur 5E, F). Tillsammans avslöjar dessa resultat hur kinesin-5-proteiner fungerar i ensembler för att driva mikrotubuli poleward under spindelmontering och belysa den biofysiska funktionen hos väsentliga reglerande proteindomäner i molekylen.

Vi har också visat att ensembler av det icke-motoriska mitotiska proteinet PRC1 fungerar som en mekanisk dashpot för att motstå mikrotubuliglidning i anafasspindelns mittzoner54 (figur 6A-C). PRC1 genererar friktionsmotstånd som skalas linjärt med draghastighet, precis som en mekanisk dashpot producerar hastighetsberoende resistiva krafter. Dessa resistiva krafter beror inte på längden på överlappningsregioner mellan mikrotubulipar eller den lokala tvärbindningstätheten, men de beror starkt på den totala koncentrationen av engagerade PRC1-molekyler (figur 6D,E). Från dessa resultat föreslås att PRC1-ensembler fungerar som en läckande kolv, där kompression av diffusiva tvärbindare ger ett hastighetsberoende motstånd, men förlusten av tvärbindare vid mikrotubuli-plusändar lindrar stora tryckkrafter.

Liknande analysgeometrier användes också för att undersöka det mitotiska kinesin-12-proteinet Kif1562. Genom att mäta kraften som producerades när mikrotubuli trycktes isär fann Reinemann et al.62 att Kif15-ensembler kan skjuta isär filament upp till en kritisk platåkraft och kräva proteinets C-terminala svansbindningsregion för att effektivt tvärbinda mikrotubuli och bygga ihållande belastningar. visade också elegant att kinesin-14 HSET, ett minus-ände riktat kinesin, på samma sätt kan glida isär antiparallella mikrotubuli63. När det blandas med lika stora mängder av det plus-end-riktade kinesin-5 Eg5-proteinet, tjänar HSET till att hämma Eg5-glidaktiviteten och deltar i en dragkamp för mikrotubuliglidande rörelse inom överlappningsregionen. Tillsammans visar dessa resultat kraften i direkt kraftmätning över aktiva mikrotubulibuntar och klargör behovet av att karakterisera proteinfunktionen i den biologiskt lämpliga nätverksgeometrin.

Figure 1
Figur 1: Passivering av glasöverdrag. (A) Schematisk som visar de sekventiella tvättstegen, torkning och konjugering av glasöverdrag nr 1.5 för amino-silankonjugering. (B) Schematiskt som visar protokollet för kovalent koppling av PEG- och biotin-PEG-grupper till glasöverdraget, tvätt och torkning och försegling av täckglasen under vakuum för kortvarig lagring. Vissa delar av schemat är modifierade bilder från 65. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Montering av en provkammare . (A) Schematisk avbildning av sammansättningen av en provflödeskammare med passiverade täckglas och en standard 3 i mikroskopglas. (B) Montering och typiska dimensioner för en- och dubbelkanaliga flödeskammare som är optimerade för optisk fångst och fluorescensavbildning av mikrotubulibuntar. Vissa delar av schemat är modifierade bilder från 65. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Generering av ytimmobiliserade mikrotubulibuntar för optisk svällning och TIRF-baserad avbildning. Scheman som visar den stegvisa monteringen av optiskt fällbara mikrotubulibuntar. (A) Reagenser flödas in från kammarens ingångsport och vätska transporteras ut från utgångskanalen. (B) Streptavidin (blått) binder först till biotin-PEG-platserna på täckglaset, och (C) kasein (rött) införs som ett ytterligare blockeringsmedel. (D) Biotinylerade långt rödmärkta mikrotubuli (magenta) införs och får inkuberas i ~ 5 minuter, följt av tillsats av (E) tvärbindningsprotein (grönt), (F) icke-biotinylerat rhodaminmärkt mikrotubuli (rött) och slutligen (G) rigorkinesinbelagda mikrosfärer upphängda i lämplig reaktionsbuffert för fastsättning på bunten och optisk fällbaserad manipulation. (H) Kammaren är förseglad med klart nagellack för att förhindra avdunstning av provbufferten under experiment. Vissa delar av schemat är modifierade bilder från 65. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Schema över den optiska pincetten/TIRF-mikroskopsystemet. En optisk fälla med en stråle införs i den optiska vägen för ett målbaserat TIRF-bildsystem inom ett inverterat mikroskop. Ett kort passfilter som sätts in strax under målet gör att fällstrålen kan riktas in i målets bakre öppning, där den kommer att fokuseras strax ovanför ytan på provskyddet och bilda en optisk fälla. En positionskänslig fotodetektor samlar upp det överförda ljuset, vilket möjliggör positions- och kraftdetektering av pärlan. Flera kanaler med fluorescensdata kan förvärvas via TIRF-avbildning och spelas in på en högkänslig EMCCD- eller sCMOS-kamera. En bredspektrum ljuskälla används för att avbilda svällande pärlor under installationen av experimenten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Representativt exempel på mätning av kraftproduktion med kinesin-5. (A) Schematisk avbildning av den experimentella geometrin, som visar mikrotubuli tvärbundna av kinesin-5-motorproteiner som genererar kraft när de skjuter isär filamenten, vilket mäts med en optisk fälla. Representativa fluorescensbilder av buntar som består av ytimmobiliserade mikrotubuli, GFP-kinesin-5 och rhodaminmärkta transportmikrotubuli. (B) Fulllängds och (C) C-terminal svans stympad kinesin-5 konstruktioner användes. Skalstänger = 5 μm. Provregister över kraftproduktion för (D) fullängdare och (E) svanslösa visas, med genomsnittlig kraft plottad som en funktion av tiden. (F) Diagram över den maximala platåkraften och motsvarande överlappningslängd för båda konstruktionerna visas, vilket avslöjar att kinesinkonstruktionen i full längd genererar beroendekrafter med överlappande längd som är väsentligt större i storlek än den svanslösa kinesinkonstruktionen. Denna siffra har modifierats från61. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Representativt exempel på mätning av friktionskrafter med PRC1. (A) Schematisk avbildning av den experimentella geometrin, som visar mikrotubuli tvärbundna av GFP-PRC1 (proteinregulator för cytokinese) tvärbindande proteiner som genererar motstånd när filamenten glider isär genom att flytta täckglaset med konstant hastighet. (B) Representativa tidsseriefluorescensbilder som visar den rörliga ytan immobiliserade fjärrröda mikrotubuli, GFP-PRC1-molekyler som kondenserar inom den krympande överlappningen och den fria rhodaminmikrotubuli som hålls med pärlan. Tidsintervall mellan ramar = 6 s; Skalstreck = 5 μm. (C) Exempel på kraftspår som visar friktionskraft under glidhändelsen, med störningshändelse och kraftfall till noll (~ 55 sek) när överlappningen nådde 0 μm. (D) Korrelation av medelkraft och integrerad GFP-intensitet inom överlappningen vid fyra olika glidhastigheter. (E) Medellutningar och beräknade passningsfel för spår i (D) visar att kraften per PRC1-molekyl ökar linjärt som en funktion av glidhastigheten. Denna siffra har modifierats från66. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikrotubuli nätverk används av otaliga celltyper för att utföra ett brett spektrum av uppgifter som är fundamentalt mekaniska till sin natur. För att beskriva hur celler fungerar i både friska och sjukdomstillstånd är det viktigt att förstå hur dessa nätverk i mikronskala organiseras och regleras av de nanometerstora proteiner som tillsammans bygger dem. Biofysiska verktyg som optisk pincett är väl lämpade för att undersöka mekanokemin hos nyckelproteiner i denna skala. Komplexa experimentella geometrier som använder optisk pincett har utforskats för att återspegla mångfalden av mikrotubulinätverksfunktion, inklusive kraftberoende analyser av mikrotubulispetsdynamik67,68, generering av krafter av kinetokorekomponenter69,70,71 och tvåstråliga hantelfällgeometrier för att undersöka mikrotubulifilamentmekanik72,73 . I detta protokoll har vi beskrivit nya metoder för att rekonstituera grundläggande mikrotubulinätverksmotiv såsom buntar och tillämpa de biofysiska verktygen för enmolekylär fluorescensmikroskopi och optisk fångst för att bedöma kritisk information om cellulär funktion.

Även om de flesta enskilda steg i detta protokoll är tekniskt enkla, finns det tillsammans många potentiella felpunkter som kan uppstå, och betydande försiktighet måste vidtas vid varje punkt för att säkerställa framgångsrika mätningar. För det första, som med många mikroskopbaserade experimentella analyser med en molekyl, är korrekt ytpassivering nyckeln, eftersom icke-specifik bindning av proteiner eller pärlor till täckplattans yta nästan alltid förhindrar ett framgångsrikt slutförande av dessa experiment. För det andra måste uttrycket och reningen av det eller de tvärbindande proteinerna av intresse optimeras för att säkerställa högkvalitativa enartsprodukter, eftersom föroreningar kan störa analysen på många sätt, såsom att inducera överdriven buntning av filament eller störa pärl- och mikrotubulifäste, för att inte tala om att införa komplexitet i tolkningen av kraftdata. För det tredje kräver upprätthållandet av robust pärl-mikrotubulifäste högkvalitativa rigorkinesinmotorer bundna med hög densitet till fångstpärlan, så att flera kinesin-filamentfästpunkter kan göras. Dessa bindningar tål 10 s pN kraft i flera minuter, vilket är lämpligt för ett brett spektrum av potentiella studiesystem som använder denna teknik.

Vi noterar också att det finns många sätt på vilka detta protokoll kan modifieras för att bäst passa slutanvändarens instrumentering eller biologiska systembehov. Medan vi har beskrivit experiment som använder GFP-märkta tvärbindande proteiner och röda / långt rödmärkta mikrotubuli, är det också möjligt att byta fluorescerande märkning efter behov. Till exempel, om användaren inte har tillräckligt med laserlinjer för att utföra trefärgad TIRF-mikroskopi, är det möjligt att få högkvalitativa data genom att differentiellt märka mikrotubuli med samma fluorofor men med olika koncentrationer (t.ex. dim vs. ljus) för varje art av mikrotubuli. På samma sätt kanske det inte alltid är möjligt eller fördelaktigt att lägga till en fluorescerande etikett till tvärbindningsproteinet. I denna situation skulle viss experimentell information som tvärbindningskoncentration eller lokalisering inte vara tillgänglig, men bestämningen av parametrar som mikrotubuliöverlappningslängd kan fortfarande göras. Vi förväntar oss att detta protokoll är mycket anpassningsbart för många olika typer och kombinationer av mikrotubuli-tvärbindningsproteiner. Införandet av flera tvärbindande proteiner skulle sannolikt kräva antingen avlägsnande av fluorescenstaggar från ett av proteinerna eller uteslutning av fluorescerande etiketter från en av de två mikrotubulityperna för att frigöra bildfunktioner i en lämplig bandbredd (t.ex. med hjälp av en röd eller långt röd proteinkodad etikett för tvärbindningsproteinet). Det är osannolikt att mer än tre fluorescerande kanaler skulle kunna användas med denna TIRF-baserade analys, även om det verkligen finns flexibilitet i hur dessa distribueras, vilket bör övervägas noggrant när man planerar ett experiment. Slutligen är det troligt att denna analys kan modifieras för att studera olika nätverksgeometrier och typer av cytoskeletala filament. Analysen av mekaniken för mikrotubuliförgrening, medierad av augmin och gamma-tubulinringkomplexet, kunde lätt undersökas och avbildas. Dessutom skulle andra tvärbundna cytoskelettnätverk, såsom de som involverar aktin, septiner eller mellanliggande filament, vara ganska mottagliga för studier med dessa verktyg, förutsatt att korrekta modifieringar och ortogonala fäststrategier till täckglaset och fångstpärlan görs.

Sammanfattningsvis har vi beskrivit ett protokoll för rekonstituering av aktiva kraftgenererande mikrotubulinätverk, som kan avbildas med hjälp av enmolekylära fluorescensmikroskopiverktyg och manipuleras via en optisk fälla med en stråle. Vi har visat användbarheten av denna metod med dataset som avslöjar ensemblemekaniken hos både ett mitotiskt motoriskt och icke-motoriskt protein. Vi förväntar oss att många typer av högorganiserade mikrotubulinätverk, såsom de som finns i neuroner, epitelvävnad eller kardiomyocyter, kan analyseras med dessa verktyg och avslöja nya principer för biofysisk funktion för den dynamiska cytoskeletten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill erkänna stöd från R21 AG067436 (till JP och SF), T32 AG057464 (till ET) och Rensselaer Polytechnic Institute School of Science Startup Funds (till SF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nm IPG Photonics YLR-10-1064-LP
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applications Chroma TRF89901v2
6x His Tag Antibody, Biotin Conjugate Invitrogen #MA1-21315-BTIN
Acetone, HPLC grade Fisher Scientific 18-608-395
Alpha casein from bovine milk Sigma 1002484390
ATP Fisher Scientific BP413-25
Benzonase Novagen 70746-3
Biotin-PEG-SVA-5000 Laysan Bio, Inc. NC0479433
BL21 (DE3) Rosetta Cells Millipore Sigma 71-400-3
Catalase MP Biomedicals LLC 190311
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objective Nikon N/A
Chloramphenicol ACROS Organics 227920250
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips Fisher Scientific C14784
Delicate Task Wipers Kimberly-Clark 34120
Dextrose Anhydrous Fisher Scientific BP3501
D-Sucrose Fisher Scientific BP220-1
DTT Fisher Scientific BP172-25
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 Bath LAUDA-Brinkmann 27709
EDTA Fisher Scientific BP118-500
EGTA Millipore Corporation 32462-25GM
FIJI / Image J https://fiji.sc/ N/A
Frosted Microscope Slides Corning 12-553-10 75mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm
Glucose Oxidase MP Biomedicals LLC 195196 Type VII, without added oxygen
GMPCPP Jena Biosciences JBS-NU-405S Can be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C
Gold Seal-Cover Glass Thermo Scientific 3405
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Imidazole Fisher Scientific 03196-500
IPTG Fisher Scientific BP1755-10
Laboratory dessicator Bel-Art 999320237 190mm plate size
Kanamycin Sulfate Fischer Scientific BP906-5
KIF5A K439 (aa:1-439)-6His Gilbert Lab, RPI N/A doi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
Kimwipe Kimberley Clark Z188956 lint-free tissue
Immersion Oil, Type B Cargille 16484
Lens Tissue ThorLabs MC-5
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm) Nikon N/A
Lysozyme MP Biomedicals LLC 100834
Magnesium Acetate Tetrahydrate Fisher Scientific BP215-500
Microfuge 18 Beckman Coulter 367160
MPEG-SVA MW-5000 Laysan Bio, Inc. NC0107576
Neutravadin Invitrogen PI31000
Nikon Ti-E inverted microscope Nikon N/A Nikon LuN4 Laser
Ni-NTA Resin Thermo Scientific 88221
Oligonucleotide - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA
GAACTTTCAAAGGC		 IDT N/A
Oligonucleotide - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA
ACTCAGAATAGGTG		 IDT N/A
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mm Beckman Coulter 343755
Optima-TLX Ultracentrifuge Beckman Coulter 361544
Paclitaxel (Taxol equivalent) Thermo Fisher Scientific P3456
PIPES ACROS Organics 172615000
PMSF Millipore 7110-5GM
Porcine Tubulin, biotin label Cytoskeleton, Inc. T333P
Porcine Tubulin, HiLyte 647 Fluor Cytoskeleton, Inc. TL670M far red labelled
Porcine Tubulin, Rhodamine Cytoskeleton, Inc. TL590M
Porcine Tubulin, Tubulin Protein Cytoskeleton, Inc. T240
Potassium Acetate Fisher Scientific BP364-500
Prime 95B sCMOS camera Photometric N/A
Quadrant Detector Sensor Head ThorLabs PDQ80A
Quikchange Lightning Kit Agilent Technologies 210518
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Square Cover Glasses Corning 12-553-450 18 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm
Streptavidin Microspheres Polysciences Inc. 24162-1
Superose-6 Column GE Healthcare 29-0915--96
TCEP Thermo Scientific 77720
TLA-100 Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter 343840
Ultrasonic Cleaner (Sonicator) Vevor JPS-08A(DD) 304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power
Vectabond APTES solution Vector Laboratories SP-1800-7
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-D S.C. Johnson SJN695237

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bentley, M., Banker, G. The cellular mechanisms that maintain neuronal polarity. Nature Reviews Neuroscience. 17 (10), 611-622 (2016).
  2. Yang, R., et al. A novel strategy to visualize vesicle-bound kinesins reveals the diversity of kinesin-mediated transport. Traffic. 20 (11), 851-866 (2019).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: Transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  4. Helmke, K. J., Heald, R., Wilbur, J. D. Interplay between spindle architecture and function. International Review of Cell and Molecular Biology. 306, (2013).
  5. Elting, M. W., Suresh, P., Dumont, S. The spindle: integrating architecture and mechanics across scales. Trends in Cell Biology. 28 (11), 896-910 (2018).
  6. Kapoor, T. Metaphase spindle assembly. Biology. 6 (1), 8 (2017).
  7. Svoboda, K., Block, S. M. Force and velocity measured for single kinesin molecules. Cell. 77 (5), 773-784 (1994).
  8. Svoboda, K., Schmidt, C. F., Schnapp, B. J., Block, S. M. Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry. Nature. 365 (6448), 721-727 (1993).
  9. Schnitzer, M. J., Visscher, K., Block, S. M. Force production by single kinesin motors. Nature Cell Biology. 2 (10), 718-723 (2000).
  10. Andreasson, J. O. L., Shastry, S., Hancock, W. O., Block, S. M. The mechanochemical cycle of mammalian kinesin-2 KIF3A/B under load. Current Biology. 25 (9), 1166-1175 (2015).
  11. Bensel, B. M. The mechanochemistry of the kinesin-2 kif3ac heterodimer is related to strain-dependent kinetic properties of kif3a and kif3c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15632-15641 (2020).
  12. Gilbert, S. P., Guzik-Lendrun, S., Rayment, I. Kinesin-2 motors: kinetics and biophysics. Journal of Biological Chemistry. 293 (12), 4510-4518 (2018).
  13. Okada, Y., Higuchi, H., Hirokawa, N. Processivity of the single-headed kinesin KIF1A through binding to tubulin. Nature. 424 (6948), 574-577 (2003).
  14. Budaitis, B. G., et al. Pathogenic mutations in the kinesin-3 motor KIF1A diminish force generation and movement through allosteric mechanisms. Journal of Cell Biology. 220 (4), 202004227 (2021).
  15. Tomishige, M., Klopfenstein, D. R., Vale, R. D. Conversion of Unc104/KIF1A kinesin into a processive motor after dimerization. Science. 297 (5590), 2263-2267 (2002).
  16. Siddiqui, N., et al. Force generation of KIF1C is impaired by pathogenic mutations. bioRxiv. , (2021).
  17. Valentine, M. T., Fordyce, P. M., Krzysiak, T. C., Gilbert, S. P., Block, S. M. Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro. Nature Cell Biology. 8 (5), 470-476 (2006).
  18. Valentine, M. T., Gilbert, S. P. To step or not to step? How biochemistry and mechanics influence processivity in Kinesin and Eg5. Current Opinion in Cell Biology. 19 (1), 75-81 (2007).
  19. Jannasch, A., Bormuth, V., Storch, M., Howard, J., Schäffer, E. Kinesin-8 is a low-force motor protein with a weakly bound slip state. Biophysical Journal. 104 (11), 2456-2464 (2013).
  20. Bormuth, V., Varga, V., Howard, J., Schäffer, E. Protein friction limits diffusive and directed movements of kinesin motors on microtubules. Science. 325 (5942), 870-873 (2009).
  21. Gennerich, A., Carter, A. P., Reck-Peterson, S. L., Vale, R. D. Force-induced bidirectional stepping of cytoplasmic dynein. Cell. 131 (5), 952-965 (2007).
  22. Mallik, R., Carter, B. C., Lex, S. A., King, S. J., Gross, S. P. Cytoplasmic dynein functions as a gear in response to load. Nature. 427 (6975), 649-652 (2004).
  23. Redwine, W. B., et al. The human cytoplasmic dynein interactome reveals novel activators of motility. eLife. 6, 28257 (2017).
  24. Belyy, V., Hendel, N. L., Chien, A., Yildiz, A. Cytoplasmic dynein transports cargos via load-sharing between the heads. Nature Communications. 5 (1), 5544 (2014).
  25. Belyy, V., et al. The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition. Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).
  26. Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
  27. Forth, S., Kapoor, T. M. The mechanics of microtubule networks in cell division. Journal of Cell Biology. 216 (6), 1525-1531 (2017).
  28. Dumont, S., Mitchison, T. J. Force and length in the mitotic spindle. Current Biology. 19 (17), 749-761 (2009).
  29. McIntosh, J. R., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I. Biophysics of mitosis. Quarterly Reviews of Biophysics. 45 (2), 147-207 (2012).
  30. McIntosh, J., Hays, T. A brief history of research on mitotic mechanisms. Biology. 5 (4), 55 (2016).
  31. Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. Mitotic functions of kinesin-5. Seminars in Cell and Developmental Biology. 21 (3), 255-259 (2010).
  32. Kapitein, L. C., et al. The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks. Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).
  33. Vukušić, K., Ponjavić, I., Buđa, R., Risteski, P., Tolić, I. M. Microtubule-sliding modules based on kinesins EG5 and PRC1-dependent KIF4A drive human spindle elongation. Developmental Cell. 56 (9), 1253-1267 (2021).
  34. Sturgill, E. G., Ohi, R. Kinesin-12 differentially affects spindle assembly depending on its microtubule substrate. Current Biology. 23 (14), 1280-1290 (2013).
  35. Drechsler, H., McHugh, T., Singleton, M. R., Carter, N. J., McAinsh, A. D. The Kinesin-12 Kif15 is a processive track-switching tetramer. eLife. 3, 01724 (2014).
  36. Tanenbaum, M. E., et al. Kif15 Cooperates with Eg5 to promote bipolar spindle assembly. Current Biology. 19 (20), 1703-1711 (2009).
  37. Mountain, V., et al. Cross-links microtubules in the mammalian mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 147 (2), 351-365 (1999).
  38. Norris, S. R., et al. Microtubule minus-end aster organization is driven by processive HSET-tubulin clusters. Nature Communications. 9 (1), 2659 (2018).
  39. Cai, S., Weaver, L. N., Ems-McClung, S. C., Walczak, C. E. Proper organization of microtubule minus ends is needed for midzone stability and cytokinesis. Current Biology. 20 (9), 880-885 (2010).
  40. Pamula, M. C., et al. High-resolution imaging reveals how the spindle midzone impacts chromosome movement. Journal of Cell Biology. 218 (8), 2529-2544 (2019).
  41. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  42. Zhu, C., Lau, E., Schwarzenbacher, R., Bossy-Wetzel, E., Jiang, W. Spatiotemporal control of spindle midzone formation by PRC1 in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6196-6201 (2006).
  43. Subramanian, R., et al. Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein. Cell. 142 (3), 433-443 (2010).
  44. Elting, M. W., Prakash, M., Udy, D. B., Dumont, S. Mapping load-bearing in the mammalian spindle reveals local kinetochore fiber anchorage that provides mechanical isolation and redundancy. Current Biology. 27 (14), 2112-2122 (2017).
  45. Fant, X., Merdes, A., Haren, L. Cell and molecular biology of spindle poles and NuMA. International Review of Cytology. 238, 1-57 (2004).
  46. Merdes, A., Heald, R., Samejima, K., Earnshaw, W. C., Cleveland, D. W. Formation of spindle poles by dynein/dynactin-dependent transport of NuMA). Journal of Cell Biology. 149 (4), 851-861 (2000).
  47. Maddox, P., Straight, A., Coughlin, P., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Direct observation of microtubule dynamics at kinetochores in Xenopus extract spindles: Implications for spindle mechanics. Journal of Cell Biology. 162 (3), 377-382 (2003).
  48. Maddox, P., Desai, A., Oegema, K., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Poleward microtubule flux is a major component of spindle dynamics and anaphase A in mitotic Drosophila embryos. Current Biology. 12 (19), 1670-1674 (2002).
  49. LaFountain, J. R., Cohan, C. S., Siegel, A. J., LaFountain, D. J. Direct visualization of microtubule flux during metaphase and anaphase in crane-fly spermatocytes. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5724-5732 (2004).
  50. Pavin, N., Tolić, I. M. Mechanobiology of the mitotic spindle. Developmental Cell. 56 (2), 192-201 (2021).
  51. Vukušić, K., Tolić, I. M. Anaphase B: Long-standing models meet new concepts. Seminars in Cell and Developmental Biology. 117, 127-139 (2021).
  52. Vukušić, K., et al. Microtubule sliding within the bridging fiber pushes kinetochore fibers apart to segregate chromosomes. Developmental Cell. 43 (1), 11-23 (2017).
  53. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  54. Gaska, I., Armstrong, M. E., Alfieri, A., Forth, S. The mitotic crosslinking protein PRC1 acts like a mechanical dashpot to resist microtubule sliding. Developmental Cell. 54 (3), 367-378 (2020).
  55. Woll, K. A., et al. An allosteric propofol-binding site in kinesin disrupts kinesin-mediated processive movement on microtubules. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11283-11295 (2018).
  56. Forth, S., Hsia, K. C., Shimamoto, Y., Kapoor, T. M. Asymmetric friction of nonmotor MAPs can lead to their directional motion in active microtubule networks. Cell. 157 (2), 420-432 (2014).
  57. Alfieri, A., Gaska, I., Forth, S. Two modes of PRC1-mediated mechanical resistance to kinesin-driven microtubule network disruption. Current Biology. 31 (12), 2495-2506 (2021).
  58. Koch, M. D., Shaevitz, J. W. Introduction to optical tweezers. Methods in Molecular Biology. 1486, 3-24 (2017).
  59. Sarshar, M., Wong, W. T., Anvari, B. Comparative study of methods to calibrate the stiffness of a single-beam gradient-force optical tweezers over various laser trapping powers. Journal of Biomedical Optics. 19 (11), 115001 (2014).
  60. Van Mameren, J., Wuite, G. J. L., Heller, I. Introduction to optical tweezers: Background, system designs, and commercial solutions. Methods in Molecular Biology. 783, 1-20 (2011).
  61. Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9, 51131 (2020).
  62. Reinemann, D. N., et al. Collective force regulation in anti-parallel microtubule gliding by dimeric Kif15 kinesin motors. Current Biology. 27 (18), 2810-2820 (2017).
  63. Reinemann, D. N., Norris, S. R., Ohi, R., Lang, M. J. Processive kinesin-14 HSET exhibits directional flexibility depending on motor traffic. Current Biology:CB. 28 (14), 2356-2362 (2018).
  64. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  65. SMART - Servier Medical ART. , Available from: https://smart.servier.com/ (2022).
  66. Gaska, I., Armstrong, M., Alfieri, A., Forth, S. The mitotic crosslinking protein PRC1 acts as a mechanical dashpot to resist microtubule sliding. Developmental Cell. 54 (3), 1-14 (2020).
  67. Janson, M. E., De Dood, M. E., Dogterom, M. Dynamic instability of microtubules is regulated by force. Journal of Cell Biology. 161 (6), 1029-1034 (2003).
  68. Kerssemakers, J. W. J., et al. Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution. Nature. 442 (7103), 709-712 (2006).
  69. Powers, A. F., et al. The Ndc80 kinetochore complex forms load-bearing attachments to dynamic microtubule tips via biased diffusion. Cell. 136 (5), 865-875 (2009).
  70. Akiyoshi, B., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
  71. Fong, K. K., et al. Direct measurement of the strength of microtubule attachment to yeast centrosomes. Molecular Biology of the Cell. 28 (14), 1853-1861 (2017).
  72. Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps. Biophysical Journal. 90 (5), 1687-1696 (2006).
  73. Memet, E., et al. Microtubules soften due to cross-sectional flattening. eLife. 7, 34695 (2018).

Tags

Biologi Utgåva 183 mikrotubuli optisk fångst mitos enmolekyl spindel mekanik kinesin mikrotubuliassocierade proteiner fluorescensmikrosopi
Direkt mätning av krafter i rekonstituerade aktiva mikrotubulibuntar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Palumbo, J., Tai, E., Forth, S.… More

Palumbo, J., Tai, E., Forth, S. Directly Measuring Forces Within Reconstituted Active Microtubule Bundles. J. Vis. Exp. (183), e63819, doi:10.3791/63819 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter