Summary
动态光散射（DLS）已成为评估静脉内施用的铁碳水化合物复合物的粒径和分布的合适测定方法。然而，这些协议缺乏标准化，需要针对分析的每个铁 - 碳水化合物复合物进行修改。本协议描述了蔗糖铁分析的应用和特殊注意事项。
Abstract
静脉注射的铁-碳水化合物纳米颗粒复合物广泛用于治疗缺铁。该类包括几种结构异质的纳米颗粒复合物，它们对可用于物理化学表征这些试剂的方法所需的条件表现出不同的敏感性。目前，铁-碳水化合物复合物的关键质量属性尚未完全确定。动态光散射（DLS）已成为确定完整粒径和分布的基本方法。然而，在实验室方法的标准化、单个铁碳水化合物产品所需的特定修改以及如何最好地描述尺寸分布方面仍然存在挑战。重要的是，使用的稀释剂和系列稀释液必须标准化。样品制备和数据报告方法的巨大差异限制了DLS用于铁碳水化合物制剂比较的使用。在本文中，我们详细介绍了一种稳健且易于重现的方案，以使用Z平均值和多分散指数测量铁 - 碳水化合物复合物蔗糖铁的大小和尺寸分布。
Introduction
蔗糖铁（IS）是一种胶体溶液，由多核氢氧化铁-氧氧核和蔗糖的复合物组成的纳米颗粒组成。IS被广泛用于治疗患有多种基础疾病状态的患者的缺铁，这些患者不能耐受口服补铁或口服铁剂无效1。IS属于美国食品和药物管理局（FDA）定义的复杂药物类别，是一类具有与生物制剂2相称的复杂化学的药物。复杂药物产品的监管评估可能需要额外的正交理化方法和/或临床前或临床研究，以准确比较后续复杂药物3,4。这很重要，因为一些研究报告说，使用IS与后续IS产品不会产生相同的临床结果。这强调了使用适用于检测IS产品之间物理化学性质差异的新型正交表征技术的重要性5,6。
准确阐明IS的大小和尺寸分布具有临床意义，因为粒径是调理率和程度的主要影响因素 - 这些复杂药物生物分布的第一个关键步骤7,8。即使粒径和粒径分布的微小变化也与氧化铁纳米颗粒复合物9,10的药代动力学特征的变化有关。Brandis 等人最近的一项研究表明，当比较参考列出的药物和通用葡萄糖酸铁钠产品时，通过 DLS 测量的粒径（14.9 nm ± 0.1 nm 与 10.1 nm ± 0.1 nm，p < 0.001）显着不同11。铁碳水化合物产品的批次间质量、安全性和有效性的一致性完全取决于制造工艺的放大，必须仔细考虑潜在的制造漂移9.制造过程可能导致残留蔗糖，这将因制造商而异 12.制造工艺变量的任何修改都可能导致最终复杂药物产品在结构、复合物稳定性和体内处置方面的重大变化9。
为了评估药物的一致性并预测药物的体内行为，需要当代正交分析方法来确定复杂纳米药物的物理化学性质。然而，方法缺乏标准化，这可能导致结果报告在实验室间存在很大差异13。尽管全球监管机构和科学界认识到这些挑战14，但IS的大多数理化特征仍然定义不清，现有监管指导文件中的关键质量属性的全部补充尚未定义15。FDA发布的铁碳水化合物复合物特定产品指导文件草案建议将DLS作为评估后续产品的大小和大小分布的程序16,17。
一些出版物详细介绍了已建立的DLS协议来确定IS纳米颗粒尺寸13,18。但是，由于已发布方法的样品制备、程序条件、仪器和仪器设置参数不同，因此在没有标准化方法来解释结果的情况下，无法直接比较DLS结果13,18。方法和数据报告方法的多样性限制了为比较目的对这些特征进行适当评估19.重要的是，之前发布的许多用于评估IS的DLS协议都没有考虑到蔗糖在悬浮液中扩散的影响，因为游离蔗糖的存在已被证明会虚假地提高胶体溶液中纳米颗粒的Z平均值计算的流体动力学半径13,18。本协议旨在标准化测量IS粒径和分布的方法。该方法已为此目的而开发和验证。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 操作机器
- 启动机器和软件
注： 补充图 S1A-D 描述了启动机器和软件的步骤。- 在开始测量前至少 30 分钟打开仪器，然后启动 PC。
- 双击 仪器软件图标 以启动程序。
- 在登录窗口中输入用户名和密码。确保每个用户都有自己的帐户。
- 等待右下角的所有三个黑条都亮起绿色，表示设备已准备好运行。
- 在长时间不活动的情况下，当用户自动注销时，在“安全性”下，单击“登录”，然后重新输入密码。
- 创建测量文件
注意：在每个测量日的开始时创建一个新的测量文件。所有测量值都列出并存储在测量文件中。有关此过程的详细信息，请参阅 补充图 S2A-B。- 通过单击“文件”|“ 创建新的测量文件新品 |测量文件。在打开的窗口中，选择存储位置，并命名测量文件。通过单击保存确认详细信息。
- 要打开文件，请单击“ 文件”|”打开 |测量文件。在打开的窗口中选择测量文件，单击“ 打开”确认详细信息，选择 文件名，然后单击 “保存”。
- 打印结果
- 根据 补充图S3打印或保存系统适用性测试（SST）的结果（参见步骤1.5）和样品测量的平均值。
- 在测量文件的 记录视图中 标记 测量值。
- 右键单击 批量打印，然后等待另一个小窗口打开。
- 从选项中选择 PSD 强度报告 ，然后单击“ 确定”进行确认。
- 开始测量的一般程序
注意：开始测量的过程在 补充图S4A-D中描述。按照下面概述的所需单位参数文件（称为 SOP）的路径进行操作：- 从下拉列表中选择 所需的 SOP 。由于列表中显示了最近使用的 SOP，因此如果需要较旧的 SOP，请选择 浏览 SOP，然后单击 绿色箭头进行确认。SOP 的存储位置打开后，继续执行步骤 1.4.2。
注：有关蔗糖铁特有的重要系统参数的详细信息（例如，衰减器的平衡时间），请参见 表1。 - 在打开的窗口中，在“示例名称和注释”下进行所需的输入。单击“确定”进行确认，然后等待测量窗口自动打开。
- 通过单击绿色的开始按钮 开始 测量。
- 一旦声音信号在测量结束时响起，请关闭 测量 窗口。
- 从下拉列表中选择 所需的 SOP 。由于列表中显示了最近使用的 SOP，因此如果需要较旧的 SOP，请选择 浏览 SOP，然后单击 绿色箭头进行确认。SOP 的存储位置打开后，继续执行步骤 1.4.2。
- 系统适用性测试 （SST） 测量
注意：请勿触摸比色皿的下部（测量区）。在序列的开始和结束时，测量20nm颗粒标准品。- 将~1 mL未稀释的颗粒标准品填充到聚苯乙烯比色皿中，并盖上盖子。
注意：步骤1.5.1中制备的稀释标准品可以使用1个月。 - 填充后，关闭比色皿，检查是否有气泡。轻轻敲击比色皿以去除气泡。
- 将比色皿放在仪器的池架中， 箭头标记 朝前，然后关闭测量室盖。
- 加载单位参数SOP，并在启动窗口中输入以下数据：
样品名称： SST 20 nm 颗粒标准品
然后，添加注释： 标准的标识符号和到期日期 - 开始测量。
- 测量结束后，当声音信号响起时，关闭测量窗口。
- 打印报告（见第 1.1.3 点）。
注意：如果粒径 Z平均值 对应于 分析证书的值±10%，则通过SST。
- 将~1 mL未稀释的颗粒标准品填充到聚苯乙烯比色皿中，并盖上盖子。
- 蔗糖铁溶液的测量
- 将 0.5 mL 铁含量为 2% m/V 的 IS 溶液移液到 25 mL 容量瓶中，并用低颗粒水填充至标记（例如新鲜去离子并过滤 [孔径 0.2 μm]）;该溶液含有0.4毫克铁/毫升。
注意：样品制备在步骤1.6.1中。在方法开发过程中建立了这种特定的稀释度，并将其确定为用于此目的的最佳稀释度。 - 对于初步清洁，用准备好的测量溶液填充聚苯乙烯比色皿约3/4，轻轻旋转，然后尽可能完全清空。
注意：请勿触摸比色皿的下部（测量区），不要摇晃比色皿，以免产生气泡。 - 测量时，将1 mL的测量溶液移入比色皿中，并盖上盖子。
- 检查比色皿中的测量溶液是否有气泡。如果有气泡，请轻轻敲击比色皿将其清除。
- 将 0.5 mL 铁含量为 2% m/V 的 IS 溶液移液到 25 mL 容量瓶中，并用低颗粒水填充至标记（例如新鲜去离子并过滤 [孔径 0.2 μm]）;该溶液含有0.4毫克铁/毫升。
- 执行测量
- 将装有测量溶液的塑料比色皿放入设备中， 箭头标记 朝前，然后盖上盖子。
- 加载参数 SOP（参见步骤 1.4.1），并在启动窗口中输入以下数据：
样品名称：批号 - 开始测量。
- 测量结束后，当声音信号响起时，关闭 测量 窗口。
- 根据 补充图S5计算六个单独测量值的平均值。在测量文件的“记录” 视图中 标记单个 测量值，右键单击 “创建平均结果”，在“ 样品名称”下添加平均值的名称，然后单击“ 确定”进行确认。
- 等待软件在列表末尾创建新记录，然后在该记录中查找输入的名称和平均结果。
- 打印报告（请参阅步骤 1.1.3）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
所述方法根据ICH Q2（R1）20进行了验证，该方法涉及在不同条件下测量测试溶液。Z平均尺寸的精度仅为0.5%RSD，而PDI的计算最大RSD为3.5%。对于 Z 平均值大小，不同分析师和天数的平均结果仅相差 0.4%，PDI 相差 1.5%。统计数据是根据两位分析师在不同日期进行的 12 次测量计算得出的。测试浓度在50%-200%范围内的变化以及测试溶液在冷藏条件下储存长达5天都没有影响最终结果。
分析的参数
Z 平均大小
流体动力学直径以Z平均粒径给出，确定该方法的方法在ISO 22412：201717中定义。Z 平均值大小是一个参数，也称为累积平均值。Z 平均值是首选的 DLS 大小参数，因为 Z 平均值的计算在数学上是稳定的，并且 Z 平均值结果对噪声不敏感。根据EMA和FDA，Z平均尺寸和PDI是表征纳米药物的推荐值15,16,21。只有当样品呈单峰、球形或近球形、单分散且在合适的分散剂中制备时，Z 平均粒径才与其他技术测量的尺寸相当。这是因为Z平均粒径对样品制备中的微小变化也很敏感。Z平均粒径是一个流体动力学参数，因此仅对分散体中的颗粒或溶液中的分子有效。
多分散指数
该指数是根据相关数据的简单双参数拟合（累积量分析）计算得出的数字。多分散指数是无量纲的，并且是缩放的，因此除了在高度单分散的标准品中，很少看到小于0.05的值。大于 0.7 的值表示样品具有非常宽的粒径分布，可能不适合 DLS 技术。各种大小分布算法可以处理介于这两个极端之间的数据。这些参数的计算在 ISO 标准文档 22412：201717 中定义。
按强度/体积/数量分布的尺寸分布
典型的尺寸分布图（强度、体积、数量）如图 1所示。结果图显示了六个独立制备的 IS 批次605211样品，浓度为 0.4 mg Fe/mL。对于 图1中的可视化，使用统计软件绘制从DLS软件获取的原始数据，无需进一步修改9。 图1A中提供了受第二个峰影响的强度大小分布，作为不良结果的示例。 图2 显示了在5,000 nm处显示附加信号的低质量数据。
图 1：尺寸分布 。 （A） 强度，（B） 体积，（C） 数量13。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：具有代表性的低质量数据。 请点击此处查看此图的大图。
在室温下储存5天的IS批次0371022A（0.4mg Fe / mL）的测试溶液在~5,000nm处显示出额外的信号，这表明存在一些额外的颗粒（例如，灰尘或沉淀）。因此，最初在0.130处确定的PDI移至0.184，而Z平均值在11.99nm处仍接近原始值（即11.33）（未发表的数据）。
精度由两名实验室技术人员在不同的日子进行测试。两位技术人员的 Z 平均值和 PDI 的 12 次重复平均值分别为 11.32 nm，RSD 为 0.4% 和 0.125，RSD 为 1.5%。符合验收标准（Z平均值为NMT 5%，PDI为NMT 20%）（未发表的数据）。
可分析参数的比较
除了计算基本参数（Z平均值和多分散性）外，DLS设备的软件还允许计算尺寸分布，可以根据探测器信号的强度或散射粒子的体积（或数量）进行加权。比较这些参数的相关性在 表2中概述的结果中显而易见。虽然按数量划分的尺寸分布与建议的基于强度的Z平均值相差多达2倍，但按体积计算的尺寸分布仅计算出略低的值。然而，应该注意的是，如果铁-碳水化合物复合物溶液含有较大的颗粒或聚集体，则基于强度的结果报告可能不准确13。
表 1：DLS 的系统参数。 缩写：RI = 折射率;DLS = 动态光散射13. 请按此下载此表格。
表2：数据报告方法如何影响IS粒度测定的示例。 这张表改编自Di Francesco和Borchard13。缩写：SD = 标准差;RSD = 相对标准偏差;PDI = 多分散指数;IS = 铁蔗糖。 请按此下载此表格。
补充图S1：系统操作步骤。请点击此处下载此文件。
补充图 S2：创建测量文件。请点击此处下载此文件。
补充图S3：系统适用性测试。请点击此处下载此文件。
补充图S4：开始新的测量。请点击此处下载此文件。
补充图S5：测量值的计算。请点击此处下载此文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DLS已成为确定纳米颗粒尺寸和尺寸分布的基本方法，用于药物开发和监管评估。尽管DLS技术取得了进步，但在稀释剂选择和样品制备方面仍然存在方法学挑战，这与胶体溶液中的铁-碳水化合物复合物尤其相关。重要的是，铁碳水化合物纳米药物的DLS方法尚未在生物学环境（例如血浆）中得到广泛研究22。因此，仍然迫切需要根据稀释剂的选择来协调最佳实践方案。稀释剂的选择很重要，因为使用纯净水与等渗盐水溶液可能会影响胶体悬浮液的稳定性16。
还应该注意的是，铁 - 碳水化合物复合物不应稀释到处方信息建议以下，以减轻使用深色，不透明溶液的挑战。过度稀释与生物无关，并且会通过离子屏蔽的变化 影响 胶体悬浮液的稳定性，从而导致潜在的沉淀和不准确的结果报告。在该方法的开发过程中测试了各种稀释液和稀释剂（未发表的数据），并确定并验证了协议步骤1.6.1中描述的样品制备，并将其验证为IS的最佳稀释液。对于铁-碳水化合物复合物的DLS分析，必须考虑进行一些修改。例如，测试溶液的制备需要在没有任何高速搅拌的情况下进行。应避免使用涡旋混合器，因为这会导致铁蔗糖聚集体的产生。为了制备测试溶液，用自动移液器将IS溶液轻轻地混合在水中。此外，运行样品进行 DLS 分析时， 应关闭自动校准功能。
铁碳水化合物纳米颗粒的DLS分析有几个固有的局限性。由于光散射角和Z平均输出的性质，报告的流体动力学直径偏向于测量溶液中的较大颗粒。因此，粒径可能被高估，并且粒径的真实分布可能被低估13。报告结果技术应在铁-碳水化合物复合物颗粒的大小以及在实验条件下聚集的可能性的背景下考虑。还应该考虑到，由于不同的制造商使用不同的算法进行计算，因此来自相同或不同制造商的不同DLS单元之间的强度，体积和数量加权尺寸分布的结果可能会有很大差异。因此，ISO22412仅建议使用 Z 平均值和多分散性，因为它们的计算算法是标准化的。监管机构还建议报告 Z 平均尺寸16。还应该注意的是，当该协议应用于其他仪器时，将需要稍作修改（例如，软件的处理、测量程序和数据准备）。
即使考虑到与DLS相关的挑战，该技术也代表了以前的分析方法的重大进步，并为铁 - 碳水化合物复合物的表征增加了令人信服的数据。它已得到科学家合作和监管机构16,18,19,21的认可。未来将DLS分析应用于铁-碳水化合物复合物的努力应首先侧重于将其应用于药物开发和监管评估的方案的全球协调，包括确保生物等效性。总体而言，此处描述的分析方案旨在标准化测量IS粒度和分布的方法，并且可以成为评估IS质量的有用工具。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.B.、E.P.、M.W. 和 A.B. 是 Vifor Pharma 的员工。G.B.是Vifor Pharma的顾问。
Acknowledgments
没有
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | NA | equipped with Zetasizer software 7.12, Helium Neon laser (633 nm, max. 4 mW) and 173° backscattering geometry |
| Materials | |||
| Disposable plastic cuvettes | |||
| LLG-Disposable plastic cells | LLG labware | LLG-Küvetten, Makro, PS; Order number 9.406011 | |
| low-particle water | (The use of freshly deionized and filtered (pore size 0.2 μm) water is recommended). | ||
| Microlitre pipette | |||
| Venofer 100 mg/5 mL | Vifor Pharma | ||
| Volumetric flask 25 mL | |||
| Nanosphere | Thermo | 3020A | Particle Standard |
| Software | |||
| Origin Pro v.8.5 | Origin Lab Corporation |
References
- Auerbach, M., Gafter-Gvili, A., Macdougall, I. C. Intravenous iron: A framework for changing the management of iron deficiency. Lancet Haematology. 7 (4), e342-e350 (2020).
- Generic drugs: FDA should make public its plans to issue and revise guidance on nonbiological complex drugs. US Government Accountability Office. , Available from: https://www.gao.gov/products/gao-18-80 (2017).
- Klein, K., et al. The EU regulatory landscape of non-biological complex drugs (NBCDs) follow-on products: Observations and recommendations. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 133, 228-235 (2019).
- Astier, A., et al. How to select a nanosimilar. Annals of the New York Academy of Sciences. 1407 (1), 50-62 (2017).
- Rottembourg, J., Kadri, A., Leonard, E., Dansaert, A., Lafuma, A. Do two intravenous iron sucrose preparations have the same efficacy. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (10), 3262-3267 (2011).
- Aguera, M. L., et al. Efficiency of original versus generic intravenous iron formulations in patients on haemodialysis. PLoS One. 10 (8), e0135967 (2015).
- Alphandery, E. Iron oxide nanoparticles for therapeutic applications. Drug Discovery Today. 25 (1), 141-149 (2020).
- Arami, H., Khandhar, A., Liggitt, D., Krishnan, K. M. In vivo delivery, pharmacokinetics, biodistribution and toxicity of iron oxide nanoparticles. Chemical Society Reviews. 44 (23), 8576-8607 (2015).
- Nikravesh, N., et al. Factors influencing safety and efficacy of intravenous iron-carbohydrate nanomedicines: From production to clinical practice. Nanomedicine. 26, 102178 (2020).
- Pai, A. B., et al. In vitro and in vivo DFO-chelatable labile iron release profiles among commercially available intravenous iron nanoparticle formulations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 97, 17-23 (2018).
- Brandis, J. E. P., et al. Evaluation of the physicochemical properties of the iron nanoparticle drug products: Brand and generic sodium ferric gluconate. Molecular Pharmaceutics. 18 (4), 1544-1557 (2021).
- Di Francesco, T., Sublet, E., Borchard, G. Nanomedicines in clinical practice: Are colloidal iron sucrose ready-to-use intravenous solutions interchangeable. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 131, 69-74 (2019).
- Di Francesco, T., Borchard, G. A robust and easily reproducible protocol for the determination of size and size distribution of iron sucrose using dynamic light scattering. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 152, 89-93 (2018).
- The Center for Research on Complex Generics. US Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/drugs/guidance-compliance-regulatory-information/center-research-complex-generics (2021).
- Drug products, including biological products, that contain nanomaterials - Guidance for industry. Center for Drug Evaluation and Research. FDA-2017-D-0759. US Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/drug-products-including-biological-products-contain-nanomaterials-guidance-industry (2022).
- US Food and Drug Administration. Draft guidance on ferric oxyhydroxide. US Food and Drug Administration. , (2021).
- ISO 22412:2017. Particle size analysis - Dynamic light scattering. International Organization for Standardization. , Available from: http://www.iso.org/standard/65410.html (2017).
- Zou, P., Tyner, K., Raw, A., Lee, S. Physicochemical characterization of iron carbohydrate colloid drug products. The AAPS Journal. 19 (5), 1359-1376 (2017).
- D'Mello, S. R., et al. The evolving landscape of drug products containing nanomaterials in the United States. Nature Nanotechnology. 12 (6), 523-529 (2017).
- Q2 (R1) Validation of analytical procedures: Text and methodology guidance for industry. FDA-2017-D-6821. US Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/q2r1-validation-analytical-procedures-text-and-methodology-guidance-industry (2005).
- Committee for Medicinal Products for Human Use. Reflection paper on the data requirements for intravenous iron-based nano-colloidal products developed with reference to an innovator medicinal product. European Medicines Agency. , Available from: https://www.ema.europe.eu/en/documents/scientific-guideline/reflection-paper-data-requirements-intravenous-iron-based-nano-colloidal-products-developed_en.pdf (2015).
- Fischer, K., Schmidt, M. Pitfalls and novel applications of particle sizing by dynamic light scattering. Biomaterials. 98, 79-91 (2016).
- Caputo, F., et al. Asymmetric-flow field-flow fractionation for measuring particle size, drug loading and (in)stability of nanopharmaceuticals. The joint view of European Union Nanomedicine Characterization Laboratory and National Cancer Institute - Nanotechnology Characterization Laboratory. Journal of Chromatography A. 1635, 461767 (2021).
- Yusa, S. Chapter 6 - Polymer characterization. Polymer Science and Nanotechnology. Narain, R. , Elsevier. Amsterdam, the Netherlands. 105-124 (2020).
