Summary
Dinamik ışık saçılması (DLS), intravenöz olarak uygulanan demir-karbonhidrat komplekslerinin partikül boyutunu ve dağılımını değerlendirmek için uygun bir test olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, protokoller standardizasyondan yoksundur ve analiz edilen her demir-karbonhidrat kompleksi için değiştirilmesi gerekir. Bu protokol, demir sakarozun analizi için uygulamayı ve özel hususları açıklamaktadır.
Abstract
İntravenöz olarak uygulanan demir-karbonhidrat nanopartikül kompleksleri, demir eksikliğini tedavi etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu sınıf, bu ajanları fizikokimyasal olarak karakterize etmek için mevcut metodolojiler için gerekli koşullara değişen duyarlılık sergileyen yapısal olarak heterojen birkaç nanopartikül kompleksi içerir. Şu anda, demir-karbonhidrat komplekslerinin kritik kalite özellikleri tam olarak belirlenmemiştir. Dinamik ışık saçılması (DLS), bozulmamış parçacık boyutunu ve dağılımını belirlemek için temel bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, laboratuvarlar arasında metodolojilerin standardizasyonu, bireysel demir-karbonhidrat ürünleri için gerekli spesifik modifikasyonlar ve boyut dağılımının en iyi şekilde nasıl tanımlanabileceği konusunda zorluklar hala devam etmektedir. Önemli olarak, kullanılan seyreltici ve seri seyreltmeler standartlaştırılmalıdır. Numune hazırlama ve veri raporlama yaklaşımlarındaki geniş farklılıklar, demir-karbonhidrat ajanlarının karşılaştırılmasında DLS kullanımını sınırlandırmaktadır. Burada, Z-ortalaması ve polidispersite indeksini kullanarak demir-karbonhidrat kompleksi, demir sakarozun boyut ve boyut dağılımını ölçmek için sağlam ve kolayca tekrarlanabilir bir protokolü detaylandırıyoruz.
Introduction
Demir sakkaroz (IS), bir polinükleer demir-oksihidroksit çekirdeği ve sakkaroz kompleksinden oluşan nanopartiküllerden oluşan kolloidal bir çözeltidir. İD, oral demir takviyesini tolere etmeyen veya oral demirin etkili olmadığı çok çeşitli altta yatan hastalık durumları olan hastalar arasında demir eksikliğini tedavi etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır1. IS, biyolojiklerle orantılı karmaşık kimyaya sahip bir ilaç sınıfı olan Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) tarafından tanımlanan karmaşık ilaçların ilaç sınıfına aittir2. Kompleks ilaç ürünlerinin düzenleyici değerlendirmesi, takip eden kompleks ilaçları doğru bir şekilde karşılaştırmak için ek ortogonal fizikokimyasal yöntemler ve / veya klinik öncesi veya klinik çalışmalar gerektirebilir 3,4. Bu önemlidir, çünkü birkaç çalışma, takip eden bir IS ürününe karşı IS'nin kullanımının aynı klinik sonuçları üretmediğini bildirmiştir. Bu, IS ürünleri arasındaki fizikokimyasal özelliklerdeki farklılıkları tespit etmek için uygun olan yeni ve ortogonal karakterizasyon tekniklerinin kullanımının kritikliğini vurgulamaktadır 5,6.
IS'nin boyut ve boyut dağılımının doğru bir şekilde aydınlatılması klinik öneme sahiptir, çünkü partikül büyüklüğü opsonizasyonun hızında ve derecesinde önemli bir etkili faktördür - bu karmaşık ilaçların biyodağılımında ilk kritik adım 7,8. Partikül boyutundaki ve partikül boyutu dağılımındaki küçük değişiklikler bile, demir-oksit nanopartikül komplekslerinin farmakokinetik profilindeki değişikliklerle ilişkilendirilmiştir 9,10. Brandis ve ark. tarafından yapılan yeni bir çalışma, DLS tarafından ölçülen partikül boyutunun, referans olarak listelenen bir ilacı ve jenerik bir sodyum ferrik glukonat ürününü karşılaştırırken sırasıyla 14.9 nm ± 0.1 nm ve10.1 nm ± 0.1 nm, p < 0.001) anlamlı derecede farklı olduğunu göstermiştir. Demir-karbonhidrat ürünlerinin tutarlı partiden partiye kalitesi, güvenliği ve etkinliği tamamen üretim sürecinin ölçeklendirilmesine bağlıdır ve potansiyel üretim sapması dikkatlice düşünülmelidir9. Üretim süreci artık sakkaroz ile sonuçlanabilir ve bu, üreticiye bağlı olarak değişecektir12. Üretim süreci değişkenlerindeki herhangi bir değişiklik, nihai karmaşık ilaç ürününde yapı, karmaşık stabilite ve in vivo eğilim9 açısından önemli değişikliklere yol açabilir.
İlaç tutarlılığını değerlendirmek ve ilacın in vivo davranışını tahmin etmek için, karmaşık nanoilaçların fizikokimyasal özelliklerini belirlemek için çağdaş ortogonal analitik metodolojilere ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, metodolojilerin standardizasyonunda bir eksiklik vardır, bu da sonuç raporlamasında yüksek derecede laboratuvarlar arası çeşitliliğe neden olabilir13. Bu zorlukların küresel düzenleyici otoriteler ve bilimsel topluluk tarafından tanınmasınarağmen14, İD'nin fizikokimyasal özelliklerinin çoğu yeterince tanımlanmamıştır ve mevcut düzenleyici rehberlik belgeleri bağlamında kritik kalite özelliklerinin tam olarak tamamlanması tanımlanmamıştır15. FDA tarafından demir-karbonhidrat kompleksleri için yayınlanan ürüne özgü kılavuz belgeler taslağı, DLS'yi takip eden ürünlerin boyut ve boyut dağılımını değerlendirmek için bir prosedür olarak önermektedir16,17.
Birçok yayın, IS nanopartikül boyutlarını belirlemek için DLS protokollerini ayrıntılı olarak belirlemiştir13,18. Bununla birlikte, numune hazırlama, prosedür koşulları, enstrümantasyon ve enstrümantasyon ayar parametreleri yayınlanan yöntemler arasında farklı olduğundan, sonuçları yorumlamak için standartlaştırılmış bir yöntemin yokluğunda DLS sonuçları doğrudan karşılaştırılamaz13,18. Metodolojilerdeki ve veri raporlama yaklaşımlarındaki çeşitlilik, bu özelliklerin karşılaştırmalı amaçlar için uygun şekilde değerlendirilmesini sınırlamaktadır19. Önemli olarak, IS'yi değerlendirmek için daha önce yayınlanan DLS protokollerinin çoğu, kolloidal çözeltilerdeki nanopartiküllerin Z-ortalaması hesaplanmış hidrodinamik yarıçapını13,18 oranında yükselttiği gösterilen serbest sakarozun varlığından dolayı süspansiyondaki sakkarozun difüzyonunun etkisini hesaba katmamaktadır. Bu protokol, IS'nin partikül boyutunun ve dağılımının ölçülmesi için metodolojiyi standartlaştırmayı amaçlamaktadır. Yöntem bu amaçla geliştirilmiş ve doğrulanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Makinenin çalıştırılması
- Makineyi ve yazılımı başlatma
NOT: Ek Şekil S1A-D , makineyi ve yazılımı başlatma adımlarını açıklamaktadır.- Ölçümlere başlamadan en az 30 dakika önce cihazı açın ve ardından bilgisayarı başlatın.
- Programı başlatmak için enstrüman yazılımı simgesine çift tıklayın.
- Oturum açma penceresine kullanıcı adını ve parolayı girin. Her kullanıcının kendi hesabına sahip olduğundan emin olun.
- Sağ alt köşedeki üç siyah çubuğun da yeşil renkte yanmasını bekleyin, bu da ünitenin çalışmaya hazır olduğunu gösterir.
- Uzun süre işlem yapılmaması durumunda, kullanıcının oturumu otomatik olarak kapatıldığında, Güvenlik altında, Oturum Aç'a tıklayın ve parolayı yeniden girin.
- Ölçüm dosyası oluşturma
NOT: Her ölçüm gününün başında yeni bir ölçüm dosyası oluşturulur. Tüm ölçümler listelenir ve ölçüm dosyasında saklanır. Bu yordamın ayrıntıları için Ek Şekil S2A-B'ye bakın.- Dosya'ya tıklayarak yeni bir ölçüm dosyası oluşturma | Yeni | Ölçüm Dosyası. Açılan pencerede, depolama konumunu seçin ve ölçüm dosyasını adlandırın . Kaydet'e tıklayarak ayrıntıları onaylayın.
- Bir dosyayı açmak için Dosya | Açık | Ölçüm Dosyası. Açılan pencerede ölçüm dosyasını seçin, Aç'a tıklayarak ayrıntıları onaylayın, dosya adını seçin ve Kaydet'e tıklayın.
- Sonuçları yazdırma
- Sistem uygunluk testinin (SST) sonuçlarını (bkz. adım 1.5) ve Ek Şekil S3'e göre numune ölçümünün ortalama değerini yazdırın veya kaydedin.
- Ölçüm(ler)i ölçüm dosyasının Kayıtlar görünümünde işaretleyin.
- Toplu Yazdırma'ya sağ tıklayın ve başka bir küçük pencerenin açılmasını bekleyin.
- Seçimlerden PSD Yoğunluğu raporunu seçin ve Tamam'a tıklayarak onaylayın.
- Ölçümü başlatmak için genel prosedür
NOT: Bir ölçümü başlatma prosedürü Ek Şekil S4A-D'de açıklanmıştır. Gerekli birim parametre dosyası (SOP olarak adlandırılır) için aşağıda özetlenen yolu izleyin:- Açılır listeden gerekli SÇP'yi seçin. En son kullanılan SÇP'ler listede görüntülendiğinden, daha eski bir SÇP'ye ihtiyaç duyulması halinde SÇP'ye Gözat'ı seçin ve yeşil oka tıklayarak onaylayın. SÇP'lerin depolama yeri açıldıktan sonra 1.4.2 adımına geçin.
NOT: Demir sakkaroza özgü önemli sistem parametrelerinin ayrıntıları için (örneğin, bir zayıflatıcının denge süresi), Tablo 1'e bakınız. - Açılan pencerede, Örnek Adı ve Notlar altında gerekli girişleri yapın. Tamam'a tıklayarak onaylayın ve ölçüm penceresinin otomatik olarak açılmasını bekleyin.
- Yeşil Başlat düğmesine tıklayarak ölçümü başlatın.
- Ölçümün sonunda akustik bir sinyal duyulduğunda, ölçüm penceresini kapatın.
- Açılır listeden gerekli SÇP'yi seçin. En son kullanılan SÇP'ler listede görüntülendiğinden, daha eski bir SÇP'ye ihtiyaç duyulması halinde SÇP'ye Gözat'ı seçin ve yeşil oka tıklayarak onaylayın. SÇP'lerin depolama yeri açıldıktan sonra 1.4.2 adımına geçin.
- Sistem uygunluk testi (SST) ölçümü
NOT: Küvetin alt kısmına (ölçüm bölgesi) dokunmayın. Dizinin başında ve sonunda, 20 nm parçacık standardını ölçün.- Seyreltilmemiş parçacık standardının ~ 1 mL'sini bir polistiren küvete doldurun ve kapakla kapatın.
NOT: Adım 1.5.1'de hazırlanan seyreltilmiş standart 1 ay süreyle kullanılabilir. - Doldurduktan sonra, küveti kapatın ve hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin. Küvete hafifçe dokunarak hava kabarcıklarını çıkarın.
- Küveti, ok işareti öne bakacak şekilde cihazın hücre tutucusuna yerleştirin ve ölçüm odası kapağını kapatın.
- Birim parametresi SOP'yi yükleyin ve başlangıç penceresine aşağıdaki verileri girin:
Örnek Adı: SST 20 nm Partikül Standardı
Ardından bir not ekleyin: Standardın tanımlayıcı numarası ve son kullanma tarihi - Ölçümü başlatın.
- Akustik sinyal çaldığında ölçümün bitiminden sonra, ölçüm penceresini kapatın.
- Raporu yazdırın (bkz. madde 1.1.3).
NOT: Partikül boyutu Z-ortalaması analiz sertifikasının %10'luk değerine karşılık gelirse SST ± geçirilir.
- Seyreltilmemiş parçacık standardının ~ 1 mL'sini bir polistiren küvete doldurun ve kapakla kapatın.
- Demir sakkaroz çözeltisinin ölçümü
- 25 mL'lik hacimsel bir şişeye %2 m/V demir içeriğine sahip 0,5 mL'lik bir IS çözeltisinden pipet alın ve işarete kadar düşük parçacıklı suyla doldurun (ör. taze deiyonize edilmiş ve filtrelenmiş [gözenek boyutu 0,2 μm]); Bu çözelti 0.4 mg Fe / mL içerir.
NOT: Adım 1.6.1'deki numune hazırlama. Bu spesifik seyreltme ile metot geliştirme sırasında tespit edilmiş ve bu amaç için en uygun seyreltme olarak belirlenmiştir. - Ön temizlik için, polistiren küveti hazırlanan ölçüm çözeltisi ile yaklaşık 3/4 oranında doldurun, yavaşça döndürün ve ardından mümkün olduğunca tamamen boşaltın.
NOT: Küvetin alt kısmına (ölçüm bölgesi) dokunmayın ve küveti sallamayarak hava kabarcıklarından kaçının. - Ölçüm için, 1 mL ölçüm çözeltisinin pipetini küvetin içine koyun ve bir kapak takın.
- Hava kabarcıkları için küvetteki ölçüm solüsyonunu kontrol edin. Hava kabarcıkları varsa, küvete hafifçe dokunarak bunları çıkarın.
- 25 mL'lik hacimsel bir şişeye %2 m/V demir içeriğine sahip 0,5 mL'lik bir IS çözeltisinden pipet alın ve işarete kadar düşük parçacıklı suyla doldurun (ör. taze deiyonize edilmiş ve filtrelenmiş [gözenek boyutu 0,2 μm]); Bu çözelti 0.4 mg Fe / mL içerir.
- Ölçümün gerçekleştirilmesi
- Plastik küveti, ölçüm çözeltisi ile birlikte ok işareti öne bakacak şekilde cihaza yerleştirin ve kapağı kapatın.
- SÇP parametresini yükleyin (bkz. adım 1.4.1) ve başlangıç penceresine aşağıdaki verileri girin:
Örnek Adı: Toplu iş numarası - Ölçümü başlatın.
- Ölçümün bitiminden sonra, akustik sinyal çaldığında, ölçüm penceresini kapatın.
- Altı ayrı ölçümün ortalama değerini Ek Şekil S5'e göre hesaplayın. Ölçüm Dosyasının Kayıt Görünümü'nde tek tek ölçümleri işaretleyin, Ortalama Sonuç Oluştur'a sağ tıklayın, Örnek Adı altına ortalama değerin adını ekleyin ve Tamam'a tıklayarak onaylayın.
- Yazılımın listenin sonunda yeni bir kayıt oluşturmasını bekleyin ve girilen adı ve bu kayıttaki ortalama sonucu arayın.
- Raporu yazdırın (bkz. adım 1.1.3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Açıklanan yöntem, değişen koşullar altında test çözeltilerinin ölçümünü içeren ICH Q2 (R1) 20'ye göre doğrulanmıştır. Hassasiyet, Z-ortalama boyutu için sadece% 0.5 RSD iken, PDI için maksimum% 3.5 RSD hesaplandı. Farklı analistlerden ve günlerden elde edilen ortalama sonuçlar, Z-ortalama büyüklüğü için sadece% 0.4 ve PDI için% 1.5 oranında farklılık gösterdi. İstatistikler, iki analist tarafından farklı günlerde gerçekleştirilen 12 ölçümden hesaplanmıştır. Ne test konsantrasyonundaki %50-%200 aralığındaki değişiklikler ne de test çözeltilerinin soğutulmuş koşullarda 5 güne kadar saklanması nihai sonuç üzerinde etkili olmamıştır.
Analiz edilen parametreler
Z-ortalama boyut
Hidrodinamik çap, Z-ortalama parçacık boyutu olarak verilmiştir ve bunu belirleme yöntemi ISO 22412: 201717'de tanımlanmıştır. Z-ortalama boyutu, kümülatif ortalama olarak da bilinen bir parametredir. Z-ortalaması, tercih edilen DLS boyut parametresidir, çünkü Z-ortalamasının hesaplanması matematiksel olarak kararlıdır ve Z-ortalaması sonucu gürültüye karşı duyarsızdır. EMA ve FDA'ya göre, PDI ile birlikte Z-ortalama boyutu, nanoilaçların karakterizasyonu için önerilen değerlerdir15,16,21. Z-ortalama parçacık boyutu, yalnızca numune monomodal, küresel veya küresele yakın şekilliyse, monodispers ise ve uygun bir dispersantta hazırlanmışsa, diğer tekniklerle ölçülen boyutla karşılaştırılabilir. Bunun nedeni, Z-ortalaması ortalama partikül boyutunun numune hazırlamadaki küçük değişikliklere bile duyarlı olmasıdır. Z-ortalama parçacık boyutu hidrodinamik bir parametredir ve bu nedenle sadece bir dağılımdaki parçacıklar veya çözeltideki moleküller için geçerlidir.
Polidispersite indeksi
Bu endeks, korelasyon verilerine (kümülatif analiz) basit iki parametreli bir uyumdan hesaplanan bir sayıdır. Polidispersite İndeksi boyutsuzdur ve yüksek monodispers standartları dışında, 0.05'ten küçük değerlerin nadiren görüleceği şekilde ölçeklendirilmiştir. 0,7'den büyük değerler, numunenin çok geniş bir parçacık boyutu dağılımına sahip olduğunu ve muhtemelen DLS tekniği için uygun olmadığını gösterir. Çeşitli boyut dağıtım algoritmaları, bu iki uç nokta arasında kalan verilerle çalışabilir. Bu parametreler için hesaplamalar ISO standart belgesi 22412:201717'de tanımlanmıştır.
Yoğunluk/hacim/sayıya göre boyut dağılımı
Tipik boyut dağılım grafikleri (yoğunluk, hacim, sayı) Şekil 1'de gösterilmiştir. Sonuç grafikleri, 0.4 mg Fe / mL konsantrasyonunda bağımsız olarak hazırlanmış altı IS parti 605211 örneğini göstermektedir. Şekil 1'deki görselleştirme için, DLS yazılımından alınan ham veriler, daha fazla değişiklik yapılmadan istatistiksel yazılım ile çizilmiştir9. İkinci bir zirveden etkilenen yoğunluğa göre boyut dağılımı, Şekil 1A'da kötü bir sonucun bir örneği olarak verilmiştir. Şekil 2 , 5.000 nm'de ek bir sinyal gösteren düşük kaliteli verileri görüntüler.
Şekil 1: Boyut dağılımı . (A) yoğunluk, (B) hacim ve (C) sayı13. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Temsili düşük kaliteli veriler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Oda sıcaklığında 5 gün boyunca saklanan IS parti 0371022A'nın (0.4 mg Fe / mL) test çözeltisi, bazı ek parçacıkların (örneğin, toz veya yağış) göstergesi olan ~ 5.000 nm'de ek bir sinyal gösterdi. Buna göre, başlangıçta 0.130'da belirlenen PDI 0.184'e kaydırılırken, Z-ortalaması hala 11.99 nm'de (yayınlanmamış veriler) orijinal değere (yani 11.33) yakındı.
Hassasiyet, iki laboratuvar teknisyeni tarafından ayrı günlerde test edildi. 12 replikatın ortalama değeri, iki teknisyen için Z-ortalaması ve PDI için sırasıyla% 0.4'lük bir RSD ile% 0.4'lük bir RSD ile 11.32 nm ve 0.125 idi. Kabul kriterleri karşılandı (Z-ortalaması için NMT% 5, PDI için% 20 NMT) (yayınlanmamış veriler).
Analiz edilebilir parametrelerin karşılaştırılması
Temel parametrelerin (Z-ortalama ve polidispersite) hesaplanmasına ek olarak, DLS cihazının yazılımı, dedektör sinyalinin yoğunluğuna veya saçılma parçacıklarının hacmine (veya sayısına) göre ağırlıklandırılabilen boyut dağılımlarının hesaplanmasına da izin verir. Bu parametrelerin karşılaştırılmasının alaka düzeyi, Tablo 2'de özetlenen sonuçlarda açıktır. Sayıya göre boyut dağılımı, önerilen yoğunluğa dayalı Z-ortalamasından 2 faktöre kadar farklılık gösterirken, hacme göre boyut dağılımı ile sadece biraz daha düşük değerler hesaplanmıştır. Bununla birlikte, demir-karbonhidrat kompleks çözeltileri daha büyük parçacıklar veya agregalar içeriyorsa, yoğunluğa dayalı sonuç raporlamasının yanlış olabileceği belirtilmelidir13.
Tablo 1: DLS için sistem parametreleri. Kısaltmalar: RI = kırılma indisi; DLS = dinamik ışık saçılması13. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: IS tarafından partikül boyutu belirlemenin veri raporlama yaklaşımından nasıl etkilendiğine dair örnekler. Bu tablo Di Francesco ve Borchard13'ten uyarlanmıştır. Kısaltmalar: SD = standart sapma; RSD = bağıl standart sapma; PDI = polidispersite indeksi; IS = demir-sakaroz. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S1: Sistem çalışma adımları. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S2: Bir ölçüm dosyası oluşturma. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S3: Sistem uygunluk testi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S4: Yeni bir ölçüme başlama. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S5: Ölçümlerin hesaplanması. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DLS, ilaç geliştirme ve düzenleyici değerlendirmedeki uygulamalar için nanopartiküllerin boyut ve boyut dağılımının belirlenmesinde temel bir tahlil haline gelmiştir. DLS tekniklerindeki ilerlemelere rağmen, özellikle kolloidal çözeltilerdeki demir-karbonhidrat kompleksleri için geçerli olan seyreltici seçimi ve numune hazırlama ile ilgili metodolojik zorluklar hala mevcuttur. Daha da önemlisi, demir-karbonhidrat nanoilaçları için DLS yöntemleri biyolojik ortamda (örneğin, plazma) henüz kapsamlı bir şekilde çalışılmamıştır22. Bu nedenle, seyreltici seçimine bağlı olarak en iyi uygulama protokollerinin uyumlaştırılması için hala kritik bir ihtiyaç vardır. Seyrelticinin seçimi önemlidir, çünkü izotonik tuzlu su çözeltilerine karşı arıtılmış su kullanılması kolloidal süspansiyonun stabilitesini etkileyebilir16.
Ayrıca, demir-karbonhidrat komplekslerinin, karanlık, opak bir çözüme sahip olmanın zorluklarını hafifletmek için reçete yazma bilgi önerilerinin altında seyreltilmemesi gerektiğine de dikkat edilmelidir. Aşırı seyreltmeler biyolojik olarak ilgili değildir ve iyonik ekranlamadaki değişiklikler yoluyla kolloidal süspansiyonun stabilitesini etkileyebilir, bu da potansiyel çökelmeye ve yanlış sonuç raporlamasına neden olabilir. Bu yöntemin geliştirilmesi sırasında çeşitli seyreltmeler ve seyrelticiler (yayınlanmamış veriler) test edilmiş ve protokolün 1.6.1 adımında açıklanan numune hazırlığı, IS için en uygun seyreltme olarak belirlenmiş ve doğrulanmıştır. Demir-karbonhidrat komplekslerinin DLS analizi için çeşitli modifikasyonlar düşünülmelidir. Örneğin, test çözeltilerinin hazırlanması, herhangi bir yüksek hızlı ajitasyonun yokluğunda yapılmalıdır. Vorteks karıştırıcılarının kullanımından kaçınılmalıdır, çünkü bu demir-sakkaroz agregalarının oluşumuna neden olur. Test çözeltilerinin hazırlanması için, IS çözeltileri otomatik bir pipet ile suda nazikçe karıştırılır. Ek olarak, DLS analizi için numuneleri çalıştırırken, otomatik kalibrasyon özelliği kapatılmalıdır.
Demir-karbonhidrat nanopartikülleri için DLS analizinin birkaç doğal sınırlaması vardır. Işık saçılma açılarının ve Z-ortalama çıkışının doğası gereği, bildirilen hidrodinamik çaplar ölçüm çözeltisindeki daha büyük parçacıklara doğru önyargılıdır. Bu nedenle, parçacık boyutu abartılabilir ve parçacık boyutunun gerçek dağılımı hafife alınabilir13. Sonuç raporlama teknikleri, demir-karbonhidrat kompleks parçacıklarının ne kadar büyük olduğu ve deney koşulları altında toplanma potansiyeli bağlamında düşünülmelidir. Ayrıca, yoğunluk, hacim ve sayı ağırlıklı boyut dağılımlarının sonuçlarının, farklı üreticiler hesaplama için farklı algoritmalar kullandığından, aynı veya farklı üreticilerin farklı DLS birimleri arasında büyük farklılıklar gösterebileceği de dikkate alınmalıdır. Bu nedenle, ISO22412 hesaplama algoritması standartlaştırıldığı için yalnızca Z-ortalamasının ve polidispersitenin kullanılmasını önerir. Düzenleyici kurumlar ayrıca Z-ortalama boyut raporlamasını da tavsiye etmişlerdir16. Ayrıca, bu protokol diğer cihazlara uygulandığında küçük değişikliklerin (örneğin, yazılımın kullanımı, ölçüm prosedürü ve veri hazırlama) gerekli olacağı da belirtilmelidir.
DLS ile ilişkili zorlukların ışığında bile, bu teknik önceki analitik metodolojilerde önemli bir ilerlemeyi temsil eder ve demir-karbonhidrat komplekslerinin karakterizasyonuna zorlayıcı veriler ekler. Bilim adamları işbirlikçileri ve düzenleyici kurumlar tarafından onaylanmıştır16,18,19,21. DLS analizinin demir-karbonhidrat komplekslerine uygulanmasında gelecekteki çabalar, en önemlisi, biyoeşdeğerliğin sağlanması da dahil olmak üzere, ilaç geliştirme ve düzenleyici değerlendirmeye uygulamaları için protokollerin küresel uyumlaştırılmasına odaklanmalıdır. Genel olarak, burada açıklanan analitik protokol, parçacık boyutunun ve IS'nin dağılımının ölçülmesi için metodolojiyi standartlaştırmayı amaçlamaktadır ve IS'nin kalitesinin değerlendirilmesi için yararlı bir araç olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
M.B., E.P., M.W. ve A.B. Vifor Pharma'nın çalışanlarıdır. G.B., Vifor Pharma'nın danışmanıdır.
Acknowledgments
Hiç kimse
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | NA | equipped with Zetasizer software 7.12, Helium Neon laser (633 nm, max. 4 mW) and 173° backscattering geometry |
| Materials | |||
| Disposable plastic cuvettes | |||
| LLG-Disposable plastic cells | LLG labware | LLG-Küvetten, Makro, PS; Order number 9.406011 | |
| low-particle water | (The use of freshly deionized and filtered (pore size 0.2 μm) water is recommended). | ||
| Microlitre pipette | |||
| Venofer 100 mg/5 mL | Vifor Pharma | ||
| Volumetric flask 25 mL | |||
| Nanosphere | Thermo | 3020A | Particle Standard |
| Software | |||
| Origin Pro v.8.5 | Origin Lab Corporation |
References
- Auerbach, M., Gafter-Gvili, A., Macdougall, I. C. Intravenous iron: A framework for changing the management of iron deficiency. Lancet Haematology. 7 (4), e342-e350 (2020).
- Generic drugs: FDA should make public its plans to issue and revise guidance on nonbiological complex drugs. US Government Accountability Office. , Available from: https://www.gao.gov/products/gao-18-80 (2017).
- Klein, K., et al. The EU regulatory landscape of non-biological complex drugs (NBCDs) follow-on products: Observations and recommendations. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 133, 228-235 (2019).
- Astier, A., et al. How to select a nanosimilar. Annals of the New York Academy of Sciences. 1407 (1), 50-62 (2017).
- Rottembourg, J., Kadri, A., Leonard, E., Dansaert, A., Lafuma, A. Do two intravenous iron sucrose preparations have the same efficacy. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (10), 3262-3267 (2011).
- Aguera, M. L., et al. Efficiency of original versus generic intravenous iron formulations in patients on haemodialysis. PLoS One. 10 (8), e0135967 (2015).
- Alphandery, E. Iron oxide nanoparticles for therapeutic applications. Drug Discovery Today. 25 (1), 141-149 (2020).
- Arami, H., Khandhar, A., Liggitt, D., Krishnan, K. M. In vivo delivery, pharmacokinetics, biodistribution and toxicity of iron oxide nanoparticles. Chemical Society Reviews. 44 (23), 8576-8607 (2015).
- Nikravesh, N., et al. Factors influencing safety and efficacy of intravenous iron-carbohydrate nanomedicines: From production to clinical practice. Nanomedicine. 26, 102178 (2020).
- Pai, A. B., et al. In vitro and in vivo DFO-chelatable labile iron release profiles among commercially available intravenous iron nanoparticle formulations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 97, 17-23 (2018).
- Brandis, J. E. P., et al. Evaluation of the physicochemical properties of the iron nanoparticle drug products: Brand and generic sodium ferric gluconate. Molecular Pharmaceutics. 18 (4), 1544-1557 (2021).
- Di Francesco, T., Sublet, E., Borchard, G. Nanomedicines in clinical practice: Are colloidal iron sucrose ready-to-use intravenous solutions interchangeable. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 131, 69-74 (2019).
- Di Francesco, T., Borchard, G. A robust and easily reproducible protocol for the determination of size and size distribution of iron sucrose using dynamic light scattering. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 152, 89-93 (2018).
- The Center for Research on Complex Generics. US Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/drugs/guidance-compliance-regulatory-information/center-research-complex-generics (2021).
- Drug products, including biological products, that contain nanomaterials - Guidance for industry. Center for Drug Evaluation and Research. FDA-2017-D-0759. US Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/drug-products-including-biological-products-contain-nanomaterials-guidance-industry (2022).
- US Food and Drug Administration. Draft guidance on ferric oxyhydroxide. US Food and Drug Administration. , (2021).
- ISO 22412:2017. Particle size analysis - Dynamic light scattering. International Organization for Standardization. , Available from: http://www.iso.org/standard/65410.html (2017).
- Zou, P., Tyner, K., Raw, A., Lee, S. Physicochemical characterization of iron carbohydrate colloid drug products. The AAPS Journal. 19 (5), 1359-1376 (2017).
- D'Mello, S. R., et al. The evolving landscape of drug products containing nanomaterials in the United States. Nature Nanotechnology. 12 (6), 523-529 (2017).
- Q2 (R1) Validation of analytical procedures: Text and methodology guidance for industry. FDA-2017-D-6821. US Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/q2r1-validation-analytical-procedures-text-and-methodology-guidance-industry (2005).
- Committee for Medicinal Products for Human Use. Reflection paper on the data requirements for intravenous iron-based nano-colloidal products developed with reference to an innovator medicinal product. European Medicines Agency. , Available from: https://www.ema.europe.eu/en/documents/scientific-guideline/reflection-paper-data-requirements-intravenous-iron-based-nano-colloidal-products-developed_en.pdf (2015).
- Fischer, K., Schmidt, M. Pitfalls and novel applications of particle sizing by dynamic light scattering. Biomaterials. 98, 79-91 (2016).
- Caputo, F., et al. Asymmetric-flow field-flow fractionation for measuring particle size, drug loading and (in)stability of nanopharmaceuticals. The joint view of European Union Nanomedicine Characterization Laboratory and National Cancer Institute - Nanotechnology Characterization Laboratory. Journal of Chromatography A. 1635, 461767 (2021).
- Yusa, S. Chapter 6 - Polymer characterization. Polymer Science and Nanotechnology. Narain, R. , Elsevier. Amsterdam, the Netherlands. 105-124 (2020).
