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Medicine

Dynamische Lichtstreuanalyse zur Bestimmung der Partikelgröße von Eisen-Kohlenhydrat-Komplexen

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/63820
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 1, 1
1Vifor Pharma Group, Vifor Pharma Management Ltd, 2Section of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmaceutical Sciences of Western Switzerland (ISPSO), University of Geneva

Summary

Die dynamische Lichtstreuung (DLS) hat sich als geeigneter Assay zur Beurteilung der Partikelgröße und -verteilung von intravenös verabreichten Eisen-Kohlenhydrat-Komplexen herausgestellt. Die Protokolle sind jedoch nicht standardisiert und müssen für jeden analysierten Eisen-Kohlenhydrat-Komplex modifiziert werden. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Anwendung und Besonderheiten bei der Analyse von Eisensaccharose.

Abstract

Intravenös verabreichte Eisen-Kohlenhydrat-Nanopartikel-Komplexe werden häufig zur Behandlung von Eisenmangel eingesetzt. Diese Klasse umfasst mehrere strukturell heterogene Nanopartikelkomplexe, die eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber den Bedingungen aufweisen, die für die verfügbaren Methoden zur physikalisch-chemischen Charakterisierung dieser Wirkstoffe erforderlich sind. Derzeit sind die kritischen Qualitätsmerkmale von Eisen-Kohlenhydrat-Komplexen noch nicht vollständig geklärt. Die dynamische Lichtstreuung (DLS) hat sich als grundlegende Methode zur Bestimmung der intakten Partikelgröße und -verteilung herausgestellt. Es bestehen jedoch noch Herausforderungen in Bezug auf die Standardisierung der Methoden zwischen den Laboratorien, spezifische Modifikationen, die für einzelne Eisen-Kohlenhydrat-Produkte erforderlich sind, und die Frage, wie die Größenverteilung am besten beschrieben werden kann. Wichtig ist, dass die verwendeten Verdünnungsmittel und Reihenverdünnungen standardisiert sein müssen. Die große Varianz der Ansätze für die Probenvorbereitung und die Datenübermittlung schränkt die Verwendung von DLS für den Vergleich von Eisen-Kohlenhydrat-Wirkstoffen ein. Im Folgenden beschreiben wir ein robustes und leicht reproduzierbares Protokoll zur Messung der Größe und Größenverteilung des Eisen-Kohlenhydrat-Komplexes Eisensaccharose unter Verwendung des Z-Durchschnitts und des Polydispersitätsindex.

Introduction

Eisensaccharose (IS) ist eine kolloidale Lösung, die aus Nanopartikeln besteht und aus einem Komplex aus einem mehrkernigen Eisenoxyhydroxidkern und Saccharose besteht. IS wird häufig zur Behandlung von Eisenmangel bei Patienten mit einer Vielzahl von Grunderkrankungen eingesetzt, die eine orale Eisensupplementierung nicht vertragen oder bei denen orales Eisen nicht wirksam ist1. IS gehört zur Arzneimittelklasse der komplexen Arzneimittel im Sinne der Food and Drug Administration (FDA), bei der es sich um eine Klasse von Arzneimitteln mit komplexer Chemie handelt, die den Biologika2 entspricht. Die regulatorische Bewertung komplexer Arzneimittel kann zusätzliche orthogonale physikalisch-chemische Methoden und/oder präklinische oder klinische Studien erfordern, um komplexe Folgearzneimittel genau vergleichen zu können 3,4. Dies ist wichtig, da mehrere Studien berichtet haben, dass die Verwendung von IS im Vergleich zu einem ES-Folgeprodukt nicht zu den gleichen klinischen Ergebnissen führt. Dies unterstreicht die Bedeutung der Verwendung neuartiger und orthogonaler Charakterisierungstechniken, die geeignet sind, Unterschiede in den physikalisch-chemischen Eigenschaften zwischen IS-Produkten zu erkennen 5,6.

Die genaue Aufklärung der Größe und Größenverteilung von IS ist von klinischer Bedeutung, da die Partikelgröße ein wichtiger Einflussfaktor für die Geschwindigkeit und das Ausmaß der Opsonisierung ist - der erste kritische Schritt in der Bioverteilung dieser komplexen Wirkstoffe 7,8. Selbst geringfügige Variationen in der Partikelgröße und Partikelgrößenverteilung wurden mit Veränderungen des pharmakokinetischen Profils von Eisenoxid-Nanopartikelkomplexen in Verbindung gebracht 9,10. Eine kürzlich von Brandis et al. durchgeführte Studie zeigte, dass sich die mit DLS gemessene Partikelgröße signifikant unterschied (14,9 nm ± 0,1 nm vs. 10,1 nm ± 0,1 nm, p < 0,001), wenn ein in der Referenzliste aufgeführtes Medikament und ein generisches Natriumeisengluconatprodukt verglichen wurden11. Die gleichbleibende Qualität, Sicherheit und Wirksamkeit von Eisen-Kohlenhydrat-Produkten von Charge zu Charge hängt vollständig vom Scale-up des Herstellungsprozesses ab, und eine mögliche Produktionsabweichung muss sorgfältig abgewogen werden9. Der Herstellungsprozess kann zu Saccharoserückständen führen, die je nach Hersteller variierenkönnen 12. Jede Modifikation der Herstellungsprozessvariablen kann zu signifikanten Veränderungen des komplexen Endprodukts in Bezug auf die Struktur, die Komplexstabilität und die In-vivo-Disposition führen9.

Um die Konsistenz des Arzneimittels zu beurteilen und das In-vivo-Verhalten des Arzneimittels vorherzusagen, sind moderne orthogonale Analysemethoden erforderlich, um die physikalisch-chemischen Eigenschaften komplexer Nanoarzneimittel zu bestimmen. Es fehlt jedoch an einer Standardisierung der Methoden, was zu einem hohen Grad an Ringversuchen bei der Ergebnisberichterstattung führen kann13. Trotz der Anerkennung dieser Herausforderungen durch die globalen Regulierungsbehörden und die wissenschaftliche Gemeinschaft14 sind die meisten physikalisch-chemischen Eigenschaften von IS nach wie vor unzureichend definiert, und die vollständige Palette kritischer Qualitätsmerkmale im Zusammenhang mit den verfügbaren regulatorischen Leitfäden wurde nicht definiert15. Die von der FDA herausgegebenen produktspezifischen Leitliniendokumente für Eisen-Kohlenhydrat-Komplexe schlagen DLS als Verfahren zur Bewertung der Größe und Größenverteilung von Folgeprodukten vor16,17.

Mehrere Veröffentlichungen haben etablierte DLS-Protokolle zur Bestimmung der IS-Nanopartikeldimensionen13,18 detailliert beschrieben. Da sich jedoch die Probenvorbereitung, die Verfahrensbedingungen, die Instrumentierung und die Parameter für die Geräteeinstellung bei den veröffentlichten Methoden unterscheiden, können die DLS-Ergebnisse nicht direkt verglichen werden, da es keine standardisierte Methode zur Interpretation der Ergebnisse gibt13,18. Die Vielfalt der Methoden und Ansätze für die Datenberichterstattung schränkt die angemessene Bewertung dieser Merkmale zu Vergleichszwecken ein19. Wichtig ist, dass viele der DLS-Protokolle, die zuvor zur Bewertung von IS veröffentlicht wurden, den Effekt der Diffusion von Saccharose in der Suspension aufgrund des Vorhandenseins von freier Saccharose nicht berücksichtigen, die nachweislich die im Z-Durchschnitt berechneten hydrodynamischen Radien der Nanopartikel in kolloidalen Lösungen fälschlicherweise erhöht13,18. Das vorliegende Protokoll zielt darauf ab, die Methodik für die Messung der Partikelgröße und -verteilung von IS zu standardisieren. Zu diesem Zweck wurde die Methode entwickelt und validiert.

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Protocol

1. Bedienung der Maschine

  1. Inbetriebnahme der Maschine und Software
    HINWEIS: Die ergänzende Abbildung S1A-D beschreibt die Schritte zum Starten der Maschine und der Software.
    1. Schalten Sie das Gerät mindestens 30 Minuten vor Beginn der Messungen ein und starten Sie dann den PC.
    2. Doppelklicken Sie auf das Software-Symbol des Geräts , um das Programm zu starten.
    3. Geben Sie den Benutzernamen und das Passwort in das Anmeldefenster ein. Stellen Sie sicher, dass jeder Benutzer über ein eigenes Konto verfügt.
    4. Warten Sie, bis alle drei schwarzen Balken in der unteren rechten Ecke grün leuchten und damit anzeigen, dass das Gerät betriebsbereit ist.
    5. Bei längerer Inaktivität, wenn der Benutzer automatisch abgemeldet wird, klicken Sie unter Sicherheit auf Anmelden und geben Sie das Kennwort erneut ein.
  2. Erstellen einer Messdatei
    HINWEIS: Zu Beginn eines jeden Messtages wird eine neue Messdatei erstellt. Alle Messungen werden aufgelistet und in der Messdatei gespeichert. Einzelheiten zu diesem Verfahren finden Sie in der ergänzenden Abbildung S2A-B.
    1. Erstellen Sie eine neue Messdatei, indem Sie auf Datei | Neu | Messdatei. Wählen Sie im geöffneten Fenster den Speicherort aus und benennen Sie die Messdatei. Bestätigen Sie die Angaben mit einem Klick auf Speichern.
    2. Um eine Datei zu öffnen, klicken Sie auf Datei | Geöffnet | Messdatei. Wählen Sie im geöffneten Fenster die Messdatei aus, bestätigen Sie die Details mit einem Klick auf Öffnen, wählen Sie den Dateinamen aus und klicken Sie auf Speichern.
  3. Drucken der Ergebnisse
    1. Drucken oder speichern Sie die Ergebnisse der Systemeignungsprüfung (SST) (siehe Schritt 1.5) und den Mittelwert der Probenmessung gemäß Ergänzungsbild S3.
    2. Markieren Sie die Messung(en) in der Datensatzansicht der Messdatei.
    3. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Stapeldruck und warten Sie, bis sich ein weiteres kleines Fenster öffnet.
    4. Wählen Sie aus den Auswahlmöglichkeiten den PSD-Intensitätsbericht aus und bestätigen Sie ihn mit OK.
  4. Allgemeiner Ablauf zum Starten einer Messung
    HINWEIS: Das Verfahren zum Starten einer Messung ist in der ergänzenden Abbildung S4A-D beschrieben. Folgen Sie dem unten beschriebenen Pfad für die erforderliche Unit-Parameterdatei (als SOP bezeichnet):
    1. Wählen Sie die gewünschte SOP aus der Dropdown-Liste aus. Da die zuletzt verwendeten SOPs in der Liste angezeigt werden, wählen Sie, wenn eine ältere SOP benötigt wird, Nach SOP suchen und bestätigen Sie mit einem Klick auf den grünen Pfeil. Sobald der Speicherort der SOPs geöffnet ist, fahren Sie mit Schritt 1.4.2 fort.
      HINWEIS: Einzelheiten zu den wichtigen Systemparametern, die für Eisensaccharose spezifisch sind (z. B. Äquilibrierungszeit eines Dämpfungsglieds), finden Sie in Tabelle 1.
    2. Nehmen Sie im geöffneten Fenster unter Probenname und Notizen die erforderlichen Eingaben vor. Bestätigen Sie mit OK und warten Sie, bis sich das Messfenster automatisch öffnet.
    3. Starten Sie die Messung, indem Sie auf die grüne Schaltfläche Start klicken.
    4. Sobald am Ende der Messung ein akustisches Signal ertönt, schließen Sie das Messfenster .
  5. Messung der Systemeignungsprüfung (SST)
    Anmerkungen: Berühren Sie nicht den unteren Teil der Küvette (Messzone). Messen Sie zu Beginn und am Ende der Sequenz den 20-nm-Partikelstandard.
    1. Füllen Sie ~1 ml des unverdünnten Partikelstandards in eine Styroporküvette und verschließen Sie ihn mit dem Deckel.
      HINWEIS: Der in Schritt 1.5.1 hergestellte verdünnte Standard kann 1 Monat lang verwendet werden.
    2. Schließen Sie nach dem Befüllen die Küvette und prüfen Sie, ob Luftblasen vorhanden sind. Entfernen Sie Luftblasen, indem Sie leicht auf die Küvette klopfen.
    3. Setzen Sie die Küvette mit der Pfeilmarkierung nach vorne in die Zellenhalterung des Geräts ein und schließen Sie den Messkammerdeckel.
    4. Laden Sie den Einheitenparameter SOP und geben Sie im Startfenster folgende Daten ein:
      Name der Probe: SST 20 nm Partikelstandard
      Fügen Sie dann eine Notiz hinzu: Identifikationsnummer und Ablaufdatum der Norm
    5. Starten Sie die Messung.
    6. Schließen Sie nach Beendigung der Messung, wenn das akustische Signal ertönt, das Messfenster.
    7. Drucken Sie den Bericht aus (siehe Punkt 1.1.3).
      HINWEIS: Der SST ist bestanden, wenn der Z-Mittelwert der Partikelgröße dem Wert des Analysezertifikats ± 10 % entspricht.
  6. Messung der Eisen-Saccharose-Lösung
    1. 0,5 ml einer IS-Lösung mit einem Eisengehalt von 2 % m/V werden in einen 25-ml-Messkolben pipettiert und bis zur Marke mit partikelarmem Wasser (z. B. frisch deionisiert und filtriert [Porengröße 0,2 μm]) aufgefüllt; Diese Lösung enthält 0,4 mg Fe/ml.
      HINWEIS: Die Probenvorbereitung in Schritt 1.6.1. Dabei wurde bei der Methodenentwicklung eine spezifische Verdünnung festgelegt, die als optimale Verdünnung für diesen Zweck ermittelt wurde.
    2. Zur Vorreinigung die Styroporküvette ca. 3/4 mit der vorbereiteten Messlösung füllen, vorsichtig schwenken und anschließend möglichst vollständig entleeren.
      Anmerkungen: Berühren Sie nicht den unteren Teil der Küvette (Messzone) und vermeiden Sie Luftblasen, indem Sie die Küvette nicht schütteln.
    3. Für die Messung pipettieren Sie 1 ml der Messlösung in die Küvette und setzen Sie einen Deckel auf.
    4. Überprüfen Sie die Messlösung in der Küvette auf Luftblasen. Wenn Luftblasen vorhanden sind, entfernen Sie diese, indem Sie leicht auf die Küvette klopfen.
  7. Durchführung der Messung
    1. Setzen Sie die Kunststoffküvette mit der Messlösung mit der Pfeilmarkierung nach vorne in das Gerät ein und schließen Sie den Deckel.
    2. Laden Sie den Parameter SOP (siehe Schritt 1.4.1) und geben Sie im Startfenster folgende Daten ein:
      Probenname: Chargennummer
    3. Starten Sie die Messung.
    4. Schließen Sie nach dem Ende der Messung, wenn das akustische Signal ertönt, das Messfenster .
    5. Berechnen Sie den Mittelwert der sechs Einzelmessungen gemäß Ergänzungsbild S5. Markieren Sie die einzelnen Messungen in der Datensatzansicht der Messdatei, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Mittelwert erstellen, fügen Sie unter Probenname den Namen des Mittelwertes hinzu und bestätigen Sie mit OK.
    6. Warten Sie, bis die Software am Ende der Liste einen neuen Datensatz erstellt hat, und suchen Sie nach dem eingegebenen Namen und dem gemittelten Ergebnis in diesem Datensatz.
    7. Drucken Sie den Bericht aus (siehe Schritt 1.1.3).

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Representative Results

Die beschriebene Methode wurde nach ICH Q2(R1)20 validiert, was die Messung von Testlösungen unter unterschiedlichen Bedingungen beinhaltete. Die Genauigkeit betrug nur 0,5 % RSD für die Z-Durchschnittsgröße, während für die PDI ein Maximum von 3,5 % RSD berechnet wurde. Die durchschnittlichen Ergebnisse verschiedener Analysten und Tage unterschieden sich nur um 0,4 % für die Größe des Z-Durchschnitts und um 1,5 % für den PDI. Die Statistiken wurden aus 12 Messungen berechnet, die von zwei Analysten an unterschiedlichen Tagen durchgeführt wurden. Weder Änderungen der Testkonzentration im Bereich von 50%-200% noch die Lagerung der Testlösungen für bis zu 5 Tage unter gekühlten Bedingungen hatten einen Einfluss auf das Endergebnis.

Analysierte Parameter
Größe des Z-Durchschnitts
Der hydrodynamische Durchmesser wird als Z-durchschnittliche Partikelgröße angegeben, und das Verfahren zu seiner Bestimmung ist in ISO 22412:201717 definiert. Die Z-Durchschnittsgröße ist ein Parameter, der auch als kumulanter Mittelwert bezeichnet wird. Der Z-Durchschnitt ist der bevorzugte DLS-Größenparameter, da die Berechnung des Z-Durchschnitts mathematisch stabil ist und das Z-Durchschnittsergebnis unempfindlich gegenüber Rauschen ist. Laut EMA und FDA sind die Z-Durchschnittsgröße zusammen mit dem PDI die empfohlenen Werte für die Charakterisierung von Nanoarzneimitteln15,16,21. Die Z-durchschnittliche Partikelgröße ist nur dann mit der mit anderen Techniken gemessenen Größe vergleichbar, wenn die Probe monomodal, kugelförmig oder nahezu kugelförmig ist, monodispers ist und in einem geeigneten Dispergiermittel hergestellt wird. Dies liegt daran, dass die mittlere Partikelgröße im Z-Mittel empfindlich auf selbst kleine Änderungen in der Probenvorbereitung reagiert. Der Z-Mittelwert der Partikelgröße ist ein hydrodynamischer Parameter und gilt daher nur für Partikel in einer Dispersion oder für Moleküle in Lösung.

Polydispersitätsindex
Bei diesem Index handelt es sich um eine Zahl, die aus einer einfachen Anpassung von zwei Parametern an die Korrelationsdaten (die kumulante Analyse) berechnet wird. Der Polydispersitätsindex ist dimensionslos und so skaliert, dass Werte kleiner als 0,05 selten zu sehen sind, außer bei stark monodispersen Standards. Werte größer als 0,7 weisen darauf hin, dass die Probe eine sehr breite Partikelgrößenverteilung aufweist und wahrscheinlich nicht für die DLS-Technik geeignet ist. Verschiedene Größenverteilungsalgorithmen können mit Daten arbeiten, die zwischen diesen beiden Extremen liegen. Die Berechnungen für diese Parameter sind in der ISO-Norm 22412:201717 definiert.

Größenverteilung nach Intensität/Volumen/Anzahl
Typische Größenverteilungsdiagramme (Intensität, Volumen, Anzahl) sind in Abbildung 1 dargestellt. Die Ergebnisdiagramme zeigen sechs unabhängig voneinander aufbereitete Proben von IS-Chargen-605211 in einer Konzentration von 0,4 mg Fe/ml. Für die Visualisierung in Abbildung 1 wurden die aus der DLS-Software entnommenen Rohdaten ohne weitere Modifikation mit einer Statistiksoftware9 aufgetragen. Eine Größenverteilung nach Intensität, die von einem zweiten Peak beeinflusst wird, ist als Beispiel für ein schlechtes Ergebnis in Abbildung 1A dargestellt. Abbildung 2 zeigt Daten von schlechter Qualität, die ein zusätzliches Signal bei 5.000 nm zeigen.

Figure 1
Abbildung 1: Größenverteilung: (A) Intensität, (B) Volumen und (C) Zahl13. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative Daten von schlechter Qualität. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Testlösung der IS-Charge 0371022A (0,4 mg Fe/ml), die 5 Tage bei Raumtemperatur gelagert wurde, zeigte ein zusätzliches Signal bei ~5.000 nm, was auf einige zusätzliche Partikel (z. B. Staub oder Niederschlag) hinweist. Dementsprechend wurde der ursprünglich bei 0,130 ermittelte PDI auf 0,184 verschoben, während der Z-Mittelwert mit 11,99 nm (unveröffentlichte Daten) immer noch nahe am ursprünglichen Wert (d. h. 11,33) lag.

Die Präzision wurde von zwei Laboranten an verschiedenen Tagen getestet. Der Mittelwert von 12 Wiederholungen betrug 11,32 nm mit einer RSD von 0,4 % und 0,125 mit einer RSD von 1,5 % für den Z-Durchschnitt bzw. PDI für die beiden Techniker. Die Akzeptanzkriterien wurden erfüllt (NMT 5% für den Z-Durchschnitt, NMT 20% für den PDI) (unveröffentlichte Daten).

Vergleich auswertbarer Parameter
Neben der Berechnung der grundlegenden Parameter - Z-Mittelwert und Polydispersität - ermöglicht die Software des DLS-Geräts auch die Berechnung von Größenverteilungen, die nach der Intensität des Detektorsignals oder dem Volumen (oder der Anzahl) der streuenden Partikel gewichtet werden können. Die Relevanz des Vergleichs dieser Parameter wird in den in Tabelle 2 dargestellten Ergebnissen deutlich. Während sich die Größenverteilung nach Anzahl um bis zu Faktor 2 von dem vorgeschlagenen intensitätsbasierten Z-Mittel unterschied, wurden durch die Größenverteilung nach Volumen nur geringfügig niedrigere Werte berechnet. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die intensitätsbasierte Ergebnisberichterstattung ungenau sein kann, wenn die Eisen-Kohlenhydrat-Komplexlösungen größere Partikel oder Aggregate enthalten13.

Tabelle 1: Systemparameter für das DLS. Abkürzungen: RI = Brechungsindex; DLS = dynamische Lichtstreuung13. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Beispiele dafür, wie die Partikelgrößenbestimmung mittels IS durch den Ansatz der Datenberichterstattung beeinflusst wird. Diese Tabelle ist eine Adaption von Di Francesco und Borchard13. Abkürzungen: SD = Standardabweichung; RSD = relative Standardabweichung; PDI = Polydispersitätsindex; IS = Eisen-Saccharose. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S1: Betriebsschritte des Systems. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S2: Erstellen einer Messdatei. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S3: Systemeignungsprüfung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S4: Starten einer neuen Messung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung S5: Berechnung der Maße. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

DLS hat sich zu einem grundlegenden Assay für die Bestimmung der Größe und Größenverteilung von Nanopartikeln für Anwendungen in der Arzneimittelentwicklung und regulatorischen Bewertung entwickelt. Trotz der Fortschritte in den DLS-Techniken bestehen nach wie vor methodische Herausforderungen bei der Auswahl des Verdünnungsmittels und der Probenvorbereitung, die insbesondere für Eisen-Kohlenhydrat-Komplexe in kolloidalen Lösungen relevant sind. Wichtig ist, dass DLS-Methoden für Eisen-Kohlenhydrat-Nanomedikamente im biologischen Milieu (z. B. im Plasma) noch nicht umfassend untersucht wurden22. Daher besteht nach wie vor ein kritischer Bedarf an der Harmonisierung von Best-Practice-Protokollen in Abhängigkeit von der Auswahl des Verdünnungsmittels. Die Auswahl des Verdünnungsmittels ist wichtig, da die Verwendung von gereinigtem Wasser im Vergleich zu isotonischen Kochsalzlösungen die Stabilität der kolloidalen Suspension beeinträchtigen kann16.

Es sollte auch beachtet werden, dass Eisen-Kohlenhydrat-Komplexe nicht unter den Empfehlungen der Verschreibungsinformationen verdünnt werden sollten, um die Herausforderungen einer dunklen, undurchsichtigen Lösung zu mildern. Übermäßige Verdünnungen sind nicht biorelevant und können die Stabilität der kolloidalen Suspension durch Änderungen der Ionenabschirmung beeinträchtigen, was zu potenzieller Ausfällung und ungenauer Ergebnisberichterstattung führen kann. Während der Entwicklung dieser Methode wurden verschiedene Verdünnungen und Verdünnungsmittel (unveröffentlichte Daten) getestet, und die in Schritt 1.6.1 des Protokolls beschriebene Probenvorbereitung wurde als optimale Verdünnung für IS bestimmt und validiert. Für die DLS-Analyse von Eisen-Kohlenhydrat-Komplexen müssen einige Modifikationen berücksichtigt werden. Zum Beispiel muss die Herstellung von Testlösungen ohne jegliche Art von Hochgeschwindigkeitsrührwerk durchgeführt werden. Der Einsatz von Wirbelmischern sollte vermieden werden, da dadurch Eisen-Saccharose-Aggregate entstehen. Für die Herstellung von Testlösungen werden IS-Lösungen mit einer automatischen Pipette schonend in Wasser gemischt. Darüber hinaus sollte beim Ausführen der Proben für die DLS-Analyse die automatische Kalibrierungsfunktion deaktiviert werden.

Es gibt mehrere inhärente Einschränkungen der DLS-Analyse für Eisen-Kohlenhydrat-Nanopartikel. Aufgrund der Beschaffenheit der Lichtstreuwinkel und der Z-Mittelwertleistung sind die berichteten hydrodynamischen Durchmesser zu größeren Partikeln in der Messlösung hin verzerrt. Daher kann die Partikelgröße überschätzt und die wahre Verteilung der Partikelgröße unterschätzt werden13. Die Techniken der Berichterstattung über die Ergebnisse sollten im Zusammenhang mit der Größe der Eisen-Kohlenhydrat-Komplexpartikel und dem Aggregationspotenzial unter den experimentellen Bedingungen betrachtet werden. Zu berücksichtigen ist auch, dass sich die Ergebnisse der intensitäts-, volumen- und zahlengewichteten Größenverteilungen zwischen verschiedenen DLS-Einheiten desselben oder unterschiedlicher Hersteller stark unterscheiden können, da verschiedene Hersteller unterschiedliche Algorithmen für die Berechnung verwenden. Daher empfiehlt ISO22412 nur die Verwendung des Z-Mittelwerts und der Polydispersität, da der Algorithmus für deren Berechnung standardisiert ist. Die Aufsichtsbehörden haben auch die Berichterstattung über die Z-Durchschnittsgrößeempfohlen 16. Es ist auch zu beachten, dass geringfügige Änderungen erforderlich sind (z. B. die Handhabung der Software, des Messverfahrens und der Datenaufbereitung), wenn dieses Protokoll auf andere Geräte angewendet wird.

Selbst angesichts der Herausforderungen, die mit DLS verbunden sind, stellt diese Technik einen bedeutenden Fortschritt gegenüber früheren Analysemethoden dar und liefert überzeugende Daten zur Charakterisierung von Eisen-Kohlenhydrat-Komplexen. Es wurde von Wissenschaftlern, Kollaborationen und Regulierungsbehörden unterstützt16,18,19,21. Zukünftige Anstrengungen zur Anwendung der DLS-Analyse auf Eisen-Kohlenhydrat-Komplexe sollten sich vor allem auf die globale Harmonisierung von Protokollen für ihre Anwendung in der Arzneimittelentwicklung und der regulatorischen Bewertung konzentrieren, einschließlich der Gewährleistung der Bioäquivalenz. Insgesamt zielt das hier beschriebene Analyseprotokoll darauf ab, die Methodik für die Messung der Partikelgröße und -verteilung von IS zu standardisieren und kann ein nützliches Werkzeug für die Bewertung der Qualität von IS sein.

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Disclosures

M.B., E.P., M.W. und A.B. sind Angestellte von Vifor Pharma. G.B. ist Beraterin bei Vifor Pharma.

Acknowledgments

Nichts

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Zetasizer Nano ZS Malvern NA equipped with Zetasizer software 7.12, Helium Neon laser (633 nm, max. 4 mW) and 173° backscattering geometry
Materials
Disposable plastic cuvettes 
LLG-Disposable plastic cells LLG labware LLG-Küvetten, Makro, PS; Order number 9.406011
low-particle water  (The use of freshly deionized and filtered (pore size 0.2 μm) water is recommended).
Microlitre pipette
Venofer 100 mg/5 mL Vifor Pharma
Volumetric flask 25 mL
Nanosphere Thermo 3020A Particle Standard
Software
Origin Pro v.8.5  Origin Lab Corporation

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References

  1. Auerbach, M., Gafter-Gvili, A., Macdougall, I. C. Intravenous iron: A framework for changing the management of iron deficiency. Lancet Haematology. 7 (4), e342-e350 (2020).
  2. Generic drugs: FDA should make public its plans to issue and revise guidance on nonbiological complex drugs. US Government Accountability Office. , Available from: https://www.gao.gov/products/gao-18-80 (2017).
  3. Klein, K., et al. The EU regulatory landscape of non-biological complex drugs (NBCDs) follow-on products: Observations and recommendations. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 133, 228-235 (2019).
  4. Astier, A., et al. How to select a nanosimilar. Annals of the New York Academy of Sciences. 1407 (1), 50-62 (2017).
  5. Rottembourg, J., Kadri, A., Leonard, E., Dansaert, A., Lafuma, A. Do two intravenous iron sucrose preparations have the same efficacy. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (10), 3262-3267 (2011).
  6. Aguera, M. L., et al. Efficiency of original versus generic intravenous iron formulations in patients on haemodialysis. PLoS One. 10 (8), e0135967 (2015).
  7. Alphandery, E. Iron oxide nanoparticles for therapeutic applications. Drug Discovery Today. 25 (1), 141-149 (2020).
  8. Arami, H., Khandhar, A., Liggitt, D., Krishnan, K. M. In vivo delivery, pharmacokinetics, biodistribution and toxicity of iron oxide nanoparticles. Chemical Society Reviews. 44 (23), 8576-8607 (2015).
  9. Nikravesh, N., et al. Factors influencing safety and efficacy of intravenous iron-carbohydrate nanomedicines: From production to clinical practice. Nanomedicine. 26, 102178 (2020).
  10. Pai, A. B., et al. In vitro and in vivo DFO-chelatable labile iron release profiles among commercially available intravenous iron nanoparticle formulations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 97, 17-23 (2018).
  11. Brandis, J. E. P., et al. Evaluation of the physicochemical properties of the iron nanoparticle drug products: Brand and generic sodium ferric gluconate. Molecular Pharmaceutics. 18 (4), 1544-1557 (2021).
  12. Di Francesco, T., Sublet, E., Borchard, G. Nanomedicines in clinical practice: Are colloidal iron sucrose ready-to-use intravenous solutions interchangeable. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 131, 69-74 (2019).
  13. Di Francesco, T., Borchard, G. A robust and easily reproducible protocol for the determination of size and size distribution of iron sucrose using dynamic light scattering. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 152, 89-93 (2018).
  14. The Center for Research on Complex Generics. US Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/drugs/guidance-compliance-regulatory-information/center-research-complex-generics (2021).
  15. Drug products, including biological products, that contain nanomaterials - Guidance for industry. Center for Drug Evaluation and Research. FDA-2017-D-0759. US Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/drug-products-including-biological-products-contain-nanomaterials-guidance-industry (2022).
  16. US Food and Drug Administration. Draft guidance on ferric oxyhydroxide. US Food and Drug Administration. , (2021).
  17. ISO 22412:2017. Particle size analysis - Dynamic light scattering. International Organization for Standardization. , Available from: http://www.iso.org/standard/65410.html (2017).
  18. Zou, P., Tyner, K., Raw, A., Lee, S. Physicochemical characterization of iron carbohydrate colloid drug products. The AAPS Journal. 19 (5), 1359-1376 (2017).
  19. D'Mello, S. R., et al. The evolving landscape of drug products containing nanomaterials in the United States. Nature Nanotechnology. 12 (6), 523-529 (2017).
  20. Q2 (R1) Validation of analytical procedures: Text and methodology guidance for industry. FDA-2017-D-6821. US Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/q2r1-validation-analytical-procedures-text-and-methodology-guidance-industry (2005).
  21. Committee for Medicinal Products for Human Use. Reflection paper on the data requirements for intravenous iron-based nano-colloidal products developed with reference to an innovator medicinal product. European Medicines Agency. , Available from: https://www.ema.europe.eu/en/documents/scientific-guideline/reflection-paper-data-requirements-intravenous-iron-based-nano-colloidal-products-developed_en.pdf (2015).
  22. Fischer, K., Schmidt, M. Pitfalls and novel applications of particle sizing by dynamic light scattering. Biomaterials. 98, 79-91 (2016).
  23. Caputo, F., et al. Asymmetric-flow field-flow fractionation for measuring particle size, drug loading and (in)stability of nanopharmaceuticals. The joint view of European Union Nanomedicine Characterization Laboratory and National Cancer Institute - Nanotechnology Characterization Laboratory. Journal of Chromatography A. 1635, 461767 (2021).
  24. Yusa, S. Chapter 6 - Polymer characterization. Polymer Science and Nanotechnology. Narain, R. , Elsevier. Amsterdam, the Netherlands. 105-124 (2020).

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Burgert, M., Marques, C. B.,… More

Burgert, M., Marques, C. B., Borchard, G., Philipp, E., Wilhelm, M., Alston, A., Digigow, R. Dynamic Light Scattering Analysis for the Determination of the Particle Size of Iron-Carbohydrate Complexes. J. Vis. Exp. (197), e63820, doi:10.3791/63820 (2023).

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