Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

ניתוח פיזור אור דינמי לקביעת גודל החלקיקים של קומפלקסים ברזל-פחמימות

Published: July 7, 2023 doi: 10.3791/63820
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 1, 1
1Vifor Pharma Group, Vifor Pharma Management Ltd, 2Section of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmaceutical Sciences of Western Switzerland (ISPSO), University of Geneva

Summary

פיזור אור דינמי (DLS) התגלה כבדיקה מתאימה להערכת גודל החלקיקים והתפלגותם של קומפלקסים של ברזל-פחמימות הניתנות תוך ורידי. עם זאת, הפרוטוקולים חסרים סטנדרטיזציה ויש לשנות אותם עבור כל קומפלקס ברזל-פחמימות שנותחו. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את היישום ואת השיקולים המיוחדים לניתוח סוכרוז ברזל.

Abstract

קומפלקסים של ננו-חלקיקי ברזל-פחמימות הניתנים תוך ורידי נמצאים בשימוש נרחב לטיפול במחסור בברזל. מחלקה זו כוללת מספר קומפלקסים הטרוגניים של ננו-חלקיקים מבחינה מבנית, המציגים רגישות משתנה לתנאים הדרושים למתודולוגיות הזמינות לאפיון פיסיקוכימי של חומרים אלה. נכון לעכשיו, תכונות האיכות הקריטיות של מתחמי ברזל-פחמימות לא הוקמו במלואם. פיזור אור דינמי (DLS) התגלה כשיטה בסיסית לקביעת גודל ופיזור חלקיקים שלמים. עם זאת, עדיין נותרו אתגרים בנוגע לסטנדרטיזציה של מתודולוגיות במעבדות, שינויים ספציפיים הנדרשים עבור מוצרי ברזל-פחמימות בודדים, וכיצד ניתן לתאר בצורה הטובה ביותר את חלוקת הגודל. חשוב לציין, המדללים והדילולים הסדרתיים המשמשים חייבים להיות סטנדרטיים. השונות הרבה בגישות להכנת דגימות ודיווח נתונים מגבילה את השימוש ב-DLS להשוואה בין סוכני ברזל-פחמימות. במאמר זה, אנו מפרטים פרוטוקול חזק וקל לשחזור למדידת התפלגות הגודל והגודל של קומפלקס ברזל-פחמימות, סוכרוז ברזל, באמצעות מדד Z-average ו- polydispersity.

Introduction

סוכרוז ברזל (IS) הוא תמיסה קולואידית המורכבת מננו-חלקיקים המורכבים מקומפלקס של ליבת ברזל-אוקסיהידרוקסיד רב-גרעינית וסוכרוז. IS נמצא בשימוש נרחב לטיפול במחסור בברזל בקרב חולים עם מגוון רחב של מחלות רקע שאינם סובלים תוספי ברזל דרך הפה או שעבורם ברזל פומי אינו יעיל1. IS שייך לקבוצת התרופות של תרופות מורכבות כפי שהוגדרה על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA), שהיא קבוצה של תרופות עם כימיה מורכבת התואמת ביולוגים2. הערכה רגולטורית של מוצרי תרופות מורכבים עשויה לדרוש שיטות פיסיקוכימיות אורתוגונליות נוספות ו / או מחקרים פרה-קליניים או קליניים כדי להשוות במדויק תרופות מורכבות המשך 3,4. זה חשוב מכיוון שמספר מחקרים דיווחו כי השימוש ב- IS לעומת מוצר המשך של IS אינו מניב את אותן תוצאות קליניות. זה מדגיש את הקריטיות של השימוש בטכניקות אפיון חדשניות ואורתוגונליות המתאימות לאיתור הבדלים בתכונות הפיזיקוכימיות בין מוצרי IS 5,6.

להבהרה מדויקת של התפלגות הגודל והגודל של IS יש חשיבות קלינית, שכן גודל החלקיקים הוא גורם משפיע מרכזי על קצב והיקף האופוזוניזציה - הצעד הקריטי הראשון בהפצה הביולוגית של תרופות מורכבות אלה 7,8. אפילו שינויים קלים בגודל החלקיקים ובהתפלגות גודל החלקיקים היו קשורים לשינויים בפרופיל הפרמקוקינטי של קומפלקסים של ננו-חלקיקים של תחמוצת ברזל 9,10. מחקר שנערך לאחרונה על ידי Brandis et al. הראה כי גודל החלקיקים שנמדד על ידי DLS היה שונה באופן משמעותי (14.9 ננומטר ± 0.1 ננומטר לעומת 10.1 ננומטר ± 0.1 ננומטר, p < 0.001) כאשר השוו בין תרופה רשומה ייחוס לבין מוצר נתרן ברזל גלוקונאט גנרי, בהתאמה11. האיכות, הבטיחות והיעילות העקביות של מוצרי ברזל-פחמימות מאצווה לאצווה תלויות לחלוטין בהרחבת תהליך הייצור, ויש לשקול בזהירות סחף ייצור פוטנציאלי9. תהליך הייצור עשוי לגרום לשאריות סוכרוז, וזה ישתנה בהתאם ליצרן12. כל שינוי במשתני תהליך הייצור יכול להוביל לשינויים משמעותיים במוצר התרופה המורכב הסופי מבחינת המבנה, יציבות מורכבת ודיספוזיציה in vivo 9.

כדי להעריך את עקביות התרופה ולחזות את התנהגות in vivo של התרופה, נדרשות מתודולוגיות אנליטיות אורתוגונליות עכשוויות כדי לקבוע את התכונות הפיזיקוכימיות של ננו-תרופות מורכבות. עם זאת, קיים חוסר סטנדרטיזציה של מתודולוגיות, אשר יכול לגרום לרמה גבוהה של שונות בין-מעבדתית בדיווח התוצאות13. למרות ההכרה באתגרים אלה על ידי רשויות רגולטוריות גלובליות והקהילה המדעית14, רוב המאפיינים הפיזיקוכימיים של IS עדיין מוגדרים בצורה גרועה, וההשלמה המלאה של תכונות איכות קריטיות בהקשר של מסמכי הנחיות רגולטוריות זמינות לא הוגדרה15. טיוטת מסמכי ההנחיות הספציפיים למוצר שהונפקו על ידי ה- FDA עבור קומפלקסים של ברזל-פחמימות מציעה DLS כהליך להערכת התפלגות הגודל והגודל של מוצרי המשך16,17.

מספר פרסומים פירטו פרוטוקולי DLS מבוססים לקביעת מידות ננו-חלקיקיםשל IS 13,18. עם זאת, מכיוון שהפרמטרים של הכנת הדגימה, תנאי הפרוצדורה, המכשור והגדרת המכשור שונים בין השיטות שפורסמו, לא ניתן להשוות ישירות את תוצאות DLS בהיעדר שיטה סטנדרטית לפרש את התוצאות13,18. הגיוון במתודולוגיות ובגישות לדיווח נתונים מגביל את ההערכה המתאימה של מאפיינים אלה למטרות השוואתיות19. חשוב לציין, רבים מהפרוטוקולים של DLS שפורסמו בעבר כדי להעריך את IS אינם לוקחים בחשבון את ההשפעה של דיפוזיה של סוכרוז בתרחיף עקב נוכחות של סוכרוז חופשי, אשר הוכח כמעלה באופן מזויף את הרדיוסים ההידרודינמיים המחושבים על ידי ממוצע Z של ננו-חלקיקים בתמיסות קולואידיות13,18. הפרוטוקול הנוכחי נועד לתקנן את המתודולוגיה למדידת גודל החלקיקים והתפלגותם של IS. השיטה פותחה ואומתה למטרה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הפעלת המכונה

  1. הפעלת המכונה והתוכנה
    הערה: איור משלים S1A-D מתאר את השלבים להפעלת המחשב והתוכנה.
    1. הפעל את המכשיר לפחות 30 דקות לפני תחילת המדידות ולאחר מכן הפעל את המחשב.
    2. לחץ פעמיים על סמל תוכנת המכשיר כדי להפעיל את התוכנית.
    3. הזן את שם המשתמש והסיסמה בחלון ההתחברות. ודא שלכל משתמש יש חשבון משלו.
    4. המתן עד שכל שלושת הפסים השחורים בפינה הימנית התחתונה יאירו בירוק, כדי לציין שהיחידה מוכנה לפעולה.
    5. במקרה של תקופות ארוכות של חוסר פעילות, כאשר המשתמש מתנתק באופן אוטומטי, תחת אבטחה, לחץ על התחברות, והזן מחדש את הסיסמה.
  2. יצירת קובץ מדידה
    הערה: קובץ מדידה חדש נוצר בתחילת כל יום מדידה. כל המדידות רשומות ומאוחסנות בקובץ המדידות. לפרטים על הליך זה, ראו איור משלים S2A-B.
    1. צור קובץ מדידה חדש על ידי לחיצה על קובץ | חדש | קובץ מדידה. בחלון הפתוח, בחרו במיקום האחסון ותנו שם לקובץ המדידה. אשר את הפרטים על ידי לחיצה על שמור.
    2. כדי לפתוח קובץ, לחץ על קובץ | פתוח | קובץ מדידה. בחר את קובץ המדידה בחלון הפתוח, אשר את הפרטים על ידי לחיצה על פתח, בחר את שם הקובץ ולחץ על שמור.
  3. הדפסת התוצאות
    1. הדפס או שמור את תוצאות בדיקת התאמת המערכת (SST) (ראה שלב 1.5) ואת הערך הממוצע של מדידת הדגימה לפי איור משלים S3.
    2. סמן את המידות בתצוגת הרשומות של קובץ המדידה.
    3. לחץ לחיצה ימנית על הדפסת אצווה והמתן לפתיחת חלון קטן נוסף.
    4. בחרו את דוח עוצמת PSD מבין האפשרויות ואשרו אותו על ידי לחיצה על אישור.
  4. הליך כללי להתחלת מדידה
    הערה: ההליך להתחלת מדידה מתואר באיור משלים S4A-D. בצע את הנתיב המתואר להלן עבור קובץ פרמטר היחידה הנדרש (המכונה SOP):
    1. בחר את SOP הנדרש מהרשימה הנפתחת. מכיוון שה-SOPs האחרונים שהיו בשימוש מוצגים ברשימה, אם יש צורך ב-SOP ישן יותר, בחר Browse for SOP, ואשר על-ידי לחיצה על החץ הירוק. לאחר פתיחת מיקום האחסון של ה-SOPs, המשך לשלב 1.4.2.
      הערה: לפרטים על פרמטרי המערכת החשובים הספציפיים לסוכרוז ברזל (למשל, זמן שיווי משקל של מנחת), ראה טבלה 1.
    2. בחלון הפתוח, בצע את הערכים הדרושים תחת שם לדוגמה והערות. אשר על ידי לחיצה על אישור, והמתן עד שחלון המדידה ייפתח אוטומטית.
    3. התחל את המדידה על ידי לחיצה על לחצן התחל הירוק.
    4. ברגע שנשמע אות אקוסטי בסוף המדידה, סגור את חלון המדידה .
  5. מדידת בדיקת התאמה למערכת (SST)
    הערה: אין לגעת בחלק התחתון של הקובט (אזור המדידה). בתחילת הרצף ובסופו, מדדו את תקן החלקיקים של 20 ננומטר.
    1. ממלאים ~1 מ"ל של תקן החלקיקים הלא מדוללים בקובט פוליסטירן, וסוגרים עם המכסה.
      הערה: ניתן להשתמש בתקן המדולל שהוכן בשלב 1.5.1 למשך חודש אחד.
    2. לאחר המילוי, לסגור את cuvette, ולבדוק בועות אוויר. הסר בועות אוויר על ידי הקשה קלה על הקובטה.
    3. הניחו את הקובט במחזיק התא של המכשיר כשסימן החץ פונה קדימה, וסגרו את מכסה תא המדידה.
    4. טען את פרמטר היחידה SOP והזן את הנתונים הבאים בחלון ההתחלה:
      שם דוגמה: SST 20 ננומטר תקן חלקיקים
      לאחר מכן, הוסף הערה: מספר מזהה ותאריך תפוגה של התקן
    5. התחל את המדידה.
    6. לאחר סיום המדידה כאשר נשמע האות האקוסטי, סגור את חלון המדידה.
    7. הדפס את הדוח (ראה נקודה 1.1.3).
      הערה: SST מועבר אם גודל החלקיק Z-ממוצע מתאים לערך תעודת הניתוח ± 10%.
  6. מדידת תמיסת סוכרוז ברזל
    1. פיפטה 0.5 מ"ל של תמיסת IS עם תכולת ברזל של 2% m/V לתוך בקבוק נפח 25 מ"ל, ולמלא עד הסימן עם מים דלי חלקיקים (למשל deionized טרי מסונן [גודל נקבוביות 0.2 μm]); תמיסה זו מכילה 0.4 מ"ג Fe/mL.
      הערה: הכנת הדגימה בשלב 1.6.1. עם דילול ספציפי זה נקבע במהלך פיתוח השיטה, וזה נקבע כדילול האופטימלי למטרה זו.
    2. לניקוי ראשוני, מלאו את קוביית הפוליסטירן כ-3/4 מלאה בתמיסת המדידה המוכנה, ערבלו בעדינות ולאחר מכן רוקנו לחלוטין ככל האפשר.
      הערה: אין לגעת בחלק התחתון של הקובט (אזור המדידה), ולהימנע מבועות אוויר על ידי לא לנער את הקובט.
    3. לצורך המדידה, פיפטה 1 מ"ל של תמיסת המדידה לתוך הקובט, ולשים על מכסה.
    4. בדוק את פתרון המדידה בקובט עבור בועות אוויר. אם יש בועות אוויר, הסר אותן על ידי הקשה קלה על הקובט.
  7. ביצוע המדידה
    1. הניחו את קוביית הפלסטיק עם תמיסת המדידה במכשיר כשסימן החץ פונה קדימה, וסגרו את המכסה.
    2. טען את הפרמטר SOP (ראה שלב 1.4.1) והזן את הנתונים הבאים בחלון התחלה:
      שם מדגם: מספר אצווה
    3. התחל את המדידה.
    4. לאחר סיום המדידה, כאשר נשמע האות האקוסטי, סגור את חלון המדידה .
    5. חשב את הערך הממוצע של שש המדידות הנפרדות לפי איור משלים S5. סמן את המידות הבודדות בתצוגת הרשומות של קובץ המדידה, לחץ לחיצה ימנית על צור תוצאה ממוצעת, הוסף את שם הערך הממוצע תחת שם מדגם, ואשר על ידי לחיצה על אישור.
    6. המתן עד שהתוכנה תיצור רשומה חדשה בסוף הרשימה וחפש את השם שהוזן ואת התוצאה הממוצעת ברשומה זו.
    7. הדפס את הדוח (ראה שלב 1.1.3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השיטה שתוארה אומתה על פי ICH Q2(R1)20, שכללה מדידה של פתרונות בדיקה בתנאים משתנים. הדיוק היה רק 0.5% RSD עבור גודל ממוצע Z, בעוד מקסימום של 3.5% RSD חושב עבור PDI. התוצאות הממוצעות של אנליסטים שונים וימים שונים היו שונות רק ב-0.4% עבור הגודל הממוצע Z וב-1.5% עבור ה-PDI. הנתונים חושבו מתוך 12 מדידות שבוצעו על ידי שני אנליסטים בימים שונים. לא שינויים בריכוז הבדיקה בטווח של 50%-200% ולא אחסון תמיסות הבדיקה עד 5 ימים בתנאי קירור לא השפיעו על התוצאה הסופית.

פרמטרים מנותחים
גודל ממוצע Z
הקוטר ההידרודינמי ניתן כגודל החלקיק הממוצע Z, והשיטה לקביעה זו מוגדרת ב- ISO 22412:201717. גודל ממוצע Z הוא פרמטר הידוע גם בשם הממוצע המצטבר. ממוצע Z הוא הפרמטר המועדף על גודל DLS, מכיוון שהחישוב של ממוצע Z יציב מתמטית, והתוצאה של ממוצע Z אינה רגישה לרעש. על פי ה- EMA וה- FDA, גודל ממוצע Z יחד עם PDI הם הערכים המומלצים לאפיון ננו-תרופות15,16,21. גודל החלקיק הממוצע Z דומה לגודל הנמדד בטכניקות אחרות רק אם הדגימה היא מונומודאלית, כדורית או כמעט כדורית בצורתה, היא חד-מפוזרת, ומוכנה בפיזור מתאים. הסיבה לכך היא שגודל החלקיקים הממוצע Z רגיש אפילו לשינויים קטנים בהכנת הדגימה. גודל החלקיקים הממוצע Z הוא פרמטר הידרודינמי ולכן תקף רק לחלקיקים בפיזור או למולקולות בתמיסה.

מדד פיזור פולידיספוזי
מדד זה הוא מספר המחושב מהתאמה פשוטה של שני פרמטרים לנתוני המתאם (ניתוח מצטבר). מדד הפיזור הרב-ממדי הוא חסר ממד וקנה המידה שלו משתנה כך שערכים קטנים מ-0.05 נראים לעתים רחוקות, למעט בסטנדרטים חד-פיזוריים מאוד. ערכים גדולים מ-0.7 מצביעים על כך שלדגימה יש התפלגות גודל חלקיקים רחבה מאוד וסביר להניח שהיא אינה מתאימה לטכניקת DLS. אלגוריתמים שונים של התפלגות גדלים יכולים לתפקד עם נתונים שנופלים בין שני הקצוות האלה. החישובים עבור פרמטרים אלה מוגדרים במסמך תקן ISO 22412:201717.

התפלגות גודל לפי עוצמה/נפח/מספר
חלקות התפלגות גודל אופייניות (עוצמה, נפח, מספר) מתוארות באיור 1. תרשימי התוצאה מראים שש דגימות שהוכנו באופן עצמאי של 605211 אצווה של IS בריכוז של 0.4 מ"ג Fe/mL. לצורך ההדמיה באיור 1, הנתונים הגולמיים שנלקחו מתוכנת DLS שורטטו באמצעות תוכנה סטטיסטית ללא שינוי נוסף9. התפלגות גודל לפי עוצמה המושפעת משיא שני מוצגת כדוגמה לתוצאה רעה באיור 1A. איור 2 מציג נתונים באיכות ירודה המציגים אות נוסף ב-5,000 ננומטר.

Figure 1
איור 1: התפלגות גודל . (A) עוצמה, (B) נפח ו-(C) מספר13. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: נתונים מייצגים באיכות ירודה. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

תמיסת הבדיקה של אצווה 0371022A של IS (0.4 מ"ג Fe/mL), שאוחסנה במשך 5 ימים בטמפרטורת החדר, הראתה אות נוסף ב~5,000 ננומטר, מה שמעיד על כמה חלקיקים נוספים (למשל, אבק או משקעים). בהתאם לכך, ה-PDI שנקבע במקור על 0.130 הוסט ל-0.184, בעוד שממוצע Z עדיין היה קרוב לערך המקורי (כלומר, 11.33) ב-11.99 ננומטר (נתונים שלא פורסמו).

הדיוק נבדק על ידי שני טכנאי מעבדה בימים נפרדים. הערך הממוצע של 12 עותקים משוכפלים היה 11.32 ננומטר עם RSD של 0.4% ו-0.125 עם RSD של 1.5% עבור ממוצע Z ו-PDI, בהתאמה, עבור שני הטכנאים. תנאי הקבלה התקיימו (NMT 5% עבור ממוצע Z, NMT 20% עבור PDI) (נתונים שלא פורסמו).

השוואה בין פרמטרים הניתנים לניתוח
בנוסף לחישוב הפרמטרים הבסיסיים - ממוצע Z ו polydispersity - התוכנה של מכשיר DLS מאפשרת גם חישוב של התפלגות גודל שניתן לשקלל על פי עוצמת אות הגלאי או נפח (או מספר) של חלקיקים פיזור. הרלוונטיות של השוואת פרמטרים אלה ברורה בתוצאות המתוארות בטבלה 2. בעוד שהתפלגות הגודל לפי מספר הייתה שונה עד פי 2 מממוצע Z מבוסס העוצמה המוצע, רק ערכים נמוכים במעט חושבו על ידי התפלגות הגודל לפי נפח. יש לציין, עם זאת, כי דיווח תוצאות מבוסס עוצמה עשוי להיות לא מדויק אם תמיסות מורכבות ברזל-פחמימות מכילות חלקיקים גדולים יותר או אגרגטים13.

טבלה 1: פרמטרי מערכת עבור DLS. קיצורים: RI = אינדקס שבירה; DLS = פיזור אור דינמי13. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2: דוגמאות לאופן שבו קביעת גודל חלקיקים על-ידי IS מושפעת מגישת דיווח הנתונים. טבלה זו לקוחה מתוך Di Francesco and Borchard13. קיצורים: SD = סטיית תקן; RSD = סטיית תקן יחסית; PDI = אינדקס פיזור; IS = ברזל-סוכרוז. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

איור משלים S1: שלבי הפעלת המערכת. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S2: יצירת קובץ מדידה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S3: בדיקת התאמה למערכת. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S4: התחלת מדידה חדשה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

תרשים משלים S5: חישוב מידות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

DLS הפך למבחן בסיסי לקביעת התפלגות הגודל והגודל של ננו-חלקיקים עבור יישומים בפיתוח תרופות והערכה רגולטורית. למרות ההתקדמות בטכניקות DLS, עדיין קיימים אתגרים מתודולוגיים בנוגע לבחירת המדללים והכנת הדגימה, הרלוונטיים במיוחד עבור קומפלקסים של ברזל-פחמימות בתמיסות קולואידיות. חשוב לציין, שיטות DLS לננו-תרופות ברזל-פחמימות עדיין לא נחקרו בהרחבה בסביבה הביולוגית (למשל, הפלזמה)22. לכן, עדיין נותר צורך קריטי בהרמוניזציה של פרוטוקולים של שיטות עבודה מומלצות בהתאם לבחירה המדללת. בחירת המדלל חשובה, שכן שימוש במים מטוהרים לעומת תמיסות מלח איזוטוניות עלול להשפיע על יציבות המתלה הקולואידי16.

כמו כן יש לציין כי מתחמי ברזל-פחמימות לא צריך להיות מדולל מתחת להמלצות מידע מרשם במאמץ להקל על האתגרים של בעל פתרון כהה ואטום. דילול יתר אינו רלוונטי ביולוגית ויכול להשפיע על יציבות המתלה הקולואידי באמצעות שינויים במיגון יוני, מה שעלול להוביל למשקעים פוטנציאליים ולדיווח תוצאות לא מדויק. במהלך פיתוח שיטה זו נבדקו דילולים ודילולים שונים (נתונים שלא פורסמו), והכנת הדגימה המתוארת בשלב 1.6.1 של הפרוטוקול נקבעה ואומתה כדילול האופטימלי ל-IS. יש לשקול מספר שינויים עבור ניתוח DLS של מתחמי פחמימות ברזל. לדוגמה, הכנת פתרונות הבדיקה צריכה להתבצע בהיעדר כל סוג של תסיסה במהירות גבוהה. יש להימנע משימוש במערבלי מערבולות, שכן הדבר גורם ליצירת אגרגטים של סוכרוז ברזל. להכנת פתרונות בדיקה, פתרונות IS מעורבבים בעדינות במים עם פיפטה אוטומטית. בנוסף, בעת הפעלת הדגימות עבור ניתוח DLS, יש לבטל את תכונת הכיול האוטומטי.

ישנן מספר מגבלות מובנות של ניתוח DLS עבור חלקיקי ברזל-פחמימות. בשל אופי זוויות פיזור האור והפלט הממוצע Z, הקטרים ההידרודינמיים המדווחים מוטים לכיוון חלקיקים גדולים יותר בתמיסת המדידה. לפיכך, ניתן להעריך יתר על המידה את גודל החלקיק, ולהעריך בחסר את ההתפלגות האמיתית של גודל החלקיק13. יש לשקול טכניקות דיווח על תוצאות בהקשר של גודל חלקיקי הברזל-פחמימות המורכבות והפוטנציאל לצבירה בתנאי הניסוי. כמו כן, יש לקחת בחשבון כי התוצאות של התפלגות הגודל המשוקלל של העוצמה, הנפח והמספר עשויות להיות שונות מאוד בין יחידות DLS שונות מאותם יצרנים או מיצרנים שונים, שכן יצרנים שונים משתמשים באלגוריתמים שונים לצורך החישוב. לכן, ISO22412 ממליץ רק על השימוש בממוצע Z ו polydispersity, כמו האלגוריתם לחישוב שלהם הוא סטנדרטי. רשויות רגולטוריות המליצו גם על דיווח בגודל ממוצע Z16. כמו כן יש לציין כי יידרשו שינויים קלים (כגון טיפול בתוכנה, הליך מדידה והכנת נתונים) כאשר פרוטוקול זה מוחל על מכשירים אחרים.

גם לאור האתגרים הקשורים ל- DLS, טכניקה זו מייצגת התקדמות משמעותית על מתודולוגיות אנליטיות קודמות ומוסיפה נתונים משכנעים לאפיון קומפלקסים של ברזל-פחמימות. זה אושר על ידי מדענים משתפי פעולה וסוכנויות רגולטוריות16,18,19,21. מאמצים עתידיים ביישום ניתוח DLS על קומפלקסים של ברזל-פחמימות צריכים להתמקד בעיקר בהרמוניה גלובלית של פרוטוקולים ליישומם לפיתוח תרופות והערכה רגולטורית, כולל הבטחת שקילות ביולוגית. בסך הכל, הפרוטוקול האנליטי המתואר כאן נועד לתקנן את המתודולוגיה למדידת גודל החלקיקים והתפלגותם של IS ויכול להיות כלי שימושי להערכת איכות IS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

M.B., E.P., M.W. ו-A.B. הם עובדים של Vifor Pharma. ג.ב. היא יועצת בחברת Vifor Pharma.

Acknowledgments

ללא

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Zetasizer Nano ZS Malvern NA equipped with Zetasizer software 7.12, Helium Neon laser (633 nm, max. 4 mW) and 173° backscattering geometry
Materials
Disposable plastic cuvettes 
LLG-Disposable plastic cells LLG labware LLG-Küvetten, Makro, PS; Order number 9.406011
low-particle water  (The use of freshly deionized and filtered (pore size 0.2 μm) water is recommended).
Microlitre pipette
Venofer 100 mg/5 mL Vifor Pharma
Volumetric flask 25 mL
Nanosphere Thermo 3020A Particle Standard
Software
Origin Pro v.8.5  Origin Lab Corporation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Auerbach, M., Gafter-Gvili, A., Macdougall, I. C. Intravenous iron: A framework for changing the management of iron deficiency. Lancet Haematology. 7 (4), e342-e350 (2020).
  2. Generic drugs: FDA should make public its plans to issue and revise guidance on nonbiological complex drugs. US Government Accountability Office. , Available from: https://www.gao.gov/products/gao-18-80 (2017).
  3. Klein, K., et al. The EU regulatory landscape of non-biological complex drugs (NBCDs) follow-on products: Observations and recommendations. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 133, 228-235 (2019).
  4. Astier, A., et al. How to select a nanosimilar. Annals of the New York Academy of Sciences. 1407 (1), 50-62 (2017).
  5. Rottembourg, J., Kadri, A., Leonard, E., Dansaert, A., Lafuma, A. Do two intravenous iron sucrose preparations have the same efficacy. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (10), 3262-3267 (2011).
  6. Aguera, M. L., et al. Efficiency of original versus generic intravenous iron formulations in patients on haemodialysis. PLoS One. 10 (8), e0135967 (2015).
  7. Alphandery, E. Iron oxide nanoparticles for therapeutic applications. Drug Discovery Today. 25 (1), 141-149 (2020).
  8. Arami, H., Khandhar, A., Liggitt, D., Krishnan, K. M. In vivo delivery, pharmacokinetics, biodistribution and toxicity of iron oxide nanoparticles. Chemical Society Reviews. 44 (23), 8576-8607 (2015).
  9. Nikravesh, N., et al. Factors influencing safety and efficacy of intravenous iron-carbohydrate nanomedicines: From production to clinical practice. Nanomedicine. 26, 102178 (2020).
  10. Pai, A. B., et al. In vitro and in vivo DFO-chelatable labile iron release profiles among commercially available intravenous iron nanoparticle formulations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 97, 17-23 (2018).
  11. Brandis, J. E. P., et al. Evaluation of the physicochemical properties of the iron nanoparticle drug products: Brand and generic sodium ferric gluconate. Molecular Pharmaceutics. 18 (4), 1544-1557 (2021).
  12. Di Francesco, T., Sublet, E., Borchard, G. Nanomedicines in clinical practice: Are colloidal iron sucrose ready-to-use intravenous solutions interchangeable. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 131, 69-74 (2019).
  13. Di Francesco, T., Borchard, G. A robust and easily reproducible protocol for the determination of size and size distribution of iron sucrose using dynamic light scattering. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 152, 89-93 (2018).
  14. The Center for Research on Complex Generics. US Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/drugs/guidance-compliance-regulatory-information/center-research-complex-generics (2021).
  15. Drug products, including biological products, that contain nanomaterials - Guidance for industry. Center for Drug Evaluation and Research. FDA-2017-D-0759. US Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/drug-products-including-biological-products-contain-nanomaterials-guidance-industry (2022).
  16. US Food and Drug Administration. Draft guidance on ferric oxyhydroxide. US Food and Drug Administration. , (2021).
  17. ISO 22412:2017. Particle size analysis - Dynamic light scattering. International Organization for Standardization. , Available from: http://www.iso.org/standard/65410.html (2017).
  18. Zou, P., Tyner, K., Raw, A., Lee, S. Physicochemical characterization of iron carbohydrate colloid drug products. The AAPS Journal. 19 (5), 1359-1376 (2017).
  19. D'Mello, S. R., et al. The evolving landscape of drug products containing nanomaterials in the United States. Nature Nanotechnology. 12 (6), 523-529 (2017).
  20. Q2 (R1) Validation of analytical procedures: Text and methodology guidance for industry. FDA-2017-D-6821. US Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/q2r1-validation-analytical-procedures-text-and-methodology-guidance-industry (2005).
  21. Committee for Medicinal Products for Human Use. Reflection paper on the data requirements for intravenous iron-based nano-colloidal products developed with reference to an innovator medicinal product. European Medicines Agency. , Available from: https://www.ema.europe.eu/en/documents/scientific-guideline/reflection-paper-data-requirements-intravenous-iron-based-nano-colloidal-products-developed_en.pdf (2015).
  22. Fischer, K., Schmidt, M. Pitfalls and novel applications of particle sizing by dynamic light scattering. Biomaterials. 98, 79-91 (2016).
  23. Caputo, F., et al. Asymmetric-flow field-flow fractionation for measuring particle size, drug loading and (in)stability of nanopharmaceuticals. The joint view of European Union Nanomedicine Characterization Laboratory and National Cancer Institute - Nanotechnology Characterization Laboratory. Journal of Chromatography A. 1635, 461767 (2021).
  24. Yusa, S. Chapter 6 - Polymer characterization. Polymer Science and Nanotechnology. Narain, R. , Elsevier. Amsterdam, the Netherlands. 105-124 (2020).

Tags

רפואה גיליון 197
ניתוח פיזור אור דינמי לקביעת גודל החלקיקים של קומפלקסים ברזל-פחמימות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Burgert, M., Marques, C. B.,… More

Burgert, M., Marques, C. B., Borchard, G., Philipp, E., Wilhelm, M., Alston, A., Digigow, R. Dynamic Light Scattering Analysis for the Determination of the Particle Size of Iron-Carbohydrate Complexes. J. Vis. Exp. (197), e63820, doi:10.3791/63820 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter