Summary
動的光散乱(DLS)は、静脈内投与された鉄-炭水化物複合体の粒子サイズおよび分布を評価するための適切なアッセイとして浮上している。ただし、プロトコルは標準化されておらず、分析する鉄-炭水化物複合体ごとに変更する必要があります。本プロトコルは、鉄スクロースの分析のための適用および特別な考慮事項を記載する。
Abstract
静脈内投与された鉄 - 炭水化物ナノ粒子複合体は、鉄欠乏症の治療に広く使用されている。このクラスには、いくつかの構造的に不均一なナノ粒子複合体が含まれ、これらの薬剤を物理化学的に特徴付けるために利用可能な方法論に必要な条件に対してさまざまな感度を示します。現在、鉄 - 炭水化物複合体の重要な品質属性は完全には確立されていない。動的光散乱(DLS)は、無傷の粒子サイズと分布を決定するための基本的な方法として浮上しています。しかし、ラボ間での方法論の標準化、個々の鉄炭水化物製品に必要な特定の変更、およびサイズ分布を最もよく記述する方法に関しては、依然として課題が残っています。重要なのは、使用する希釈液と段階希釈液を標準化する必要があることです。サンプル調製とデータ報告のアプローチが大きく異なるため、鉄-炭水化物剤の比較にDLSを使用することは限られています。ここでは、Z平均および多分散指数を使用して、鉄-炭水化物複合体である鉄スクロースのサイズおよびサイズ分布を測定するための堅牢で容易に再現可能なプロトコルについて詳述する。
Introduction
鉄スクロース(IS)は、多核鉄オキシ水酸化物コアとスクロースの複合体からなるナノ粒子で構成されるコロイド溶液です。ISは、経口鉄補給に耐えられない、または経口鉄が有効でないさまざまな基礎疾患状態の患者の鉄欠乏症の治療に広く使用されています1。ISは、食品医薬品局(FDA)によって定義された複雑な薬物の薬物クラスに属し、生物学的製剤2に見合った複雑な化学的性質を持つ薬物のクラスです。複雑な医薬品の規制評価では、後続の複雑な医薬品を正確に比較するために、追加の直交物理化学的方法および/または前臨床または臨床試験が必要になる場合があります3,4。いくつかの研究で、ISと後続IS製品の使用が同じ臨床転帰をもたらさないことが報告されているため、これは重要です。これは、IS製品間の物理化学的特性の違いを検出するのに適した新規で直交する特性評価技術の使用の重要性を強調しています5,6。
粒子サイズはオプソニン化の速度と程度に大きな影響を与える要因であり、これらの複雑な薬物の生体内分布における最初の重要なステップであるため、ISのサイズとサイズ分布の正確な解明は臨床的に重要です7,8。粒径および粒度分布のわずかな変動でさえ、酸化鉄ナノ粒子複合体の薬物動態プロファイルの変化に関連している9、10。Brandisらによる最近の研究では、参照リストに記載されている薬物とジェネリックグルコン酸第二鉄ナトリウム製品をそれぞれ比較した場合、DLSによって測定された粒子サイズが有意に異なることが示されました(14.9 nm ± 0.1 nm対10.1 nm ± 0.1 nm、p < 0.001)。鉄炭水化物製品の一貫したバッチ間の品質、安全性、および有効性は、製造プロセスのスケールアップに完全に依存しており、潜在的な製造ドリフトを慎重に考慮する必要があります9。製造工程は残留スクロースをもたらす可能性があり、これは製造業者12によって異なるであろう。製造プロセス変数に変更を加えると、構造、複雑な安定性、およびin vivoの性質に関して、最終的な複雑な薬物製品に大きな変化が生じる可能性があります9。
薬物の一貫性を評価し、薬物のin vivo挙動を予測するには、複雑なナノ医薬品の物理化学的特性を決定するための最新の直交分析方法論が必要です。ただし、方法論の標準化が不足しているため、結果報告に実験室間のばらつきが大きくなる可能性があります13。世界の規制当局と科学界がこれらの課題を認識しているにもかかわらず14、ISの物理化学的特性のほとんどは十分に定義されておらず、利用可能な規制ガイダンス文書の文脈における重要な品質属性の完全な補完は定義されていません15。鉄-炭水化物複合体についてFDAが発行した製品固有のガイダンス文書の草案は、後続製品のサイズとサイズ分布を評価する手順としてDLSを示唆しています16,17。
いくつかの刊行物は、ISナノ粒子の寸法を決定するために確立されたDLSプロトコルを詳述している13、18。ただし、サンプル調製、手順条件、インスツルメンテーション、およびインスツルメンテーション設定パラメータは公開されている方法間で異なるため、結果を解釈するための標準化された方法がない場合、DLS結果を直接比較することはできません13,18。方法論とデータ報告アプローチの多様性は、比較目的でこれらの特性の適切な評価を制限します19。重要なことに、ISを評価するために以前に公開されたDLSプロトコルの多くは、遊離スクロースの存在による懸濁液中のスクロースの拡散の影響を考慮しておらず、コロイド溶液中のナノ粒子のZ平均計算された流体力学的半径を偽りに上昇させることが示されている13、18。本プロトコルは、ISの粒径および分布の測定方法を標準化することを目的としている。この方法は、この目的のために開発され、検証されています。
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Protocol
1.機械の操作
- マシンとソフトウェアの起動
メモ: 補足図S1A-Dは 、マシンとソフトウェアを起動する手順を説明しています。- 測定を開始する少なくとも30分前に機器の電源を入れてから、PCを起動します。
- 計測器ソフトウェアアイコンをダブルクリックして、プログラムを開始します。
- ログインウィンドウにユーザー名とパスワードを入力します。各ユーザーが自分のアカウントを持っていることを確認します。
- 右下隅にある3つの黒いバーがすべて緑色に点灯し、ユニットが操作の準備ができていることを示すまで待ちます。
- 非アクティブな状態が長時間続く場合、ユーザーが自動的にログアウトしたら、[セキュリティ] で [ログイン] をクリックし、パスワードを再入力します。
- 測定ファイルの作成
注意: 新しい測定ファイルは、各測定日の初めに作成されます。すべての測定値が一覧表示され、測定ファイルに保存されます。この手順の詳細については、 補足図S2A-Bを参照してください。- ファイルをクリックして新しい測定ファイルを作成します |新規 |測定ファイル。開いたウィンドウで、 保存場所を選択し、測定ファイルに 名前を付け ます。 [保存]をクリックして詳細を確認します。
- ファイルを開くには、[ ファイル] |開館時間 |測定ファイル。開いたウィンドウで測定ファイルを選択し、[ 開く]をクリックして詳細を確認し、 ファイル名を選択して [保存]をクリックします。
- 結果の印刷
- システム適合性テスト(SST)の結果(手順1.5を参照)と、 補足図S3に従ってサンプル測定の平均値を印刷または保存します。
- 測定ファイルのレコードビューで測定値をマークします。
- バッチ印刷を右クリックし、別の小さなウィンドウが開くのを待ちます。
- 選択肢から PSD強度レポート を選択し、[ OK]をクリックして確認します。
- 測定を開始するための一般的な手順
注意: 測定を開始する手順は、 補足図S4A-Dに記載されています。必要なユニットパラメータファイル(SOPと呼ばれる)について、以下に概説するパスに従ってください。- ドロップダウンリストから 必要なSOP を選択します。最近使用したSOPがリストに表示されるため、古いSOPが必要な場合は、[ SOPの参照]を選択し、 緑色の矢印をクリックして確定します。SOPの保存場所が開いたら、手順1.4.2に進みます。
注:鉄スクロースに固有の重要なシステムパラメータ(減衰器の平衡時間など)の詳細については、 表1を参照してください。 - 開いたウィンドウで、[ サンプル名 と メモ]で必要なエントリを作成します。 OKをクリックして確定し、測定ウィンドウが自動的に開くのを待ちます。
- 緑色の [開始 ]ボタンをクリックして測定を開始します。
- 測定の最後に音響信号が鳴ったら、 測定 ウィンドウを閉じます。
- ドロップダウンリストから 必要なSOP を選択します。最近使用したSOPがリストに表示されるため、古いSOPが必要な場合は、[ SOPの参照]を選択し、 緑色の矢印をクリックして確定します。SOPの保存場所が開いたら、手順1.4.2に進みます。
- システム適合性テスト(SST)測定
注意: キュベットの下部(測定ゾーン)には触れないでください。シーケンスの開始時と終了時に、20 nmの粒子標準を測定します。- 希釈していない粒子標準物質~1 mLをポリスチレンキュベットに充填し、蓋をして閉じます。
注意: ステップ1.5.1で調製した希釈標準物質は1ヶ月間使用できます。 - 充填後、キュベットを閉じて気泡を確認します。キュベットを軽くたたいて気泡を取り除きます。
- 矢印マークを前に向けてキュベットを機器のセルホルダーに入れ、測定チャンバーカバーを閉じます。
- 単位パラメータSOPをロードし、開始ウィンドウに以下のデータを入力します。
サンプル名: SST 20のnmの粒子の標準
次に、メモを追加します: 標準の識別子番号と有効期限 - 測定を開始します。
- 音響信号が鳴ったときに測定が終了したら、測定ウィンドウを閉じます。
- レポートを印刷します(ポイント1.1.3を参照)。
注:粒子サイズの Z平均 が 分析証明書の値±10%に対応する場合、SSTは合格です。
- 希釈していない粒子標準物質~1 mLをポリスチレンキュベットに充填し、蓋をして閉じます。
- 鉄スクロース溶液の測定
- 鉄含有量2%m/VのIS溶液0.5 mLを25 mLメスフラスコにピペットで入れ、低粒子水(例:新たに脱イオンしてろ過した[孔径0.2 μm])でマークまで満たします。この溶液には0.4 mgのFe/mLが含まれています。
注意: ステップ1.6.1のサンプル調製。これにより、メソッド開発中に特定の希釈が確立され、これがこの目的に最適な希釈として決定されました。 - 予備洗浄のために、ポリスチレンキュベットを調製した測定溶液で約3/4いっぱい満たし、穏やかに旋回させてから、できるだけ完全に空にします。
注意: キュベットの下部(測定ゾーン)に触れたり、キュベットを振らないように気泡を避けたりしないでください。 - 測定のために、測定溶液1mLをキュベットにピペットで入れ、蓋をした。
- キュベット内の測定溶液に気泡がないか確認してください。気泡がある場合は、キュベットを軽くたたいて気泡を取り除きます。
- 鉄含有量2%m/VのIS溶液0.5 mLを25 mLメスフラスコにピペットで入れ、低粒子水(例:新たに脱イオンしてろ過した[孔径0.2 μm])でマークまで満たします。この溶液には0.4 mgのFe/mLが含まれています。
- 測定の実行
- 矢印マークを前に向けて、測定溶液の入ったプラスチックキュベットを装置に入れ、蓋を閉めます。
- パラメータSOPをロードし(ステップ1.4.1を参照)、スタートウィンドウに以下のデータを入力します。
サンプル名: バッチ番号 - 測定を開始します。
- 測定終了後、音響信号が鳴ったら、 測定 ウィンドウを閉じます。
- 6つの個別測定値の平均値を補足図S5に従って算出する。測定ファイルのレコードビューで個々の測定値をマークし、[平均結果の作成]を右クリックし、[サンプル名]の下に平均値の名前を追加して、[OK]をクリックして確認します。
- ソフトウェアがリストの最後に新しいレコードを作成するのを待ち、入力された名前とそのレコードの平均結果を探します。
- レポートを印刷します (手順 1.1.3 を参照)。
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Representative Results
記載されている方法は、さまざまな条件下での試験溶液の測定を含むICH Q2(R1)20に従って検証されました。精度はZ平均サイズでわずか0.5%のRSDでしたが、PDIでは最大3.5%のRSDが計算されました。異なるアナリストと日の平均結果は、Z平均サイズで0.4%、PDIで1.5%しか異なっていませんでした。統計は、2人のアナリストがさまざまな日に実施した12の測定から計算されました。50%〜200%の範囲の試験濃度の変化も、冷蔵条件下での試験溶液の最大5日間の保管も、最終結果に影響を与えませんでした。
分析されたパラメータ
Z 平均サイズ
流体力学的直径はZ平均粒子サイズとして与えられ、これを決定する方法はISO 22412:201717で定義されています。Z 平均サイズは、キュムラント平均とも呼ばれるパラメーターです。Z平均の計算は数学的に安定しており、Z平均の結果はノイズの影響を受けないため、Z平均は推奨されるDLSサイズパラメータです。EMAおよびFDAによると、Z平均サイズとPDIは、ナノ医薬品の特性評価のための推奨値です15,16,21。Z平均粒子サイズは、サンプルが単峰性、球状、または球形に近い形状であり、単分散であり、適切な分散剤で調製されている場合にのみ、他の手法で測定されたサイズと同等です。これは、Z平均平均粒子径がサンプル調製の小さな変化にも敏感であるためです。Z平均粒子サイズは流体力学的パラメータであるため、分散液中の粒子または溶液中の分子に対してのみ有効です。
多分散指数
この指標は、相関データへの単純な2パラメータ適合(キュムラント分析)から計算された数値です。多分散性指数は無次元であり、高度に単分散の標準を除いて、0.05未満の値がめったに見られないようにスケーリングされます。0.7より大きい値は、サンプルの粒度分布が非常に広く、DLS技術には適していない可能性が高いことを示します。さまざまなサイズ分布アルゴリズムは、これら2つの両極端の間にあるデータで機能します。これらのパラメータの計算は、ISO標準ドキュメント22412:201717で定義されています。
強度/体積/数によるサイズ分布
典型的なサイズ分布プロット(強度、体積、数)を 図1に示します。結果プロットは、0.4 mg Fe/mLの濃度でISバッチ605211の6つの独立して調製されたサンプルを示しています。 図1の視覚化のために、DLSソフトウェアから取得した生データを、さらに変更することなく統計ソフトウェアでプロットしました9。2番目のピークの影響を受ける強度によるサイズ分布は、 図1Aの悪い結果の例として提供されています。 図2 は、5,000 nmでの追加シグナルを示す低品質のデータを示しています。
図1:サイズ分布 。 (A)強度、(B)体積、および(C)番号13。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:代表的な低品質のデータ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
室温で5日間保存されたISバッチ0371022A(0.4 mg Fe/mL)の試験溶液は、~5,000 nmで追加のシグナルを示し、これはいくつかの追加の粒子(例えば、粉塵または沈殿のいずれか)を示しています。したがって、当初0.130と決定されたPDIは0.184にシフトしましたが、Z平均は11.99nmで元の値(つまり11.33)に近いままでした(未発表データ)。
精度は、2人のラボ技術者が別々の日にテストしました。12回の反復の平均値は、2人の技術者のZ平均とPDIでそれぞれRSDが0.4%で11.32 nm、RSDが1.5%で0.125でした。合格基準を満たした(Z平均はNMT 5%、PDIはNMT 20%)(未発表データ)。
分析可能なパラメータの比較
DLSデバイスのソフトウェアは、Z平均と多分散度などの基本パラメータの計算に加えて、検出器信号の強度または散乱粒子の体積(または数)に応じて重み付けできるサイズ分布の計算も可能にします。これらのパラメータを比較することの関連性は、 表2に概説した結果で明らかです。数によるサイズ分布は、提案された強度ベースのZ平均と最大2倍異なっていましたが、体積によるサイズ分布によってわずかに低い値しか計算されませんでした。ただし、強度ベースの結果レポートは、鉄-炭水化物複合体溶液により大きな粒子または凝集体が含まれている場合、不正確になる可能性があることに注意してください13。
表 1: DLS のシステムパラメータ。 略語:RI =屈折率;DLS = 動的光散乱13. この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:ISによる粒子サイズ決定がデータ報告アプローチによってどのように影響を受けるかの例。 この表は、ディフランチェスコとボーチャード13から適応されています。略語:SD =標準偏差;RSD = 相対標準偏差;PDI = 多分散指数;IS =鉄スクロース。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S1:システム操作手順。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S2:測定ファイルの作成。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S3:システム適合性テスト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S4:新しい測定を開始します。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S5:測定値の計算。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
DLSは、医薬品開発や規制評価への応用のために、ナノ粒子のサイズとサイズ分布を決定するための基本的なアッセイとなっています。DLS技術の進歩にもかかわらず、希釈剤の選択とサンプル調製に関して方法論的な課題が依然として存在し、特にコロイド溶液中の鉄-炭水化物複合体に関連しています。重要なことに、鉄-炭水化物ナノ医薬品のDLS法は、生物学的環境(血漿など)ではまだ広く研究されていません22。したがって、希釈剤の選択に応じてベストプラクティスプロトコルを調和させる重要な必要性が依然として残っています。精製水と等張食塩水を使用するとコロイド懸濁液の安定性に影響を与える可能性があるため、希釈剤の選択は重要です16。
また、鉄-炭水化物複合体は、暗くて不透明な溶液を持つことの課題を軽減するために、処方情報の推奨事項以下に希釈されるべきではないことにも注意する必要があります。過度の希釈は生体に関連しておらず、イオンシールドの変化 を介して コロイド懸濁液の安定性に影響を与える可能性があり、潜在的な沈殿や不正確な結果報告につながる可能性があります。この方法の開発中にさまざまな希釈液と希釈剤(未発表データ)がテストされ、プロトコルのステップ1.6.1で説明されているサンプル調製がISの最適な希釈として決定および検証されました。鉄 - 炭水化物複合体のDLS分析のためにいくつかの修正を考慮する必要があります。例えば、試験溶液の調製は、いかなる種類の高速攪拌もない状態で行われる必要がある。ボルテックスミキサーの使用は、鉄 - スクロース凝集体の生成を誘発するので、避けるべきである。試験溶液を調製するために、IS溶液を自動ピペットで水中で穏やかに混合する。さらに、DLS分析のためにサンプルを実行する場合は、 自動キャリブレーション機能をオフにする必要があります。
鉄-炭水化物ナノ粒子のDLS分析には、いくつかの固有の制限があります。光散乱角とZ平均出力の性質により、報告される流体力学的直径は、測定ソリューション内のより大きな粒子に偏っています。したがって、粒子サイズは過大評価される可能性があり、粒子サイズの真の分布は過小評価される可能性があります13。報告結果の手法は、鉄-炭水化物複合体粒子の大きさと実験条件下での凝集の可能性との関連で考慮する必要があります。また、強度、体積、および数で重み付けされたサイズ分布の結果は、同じメーカーまたは異なるメーカーの異なるDLSユニット間で大きく異なる場合があり、メーカーが異なれば計算に使用するアルゴリズムも考慮に入れる必要があります。したがって、ISO22412は、計算のアルゴリズムが標準化されているため、Z平均と多分散度の使用のみを推奨しています。規制当局もZ平均サイズの報告を推奨しています16。また、このプロトコルを他の機器に適用する場合は、軽微な変更(ソフトウェアの取り扱い、測定手順、データ準備など)が必要になることにも注意してください。
DLSに関連する課題に照らしても、この手法は以前の分析方法論の大幅な進歩を表しており、鉄-炭水化物複合体の特性評価に説得力のあるデータを追加します。科学者の共同研究者や規制当局によって承認されています16,18,19,21。DLS分析を鉄-糖鎖複合体に適用する今後の取り組みは、生物学的同等性の確保を含め、医薬品開発や規制評価への適用のためのプロトコルの世界的な調和に最も焦点を当てるべきである。全体として、ここで説明する分析プロトコルは、ISの粒子サイズおよび分布の測定方法を標準化することを目的としており、ISの品質を評価するための有用なツールとなり得る。
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Disclosures
M.B.、E.P.、M.W.、A.B.はVifor Pharmaの従業員です。G.B.はVifor Pharmaのコンサルタントです。
Acknowledgments
何一つ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | NA | equipped with Zetasizer software 7.12, Helium Neon laser (633 nm, max. 4 mW) and 173° backscattering geometry |
| Materials | |||
| Disposable plastic cuvettes | |||
| LLG-Disposable plastic cells | LLG labware | LLG-Küvetten, Makro, PS; Order number 9.406011 | |
| low-particle water | (The use of freshly deionized and filtered (pore size 0.2 μm) water is recommended). | ||
| Microlitre pipette | |||
| Venofer 100 mg/5 mL | Vifor Pharma | ||
| Volumetric flask 25 mL | |||
| Nanosphere | Thermo | 3020A | Particle Standard |
| Software | |||
| Origin Pro v.8.5 | Origin Lab Corporation |
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