Summary
Die viskoelastischen Eigenschaften des Schleims spielen eine entscheidende Rolle bei der schleimhäutigen Clearance. Traditionelle rheologische Schleimtechniken erfordern jedoch komplexe und zeitaufwändige Ansätze. Diese Studie liefert ein detailliertes Protokoll für die Verwendung eines Tischrheometers, das schnell und zuverlässig viskoelastische Messungen durchführen kann.
Abstract
Bei muko-obstruktiven Lungenerkrankungen (z. B. Asthma, chronisch obstruktive Lungenerkrankung, Mukoviszidose) und anderen Atemwegserkrankungen (z. B. virale / bakterielle Infektionen) werden die biophysikalischen Eigenschaften des Schleims durch Becherzellhypersekretion, Atemwegsdehydrierung, oxidativen Stress und das Vorhandensein von extrazellulärer DNA verändert. Frühere Studien zeigten, dass die Viskoelastizität des Sputums mit der Lungenfunktion korrelierte und dass Behandlungen, die die Sputumrheologie beeinflussen (z. B. Mukolytika), zu bemerkenswerten klinischen Vorteilen führen können. Im Allgemeinen verwenden rheologische Messungen von nicht-newtonschen Flüssigkeiten ausgefeilte, zeitaufwändige Ansätze (z. B. parallele / Kegelplatten-Rheometer und / oder Mikroperlenpartikel-Tracking), die ein umfangreiches Training erfordern, um den Assay durchzuführen und die Daten zu interpretieren. Diese Studie testete die Zuverlässigkeit, Reproduzierbarkeit und Empfindlichkeit von Rheomuco, einem benutzerfreundlichen Tischgerät, das entwickelt wurde, um schnelle Messungen mit dynamischer Oszillation mit einem Scher-Dehnungs-Sweep durchzuführen, um lineare viskoelastische Moduli (G', G", G* und tan δ) und Gelpunkteigenschaften (γ c und σc) für klinische Proben innerhalb von 5 Minuten bereitzustellen. Die Geräteleistung wurde unter Verwendung verschiedener Konzentrationen eines Schleimsimulans, 8 MDa Polyethylenoxid (PEO), und anhand herkömmlicher Bulk-Rheologiemessungen validiert. Ein klinisches Isolat, das von einem intubierten Patienten mit Status asthmaticus (SA) entnommen wurde, wurde dann in dreifachen Messungen bewertet und der Variationskoeffizient zwischen den Messungen beträgt <10%. Die Ex-vivo-Anwendung eines starken Schleimreduktionsmittels, TCEP, auf SA-Schleim führte zu einer fünffachen Abnahme des Elastizitätsmoduls und einer Veränderung hin zu einem insgesamt "flüssigkeitsähnlicheren" Verhalten (z. B. höhere Bräunung δ). Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass das getestete Tischrheometer zuverlässige Messungen der Schleimviskoelastizität in klinischen und Forschungsumgebungen durchführen kann. Zusammenfassend könnte das beschriebene Protokoll verwendet werden, um die Wirkungen von mukoaktiven Arzneimitteln (z. B. rhDNase, N-Acetylcystein) vor Ort zu untersuchen, um die Behandlung von Fall zu Fall oder in präklinischen Studien mit neuartigen Verbindungen anzupassen.
Introduction
Muko-obstruktive Atemwegserkrankungen, einschließlich Asthma, chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD), Mukoviszidose (CF) und andere Atemwegserkrankungen wie virale und bakterielle Lungenentzündung, sind weltweit weit verbreitete Gesundheitsprobleme. Während die Pathophysiologie zwischen den einzelnen Erkrankungen stark variiert, ist ein gemeinsames Schlüsselmerkmal eine abnormale mukoziliäre Clearance. In gesunden Lungen kleidet Schleim das Atemwegsepithel aus, um eingeatmete Partikel einzufangen und eine physikalische Barriere gegen Krankheitserreger zu schaffen. Nach der Sekretion wird der Atemwegsschleim, der aus ~ 97,5% Wasser, 0,9% Salz, ~ 1,1% Kugelproteinen und ~ 0,5% Schleim besteht, allmählich durch das koordinierte Schlagen von Zilien 1,2 in Richtung der Stimmblase transportiert. Mucine sind große O-verknüpfte Glykoproteine, die über nicht-kovalente und kovalente Bindungen interagieren, um die unterschiedlichen viskoelastischen Eigenschaften von Schleim bereitzustellen, die für einen effizienten Transport erforderlichsind 3. Veränderungen in der Ultrastruktur des Mucin-Netzwerks, die durch veränderten Ionentransport, Mucinentfaltung, elektrostatische Wechselwirkungen, Vernetzung oder Änderungen der Zusammensetzung verursacht werden, können die Viskoelastizität des Schleims signifikant beeinflussen und die mukoziliäre Clearancebeeinträchtigen 4,5. Daher ist die Identifizierung von Veränderungen der biophysikalischen Eigenschaften von Atemwegsschleim für das Verständnis der Krankheitspathogenese und die Erprobung neuartiger mukoaktiver Verbindungenunerlässlich 6.
Verschiedene Faktoren können zur Produktion von aberrantem Schleim in der Lunge führen. Bei COPD löst das chronische Einatmen von Zigarettenrauch eine Schleimhypersekretion als Folge der Becherzellmetaplasie sowie eine Dehydrierung der Atemwege über die Herunterregulierung des CFTR-Kanals (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) aus, was zu einer Schleimhyperkonzentration und einer Obstruktion der kleinen Atemwege führt 7,8. In ähnlicher Weise ist CF, eine genetische Störung, die mit Mutationen im CFTR-Gen assoziiert ist, durch die Produktion von viskosem, adhärentem Schleim gekennzeichnet, der für den Transport nicht ausreicht 8,9. Kurz gesagt, CFTR-Dysfunktion induziert die Erschöpfung der Atemwegsoberflächenflüssigkeit, die Verschränkung des polymeren Mucins und erhöhte biochemische Wechselwirkungen, die zu chronischen Entzündungen und bakteriellen Infektionen führen. Darüber hinaus verschlimmern Entzündungszellen, die in statischem Schleim gefangen sind, die Viskoelastizität des Schleims weiter, indem sie ein weiteres großes Molekül, DNA, in die Gelmatrix geben, was die Atemwegsobstruktionverschlimmert 5. Eines der besten Beispiele für die Bedeutung der Schleimrheologie für die allgemeine Gesundheit der Lunge ist das Beispiel der rekombinanten humanen DNFase (rhDNase) bei der Behandlung von Mukoviszidose-Patienten. Die Wirkungen von rhDNase wurden erstmals ex vivo auf schleimlösenden Sputum nachgewiesen, der innerhalb von Minuten10,11 einen Übergang von viskosem Schleim zu einer fließenden Flüssigkeit zeigte. Klinische Studien an CF-Patienten zeigten, dass die Verringerung der Viskoelastizität des Atemwegsschleims mit rhDNase-Inhalation die Rate der pulmonalen Exazerbationen verringerte und die Lungenfunktion und das allgemeine Wohlbefinden des Patienten verbesserte12,13,14. Infolgedessen wurde die rhDNase-Inhalation zur Erleichterung der Clearance für mehr als zwei Jahrzehnte zum Behandlungsstandard für CF-Patienten. Ähnliche klinische Vorteile wurden bei der Verwendung von inhalativer hypertoner Kochsalzlösung zur Schleimhydratation bei CF beobachtet, die mit Veränderungen der rheologischen Eigenschaften korrelierte und zu einer Beschleunigung der mukoziliären Clearance und einer verbesserten Lungenfunktionführte 15,16. Daher ist ein schnelles und zuverlässiges Protokoll zur Messung der viskoelastischen Eigenschaften von Schleim in klinischen Umgebungen wichtig, um therapeutische Ansätze zu optimieren.
Das hier getestete Tischrheometer bietet eine schnelle und komfortable Alternative für die Durchführung umfassender viskoelastischer Messungen von Schleim-/Sputumproben. Unter Verwendung dynamischer Schwingungen mit kontrollierter Winkelverschiebung bietet das Gerät eine Verformung über ein Paar einstellbarer paralleler Platten (z. B. grobe oder glatte Geometrien), um das Drehmoment und die Verschiebung mit Auflösungen von 15 nN zu messen. m und150 nm bzw. 17. Eine standardisierte Standardkalibrierung in Kombination mit Benutzerrichtlinien, die für Nicht-Rheologie-Spezialisten angepasst sind, ermöglicht einfache Messungen und reduziert das Risiko von Bedienerfehlern. Das Gerät erzeugt eine Dehnungskurven, die in Echtzeit (innerhalb von ~ 5 min) verarbeitet und analysiert wird und automatisch sowohl lineare viskoelastische (G', G", G* und tan δ) als auch gelförmige (γ c und σc) Eigenschaften liefert (siehe Tabelle 1). Der Elastizitäts- oder Speichermodul (G') beschreibt, wie eine Probe auf Stress reagiert (d. h. die Fähigkeit, in ihre ursprüngliche Form zurückzukehren), während der viskose oder Verlustmodul (G) die Energie beschreibt, die pro Zyklus der sinusförmigen Verformung abgeführt wird (dh die Energie, die durch die Reibung von Molekülen verloren geht). Der komplexe oder dynamische Modul (G*) ist das Verhältnis von Spannung zu Dehnung, das das Ausmaß des inneren Kraftaufbaus als Reaktion auf eine Schubverschiebung (d. h. die gesamten viskoelastischen Eigenschaften) beschreibt. Der Dämpfungsfaktor (tan δ) ist das Verhältnis des viskosen Moduls zum Elastizitätsmodul, was die Fähigkeit einer Probe angibt, Energie abzuleiten (d. h. eine niedrige Bräunung δ zeigt ein elastisch-dominantes/feststoffähnliches Verhalten an, während ein hoher Bräunungs-δ ein viskos-dominantes/flüssigkeitsähnliches Verhalten anzeigt). Für Gelpunkteigenschaften ist die Übergangsdehnung (γc) das Maß der Scherdehnung, berechnet durch das Verhältnis des Umlenkweges zur Scherspalthöhe, bei der die Probe von einem feststoffähnlichen zu einem flüssigkeitsähnlichen Verhalten übergeht und definitionsgemäß bei Schwingungsdehnung auftritt, wobei G' = G" oder tan δ = 1 ist. Die Übergangsfließspannung (σc) ist ein Maß für die Höhe der Spannung, die von der Vorrichtung ausgeübt wird, bei der sich die elastischen und viskosen Module kreuzen. Bei gesunden Sputa dominiert die Elastizität die mechanische Reaktion auf Dehnung (G' > G"). Bei muko-obstruktiven Erkrankungen nehmen sowohl G' als auch "G" infolge pathologischer Schleimveränderungenzu 17,18,19. Die einfache Bedienung des Geräts erleichtert Messungen vor Ort und umgeht die Notwendigkeit der Lagerung / des Transports / des Versands von Proben zu einer externen Einrichtung zur Analyse, wodurch die Zeit- und Frost-Tau-Effekte auf die Eigenschaften dieser biologischen Proben vermieden werden.
In dieser Studie wurden 8 MDa-Polyethylenoxid (PEO)-Lösungen unterschiedlicher Konzentration (1%-3%) verwendet, um den Messbereich eines handelsüblichen Tischrheometers (Table of Materials) zu validieren, und die erhaltene konzentrationsabhängige Kurve wurde direkt mit Messungen verglichen, die mit einem herkömmlichen Bulk-Rheometer (Table of Materials) durchgeführt wurden. ). Die Wiederholbarkeit der rheologischen Messungen wurde dann anhand von bronchoskopisch geerntetem Schleim eines intubierten Patienten mit Status asthmaticus (SA) beurteilt, einer extremen Form der Asthma-Exazerbation, die durch Bronchospasmus, eosinophile Entzündungen und Schleimhyperproduktion als Reaktion auf einen Umwelt- oder Infektionserreger gekennzeichnet ist8,20 . In diesem Fall war der SA-Patient wegen schwerer Ateminsuffizienz intubiert worden und benötigte ECMO (extrakorporale Membranoxygenierung), da der Patient trotz aggressiver Standard-Asthmatherapien nicht allein mit mechanischer Beatmung effektiv und sicher unterstützt werden konnte. Während einer klinisch indizierten Bronchoskopie für den Lobarkollaps wurden dicke, klare, hartnäckige Sekrete festgestellt, die die Lobarbronchien verstopften und mit Kochsalzwaschungen abgesaugt wurden. Unmittelbar nach der Entnahme wurde überschüssige Kochsalzlösung aus dem Aspirat entfernt und die viskoelastischen Eigenschaften der verbleibenden SA-Probe mit dem Tischgerät analysiert. Zusätzliche Probenaliquots wurden mit einem Reduktionsmittel, Tris (2-carboxylethyl) phosphinhydrochlorid (TCEP), behandelt, um festzustellen, ob dieses Protokoll zur Charakterisierung der therapeutischen Wirkstoffwirksamkeit ex vivo verwendet werden könnte.
Die Ergebnisse zeigten, dass dieses Protokoll und das Tischgerät effektiv in einer klinischen Umgebung eingesetzt werden können. Die aus PEO-Konzentrationskurven (Abbildung 1A) ermittelten rheologischen Eigenschaften waren zwischen dem getesteten Tischgerät und einem herkömmlichen parallelen Plattenrheometer nicht zu unterscheiden (Abbildung 1B). Dreifache Messungen des SA-Schleims waren wiederholbar, mit einem Variationskoeffizienten von 10% für G*-, G'- und G"-Endpunkte und spiegelten die erheblichen Anomalien der Schleimviskoelastizität wider, die im Fall dieses Patienten klinisch offensichtlich waren (Abbildung 1D). Schließlich führte die Ex-vivo-Behandlung mit TCEP zu einer signifikanten Reduktion von G' und G" und einer Zunahme der Bräunungs δ, was zeigt, dass sie durch Veränderungen im Mucin-Netzwerk auf die Behandlung ansprechen (Abbildung 2). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll mit einem Tischrheometer einen einfachen und effektiven Ansatz zur Beurteilung der viskoelastischen Eigenschaften von Schleimproben aus der Klinik bietet. Diese Fähigkeit kann verwendet werden, um präzisionsmedizinische Ansätze für die Versorgung zu erleichtern, da Kliniker die Wirksamkeit zugelassener mukoaktiver Medikamente vor Ort testen können, was dazu beitragen kann, alternative Behandlungsoptionen zu identifizieren. Darüber hinaus kann dieser Ansatz in klinischen Studien eingesetzt werden, um die Wirkung von Prüfpräparaten zu untersuchen.
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Protocol
In der vorliegenden Studie wurden Proben während einer klinisch indizierten Bronchoskopie gesammelt, nachdem die Einwilligung nach Aufklärung gemäß einem vom UNC Institutional Review Board genehmigten Protokoll eingeholt worden war.
1. Sputum-/Schleimsammlung und -lagerung
- Sammeln Sie Atemwegsschleim durch Sputumsammlung oder Bronchoskopie-Aspiration.
- Sammeln Sie Sputum entweder durch spontanen Auswurf oder induzieren Sie Sputum durch 3% hypertone Kochsalzinhalation. Alternativ können Sie während einer Bronchoskopie direkt Schleim aus den Atemwegen aspirieren.
- Bewahren Sie gesammelten Auswurf/Schleim der Atemwege in sterilen Probenbechern auf. Im Falle von Sputum entfernen Sie überschüssigen Speichel sofort nach der Entnahme aus der Probe.
- Legen Sie die Proben zum Transport auf Eis. Begrenzen Sie die Transportzeit auf weniger als 4 h.
- Analysieren Sie die Proben zum Zeitpunkt der Entnahme oder lagern Sie sie bei -80 °C, bis sie verarbeitet sind.
- Vor der Lagerung den Schleim homogenisieren, indem Sie drei- bis fünfmal mit einer Verdrängungspipette oder Pipette vorsichtig auf und ab pipettieren, direkt in die Mikrozentrifugenröhrchen.
- Aliquot die Proben zur Lagerung in Volumina ≥500 μL, um ein ausreichendes Volumen für Experimente zu gewährleisten.
HINWEIS: Einfrieren und Auftauen können die viskoelastischen Eigenschaften der Probe beeinträchtigen. Vergleichen Sie nur Proben, die ähnliche Frost-Tau-Zyklen durchlaufen haben.
2. Probenvorbereitung
- Pipetten Sie frischen und gefrorenen Spachtel/Schleim direkt oder homogenisieren Sie Proben mit einer Verdrängungspipette, indem Sie drei bis fünf Mal vorsichtig auf und ab pipettieren, bevor sie aliquotiert werden.
HINWEIS: Die Homogenisierung ist wichtig für Proben, die dicke Pfropfen enthalten, die die Reproduzierbarkeit beeinträchtigen können. - Aliquot 400-500 μL der Probe in separate Mikrozentrifugenröhrchen. Bereiten Sie so viele Aliquots wie nötig für Wiederholungsmessungen und/oder die Behandlung mit pharmakologischen Reagenzien (z. B. rhDNase, N-Acetylcystein) vor. Die zu testenden Aliquots vor der Messung mindestens 5 min bei 37 °C inkubieren.
- Verwenden Sie zum Testen pharmakologischer Wirkstoffe (optional) hohe Konzentrationen von Stammlösungen, um eine Verdünnung der Proben zu verhindern.
- Zwischen 0,4 % und 10 % Volumen (zur Minimierung der Probenverdünnung) des gewünschten Reagenzes (z. B. TCEP) direkt in die Probe geben. Stellen Sie sicher, dass kein Tropfen der Verbindung auf der Seite des Röhrchens bleibt.
- Die Proben werden bei 37 °C für die gewünschte Zeitspanne inkubiert, um eine chemische Reaktion zu ermöglichen (<1 h, um den proteolytischen Abbau des Schleims zu verhindern).
- Mischen Sie die Schleimprobe und das Reagenz, indem Sie alle 2 Minuten den Boden des Mikrozentrifugenröhrchens streichen, um ein progressives Eindringen des Reagenzes in die Schleimprobe zu ermöglichen, ohne das Mucinnetzwerk zu beeinträchtigen (z. B. Nachahmung von Ziliarschlägen und mukoziliärer Clearance). Stellen Sie beim Vergleich mehrerer Arzneimittelreagenzien sicher, dass die Inkubationszeit ähnlich ist.
3. Geräteinitialisierung und Kalibrierung
- Schalten Sie den Computer ein (Table of Materials) und initialisieren Sie die Software.
- Wählen Sie Neue Messung aus. Geben Sie unter Measure-ID die Probenidentifikationsnummer und unter Operator den Namen des Operators ein, um fortzufahren. Geben Sie unter Kommentare zusätzliche Informationen oder Kommentare ein.
- Wählen Sie einen Geometriesatz aus (d. h. grobe oder glatte 25 mm parallele Platten) und prüfen Sie große und kleine Platten sorgfältig, um sicherzustellen, dass die Platten sauber und in einwandfreiem Zustand sind).
HINWEIS: Raue Platten sind für große Volumina (350-500 μL) und glatte Platten für kleinere Volumina (250-350 μL) ausgelegt. Die Verwendung eines geringeren oder höheren Probenvolumens als empfohlen kann zu ungenauen Messungen führen. - Setzen Sie die große Platte fest auf die untere Kanzel.
- Setzen Sie die kleine Platte vorsichtig auf die obere Kanzel ein und verriegeln Sie die Platte, indem Sie sie leicht drehen, bis Sie ein "Klicken" hören, das anzeigt, dass die Platte richtig eingespannt ist. Beachten Sie, dass die freie Schwingung der oberen Platte normal ist.
- Warten Sie, bis die Temperatur den Zielwert von 37 °C erreicht hat. Starten Sie dann die automatische Kalibrierung, wenn Sie von der Software dazu aufgefordert werden.
HINWEIS: Stören Sie während dieses Vorgangs nicht die Maschinen- oder Tischoberfläche.
4. Laden von Proben
- Mit einer Verdrängungspipette werden langsam zwischen 250 und 500 μL der Probe in der Mitte der großen Bodenplatte pipettiert. Nach der Ablagerung auf der Platte nehmen viskose Proben eine Kuppelform an, während hochelastische Proben eine physische Trennung erfordern können (verwenden Sie eine Sezierschere).
HINWEIS: Vermeiden Sie die Einführung von Luftblasen. Entfernen Sie bei Bedarf Restblasen, indem Sie sie mit einer Pipettenspitze wegdrücken. - Senken Sie den Messkopf, der die kleine Platte trägt, über die Software ab und beobachten Sie die Probe. Wenn die Probe richtig auf die Bodenplatte geladen wird, berührt sie und wird zwischen den beiden Platten zentriert.
- Um sicherzustellen, dass die Probe den Spalt füllt (d. h. indem sie sich auf die Kanten der Platten ausbreitet), verwenden Sie die Funktion "Lücke reduzieren ", bis die Probe nicht mehr in einer bikonkaven Form vorliegt oder an der Kante der Platten ausgerichtet ist. Die Funktion Reduce Gap senkt den Messkopf in 0,1 mm Schritten ab und ist auf sieben Schritte beschränkt.
HINWEIS: Überwachen Sie die Probe sorgfältig und passen Sie den Spalt schrittweise an, um ein Überlaufen zu vermeiden.- Wenn nach sieben Schritten ein Spalt verbleibt, klicken Sie auf Installation wiederholen , um zur Ausgangsposition zurückzukehren und die Position und/oder das Volumen der Probe anzupassen.
- Wenn der Spalt stark reduziert wird (z. B. bikonvexe Form), entfernen Sie die überschüssige Probe mit einem Spatel durch eine kreisförmige Bewegung entlang der Kante der oberen Platte. Achten Sie darauf, die überschüssige Probe vorsichtig zu trimmen, um Scherspannungen zu vermeiden.
HINWEIS: Am Ende dieses Schritts sollte der Rand der Probe an der Kante der oberen Platte ausgerichtet werden, wie in den Benutzerrichtlinien gezeigt.
- Senken Sie die Schutzabdeckung ab, um eine versehentliche Projektion kontaminierter Flüssigkeiten während der Schwingung zu vermeiden.
5. Biophysikalische Messung einleiten
- Um die Messung zu starten, klicken Sie auf Analyse starten. Ein voller Zyklus dauert 4-7 Minuten.
- Vermeiden Sie es, während der gesamten Dauer des Zyklus laut zu sprechen und das Gerät oder die Bank zu berühren. Eine ruhige Umgebung ist besonders wichtig für die ersten 2 min.
HINWEIS: Während des Zyklus führt das Gerät einen standardisierten Dehnungssweep-Test durch, der aus aufeinanderfolgenden oszillierenden Schritten besteht. Jeder Schritt ist eine Reihe von 10 Schwingungen bei konstanter Amplitude und Frequenz (1 Hz), bei denen das entsprechende Drehmoment in Echtzeit gemessen wird. Die Dehnungs- und Drehmomentsignale ermöglichen die Berechnung der komplexen (G*), elastischen (G') und viskosen (G") Module sowie des Dämpfungsverhältnisses (tan δ) bei jedem Schritt. Schwingungen nehmen allmählich an Amplitude zu, was die Deformation, die der Probe auferlegt wird, verstärkt.
- Vermeiden Sie es, während der gesamten Dauer des Zyklus laut zu sprechen und das Gerät oder die Bank zu berühren. Eine ruhige Umgebung ist besonders wichtig für die ersten 2 min.
6. Probenentnahme
- Wenn der Zyklus abgeschlossen ist, klicken Sie auf Weiter , um den Messkopf zu erhöhen und den Probenanalysebericht zu erstellen.
HINWEIS: Für den Bericht berechnet die Software die aufgezeichneten Daten und stellt automatisch zwei Kurven grafisch dar, die die Entwicklung der viskosen und der elastischen Module in Bezug auf die auf die Probe ausgeübte Verformung zeigen, und zeigt das lineare viskoelastische Regime (dh ein Plateau bei geringer Verformung) an, falls vorhanden. Wenn kein lineares Regime erkannt wird, werden die Werte von G', G", G* und tan δ bei einer Dehnung von 0,05 extrahiert. Zusätzlich werden die Übergangsdehnung und die Streckgrenze (γ c und σc) bei tan δ = 1 berechnet. Die Daten werden auch in Tabellenkalkulationen für jeden Schritt zur weiteren Analyse bereitgestellt. - Sobald der Messkopf vollständig eingezogen ist, heben Sie die Schutzhülle an, entsorgen Sie die Probe und entfernen Sie vorsichtig die Platten. Reinigen und desinfizieren Sie die Teller mit warmem Wasser und Seife.
HINWEIS: Trocknen Sie den Geometriesatz gründlich ab, bevor Sie ihn wiederholt verwenden.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt die Genauigkeit und Wiederholbarkeit rheologischer Messungen unter Verwendung konzentrationsabhängiger Kurven der viskoelastischen Kontrolle, d. h. Polyethylenoxid (PEO)-Lösung, und Status asthmaticus (SA)-schleim. Messungen der viskoelastischen Eigenschaften von 8 MDa PEO bei fünf verschiedenen Konzentrationen (1%, 1,5%, 2%, 2,5% und 3%) wurden direkt zwischen dem ausgewerteten Tischrheometer und einem traditionellen Bulk-Rheometer verglichen (Werkstofftabelle). Im Gegensatz zu SA-Schleim waren PEO-Lösungen im gesamten Dehnungsbereich viskos dominiert (G" > G') und zeigten keine Crossover und zeigten daher ein feststoffähnliches Verhalten. Darüber hinaus bestätigten dreifache Messungen an 1,5%iger PEO-Lösung und klinischer SA-Schleimprobe, dass lineare viskoelastische Eigenschaften (G*, G' und G") für die aus der biologischen Probe erhaltenen Werte (<10% Variationskoeffizient) sehr wiederholbar waren.
Die Beobachtung des Lobarkollapses beim SA-Patienten deutete darauf hin, dass das Schleimverstopfen die Fähigkeit zur mechanischen Beatmung der Lunge erschweren könnte, und erhöhte die Möglichkeit, dass nicht standardmäßige, mukolytische Therapien in Betracht gezogen werden könnten. In Abbildung 2 wurde das hierin beschriebene Protokoll verwendet, um Veränderungen der viskoelastischen Eigenschaften von Schleim nach der Behandlung mit einem mukolytischen Mittel zu messen. Während NAC für die Verwendung mit COPD und CF zugelassen wurde, wurde gezeigt, dass es eine langsame Kinetik und eine geringe Wirksamkeit als Reduktionsmittel21 aufweist. TCEP hat sich als sehr wirksam bei der Modifikation der biophysikalischen Eigenschaften von Schleim22 erwiesen. Die Auswirkungen von TCEP auf die Viskoelastizität von SA-Schleim wurden in einer klinischen Umgebung mit dem Tischrheometer getestet. Die mukolytische Behandlung führte zu einer flüssigkeitsähnlicheren Probe mit einer Abnahme des komplexen Moduls (G*) um das 4,6-fache, des Elastizitätsmoduls (G') um das 5,1-fache, des viskosen Moduls (G") um das 1,9-fache, der Crossover-Dehnung (γ c) um das 3,3-fache und der Crossover-Fließspannung (σc) um das 5,7-fache und einer Erhöhung des Dämpfungsverhältnisses (tan δ) um das 2,8-fache.
| Zone | Parameter | Symbol | Einheit | Definition | Bedeutung | ||||
| Lineares viskoelastisches Regime (LVR) | Komplexer Modul | G* | Papa | Repräsentatives viskoelastisches Verhalten im linearen Bereich | Gesamtresistenz gegen Verformung des molekularen Netzwerks | ||||
| G* = σ/γ | |||||||||
| E-Modul | G' | Papa | Elastizität des Materials im linearen Bereich | Steifigkeit der molekularen Struktur im Ruhezustand, bezogen auf die Steifigkeit des molekularen Netzwerks | |||||
| →0 : weich →∞ : steif |
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| Viskoser Modul | G" | Papa | Viskosität des Materials im linearen Bereich | Irreversibler Energieverlust, während sich die Struktur unter sehr geringer Belastung bewegt | |||||
| →0 : reiner Feststoff →∞ : dissipativ |
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| Dämpfungsfaktor | braune δ | Einheitslos | Dämpfungsfaktor im linearen Bereich | Energiedissipationsfaktor, bezogen auf die molekulare Netzwerkmorphologie. Jede Veränderung weist auf eine Veränderung der molekularen Natur hin. | |||||
| tan δ= G''/G' | →0 : reiner Feststoff =1: verschmutzter/flüssiger Übergang →∞ : reine Flüssigkeit |
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| Gel-Punkt | Kritische oder Crossover-Dehnung | γc | Einheitslos | Belastung beim Umschalten von Gel- auf Fließverhalten | Dehnbarkeit des Gels, die gesamte Verformung, die erforderlich ist, um einen Fluss zu starten oder einen Feststoff zu brechen | ||||
| →0 : spröde →∞ : flexibel |
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| Kritische oder Crossover-Fließspannung | σc | Papa | Belastung beim Umschalten auf Strömungsverhalten | Stärke des Gels, die Menge an Kraft, die benötigt wird, um einen Fluss zu starten oder einen Feststoff zu brechen | |||||
| →0 : schwach →∞ : stark |
|||||||||
Tabelle 1: Lineare viskoelastische Module und Gelpunktcharakteristiken, gemessen mit dem Tischrheometer. Das Gerät führt schnelle Messungen mit dynamischer Schwingung mit einem Scher-Dehnungs-Sweep durch, um lineare viskoelastische (G', G", G* und tanδ) Moduli und Gelpunkteigenschaften (γ c und σc) innerhalb von ~ 5 min bereitzustellen. Parameter, Symbole, Einheiten und eine kurze Beschreibung der Maße werden bereitgestellt.
Abbildung 1: Messungen der viskoelastischen Eigenschaften von PEO-Lösungen und SA-Schleim. Lösungen von 8 MDa PEO wurden in den Konzentrationen 1%, 1,5%, 2%, 2,5% und 3% hergestellt. SA-Schleim wurde während eines Bronchoskopie-Verfahrens geerntet. Für Messungen mit dem Tischrheometer wurden 25 mm grobe Platten und 500 μL der Probe verwendet. Für die Messungen mit dem herkömmlichen Bulk-Rheometer wurden 20 mm parallele glatte Platten und 30 μL PEO-Lösungen verwendet. Beide Messungen wurden mit einer Frequenz von 1 Hz durchgeführt. (A) Kurven aus einem einzigen Zyklus zur Analyse von 1%, 1,5%, 2%, 2,5% und 3% 8 MDa PEO, die die Entwicklung des Elastizitätsmoduls (G') in Blau (i) und Viskositätsmodul (G") in Rot (ii) zeigen. (B) Kurven zum Vergleich von elastischen (i) und viskosen Modulen (ii) für steigende Konzentrationen von PEO-Lösungen, analysiert durch Tisch- und traditionelle Rheometer bei 5% Dehnung. (C) Kurven, die die Entwicklung von G' und G' des SA-Schleims zeigen, gemessen mit dem Tischrheometer. Der Pfeil zeigt die Übergangsdehnung (γc) an, die einen Übergang von weich-festem zu flüssigkeitsähnlichem Verhalten anzeigt. (D) Diagramme, die drei Replikatmessungen von (i) G*-, (ii) G'- und (iii) G"-Werten für 1,5% PEO (schwarze Balken) und SA-Schleim (graue Balken) im linearen viskoelastischen Regime (LVR) bzw. bei 5% Dehnung zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Auswirkungen der TCEP-Behandlung auf die Viskoelastizität von SA-Schleim. SA-Schleim wurde vor (nicht behandelt oder NT) und nach der TCEP-Behandlung (TCEP) analysiert. Die Behandlung bestand aus der Zugabe von 2 μL 5 mM TCEP-Lösung in 500 μL Aliquots (endgültige TCEP-Konzentration von 20 μM). NT- und TCEP-behandelte Proben wurden 20 min lang bei 37 °C inkubiert und gemischt, indem alle 2 Minuten vor der Analyse der Boden des Röhrchens gestreichelt wurde. Die Messungen wurden unter oszillierender Dehnung bei einer Frequenz von 1 Hz durchgeführt. (A) Kurven von NT- und TCEP-behandeltem SA-Schleim, die die Entwicklung von (i) elastischen (G') und (ii) viskosen (G") Modulen zeigen. Die horizontale schwarze gestrichelte Linie zeigt das lineare viskoelastische Regime (LVR) und die vertikale schwarze gepunktete Linie die Dehnungsreferenz von 5% an, falls kein LVR festgestellt werden konnte. (B) Vergleich des komplexen Moduls (G*), des Elastizitätsmoduls (G'), des Viskositätsmoduls (G), des Dämpfungsverhältnisses (tan δ), der Übergangsdehnung (γ c) und der Kreuzerfließspannung (σc) von NT- und TCEP-behandeltem Schleim, der aus den entsprechenden Kurven abgeleitet wird. Es wurden statistische Analysen durchgeführt, und die p-Werte wurden mit Hilfe von gepaarten t-Tests erfasst. Die Werte für alle Diagramme werden als ±SEM) angezeigt. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die einzigartigen viskoelastischen Eigenschaften von Schleim sind für die Erhaltung gesunder Atemwege unerlässlich. Interne und externe Faktoren können die biophysikalischen Eigenschaften des Atemwegsschleims verändern und klinische Komplikationen verursachen, die für schleimobstruktive Erkrankungen charakteristisch sind. Daher könnte die Überwachung von Veränderungen der Schleimviskoelastizität bei der Beurteilung des Krankheitsstatus und der Erforschung von Therapien, die die Viskoelastizität des Schleims reduzieren, in Betracht gezogen werden. Empirische Studien aus den 1980er Jahren zeigten eine starke Korrelation zwischen Schleimrheologie und Atemwegsclearance mit Magnetperlrheometern23,24. In den letzten Jahren hat sich die Rheologie weiterentwickelt, um verschiedene Techniken zu nutzen, die Schleim auf verschiedenen Skalen analysieren. Zum Beispiel verwenden mikrorheologische Assays mikroskopische Sonden, um lokale Schleimeigenschaften basierend auf der Bewegung von magnetischen oder fluoreszierenden Mikrometer-Partikeln zu beschreiben. Da diese Technik jedoch kleine Probenvolumina verwendet, kann es schwierig sein, repräsentative Daten zu erhalten, die heterogene Proben wie Sputum beschreiben. Darüber hinaus erfordern mikrorheologische Assays hochauflösende Mikroskope, erhebliche Rechenfähigkeiten und zeitaufwändige Analysen und eignen sich daher nur unzureichend für den weit verbreiteten Einsatz in Labors oder Kliniken.
Während Mikrorheologie und Makrorheologie in der Regel nicht vergleichbar sind, gelten ähnliche Einschränkungen für seit langem etablierte Geräte wie Kegel- / Parallelplatten-Bulk-Rheometer. Die Makrorheologie wird mit Präzisionsinstrumenten durchgeführt, die mit rotierenden Kegeln, Platten, Bechern und/oder Rotoren verschiedener Abmessungen ausgestattet sind, um extrem kleine Drehmomente und Verschiebungen bis zum Sub nN zu messen. m und sub Å Bereiche. Um eine so hohe Präzision zu erreichen, benötigen die meisten kommerziellen Rheometer eine direkte Verbindung mit einem Druckluftversorgungs- und Kühlsystem in einer Umgebung, die frei von Öl, Staub oder Lärm ist, und mit einer kontrollierten Umgebungstemperatur und Luftfeuchtigkeit, um die Bildung von Artefakten zu verhindern. Während herkömmliche Bulk-Rheometer eine breite Palette von Materialien durch die Einstellung spezifischer Variablen messen können, nimmt die Kalibrierung dieser Instrumente viel Zeit in Anspruch und erfordert umfangreiche Schulungen.
Im Gegensatz dazu wurde das Rheomuco-Tischrheometer speziell für die Messung der viskoelastischen Eigenschaften von Schleim und Sputum entwickelt und erfordert einen einzigen Kalibrierschritt, um lineare viskoelastische und Gelpunktmessungen innerhalb von Minuten durchzuführen. Dieses Tischgerät verwendet ein einfaches und standardisiertes Protokoll, um schnelle und genaue viskoelastische Messungen zu erstellen, ohne dass eine umfassende Schulung in der Instrumentenkalibrierung oder der rheologischen Datenanalyse / -berechnung erforderlich ist. Das Gerät misst Drehmoment und Verschiebung nach Schwingungen mit kontrollierter Winkelverschiebung, um eine Dehnungskurvenkurve zu erzeugen und ein lineares viskoelastisches Regime oder LVR (einen Bereich mit gleichmäßiger viskoelastischer Reaktion auf Dehnung, der in Abbildung 2A mit einer horizontalen gestrichelten Linie angezeigt wird) festzulegen, bevor der Punkt erreicht wird, an dem die Probe nachgibt. In den meisten Fällen befinden sich Sputumproben innerhalb des LVR über dem Dehnungsbereich von 1%-10%. Wenn kein LVR erkannt wird, wird üblicherweise auf den Wert bei einer Dehnung von 5 % verwiesen, um die viskoelastischen Eigenschaften der Probe zu ermitteln. Das Fehlen eines nachgewiesenen LVR macht die Messung nicht ungültig, sondern spiegelt eine Probe wider, deren Eigenschaften sich von denen der meisten Proben unterscheiden (plastischer). Die Empfindlichkeit dieses Instruments ist optimiert, um den Bedürfnissen viskoser und elastischer Flüssigkeiten in der Nähe von Schleim gerecht zu werden und gleichzeitig eine hohe Toleranz gegenüber mechanischem Rauschen zu bieten, was es ideal für die Untersuchung biologischer Flüssigkeiten in klinischen Umgebungen macht; Es ist jedoch möglicherweise nicht geeignet, andere viskoelastische Materialien mit extrem niedrigen (z. B. Speichel) oder extrem hohen (z. B. Kohlenteer) elastischen oder viskosen Modulen zu untersuchen, da die Softwareparameter eingeschränkt sind und Variablen wie Plattenform, Oberfläche, Abstand und Rotationsfrequenz nicht manipuliert werden können. Die konzentrationsabhängigen rheologischen Messungen an PEO 8 MDa (Abbildung 1) ermöglichten die Abschätzung der Empfindlichkeit (d. h. der unteren Nachweisgrenze) dieses Produkts, die zwischen 0,3 % und 0,4 % von 8 MDa PEO oder <0,05 Pa für G* liegt. Eine Obergrenze konnte jedoch nicht festgelegt werden, da es schwierig ist, PEO-Konzentrationen von mehr als 3 % zu lösen. Dennoch war das Gerät in der Lage, G' und G" für 3% 8 MDa PEO zu melden, was viskoelastischer ist als SA-Schleimproben (~ 5-fach größeres G' und 25-fach größeres G" im Vergleich zu SA), was auf einen relevanten Dynamikbereich für Schleim-Bioproben hindeutet. Es sollte beachtet werden, dass, um genaue Messungen während der Schwingungen zu erhalten, ein angemessenes Volumen der Probe in der Mitte der Platte ohne das Vorhandensein von Blasen platziert werden muss. Während der Probenbeladung erzeugen unzureichendes Volumen, Luftblasen und/oder außermittige Platzierung einen unzureichenden Kontakt mit den Platten, was zu niedrigeren aufgezeichneten Werten führt. Umgekehrt führt ein Probenüberlauf aufgrund der zusätzlichen Schleppkraft zu einer übermäßigen Schubspannung25.
Diese Studie beschreibt, wie dicke Schleimproben unmittelbar nach der Entnahme verarbeitet, gelagert und behandelt werden. Eine der größten Herausforderungen, mit denen Studien der Sputumrheologie konfrontiert sind, ist die Heterogenität dieser Proben und die Entwicklung standardisierter Messansätze. Sputum ist eine schleimlösende Substanz, die oft mit Speichel kontaminiert ist und Bakterien und Verdauungsenzyme enthält, die das Mucinnetzwerk schnell verändern und die Viskoelastizität des Schleims beeinflussen können. Daher ist es wichtig, Speichel sofort nach der Entnahme und/oder vor der Homogenisierung aus den Sputumproben zu entfernen. Von Natur aus ist Schleim klebrig und schwer zu handhaben, aber die Verwendung von Verdrängungspipetten erleichtert die Homogenisierung, ohne das Mucinnetzwerk zu beeinträchtigen, ermöglicht eine genaue Aliquot-Präparation und vereinfacht das Laden der Proben. Je nach Experiment ist möglicherweise keine Probenhomogenisierung erforderlich, kann jedoch die Variabilität zwischen den Replikaten minimieren. Während die Verarbeitung von Sputum unmittelbar nach der Entnahme empfohlen wird, behält der Atemwegsschleim nach dem Einfrieren und Auftauen einzigartige biophysikalische Eigenschaften bei. Einfrieren und Auftauen kann jedoch die gesamte Rheologie einer Probe beeinflussen. Daher sollten nur Proben, die ähnliche Frost-/Tauzyklen durchlaufen haben, miteinander verglichen werden. Bei der Prüfung der Wirkung von mukoaktiven Wirkstoffen ist die Homogenisierung der Erstprobe wichtig, um die Diffusion der Verbindungen zu optimieren. Die Medikamentenabgabe an die Lunge durch Inhalation begrenzt die Volumina, die auf das Ziel zugreifen (dh Schleimpfropfen), aber das ständige Schlagen der Zilien in Kombination mit dem schleimlösenden Transport erzeugt eine gewisse Vermischung von Medikament und Ziel. Um eine In-vivo-Behandlung zu simulieren, können kleine Mengen eines pharmakologischen Mittels direkt auf Proben aufgetragen und während der gesamten Inkubationszeit durch regelmäßiges Rühren allmählich gemischt werden. Es können jedoch auch andere Behandlungsmethoden (z.B. Arzneimittelvernebelung auf die Probe in einer Petrischale) untersucht werden. Sanftes Rühren während der Inkubation gewährleistet eine fortschreitende Arzneimittelpenetration, ohne das Mucinnetzwerk durch mechanische Störungen (z. B. Wirbelung oder Beschallung) zu beeinträchtigen. Derzeit wird TCEP nicht in klinischen Umgebungen eingesetzt, aber andere mukoaktive Reagenzien wie NAC, rhDNase, P-2119, ARINA-1 und PAAG werden für eine breite Palette von muko-obstruktiven Zuständenuntersucht 21,26,27,28. Für die Konzeptvalidierung wurde gezeigt, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, um signifikante Veränderungen des asthmatischen Schleims als Reaktion auf die TCEP-Behandlung nachzuweisen. Ein flüssigerer Schleim wurde durch Behandlung mit einem Reduktionsmittel erzeugt, was aus den unteren linearen viskoelastischen und Gelpunktmarkern hervorgeht, was auf eine Verbesserung der Clearance-Fähigkeit hindeutet. Obwohl rhDNase bei CF enorme klinische Vorteile brachte, wird es typischerweise nicht für andere muko-obstruktive Erkrankungen verwendet, wahrscheinlich aufgrund chronisch niedrigerer extrazellulärer DNA-Konzentrationen. Während einer akuten viralen und bakteriellen Infektion kann eine starke Entzündungsreaktion jedoch vorübergehend eine hohe extrazelluläre DNA-Konzentration verursachen und die Atemwegsclearance verringern. Daher könnten schnelle Ex-vivo-Tests der Wirksamkeit von rhDNase von Fall zu Fall eine Anleitung für die Behandlung von viral- und bakteriell induzierter Pneumonie liefern. Dies könnte angesichts der COVID-19-Pandemie, die durch das Atemwegsvirus SARS-CoV-2 verursacht wird, besonders wertvoll sein.
Zusammenfassend bietet die beschriebene Vorrichtung machbare, schnelle und genaue rheologische Messungen. Diese Eigenschaften bieten das Potenzial, den Status von Atemwegserkrankungen zu untersuchen und zu überwachen sowie die Auswirkungen neuartiger mukoaktiver Verbindungen zu testen. Die Schnelligkeit und Einfachheit der Messungen ermöglichen die Durchführung von Assays ohne Komplikationen im Zusammenhang mit dem Einfrieren und/oder den zeitlichen Auswirkungen einer längeren Lagerung oder eines längeren Transports, während diese Assays in einer Vielzahl von Umgebungen möglich sind. Letztendlich könnte dieser Ansatz für die Auswahl personalisierter Therapien aus einem Panel von Optionen untersucht werden, was eine Echtzeit-Anpassung der Patientenbehandlung ermöglicht.
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Disclosures
Nichts
Acknowledgments
Dieses Papier wird durch Stipendien von Vertex Pharmaceuticals (Ehre RIA Award) und CFF-supported Research EHRE20XX0 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capillary Pistons Tips | Gilson | CP1000 | |
| Discovery Hybrid Rheometer-3 | TA Instruments | DHR-3 Bulk Rheometer manufactured by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests. |
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| Graphing Software | GraphPad Prism | GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis | |
| Microcentrifuge Tube | Costar | 3621 | |
| Peltier plate | TA Instruments | Temperature control system manufactured by TA Instruments in New Castle, DE |
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| Polyethylene oxide | Sigma | 372838 | 8 MDa polymer used as mucus simulant |
| Positive Displacement Pipette | Gilson | M1000 | Pipette used for handling viscous solutions |
| Rheomuco | Rheonova | Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests. | |
| Rough Lower Geometries | Rheonova | D-1811-007 | 25mm Diameter |
| Rough Upper Geometries | Rheonova | U-1811-007 | 25mm Diameter |
| Smooth Upper Parallel Plate | TA Instruments | 20mm Diameter | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Sigma | 646547-10X1ML | TCEP: Potent reducing agent. |
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