Summary
De viskoelastiska egenskaperna hos slem spelar en kritisk roll vid mucociliary clearance. Traditionella slemreologiska tekniker kräver emellertid komplexa och tidskrävande tillvägagångssätt. Denna studie ger ett detaljerat protokoll för användning av en bänkreometer som snabbt och tillförlitligt kan utföra viskoelastiska mätningar.
Abstract
Vid muko-obstruktiva lungsjukdomar (t.ex. astma, kronisk obstruktiv lungsjukdom, cystisk fibros) och andra andningssjukdomar (t.ex. virus-/bakterieinfektioner) förändras slemets biofysiska egenskaper av bägarecellshypersekretion, uttorkning av luftvägarna, oxidativ stress och närvaron av extracellulärt DNA. Tidigare studier visade att sputumviskopelasticitet korrelerade med lungfunktionen och att behandlingar som påverkar sputumreologi (t.ex. mukolytika) kan resultera i anmärkningsvärda kliniska fördelar. I allmänhet använder reologiska mätningar av icke-newtonska vätskor utarbetade, tidskrävande metoder (t.ex. parallella / konplattreometrar och / eller mikrobpartikelspårning) som kräver omfattande träning för att utföra analysen och tolka data. Denna studie testade tillförlitligheten, reproducerbarheten och känsligheten hos Rheomuco, en användarvänlig bänkskiva som är utformad för att utföra snabba mätningar med dynamisk svängning med ett skjuvspänningssvep för att ge linjär viskoelastisk moduli (G ', G ", G * och tan δ) och gelpunktsegenskaper (γc och σc) för kliniska prover inom 5 minuter. Enhetens prestanda validerades med olika koncentrationer av en slemsimulator, 8 MDa polyetenoxid (PEO), och mot traditionella bulkreologimätningar. Ett kliniskt isolat som skördats från en intuberad patient med status asthmaticus (SA) bedömdes sedan i tredubbla mätningar och variationskoefficienten mellan mätningarna är <10%. Ex vivo-användning av ett potent slemreducerande medel, TCEP, på SA-slem resulterade i en femfaldig minskning av elastisk modul och en förändring mot ett mer "vätskeliknande" beteende totalt sett (t.ex. högre δ). Tillsammans visar dessa resultat att den testade bänkskivans reometer kan göra tillförlitliga mått på slemviskopelasticitet i kliniska och forskningsmiljöer. Sammanfattningsvis kan det beskrivna protokollet användas för att undersöka effekterna av mukoaktiva läkemedel (t.ex. rhDNas, N-acetylcystein) på plats för att anpassa behandlingen från fall till fall eller i prekliniska studier av nya föreningar.
Introduction
Muco-obstruktiva luftvägssjukdomar, inklusive astma, kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL), cystisk fibros (CF) och andra andningssjukdomar, såsom viral och bakteriell lunginflammation, är vanliga hälsoproblem över hela världen. Medan patofysiologin varierar mycket mellan varje tillstånd, är en vanlig nyckelfunktion onormal mucociliär clearance. I friska lungor leder slem luftvägsepitelet för att fånga inhalerade partiklar och ge en fysisk barriär mot patogener. När det väl utsöndrats transporteras luftvägsslem, bestående av ~ 97,5% vatten, 0,9% salt, ~ 1,1% klotformiga proteiner och ~ 0,5% muciner, gradvis mot glottis genom samordnad slagning av cilia 1,2. Muciner är stora O-länkade glykoproteiner som interagerar via icke-kovalenta och kovalenta bindningar för att ge de distinkta viskoelastiska egenskaperna hos slem, vilket krävs för effektiv transport3. Förändringar i ultrastrukturen i mucinnätverket orsakade av förändrad jontransport, mucinutfällning, elektrostatiska interaktioner, tvärbindning eller förändringar i kompositionen kan signifikant påverka slemviskopelasticiteten och försämra mucociliary clearance 4,5. Därför är det viktigt att identifiera förändringar i de biofysiska egenskaperna hos luftvägsslem för att förstå sjukdomspatogenes och testa nya mukoaktiva föreningar6.
Olika faktorer kan leda till produktion av avvikande slem i lungorna. Vid KOL utlöser kronisk inandning av cigarettrök slemhypersekretion som ett resultat av metaplasi i bägare, liksom uttorkning av luftvägarna via nedreglering av kanalen cystisk fibros transmembrankonduktansregulator (CFTR), vilket orsakar slemhyperkoncentration och liten luftvägsobstruktion 7,8. På samma sätt kännetecknas CF, en genetisk störning associerad med mutationer i CFTR-genen, av produktion av visköst, vidhäftande slem som är otillräckligt för transport 8,9. I korthet inducerar CFTR-dysfunktion vätskeutarmning av luftvägsytan, polymer mucin intrassling och ökade biokemiska interaktioner, vilket resulterar i kronisk inflammation och bakterieinfektioner. Dessutom förvärrar inflammatoriska celler fångade i statiskt slem ytterligare viskoelasticiteten hos slem genom att tillsätta en annan stor molekyl, DNA, i gelmatrisen, förvärra luftvägsobstruktion5. Ett av de bästa exemplen på vikten av slemreologi på lungans allmänna hälsa tillhandahålls av exemplet med rekombinant human DNFase (rhDNase) vid behandling av cystisk fibrospatienter. Effekterna av rhDNas visades först ex vivo på slemlösat sputum, vilket visade en övergång från visköst slem till en flytande vätska inom några minuter10,11. Kliniska prövningar på CF-patienter visade att minskning av luftvägsslem viskoelasticitet med rhDNase inhalation minskade frekvensen av lungförvärringar och förbättrade lungfunktionen och patientens övergripande välbefinnande 12,13,14. Som ett resultat blev rhDNase inhalation som syftade till att underlätta clearance vårdstandarden för CF-patienter i mer än två decennier. Liknande kliniska fördelar observerades vid användning av inhalerad hypertonisk saltlösning för slemhydrering vid CF, vilket korrelerade med förändringar i reologiska egenskaper och resulterade i mucociliär clearanceacceleration och förbättrad lungfunktion15,16. Därför är ett snabbt och tillförlitligt protokoll för att mäta slem viskoelastiska egenskaper i kliniska miljöer viktigt för att optimera terapeutiska metoder.
Bänkskivans reometer som testas här erbjuder ett snabbt och bekvämt alternativ för att utföra omfattande viskoelastiska mätningar av slem / sputumprover. Med hjälp av dynamiska svängningar med kontrollerad vinkelförskjutning ger instrumentet deformation via ett par justerbara parallella plattor (t.ex. grova eller släta geometrier) för att mäta vridmoment och förskjutning med upplösningar på 15 nN. m respektive 150 nm17. En standardiserad kalibrering i kombination med användarriktlinjer anpassade för icke-reologispecialister möjliggör enkla mätningar och minskar risken för operatörsfel. Enheten producerar en töjningssvepkurva som bearbetas och analyseras i realtid (inom ~ 5 min) och ger automatiskt både linjära viskoelastiska (G ', G ", G * och tan δ) och gelpunkt (γc och σc) egenskaper (se tabell 1). Den elastiska eller lagringsmodulen (G ') beskriver hur ett prov reagerar på stress (dvs. förmågan att återgå till sin ursprungliga form), medan den viskösa eller förlustmodulen (G") beskriver den energi som försvinner per cykel av sinusformad deformation (dvs den energi som förloras på grund av molekylernas friktion). Den komplexa eller dynamiska modulen (G*) är förhållandet mellan spänning och töjning, som beskriver mängden intern kraftuppbyggnad som svar på en skjuvförskjutning (dvs. de totala viskoelastiska egenskaperna). Dämpningsfaktorn (tan δ) är förhållandet mellan den viskösa modulen och den elastiska modulen, vilket indikerar ett provs förmåga att sprida energi (dvs. en låg solbränna δ indikerar ett elastiskt dominerande / fastliknande beteende, medan en hög solbränna δ indikerar ett visköst dominerande / vätskeliknande beteende). För gelpunktsegenskaper är crossover-stammen (γc) måttet på skjuvspänningen, beräknad med förhållandet mellan avböjningsvägen och skjuvgapets höjd, vid vilken provet övergår från ett fastliknande till ett vätskeliknande beteende och per definition uppträder vid oscillationsspänning där G ' = G " eller solbränna δ = 1. Crossover-utbytesspänningen (σc) är ett mått på mängden spänning som appliceras av anordningen vid vilken den elastiska och viskösa modulen korsar varandra. I hälsosam sputa dominerar elasticiteten det mekaniska svaret på töjning (G' > G"). Vid muco-obstruktiva sjukdomar ökar både G' och G" till följd av patologiska slemförändringar 17,18,19. Enhetens operativa enkelhet underlättar mätningar på plats och kringgår behovet av provlagring / transport / transport till en extern anläggning för analys, vilket undviker tids- och frys-tina effekter på egenskaperna hos dessa biologiska prover.
I denna studie användes 8 MDa polyetenoxidlösningar (PEO) med olika koncentrationer (1% -3%) för att validera mätområdet för en kommersiell bänktreometer (materialtabell) och den erhållna koncentrationsberoende kurvan jämfördes direkt med mätningar som erhållits med en traditionell bulkreometer (materialtabell ). Repeterbarheten av reologiska mätningar bedömdes sedan med hjälp av bronkoskopiskt skördat slem från en intuberad patient som lider av status asthmaticus (SA), en extrem form av astmaförvärring som kännetecknas av bronkospasm, eosinofil inflammation och slemhyperproduktion som svar på ett miljö- eller smittämne8 20 . I detta fall hade SA-patienten intuberats för svår andningssvikt och krävde ECMO (extrakorporeal membransyresättning) på grund av oförmågan att stödja patienten effektivt och säkert med enbart mekanisk ventilation, trots aggressiva standardastmaterapier. Under en kliniskt indikerad bronkoskopi för lobar kollaps noterades tjocka, klara, ihärdiga sekret som hindrar lobar bronkier och aspirerades med saltlösning. Omedelbart efter insamling avlägsnades överskott av saltlösning från aspiranten och de viskoelastiska egenskaperna hos det återstående SA-provet analyserades med användning av bänkskivan. Ytterligare prov alikvoter behandlades med ett reduktionsmedel, tris (2-karboxyletyl) fosfinhydroklorid (TCEP), för att avgöra om detta protokoll kan användas för att karakterisera terapeutisk föreningseffekt ex vivo.
Resultaten visade att detta protokoll och bänkskivan kan användas effektivt i en klinisk miljö. De reologiska egenskaper som bestämdes utifrån PEO-koncentrationsberoende kurvor (figur 1A) kunde inte skiljas mellan den testade bänkskivan och en traditionell parallellplåtsreometer (figur 1B). Tredubbla mätningar av SA-slemmet var repeterbara, med en variationskoefficient på 10% för G *, G ', och G "slutpunkter och återspeglade de väsentliga avvikelserna i slemviskopelasticitet som var kliniskt uppenbara i denna patients fall (figur 1D). Slutligen resulterade ex vivo-behandling med TCEP i en signifikant minskning av G 'och G", och en ökning av solbränna δ, vilket visar lyhördhet för behandlingen genom förändringar i mucinnätverket (figur 2). Sammanfattningsvis ger detta protokoll med hjälp av en bänkreometer ett enkelt och effektivt tillvägagångssätt för att bedöma viskoelastiska egenskaper hos slemprover erhållna från kliniken. Denna förmåga kan användas för att underlätta precisionsmedicinska metoder för vård, eftersom kliniker kan testa effekten av godkända mukoaktiva läkemedel på plats, vilket kan hjälpa till att identifiera alternativa behandlingsalternativ. Dessutom kan detta tillvägagångssätt användas i kliniska prövningar för att undersöka effekterna av prövningsläkemedel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I den aktuella studien samlades prover in under en kliniskt indikerad bronkoskopi efter att ha erhållit informerat samtycke enligt ett protokoll som godkänts av UNC Institutional Review Board.
1. Sputum / slemuppsamling och lagring
- Samla luftvägsslem via sputumuppsamling eller bronkoskopi aspiration.
- Samla sputum antingen via spontan expectoration eller inducera sputum genom 3% hypertonisk saltlösning inandning. Alternativt, direkt aspirera slem från luftvägarna under en bronkoskopi förfarande.
- Förvara uppsamlat luftvägssputum/slem i sterila provkoppar. När det gäller sputum, ta bort överskott av saliv från provet omedelbart efter insamling.
- Placera proverna på is för transport. Begränsa transporttiden till mindre än 4 timmar.
- Analysera proverna vid insamlingstillfället eller förvara vid -80 °C tills de bearbetas.
- Före lagring, homogenisera slemmet genom att försiktigt pipettera upp och ner tre till fem gånger med en positiv förskjutningspipett eller pipett direkt i mikrocentrifugrören.
- Alikvotera proverna för lagring i volymer ≥500 μL för att säkerställa tillräcklig volym för experiment.
OBS: Frysning och upptining kan påverka provets viskoelastiska egenskaper. Jämför endast prover som har genomgått liknande frys-/upptiningscykler.
2. Beredning av prover
- Pipettera över färsk och fryst sputa/slem direkt eller homogenisera prover med hjälp av en positiv förskjutningspipett genom att försiktigt pipettera upp och ner tre till fem gånger före alikvotering.
OBS: Homogenisering är viktigt för prover som innehåller tjocka pluggar som kan påverka reproducerbarheten. - Alikvot 400-500 μL av provet i separata mikrocentrifugrör. Förbered så många alikvoter som behövs för upprepade mätningar och/eller behandling med farmakologiska reagenser (t.ex. rhDNas, N-acetylcystein). Inkubera de alikvoter som ska provas vid 37 °C i minst 5 minuter före mätningen.
- För att testa farmakologiska medel (valfritt), använd höga koncentrationer av stamlösningar för att förhindra provutspädning.
- Tillsätt mellan 0,4 % och 10 % volym (för att minimera provutspädningen) av det önskade reagenset (t.ex. TCEP) direkt på provet. Se till att ingen droppe av föreningen stannar på sidan av röret.
- Inkubera proverna vid 37 °C under önskad tid för att möjliggöra en kemisk reaktion (<1 h för att förhindra proteolytisk nedbrytning av slem).
- Blanda slemprovet och reagenset genom att snärta botten av mikrocentrifugröret var 2: e minut för att möjliggöra progressiv penetrering av reagenset i slemprovet utan att kompromissa med mucinnätverket (t.ex. efterlikna ciliärslag och mucociliary clearance). När du jämför flera läkemedelsreagenser, se till att inkubationstiden är liknande.
3. Instrumentinitiering och kalibrering
- Slå på maskinen (materialtabell) och initiera programvaran.
- Välj Ny mätning. Ange provets identifieringsnummer under Åtgärd ID och operatörens namn under Operatör för att fortsätta. Ange ytterligare information eller kommentarer under Kommentarer.
- Välj en geometriuppsättning (dvs. grova eller släta 25 mm parallella plattor) och inspektera stora och små plattor noggrant för att säkerställa att plattorna är rena och i perfekt skick).
OBS: Grova plattor är konstruerade för stora volymer (350-500 μL) och släta plattor är konstruerade för mindre volymer (250-350 μL). Att använda en lägre eller högre provvolym än rekommenderat kan orsaka felaktiga mätningar. - Sätt in den stora plattan ordentligt på den nedre predikstolen.
- Sätt försiktigt in den lilla plattan på den övre predikstolen och lås plattan genom att rotera något tills du hör ett "klick", vilket indikerar att plattan är ordentligt fastspänd. Observera att fri svängning av den övre plattan är normal.
- Vänta tills temperaturen når målvärdet på 37 °C. Starta sedan automatisk kalibrering enligt uppmaningen från programvaran.
OBS: Stör inte maskinen eller bänkskivans yta under denna process.
4. Provbelastning
- Använd en positiv deplacementpipett och pipettera långsamt mellan 250 och 500 μL av provet på mitten av den stora bottenplattan. När de väl har deponerats på plattan kommer viskösa prover att anta en kupolform medan mycket elastiska prover kan kräva fysisk avskiljning (använd dissekerande sax).
OBS: Undvik att införa luftbubblor. Ta bort kvarvarande bubblor om det behövs genom att trycka bort med en pipettspets. - Sänk mäthuvudet som bär den lilla plattan via programvaran och observera provet. Om den är ordentligt laddad på bottenplattan kommer provet att få kontakt och centreras mellan de två plattorna.
- För att säkerställa att provet fyller gapet (dvs. genom att sprida sig till kanterna på plattorna), använd funktionen Minska mellanrum tills provet inte längre är i bikonkavform eller är i linje med plattans kant. Funktionen Minska gap sänker mäthuvudet i steg om 0,1 mm och är begränsad till sju steg.
OBS: Övervaka provet noggrant och justera gapet gradvis för att undvika överdosering.- Om ett mellanrum kvarstår efter sju steg, klicka på Gör om installationen för att återgå till utgångsläget och justera provets position och /eller volym.
- Om spalten är kraftigt reducerad (t.ex. bikonvex form), ta bort överskottsprovet med en spatel genom en cirkulär rörelse längs kanten på den övre plattan. Se till att trimma överskottsprovet försiktigt för att undvika skjuvspänning.
OBS: I slutet av detta steg ska provets kant justeras med kanten på den övre plattan som visas i användarriktlinjerna.
- Sänk skyddskåpan för att undvika oavsiktlig projicering av förorenade vätskor under svängning.
5. Initiera biofysisk mätning
- För att initiera mätning, klicka på Starta analys. En hel cykel tar 4-7 min.
- Undvik att prata högt och röra vid enheten eller bänken under hela cykelns längd. En lugn miljö är särskilt viktig under de första 2 minuterna.
OBS: Under cykeln utför instrumentet ett standardiserat töjningssveptest, som består av successiva oscillerande steg. Varje steg är en serie av 10 svängningar vid konstant amplitud och frekvens (1 Hz), under vilken motsvarande vridmoment mäts i realtid. Töjnings- och vridmomentsignalerna möjliggör beräkning av komplex (G*), elastisk (G ') och viskös (G") moduli, liksom dämpningsförhållandet (solbränna δ) vid varje steg. Oscillationer ökar gradvis i amplitud, vilket intensifierar deformationen som åläggs provet.
- Undvik att prata högt och röra vid enheten eller bänken under hela cykelns längd. En lugn miljö är särskilt viktig under de första 2 minuterna.
6. Borttagning av prov
- När cykeln är klar klickar du på Nästa för att höja mäthuvudet och generera provanalysrapporten.
OBS: För rapporten beräknar programvaran inspelade data och ritar automatiskt två kurvor som visar utvecklingen av den viskösa och den elastiska modulen i förhållande till deformationen som utövas på provet och visar den linjära viskoelastiska regimen (dvs. en platå vid låg deformation) om den finns. Om ingen linjär regim detekteras extraheras värdena för G', G", G* och tan δ vid 0,05 stam. Dessutom beräknas delningsspänningen och utbytesspänningen (γc och σc) vid solbränna δ = 1. Data tillhandahålls också i kalkylblad för varje steg för vidare analys. - När mäthuvudet är helt indraget, lyft upp skyddskåpan, kassera provet och ta försiktigt bort plattorna. Rengör och desinficera plattorna med varmt vatten och tvål.
OBS: Torka geometrin noggrant före upprepad användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar noggrannheten och repeterbarheten för reologiska mätningar med koncentrationsberoende kurvor för viskoelastisk kontroll, dvs. polyetenoxidlösning (PEO) och status asthmaticus (SA) slem. Mätningar av viskoelastiska egenskaper hos 8 MDa PEO vid fem olika koncentrationer (1%, 1,5%, 2%, 2,5% och 3%) jämfördes direkt mellan den utvärderade bänkskivans reometer och en traditionell bulkreometer (materialtabell). I motsats till SA-slem var PEO-lösningar viskösa dominerade (G " > G ') i hela stamområdet och uppvisade inte crossover och presenterade därför ett fastliknande beteende. Dessutom bekräftade tredubbla mätningar utförda på 1,5% PEO-lösning och kliniskt SA-slemprov att linjära viskoelastiska egenskaper (G *, G 'och G") var mycket repeterbara (<10% variationskoefficient) för de värden som erhölls från det biologiska provet.
Observationen av lobar kollaps hos SA-patienten föreslog att slempluggning kunde komplicera förmågan att mekaniskt ventilera lungorna och ökade möjligheten att icke-standardiserade, mukolytiska terapier kunde övervägas. I figur 2 användes protokollet som beskrivs häri för att mäta förändringar i slemets viskoelastiska egenskaper efter behandling med ett mukolytiskt medel. Medan NAC har godkänts för användning med KOL och CF, Det visade sig ha långsam kinetik och låg potens som ett reduktionsmedel21. TCEP har visat sig vara mycket effektivt för att modifiera de biofysiska egenskaperna hos slem22. Effekterna av TCEP på SA-slemviskopelasticitet testades i klinisk miljö med hjälp av bänkskivans reometer. Mukolytisk behandling resulterade i ett mer vätskeliknande prov med en minskning av den komplexa modulen (G*) med 4,6 gånger, elastisk modul (G') med 5,1 gånger, viskös modul (G") med 1,9 gånger, crossover-töjning (γc) med 3,3-faldig och crossover-utbytesspänning (σc) med 5,7-faldig och en ökning av dämpningsförhållandet (tan δ) med 2,8 gånger.
| Zon | Parameter | Symbol | Enhet | Definition | Betydelse | ||||
| Linjär viskoelastisk regim (LVR) | Komplex modul | G* | Pa | Representativt viskoelastiskt beteende i linjärregimen | Övergripande motstånd mot deformation av det molekylära nätverket | ||||
| G* = σ/γ | |||||||||
| Elastisk modul | G' | Pa | Materialets elasticitet i linjärregimen | Styvhet hos den molekylära strukturen i vila, relaterad till molekylär nätverksstyvhet | |||||
| →0 : mjuk →∞ : styv |
|||||||||
| Viskös modul | G" | Pa | Viskositeten hos materialet i linjärregimen | Irreversibel förlust av energi medan strukturen rör sig under mycket låg belastning | |||||
| →0 : rent fast ämne →∞ : dissipativ |
|||||||||
| Dämpande faktor | solbränna δ | Enhetslös | Dämpningsfaktor i den linjära regimen | Energiavledningsfaktor, relaterad till molekylärnätverksmorfologin. Varje förändring indikerar en förändring i molekylär natur. | |||||
| solbränna δ= G''/G' | →0 : rent fast ämne =1: smutsig/flytande övergång →∞: ren vätska |
||||||||
| Gel Punkt | Kritisk eller crossover-stam | γc | Enhetslös | Stam vid byte från gel till flödesbeteende | Gelens töjbarhet, den totala deformation som behövs för att starta ett flöde eller bryta ett fast ämne | ||||
| →0 : spröd →∞ : flexibel |
|||||||||
| Kritisk eller crossover-avkastningsstress | σc | Pa | Stress när du byter till flödesbeteende | Gelens styrka, mängden kraft som behövs för att starta ett flöde eller bryta ett fast ämne | |||||
| →0 : svag →∞ : stark |
|||||||||
Tabell 1: Linjära viskoelastiska moduli- och gelpunktsegenskaper uppmätta med bänkskivans reometer. Enheten utför snabba mätningar med dynamisk svängning med ett skjuvspänningssvep för att ge linjära viskoelastiska (G ', G ", G * och tan δ) moduli- och gelpunktsegenskaper (γc och σc) inom ~ 5 min. Parametrar, symboler, enheter och en kort beskrivning av mätningarna tillhandahålls.
Figur 1: Mätningar av de viskoelastiska egenskaperna hos PEO-lösningar och SA-slem. Lösningar av 8 MDa PEO bereddes i koncentrationer 1%, 1,5%, 2%, 2,5% och 3%. SA slem skördades under en bronkoskopi förfarande. För mätningar med hjälp av bänkskivans reometer användes 25 mm grova plattor och 500 μl av provet. För mätningarna med den traditionella bulkreometern användes 20 mm parallella släta plattor och 30 μl PEO-lösningar. Båda mätningarna kördes med en frekvens av 1 Hz. (A) Kurvor erhållna från en enda cykel som analyserade 1%, 1,5%, 2%, 2,5% och 3% 8 MDa PEO, som visar utvecklingen av den elastiska modulen (G ') i blått (i) och viskös modul (G") i rött (ii). (B) Kurvor som jämför elastisk (i) och viskös moduli (ii) för ökande koncentrationer av PEO-lösningar, analyserade med bänkskivor och traditionella reometrar vid 5% töjning. (C) Kurvor som visar utvecklingen av G' och G' av SA-slem, mätt med bänkskivans reometer. Pil indikerar crossover-stam (γc), vilket betecknar en övergång från mjukt fast till vätskeliknande beteende. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Effekter av TCEP-behandling på viskoelasticiteten hos SA-slem. SA-slem analyserades före (icke-behandlad eller NT) och efter TCEP-behandling (TCEP). Behandlingen bestod av tillsats av 2 μl 5 mM TCEP-lösning till 500 μL alikvoter (slutlig TCEP-koncentration på 20 μM). NT- och TCEP-behandlade prover inkuberades i 20 minuter vid 37 °C och blandades genom att snärta på rörets botten var 2:e minut före analys. Mätningarna utfördes under oscillerande belastning vid en frekvens av 1 Hz. (A) Kurvor från NT- och TCEP-behandlat SA-slem som visar utvecklingen av (i) elastisk (G') och (ii) viskös (G") moduli. Den horisontella svarta streckade linjen indikerar den linjära viskoelastiska regimen (LVR) och den vertikala svarta prickade linjen indikerar 5% töjningsreferens i händelse av att en LVR inte kunde fastställas. (B) Jämförelse av komplex modul (G*), elastisk modul (G'), viskös modul (G), dämpningsförhållande (solbränna δ), delningsspänning (γc) och delningsutbytesspänning (σc) för NT- och TCEP-behandlat slem som härletts från motsvarande kurvor. Statistisk analys utfördes och p-värden förvärvades med hjälp av parade t-tester. Värden för alla diagram visas som ±SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De unika viskoelastiska egenskaperna hos slem är viktiga för att upprätthålla friska luftvägar. Interna och externa faktorer kan förändra luftvägsslem biofysiska egenskaper, vilket orsakar kliniska komplikationer som är karakteristiska för muco-obstruktiva sjukdomar. Därför kan övervakning av förändringar i slemviskopelasticitet övervägas vid bedömningar av sjukdomsstatus och utforskning av terapier som minskar slemviskopelasticitet. Empiriska studier från 1980-talet visade en stark korrelation mellan slemreologi och luftvägsavstånd med hjälp av magnetiska pärlreometrar 23,24. Under de senaste åren har reologi utvecklats för att dra nytta av flera tekniker som analyserar slem i olika skalor. Till exempel använder mikrorheologiska analyser mikroskopiska sonder för att beskriva lokala slemegenskaper baserat på rörelsen av magnetiska eller fluorescerande partiklar i mikrometerstorlek. Eftersom denna teknik använder små provvolymer kan det dock vara svårt att få representativa data som beskriver heterogena prover såsom sputum. Vidare kräver mikrorheologianalyser högupplösta mikroskop, betydande beräkningsförmåga och tidskrävande analyser och är därför dåligt lämpade för utbredd laboratorie- eller klinikanvändning.
Även om mikrorheologi och makrorheologi vanligtvis inte är jämförbara, gäller liknande begränsningar för sedan länge etablerade anordningar, såsom bulkreometrar för kon/parallella plattor. Makrorheologi utförs med hjälp av precisionsinstrument utrustade med roterande koner, plattor, koppar och / eller rotorer av olika dimensioner för att mäta extremt små vridmoment och förskjutningar ner till sub nN. m och sub Å intervall. För att uppnå så hög precision kräver de flesta kommersiella reometrar en direkt anslutning till ett tryckluftsförsörjnings- och kylsystem i en miljö fri från olja, damm eller buller och med en kontrollerad omgivningstemperatur och luftfuktighet för att förhindra artefaktbildning. Dessutom, medan traditionella bulkreometrar kan mäta ett brett spektrum av material via justering av specifika variabler, tar kalibrering av dessa instrument betydande tid och kräver omfattande utbildning.
Däremot var Rheomuco bänkrometrar speciellt utformad för att mäta de viskoelastiska egenskaperna hos slem och sputum och kräver ett enda kalibreringssteg för att utföra linjära viskoelastiska och gelpunktsmätningar inom några minuter. Denna bänkskiva använder ett enkelt och standardiserat protokoll för att producera snabba och exakta viskoelastiska mätningar utan behov av omfattande utbildning i instrumentkalibrering eller reologisk dataanalys / beräkning. Anordningen arbetar genom att mäta vridmoment och förskjutning efter svängningar med kontrollerad vinkelförskjutning för att producera en töjningssvepkurva och upprätta en linjär viskoelastisk regim eller LVR (ett område med enhetligt viskoelastiskt svar på töjning, indikerat med en horisontell streckad linje i figur 2A), innan den når den punkt där provet ger. I de flesta fall ligger sputumprover inom LVR över 1% -10% töjningsintervallet. När en LVR inte detekteras hänvisas det vanligtvis till värdet vid 5% stam för att rapportera om provets viskoelastiska egenskaper. Frånvaron av ett detekterat LVR ogiltigförklarar inte mätningen, utan återspeglar snarare ett prov vars egenskaper skiljer sig (mer plast) från de flesta prover. Känsligheten hos detta instrument är optimerad för att matcha behoven hos viskösa och elastiska vätskor nära slem samtidigt som det ger hög tolerans mot mekaniskt brus, vilket gör det idealiskt för studier av biologiska vätskor i kliniska miljöer; Det kan dock inte vara lämpligt att studera andra viskoelastiska material med extremt låg (t.ex. saliv) eller extremt hög (t.ex. koltjära) elastisk eller viskös moduli som ett resultat av begränsade programvaruparametrar och oförmågan att manipulera variabler som plattform, yta, avstånd och rotationsfrekvens. De koncentrationsberoende reologiska mätningarna på PEO 8 MDa (figur 1) möjliggjorde uppskattningen av känsligheten (dvs. den nedre detektionsgränsen) för denna enhet, som är mellan 0,3% och 0,4% av 8 MDa PEO eller <0,05 Pa för G*. En övre gräns kunde dock inte fastställas på grund av svårigheten att solubilisera PEO-koncentrationer som var högre än 3 %. Ändå kunde enheten rapportera G 'och G" för 3% 8 MDa PEO, vilket är mer viskoelastiskt än SA-slemprover (~ 5 gånger större G 'och 25 gånger större G" jämfört med SA), vilket tyder på ett relevant dynamiskt omfång för slembiospecimens. Det bör noteras att för att erhålla noggranna mätningar under svängningar måste en lämplig volym av provet placeras i mitten av plattan utan närvaro av bubblor. Under provbelastning kommer otillräcklig volym, luftbubblor och / eller placering utanför centrum att skapa otillräcklig kontakt med plattorna, vilket resulterar i lägre registrerade värden. Omvänt kommer provflöde att skapa överdriven skjuvspänning på grund av ytterligare dragkraft25.
Denna studie beskriver hur man bearbetar, lagrar och behandlar tjocka slemprover omedelbart efter insamling. En av de största utmaningarna som konfronterar studier av sputumreologi är den heterogena karaktären hos dessa prover och utvecklingen av standardiserade mätmetoder. Sputum är ett slemlösat ämne som ofta är förorenat med saliv som innehåller bakterier och matsmältningsenzymer som snabbt kan förändra mucinnätverket och påverka slemviskopelasticiteten. Därför är det viktigt att ta bort saliv från sputumprover omedelbart efter insamling och / eller före homogenisering. Av naturen är slem klibbigt och svårt att hantera, men användningen av positiva förskjutningspipetter underlättar homogenisering utan att kompromissa med mucinnätverket, möjliggör noggrann alikvotberedning och förenklar provbelastningen. Beroende på experimentet kanske provhomogenisering inte krävs men kan minimera variationen mellan replikat. Medan bearbetning av sputum omedelbart efter insamling rekommenderas, upprätthåller luftvägsslim unika biofysiska egenskaper efter frysning och upptining. Frysning och upptining kan dock påverka det övergripande reologin för ett prov. Därför bör endast prover som har genomgått liknande frys-/upptiningscykler jämföras med varandra. Vid testning av effekterna av mukoaktiva medel är initial provhomogenisering viktig för att optimera föreningsdiffusion. Läkemedelsleverans till lungorna via inandning begränsar volymerna som kommer åt målet (dvs. slempropp), men den ständiga slagen av flimmerhåren i kombination med mucociliär transport genererar en viss blandning av läkemedlet och målet. För att simulera in vivo-behandling kan små volymer av ett farmakologiskt medel appliceras direkt på prover och gradvis blandas genom regelbunden omrörning under inkubationstiden. Andra behandlingsmetoder (t.ex. läkemedelsnebulisering på provet i en petriskål) kan dock undersökas. Mild omrörning under inkubation kommer att säkerställa progressiv läkemedelspenetration utan att kompromissa med mucinnätverket på grund av mekanisk störning (t.ex. virvel eller ultraljudsbehandling). För närvarande används inte TCEP i kliniska miljöer, men andra mukoaktiva reagenser, såsom NAC, rhDNase, P-2119, ARINA-1 och PAAG undersöks för ett brett spektrum av muco-obstruktiva tillstånd 21,26,27,28. För konceptvalidering visades att detta protokoll kan användas för att upptäcka signifikanta förändringar i astmatiskt slem som svar på TCEP-behandling. Ett mer vätskeliknande slem producerades genom behandling med ett reduktionsmedel, vilket framgår av de lägre linjära viskoelastiska och gelpunktsmarkörerna, vilket tyder på en förbättring av clearanceförmågan. Även om rhDNase producerade enorma kliniska fördelar vid CF, används det vanligtvis inte för andra muco-obstruktiva sjukdomar, troligen på grund av kroniskt lägre extracellulära DNA-koncentrationer. Men under en akut virus- och bakterieinfektion kan ett starkt inflammatoriskt svar tillfälligt orsaka hög extracellulär DNA-koncentration och minska luftvägsclearance. Därför kan snabb ex vivo-testning av rhDNase-effekt från fall till fall ge vägledning för behandling av virus- och bakterieinducerad lunginflammation. Detta kan vara särskilt värdefullt mitt i COVID-19-pandemin, som orsakas av andningsviruset SARS-CoV-2.
Sammanfattningsvis ger den beskrivna enheten genomförbara, snabba och exakta reologiska åtgärder. Dessa egenskaper ger möjlighet att undersöka och övervaka statusen för luftvägssjukdomar, samt testa effekterna av nya mukoaktiva föreningar. Mätningarnas snabbhet och enkelhet gör det möjligt att utföra analyser utan att ådra sig komplikationer relaterade till frysning och /eller tidsmässiga effekter av långvarig lagring eller transport samtidigt som dessa analyser görs möjliga i en mängd olika miljöer. I slutändan kan detta tillvägagångssätt utforskas för val av personliga terapier från en panel av alternativ, vilket möjliggör skräddarsy i realtid av patientbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Detta dokument stöds av bidrag från Vertex Pharmaceuticals (Ehre RIA Award) och CFF-stödda Research EHRE20XX0.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capillary Pistons Tips | Gilson | CP1000 | |
| Discovery Hybrid Rheometer-3 | TA Instruments | DHR-3 Bulk Rheometer manufactured by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests. |
|
| Graphing Software | GraphPad Prism | GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis | |
| Microcentrifuge Tube | Costar | 3621 | |
| Peltier plate | TA Instruments | Temperature control system manufactured by TA Instruments in New Castle, DE |
|
| Polyethylene oxide | Sigma | 372838 | 8 MDa polymer used as mucus simulant |
| Positive Displacement Pipette | Gilson | M1000 | Pipette used for handling viscous solutions |
| Rheomuco | Rheonova | Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests. | |
| Rough Lower Geometries | Rheonova | D-1811-007 | 25mm Diameter |
| Rough Upper Geometries | Rheonova | U-1811-007 | 25mm Diameter |
| Smooth Upper Parallel Plate | TA Instruments | 20mm Diameter | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Sigma | 646547-10X1ML | TCEP: Potent reducing agent. |
References
- Button, B., et al. A periciliary brush promotes the lung health by separating the mucus layer from airway epithelia. Science. 337 (6097), 937-941 (2012).
- Boucher, R. C. Muco-obstructive lung diseases. New England Journal of Medicine. 380 (20), 1941-1953 (2019).
- Rose, M. C., Voynow, J. A. Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in health and disease. Physiological Reviews. 86 (1), 245-278 (2006).
- Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. Cystic fibrosis: An inherited disease affecting mucin-producing organs. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 52, 136-145 (2014).
- Morrison, C. B., Markovetz, M. R., Ehre, C. Mucus, mucins, and cystic fibrosis. Pediatric Pulmonology. 54, 84-96 (2019).
- Hill, D. B., Button, B., Rubinstein, M., Boucher, R. C. Physiology and Pathophysiology of Human Airway Mucus. Physiological Reviews. , (2022).
- Lin, V. Y., et al. Excess mucus viscosity and airway dehydration impact COPD airway clearance. European Respiratory Journal. 55 (1), 1900419 (2020).
- Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. The New England Journal of Medicine. 363 (23), 2233-2247 (2010).
- Tomaiuolo, G., et al. A new method to improve the clinical evaluation of cystic fibrosis patients by mucus viscoelastic properties. PloS One. 9 (1), 82297 (2014).
- Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (23), 9188-9192 (1990).
- Zahm, J. M., et al. Dose-dependent in vitro effect of recombinant human DNase on rheological and transport properties of cystic fibrosis respiratory mucus. The European Respiratory Journal. 8 (3), 381-386 (1995).
- Fuchs, H. J., et al. Effect of aerosolized recombinant human DNase on exacerbations of respiratory symptoms and on pulmonary function in patients with cystic fibrosis. The Pulmozyme Study Group. The New England Journal of Medicine. 331 (10), 637-642 (1994).
- Hubbard, R. C., et al. A preliminary study of aerosolized recombinant human deoxyribonuclease I in the treatment of cystic fibrosis. The New England Journal of Medicine. 326 (12), 812-815 (1992).
- Shak, S. Aerosolized recombinant human DNase I for the treatment of cystic fibrosis. Chest. 107, 2 Suppl 65-70 (1995).
- Ma, J. T., Tang, C., Kang, L., Voynow, J. A., Rubin, B. K. Cystic fibrosis sputum rheology correlates with both acute and longitudinal changes in lung function. Chest. 154 (2), 370-377 (2018).
- Donaldson, S. H., et al. Mucus clearance and lung function in cystic fibrosis with hypertonic saline. The New England Journal of Medicine. 354 (3), 241-250 (2006).
- Patarin, J., et al. Rheological analysis of sputum from patients with chronic bronchial diseases. Scientific Reports. 10 (1), 15685 (2020).
- Markovetz, M. R., et al. Endotracheal tube mucus as a source of airway mucus for rheological study. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (4), 498-509 (2019).
- Ramsey, K. A., et al. Airway mucus hyperconcentration in non-cystic fibrosis bronchiectasis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (6), 661-670 (2020).
- Dunican, E. M., et al. Mucus plugs in patients with asthma linked to eosinophilia and airflow obstruction. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 997-1009 (2018).
- Ehre, C., et al. An improved inhaled mucolytic to treat airway muco-obstructive diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (2), 171-180 (2019).
- Morrison, C. B., et al. Treatment of cystic fibrosis airway cells with CFTR modulators reverses aberrant mucus properties via hydration. The European Respiratory Journal. 59 (2), 2100185 (2021).
- Puchelle, E., Jacquot, J., Beck, G., Zahm, J. M., Galabert, C. Rheological and transport properties of airway secretions in cystic fibrosis-relationships with the degree of infection and severity of the disease. European Journal of Clinical Investigation. 15 (6), 389-394 (1985).
- Puchelle, E., Zahm, J. M., Quemada, D. Rheological properties controlling mucociliary frequency and respiratory mucus transport. Biorheology. 24 (6), 557-563 (1987).
- Cardinaels, R., Reddy, N. K., Clasen, C. Quantifying the errors due to overfilling for Newtonian fluids in rotational rheometry. Rheologica Acta. 58 (8), 525-538 (2019).
- Hancock, L. A., et al. Muc5b overexpression causes mucociliary dysfunction and enhances lung fibrosis in mice. Nature Communications. 9 (1), 5363 (2018).
- Adewale, A. T., et al. Novel therapy of bicarbonate, glutathione, and ascorbic acid improves cystic fibrosis mucus transport. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 63 (3), 362-373 (2020).
- Fernandez-Petty, C. M., et al. A glycopolymer improves vascoelasticity and mucociliary transport of abnormal cystic fibrosis mucus. JCI Insight. 4 (8), 125954 (2019).
