Summary
De viskoelastiske egenskapene til slim spiller en kritisk rolle i mucociliary clearance. Imidlertid krever tradisjonelle slim reologiske teknikker komplekse og tidkrevende tilnærminger. Denne studien gir en detaljert protokoll for bruk av et benkeplate-reometer som raskt og pålitelig kan utføre viskoelastiske målinger.
Abstract
Ved slim-obstruktive lungesykdommer (f.eks. astma, kronisk obstruktiv lungesykdom, cystisk fibrose) og andre luftveissykdommer (f.eks. virus/bakterielle infeksjoner), endres slimbiofysiske egenskaper ved begercellehypersekresjon, luftveisdehydrering, oksidativt stress og tilstedeværelse av ekstracellulært DNA. Tidligere studier viste at sputumviskoelastisitet korrelert med lungefunksjon og at behandlinger som påvirker sputumreologi (f.eks. mukolytika) kan gi bemerkelsesverdige kliniske fordeler. Generelt benytter reologiske målinger av ikke-newtonske væsker forseggjorte, tidkrevende tilnærminger (f.eks. parallelle/kjegleplate-revometere og/eller mikrobeadpartikkelsporing) som krever omfattende opplæring for å utføre analysen og tolke dataene. Denne studien testet påliteligheten, reproduserbarheten og følsomheten til Rheomuco, en brukervennlig stasjonær enhet som er designet for å utføre raske målinger ved hjelp av dynamisk oscillasjon med en skjærstammesveip for å gi lineær viskoelastisk moduli (G', G", G * og tan δ) og gelpunktegenskaper (γc og σc) for kliniske prøver innen 5 min. Enhetens ytelse ble validert ved hjelp av forskjellige konsentrasjoner av et slimsimulerende middel, 8 MDa polyetylenoksid (PEO), og mot tradisjonelle bulkreologimålinger. En klinisk isoler høstet fra en intubert pasient med status astmaticus (SA) ble deretter vurdert i triplikatmålinger og variasjonskoeffisienten mellom målingene er <10%. Ex vivo bruk av et potent slimreduserende middel, TCEP, på SA-slim resulterte i en fem ganger reduksjon i elastisk modulus og en endring mot en mer "væskelignende" oppførsel generelt (f.eks. høyere brunfarge δ). Sammen viser disse resultatene at det testede benkeplatens reometer kan gjøre pålitelige mål på slimviskoelastisitet i kliniske og forskningsmiljøer. Oppsummert kan den beskrevne protokollen brukes til å utforske effekten av mukoaktive legemidler (f.eks. rhDNase, N-acetyl cystein) på stedet for å tilpasse behandlingen fra sak til sak, eller i prekliniske studier av nye forbindelser.
Introduction
Muco-obstruktive luftveissykdommer, inkludert astma, kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS), cystisk fibrose (CF) og andre respiratoriske tilstander, som viral og bakteriell lungebetennelse, er utbredte helseproblemer over hele verden. Mens patofysiologien varierer sterkt mellom hver tilstand, er en vanlig nøkkelfunksjon unormal mucociliary clearance. I sunne lunger linjer slim luftveisepitelet for å fange inhalerte partikler og gi en fysisk barriere mot patogener. Når det er utskilt, blir luftveisslim, sammensatt av ~ 97,5% vann, 0,9% salt, ~ 1,1% kuleformede proteiner og ~ 0,5% mucins, gradvis transportert mot glottis ved koordinert juling av cilia 1,2. Mucins er store O-koblede glykoproteiner som samhandler via ikke-kovalente og kovalente bindinger for å gi de distinkte viskoelastiske egenskapene til slim, som kreves for effektiv transport3. Endringer i ultrastruktur av mucinnettverket forårsaket av endret iontransport, mucin utfoldelse, elektrostatiske interaksjoner, krysskobling eller endringer i sammensetningen kan påvirke slimviskoelastisiteten betydelig og svekke mukopiliarclearance 4,5. Derfor er identifisering av endringer i de biofysiske egenskapene til luftveisslim avgjørende for å forstå sykdomspatogenese og teste nye mukoaktive forbindelser6.
Ulike faktorer kan føre til produksjon av avvikende slim i lungene. Ved KOLS utløser kronisk innånding av sigarettrøyk slimhyperseretion som følge av begercellemetasi, samt luftveisdehydrering via nedregulering av den cystiske fibrosetransmembrane ledningsregulatoren (CFTR) -kanalen, forårsaker slim hyperkonsentrasjon og liten luftveisobstruksjon 7,8. På samme måte er CF, en genetisk lidelse forbundet med mutasjoner i CFTR-genet, preget av produksjon av viskøs, tilhengerslim som er utilstrekkelig for transport 8,9. Kort sagt, CFTR dysfunksjon induserer luftveier overflate væske uttømming, polymer mucin innvikling, og økt biokjemisk interaksjoner, noe som resulterer i kronisk betennelse og bakterielle infeksjoner. I tillegg forverrer inflammatoriske celler fanget i statisk slim ytterligere viscoelasticity av slim ved å legge til et annet stort molekyl, DNA, inn i gelmatrisen, forverre luftveisobstruksjon5. Et av de beste eksemplene på betydningen av slimreologi på lungenes generelle helse er gitt av eksempelet på rekombinant human DNFase (rhDNase) i behandlingen av cystiske fibrosepasienter. Effektene av rhDNase ble først demonstrert ex vivo på eksorated sputum, som viste en overgang fra viskøs slim til en flytende væske i løpet av minutter10,11. Kliniske studier hos CF-pasienter viste at reduksjon av luftveisslim viskoelastisitet med rhDNase-innånding reduserte frekvensen av lungeforverringer, og forbedret lungefunksjon og generell pasienttilpasning 12,13,14. Som et resultat ble rhDNase-innånding med sikte på å lette clearance standarden for omsorg for CF-pasienter i mer enn to tiår. Lignende kliniske fordeler ble observert ved bruk av inhalert hypertonisk saltvann for slimhydrering i CF, som korrelerte med endringer i reologiske egenskaper og resulterte i mukociliær clearance akselerasjon og forbedret lungefunksjon15,16. Derfor er en rask og pålitelig protokoll for å måle slimviskoelastiske egenskaper i kliniske omgivelser viktig for å optimalisere terapeutiske tilnærminger.
Benkeplatens reometertestet heri gir et raskt og praktisk alternativ for å utføre omfattende viskoelastiske målinger av slim/ sputumprøver. Ved hjelp av dynamiske svingninger med kontrollert vinkelforskyvning gir instrumentet deformasjon via et par justerbare parallelle plater (f.eks. grove eller glatte geometrier) for å måle dreiemomentet og forskyvningen med oppløsninger på 15 nN. henholdsvis m og 150nm. En standardisert kalibrering kombinert med brukerretningslinjer tilpasset ikke-reologispesialister gir enkel måling og reduserer risikoen for operatørfeil. Enheten produserer en strekksveipkurve som behandles og analyseres i sanntid (innen ~5 min) og gir automatisk både lineære viskoelastiske (G', G", G*, og tan δ) og gelpunktegenskaper (γc og σc) (se tabell 1). Den elastiske eller lagringsmodulus (G') beskriver hvordan en prøve reagerer på stress (dvs. evnen til å gå tilbake til sin opprinnelige form), mens viskøs eller tap modulus (G") beskriver energien dissipated per syklus av sinusformet deformasjon (dvs. energien tapt på grunn av friksjon av molekyler). Den komplekse eller dynamiske modulusen (G*) er forholdet mellom stress og belastning, som beskriver mengden intern kraftoppbygging som svar på en skjæreforskyvning (dvs. de generelle viskoelastiske egenskapene). Dempingsfaktoren (brunfarge δ) er forholdet mellom det viskøse moduluset og det elastiske moduluset, som indikerer en prøves evne til å spre energi (dvs. en lav brunfarge δ indikerer en elastisk dominerende / solid-lignende oppførsel, mens en høy brunfarge δ indikerer en viskøs-dominerende / væskelignende oppførsel). For gelpunktegenskaper er crossoverstammen (γc) målet på skjærstammen, beregnet av forholdet mellom avbøyningsbanen og skjærgaphøyden, hvor prøven går fra en solid-lignende til en væskelignende oppførsel og oppstår per definisjon ved oscillasjonsstamme der G ' = G" eller brunfarge δ = 1. Crossover yield stress (σc) er et mål på mengden stress som påføres av enheten der den elastiske og viskøse moduli krysser. I sunn sputa dominerer elastisitet den mekaniske responsen på belastning (G' > G"). Ved slim-obstruktive sykdommer øker både G' og G" som følge av patologiske slimendringer 17,18,19. Den operative enkelheten til enheten letter målinger på stedet og omgår behovet for prøvelagring / transport / forsendelse til et anlegg utenfor stedet for analyse og dermed unngå tid og fryse-tine effekter på egenskapene til disse biologiske prøvene.
I denne studien ble 8 MDa polyetylenoksid (PEO) løsninger av forskjellige konsentrasjoner (1%-3%) brukt til å validere måleområdet til et kommersielt benkeplate-reometer (Materialfortegnelse) og den oppnådde konsentrasjonsavhengige kurven ble direkte sammenlignet med målinger oppnådd med et tradisjonelt bulkreometer (Tabell over materialer) ). Repeterbarheten av reologiske målinger ble deretter vurdert ved hjelp av bronkoskopisk høstet slim fra en intubert pasient som lider av status astmaticus (SA), en ekstrem form for astmaforverring preget av bronkospasme, eosinofil betennelse og slimhyperproduksjon som svar på et miljø- eller smittsomt middel 820 . I dette tilfellet hadde SA-pasienten blitt intubert for alvorlig åndedrettssvikt og krevde ECMO (ekstrakorporeal membranoksygenering) på grunn av manglende evne til å støtte pasienten effektivt og trygt med mekanisk ventilasjon alene, til tross for aggressive standard astmabehandlinger. Under en klinisk indikert bronkoskopi for lobarkollaps ble tykke, klare, tålmodige sekreter bemerket å hindre lobar bronkier og ble aspirert ved hjelp av saltvannsvask. Umiddelbart etter innsamling ble overflødig saltvann fjernet fra aspireringen, og de viskoelastiske egenskapene til den gjenværende SA-prøven ble analysert ved hjelp av benkplatenheten. Ytterligere prøve aliquots ble behandlet med et reduksjonsmiddel, tris (2-karboksylethyl) fosfinhydroklorid (TCEP), for å avgjøre om denne protokollen kan brukes til å karakterisere terapeutisk sammensatt effekt ex vivo.
Resultatene viste at denne protokollen og benkeplaten kan brukes effektivt i en klinisk setting. De revologiske egenskapene som ble bestemt fra PEO konsentrasjonsavhengige kurver (figur 1A) var uutslettelige mellom den testede benkeplaten og et tradisjonelt parallellplaterometer (figur 1B). Triplikatmålinger av SA-slimet var repeterbare, med en 10 % variasjonskoeffisient for G*-, G- og G-endepunkter og reflekterte de betydelige abnormitetene i slimviskoelastisitet som var klinisk tydelige i denne pasientens tilfelle (figur 1D). Til slutt resulterte ex vivo-behandling med TCEP i en betydelig reduksjon i G' og G", og en økning i brunfarge δ, noe som viste respons på behandlingen ved endringer i mucinnettverket (figur 2). Til slutt gir denne protokollen ved hjelp av et benkeplate-reometer en enkel og effektiv tilnærming for å vurdere viskoelastiske egenskaper til slimprøver hentet fra klinikken. Denne evnen kan brukes til å lette presisjonsmedisinske tilnærminger til omsorg, da klinikere kan teste effekten av godkjente mukoaktive legemidler på stedet, noe som kan bidra til å identifisere alternative behandlingsalternativer. I tillegg kan denne tilnærmingen brukes i kliniske studier for å undersøke effekten av undersøkelsesmedisiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I den nåværende studien ble det samlet inn prøver under en klinisk indikert bronkoskopi etter å ha innhentet informert samtykke i henhold til en protokoll godkjent av UNC Institutional Review Board.
1. Sputum / slim samling og lagring
- Samle airway slim via sputum samling eller bronkoskopi aspirasjon.
- Samle sputum enten via spontan ekspektorasjon eller indusere sputum med 3% hypertonisk saltvannsinhalasjon. Alternativt kan du direkte aspirere slim fra luftveiene under en bronkoskopiprosedyre.
- Oppbevar oppsamlet luftveissputum/slim i sterile prøvekopper. Ved sputum, fjern overflødig spytt fra prøven umiddelbart ved innsamling.
- Plasser prøvene på is for transport. Begrens transporttiden til mindre enn 4 timer.
- Analyser prøvene på tidspunktet for innsamling eller oppbevar ved -80 °C til de er behandlet.
- Før lagring, homogeniser slimet ved å forsiktig pipettere opp og ned tre til fem ganger med en positiv forskyvningspipette eller pipette direkte inn i mikrocentrifugerørene.
- Aliquot prøvene for lagring i volumer ≥500 μL for å sikre tilstrekkelig volum for eksperimenter.
MERK: Frysing og opptining kan påvirke de viskoelastiske egenskapene til prøven. Sammenlign bare prøver som har gjennomgått lignende fryse-/tinesykluser.
2. Prøvepreparering
- Pipette friske og frosne sputa/slim direkte eller homogenisere prøver ved hjelp av en positiv forskyvning pipette ved forsiktig pipettering opp og ned tre til fem ganger før aliquoting.
MERK: Homogenisering er viktig for prøver som inneholder tykke plugger som kan påvirke reproduserbarheten. - Aliquot 400-500 μL av prøven i separate mikrocentrifugerør. Forbered så mange aliquots som nødvendig for gjentatte målinger og /eller behandling med farmakologiske reagenser (f.eks. rhDNase, N-acetyl cystein). Inkuber aliquots som skal testes ved 37 °C i minst 5 minutter før måling.
- For testing av farmakologiske midler (valgfritt), bruk høye konsentrasjoner av lagerløsninger for å forhindre prøvefortynning.
- Tilsett mellom 0,4 % og 10 % volum (for å minimere prøvefortynning) av ønsket reagens (f.eks. TCEP) direkte på prøven. Pass på at ingen dråpe av forbindelsen forblir på siden av røret.
- Inkuber prøvene ved 37 °C i ønsket tid for å tillate en kjemisk reaksjon (<1 h for å forhindre proteolytisk nedbrytning av slimet).
- Bland slimprøven og reagenset ved å flikke bunnen av mikrocentrifugerøret hvert 2. minutt for å tillate progressiv penetrasjon av reagenset i slimprøven uten å gå på kompromiss med mucinnettverket (f.eks. etterligning av ciliary banking og mucociliary clearance). Når du sammenligner flere legemiddelreagenser, må du sørge for at inkubasjonstiden er lik.
3. Instrumentinitialisering og kalibrering
- Slå på maskinen (Materialliste) og initialiser programvaren.
- Velg Ny måling. Angi prøveidentifikasjonsnummeret under Mål-ID og navnet på operatoren under Operatør for å fortsette. Skriv inn tilleggsinformasjon eller kommentarer under Kommentarer.
- Velg et geometrisett (dvs. grove eller glatte 25 mm parallelle plater) og inspiser store og små plater nøye for å sikre at platene er rene og i perfekt stand).
MERK: Grove plater er designet for store volumer (350-500 μL) og glatte plater er designet for mindre volumer (250-350 μL). Hvis du bruker et lavere eller høyere prøvevolum enn anbefalt, kan det føre til unøyaktige målinger. - Sett den store platen godt inn på den nederste prekestolen.
- Sett den lille platen forsiktig på øvre prekestol og lås platen ved å rotere litt til du hører et "klikk", noe som indikerer at platen er ordentlig klemt. Vær oppmerksom på at fri oscillasjon av overplaten er normalt.
- Vent til temperaturen når målverdien på 37 °C. Deretter starter du automatisk kalibrering som du blir bedt om av programvaren.
MERK: Ikke forstyrr maskinen eller benken under denne prosessen.
4. Prøve lasting
- Ved hjelp av en positiv forskyvningspipette pipetterer du langsomt mellom 250 og 500 μL av prøven på midten av den store bunnplaten. Når de er avsatt på platen, vil viskøse prøver vedta en kuppelform, mens svært elastiske prøver kan kreve fysisk kutting (bruk dissekeringssaks).
MERK: Unngå å introdusere luftbobler. Fjern om nødvendig gjenværende bobler ved å skyve bort med en pipettespiss. - Senk målehodet med den lille platen via programvaren og følg prøven. Hvis den er riktig lastet på bunnplaten, vil prøven komme i kontakt og være sentrert mellom de to platene.
- For å sikre at prøven fyller gapet (dvs. ved å spre seg til kantene på platene), bruker du Reduser avstand-funksjonen til prøven ikke lenger er i en bikoncave form eller er på linje med kanten av platene. Reduser avstand-funksjonen senker målehodet i trinn på 0,1 mm og er begrenset til syv trinn.
MERK: Overvåk prøven nøye og juster gapet gradvis for å unngå overspill.- Hvis det gjenstår et mellomrom etter syv trinn, klikker du på Gjør om installasjonen for å gå tilbake til startposisjonen og justere posisjonen og/eller volumet på prøven.
- Hvis gapet er overmåte redusert (f.eks. bikonveks form), fjern overflødig prøve med en slikkepott med en sirkulær bevegelse langs kanten av den øvre platen. Pass på å trimme overflødig prøve forsiktig for å unngå skjærspenning.
MERK: På slutten av dette trinnet skal kanten på prøven justeres etter kanten på den øvre platen som vist i brukerretningslinjene.
- Senk beskyttelsesdekselet for å unngå utilsiktet projeksjon av forurensede væsker under oscillasjon.
5. Initiere biofysisk måling
- For å starte målingen, klikk på Start analyse. En full syklus vil ta 4-7 min.
- Unngå å snakke høyt og berøre enheten eller benken under hele lengden av syklusen. Et rolig miljø er spesielt viktig de første 2 min.
MERK: I løpet av syklusen utfører instrumentet en standardisert strekksveiptest, som består av påfølgende oscillerende trinn. Hvert trinn er en serie på 10 svingninger ved konstant amplitude og frekvens (1 Hz), hvor det tilsvarende dreiemomentet måles i sanntid. Belastnings- og dreiemomentsignalene tillater beregning av komplekset (G*), elastisk (G' og viskøs (G") moduli, samt dempingsforholdet (brunfarge δ) ved hvert trinn. Svingningene øker gradvis i amplitude, noe som intensiverer deformasjonen som er pålagt prøven.
- Unngå å snakke høyt og berøre enheten eller benken under hele lengden av syklusen. Et rolig miljø er spesielt viktig de første 2 min.
6. Fjerning av prøve
- Når syklusen er fullført, klikker du på Neste for å heve målehodet og generere prøveanalyserapporten.
MERK: For rapporten beregner programvaren de registrerte dataene og grafer automatisk to kurver som viser utviklingen av viskøse og elastiske moduli i forhold til deformasjonen som utøves til prøven og viser det lineære viskoelastiske regimet (dvs. et platå ved lav deformasjon) hvis det er til stede. Hvis det ikke oppdages noe lineært regime, ekstraheres verdiene til G', G", G*, og brunfarge δ ved 0,05-stamme. I tillegg beregnes crossoverstammen og utbyttespenningen (γc og σc) ved brunfarge δ = 1. Data finnes også i regneark for hvert trinn for videre analyse. - Når målehodet er helt trukket tilbake, hev beskyttelsesdekselet, kast prøven og fjern platene forsiktig. Rengjør og desinfiser platene med varmt vann og såpe.
MERK: Tørk geometrisettet grundig før gjentatt bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser nøyaktigheten og repeterbarheten av reologiske målinger ved hjelp av konsentrasjonsavhengige kurver av viskoelastisk kontroll, det vil si polyetylenoksid (PEO)-løsning og status astmaticus (SA) slim. Målinger av viskoelastiske egenskaper ved 8 MDa PEO ved fem forskjellige konsentrasjoner (1%, 1,5%, 2%, 2,5% og 3%) ble direkte sammenlignet mellom det evaluerte benkeplatens reometer og et tradisjonelt bulkreometer (Materialtabell). I motsetning til SA-slim var PEO-løsninger viskøsdominerte (G" > G') i hele strekkområdet og viste ikke crossover og presenterte derfor en solid oppførsel. I tillegg bekreftet triplikatmålinger utført på 1,5 % PEO-oppløsning og klinisk SA-slimprøve at lineære viskoelastiske egenskaper (G*, G og G») var svært repeterbare (<10 % variasjonskoeffisient) for verdiene som ble oppnådd fra den biologiske prøven.
Observasjonen av lobarkollaps i SA-pasienten antydet at slimplugging kunne komplisere evnen til mekanisk ventilering av lungene og økte muligheten for at ikke-standard, mukolytiske terapier kunne vurderes. I figur 2 ble protokollen som er beskrevet her, brukt til å måle endringer i slimets viskoelastiske egenskaper etter behandling med et mukolytisk middel. Mens NAC er godkjent for bruk med KOLS og CF, ble det vist seg å ha langsom kinetikk og lav styrke som reduksjonsmiddel21. TCEP har vist seg å være svært effektiv til å modifisere de biofysiske egenskapene til slim22. Effektene av TCEP på SA slimviskoelastisitet ble testet i en klinisk setting ved hjelp av benkeplatens reometer. Mukolytisk behandling resulterte i en mer væskelignende prøve med en reduksjon i den komplekse modulen (G*) med 4,6 ganger, elastisk modulus (G') x 5,1 ganger, viskøs modulus (G") med 1,9 ganger, crossover-belastning (γc) med 3,3 ganger og crossover utbyttespenning (σc) med 5,7 ganger, og en økning i dempingsforholdet (brunfarge δ) med 2,8 ganger.
| Sone | Parameter | Symbol | Enhet | Definisjon | Betydning | ||||
| Lineært viskoelastisk regime (LVR) | Kompleks modulus | G* | Pa | Representativ viskoelastisk oppførsel i det lineære regimet | Generell motstand mot deformasjon av molekylærnettverket | ||||
| G* = σ/γ | |||||||||
| Elastisk modulus | G' | Pa | Elastisitet av materialet i det lineære regimet | Stivhet av den molekylære strukturen i ro, relatert til molekylær nettverksstivhet | |||||
| →0 : myk →∞ : stiv |
|||||||||
| Viskøs Modulus | G" | Pa | Viskositet av materialet i det lineære regimet | Irreversibel tap av energi mens strukturen beveger seg under svært lav belastning | |||||
| →0 : rent heldekkende →∞ : avledende |
|||||||||
| Dempingsfaktor | brunfarge δ | Enhetløs | Dempingsfaktor i det lineære regimet | Energispredningsfaktor, relatert til molekylær nettverksmorfologi. Enhver endring indikerer en endring i molekylær natur. | |||||
| brunfarge δ= G''/G' | →0 : rent heldekkende =1: skitten/flytende overgang →∞ : ren væske |
||||||||
| Gel-punkt | Kritisk eller crossover-belastning | γc | Enhetløs | Belastning når du bytter fra gel til strømningsadferd | Strekkbarhet av gelen, den totale deformasjonen som trengs for å starte en strømning eller bryte en solid | ||||
| →0 : sprø →∞ : fleksibel |
|||||||||
| Kritisk eller crossover yield stress | σc | Pa | Stress når du bytter til flytatferd | Gelens styrke, mengden kraft som trengs for å starte en strømning eller bryte en solid | |||||
| →0 : svak →∞ : sterk |
|||||||||
Tabell 1: Lineære viskoelastiske moduli- og gelpunktegenskaper målt ved benkeplatens reometer. Enheten utfører raske målinger ved hjelp av dynamisk oscillasjon med en skjærstammesveip for å gi lineære viskoelastiske (G', G", G *, og brunfarge δ) moduli- og gelpunktegenskaper (γc og σc) innen ~ 5 min. Parametere, symboler, enheter og en kort beskrivelse av målingene er angitt.
Figur 1: Målinger av viskoelastiske egenskaper til PEO-løsninger og SA-slim. Løsninger på 8 MDa PEO ble fremstilt i konsentrasjoner 1%, 1,5%, 2%, 2,5% og 3%. SA slim ble høstet under en bronkoskopi prosedyre. For målinger ved hjelp av benkeplatens reometer ble det brukt 25 mm grove plater og 500 μL av prøven. For målingene ved hjelp av det tradisjonelle bulkreometeret ble det brukt 20 mm parallelle glatte plater og 30 μL PEO-løsninger. Begge målingene ble kjørt med en frekvens på 1 Hz. (A) Kurver oppnådd fra en enkelt syklus som analyserte 1%, 1,5%, 2%, 2,5% og 3% 8 MDa PEO, som viser utviklingen av den elastiske modulus (G') i blått (i) og viskøs modulus (G") i rødt (ii). (B) Kurver som sammenligner elastiske (i) og viskøse moduli (ii) for økende konsentrasjoner av PEO-løsninger, analysert av benkeplater og tradisjonelle revometere ved 5% belastning. (C) Kurver som viser utviklingen av G' og G" av SA-slim, målt ved benkeplatens reometer. Pil indikerer crossover-belastning (γc), som betegner en overgang fra mykfast til væskelignende oppførsel. (D) Grafer som viser tre replikerte målinger av (i) G*, (ii) G' og (iii) G"-verdier for henholdsvis 1,5 % PEO (svarte stolper) og SA-slim (gråstenger) i det lineære viskoelastiske regimet (LVR) eller ved henholdsvis 5 % belastning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Effekter av TCEP-behandling på viskoelastisiteten til SA-slim. SA-slim ble analysert før (ikke-behandlet eller NT) og etter TCEP-behandling (TCEP). Behandlingen besto av å tilsette 2 μL 5 mM TCEP-oppløsning i 500 μL aliquots (endelig TCEP-konsentrasjon på 20 μM). NT- og TCEP-behandlede prøver ble inkubert i 20 minutter ved 37 °C og blandet ved å flikke bunnen av røret hvert 2. Målinger ble utført under oscillerende stamme med en frekvens på 1 Hz. (A) Kurver fra NT og TCEP-behandlet SA-slim som viser utviklingen av (i) elastisk (G') og (ii) viskøs (G") moduli. Den horisontale svarte stiplede linjen angir det lineære viskoelastiske regimet (LVR) og den vertikale svarte stiplede linjen indikerer 5% belastningsreferansen i tilfelle en LVR ikke kunne etableres. (B) Sammenligning av den komplekse modulus (G*), elastisk modulus (G'), viskøs modulus (G"), dempingsforhold (brunfarge δ), crossover-stamme (γc) og crossover yield stress (σc) av NT- og TCEP-behandlet slim avledet fra de tilsvarende kurvene. Statistisk analyse ble utført, og p-verdier ble anskaffet ved hjelp av parvise t-tester. Verdier for alle grafer vises som ±SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De unike viskoelastiske egenskapene til slim er avgjørende for å opprettholde sunne luftveier. Interne og eksterne faktorer kan endre luftveis slimbiofysiske egenskaper, noe som forårsaker kliniske komplikasjoner som er karakteristiske for slim-obstruktive sykdommer. Derfor kan overvåking av endringer i slimviskoelastisitet vurderes under vurderinger av sykdomsstatus og utforskning av terapier som reduserer slimviskoelastisitet. Empiriske studier fra 1980-tallet viste en sterk sammenheng mellom slimreologi og luftveisklaring ved hjelp av magnetiske perleimetre 23,24. De siste årene har reologi utviklet seg til å dra nytte av flere teknikker som analyserer slim i ulike skalaer. For eksempel bruker mikroheologiske analyser mikroskopiske sonder for å beskrive lokale slimegenskaper basert på bevegelsen av magnetiske eller fluorescerende mikrometre-størrelse partikler. Fordi denne teknikken bruker små prøvevolumer, kan det imidlertid være vanskelig å skaffe representative data som beskriver heterogene prøver som sputum. Videre krever mikroheologianalyser mikroskoper med høy oppløsning, betydelige beregningsevner og tidkrevende analyser, og er dermed dårlig egnet til utbredt laboratorie- eller klinikkbruk.
Selv om mikroheologi og makroheologi vanligvis ikke er sammenlignbare, gjelder lignende begrensninger for veletablerte enheter, for eksempel kegle/parallellplate bulkreometere. Makroheologi utføres ved hjelp av presisjonsinstrumenter utstyrt med roterende kjegler, plater, kopper og / eller rotorer av forskjellige dimensjoner for å måle ekstremt små dreiemomenter og forskyvninger ned til sub nN. m og sub Å-områder. For å nå så høy presisjon krever de fleste kommersielle reometere en direkte forbindelse med et trykklufttilførsels- og kjølesystem i et miljø uten olje, støv eller støy og med kontrollert omgivelsestemperatur og fuktighet for å forhindre artefaktdannelse. I tillegg, mens tradisjonelle bulkreometere kan måle et bredt spekter av materialer via justering av spesifikke variabler, tar kalibrering av disse instrumentene betydelig tid og krever omfattende opplæring.
Derimot ble Rheomuco benkeplate reometer spesielt designet for å måle de viskoelastiske egenskapene til slim og sputum og krever et enkelt kalibreringstrinn for å utføre lineære viskoelastiske og gelpunktmålinger i løpet av få minutter. Denne stasjonære enheten bruker en enkel og standardisert protokoll for å produsere raske og nøyaktige viskoelastiske målinger uten behov for omfattende opplæring i instrumentkalibrering eller reologisk dataanalyse /beregning. Enheten opererer ved å måle dreiemoment og forskyvning etter svingninger med kontrollert vinkelforskyvning for å produsere en strekksveipkurve og etablere et lineært viskoelastisk regime eller LVR (en region med jevn viskoelastisk respons på belastning, indikert med en horisontal stiplet linje i figur 2A), før den når punktet der prøven gir. I de fleste tilfeller er sputumprøver innenfor LVR over 1% -10% belastningsområdet. Når en LVR ikke oppdages, refereres det vanligvis til verdien ved 5 % belastning for å rapportere om de viskoelastiske egenskapene til prøven. Fraværet av en påvist LVR ugyldiggjør ikke målingen, men gjenspeiler heller en prøve hvis egenskaper er distinkte (mer plastiske) fra de fleste prøver. Følsomheten til dette instrumentet er optimalisert for å matche behovene til viskøse og elastiske væsker nær slim, samtidig som det gir høy toleranse for mekanisk støy, noe som gjør det ideelt for studiet av biologiske væsker i kliniske omgivelser; Det kan imidlertid ikke være egnet til å studere andre viskoelastiske materialer med ekstremt lave (f.eks. spytt) eller ekstremt høye (f.eks. kulltjære) elastiske eller viskøse moduli som følge av begrensede programvareparametere og manglende evne til å manipulere variabler som plateform, overflate, avstand og rotasjonsfrekvens. De konsentrasjonsavhengige reologiske målingene på PEO 8 MDa (figur 1) tillot estimering av sensitivitet (dvs. nedre deteksjonsgrense) for denne enheten, som er mellom 0,3% og 0,4% av 8 MDa PEO eller <0,05 Pa for G*. En øvre grense kunne imidlertid ikke etableres på grunn av vanskeligheten med å løse PEO-konsentrasjoner høyere enn 3%. Likevel var enheten i stand til å rapportere G' og G" for 3% 8 MDa PEO, som er mer viskoelastisk enn SA-slimprøver (~ 5 ganger større G' og 25 ganger større G" sammenlignet med SA), noe som tyder på et relevant dynamisk område for slim biospecimens. Det skal bemerkes at for å oppnå nøyaktige målinger under svingninger, må et passende volum av prøven plasseres i midten av platen uten tilstedeværelse av bobler. Under prøvelasting vil utilstrekkelig volum, luftbobler og/eller off-center plassering skape utilstrekkelig kontakt med platene, noe som resulterer i lavere registrerte verdier. Omvendt vil prøveoverflyt skape overdreven skjærspenning på grunn av ekstra drakraft25.
Denne studien beskriver hvordan du behandler, lagrer og behandler tykke slimprøver umiddelbart etter innsamling. En av hovedutfordringene som konfronterer studier av sputumreologi er den heterogene karakteren av disse prøvene og utviklingen av standardiserte målemetoder. Sputum er et ekspektorert stoff som ofte er forurenset med spytt som inneholder bakterier og fordøyelsesenzymer som raskt kan endre mucinnettverket og påvirke slimviskoelastisitet. Derfor er det viktig å fjerne spytt fra sputumprøver umiddelbart ved innsamling og /eller før homogenisering. Av natur er slim klebrig og vanskelig å håndtere, men bruken av positive forskyvningspipetter letter homogenisering uten å gå på kompromiss med mucinnettverket, muliggjør nøyaktig aliquot-forberedelse og forenkler prøvebelastning. Avhengig av eksperimentet kan det hende at samplingshomogenisering ikke er nødvendig, men kan minimere variasjonen mellom replikeringer. Under behandling av sputum umiddelbart etter innsamling anbefales, opprettholder luftveisslim unike biofysiske egenskaper etter frysing og opptining. Frysing og opptining kan imidlertid påvirke den generelle reologien til en prøve. Derfor bør bare prøver som har gjennomgått lignende fryse-/tinesykluser sammenlignes med hverandre. Når du tester effekten av mukoaktive midler, er innledende prøvehomogenisering viktig for å optimalisere sammensatt diffusjon. Legemiddellevering til lungene via innånding begrenser volumene som får tilgang til målet (dvs. slimplugg), men den konstante julingen av cilia kombinert med mucociliary transport genererer en viss blanding av stoffet og målet. For å simulere in vivo-behandling kan små mengder farmakologisk middel påføres direkte på prøver og gradvis blandes ved regelmessig agitasjon gjennom inkubasjonstid. Imidlertid kan andre behandlingsmetoder (f.eks. legemiddelnebulering på prøven i en Petri-tallerken) undersøkes. Skånsom agitasjon under inkubasjon vil sikre progressiv legemiddelinntrengning uten at det går på bekostning av mucinnettverket på grunn av mekanisk forstyrrelse (f.eks. virveldannelse eller sonikering). For tiden brukes TCEP ikke i kliniske omgivelser, men andre mucoactive reagenser, som NAC, rhDNase, P-2119, ARINA-1 og PAAG undersøkes for et bredt spekter av muco-obstruktive forhold 21,26,27,28. For konseptvalidering ble det vist at denne protokollen kan brukes til å oppdage betydelige endringer i astmatisk slim som svar på TCEP-behandling. Et mer væskelignende slim ble produsert ved behandling med et reduksjonsmiddel, som er tydelig fra de nedre lineære viskoelastiske og gelpunktmarkørene, noe som tyder på en forbedring i clearance-evnen. Selv om rhDNase ga enorme kliniske fordeler i CF, brukes den vanligvis ikke til andre muco-obstruktive sykdommer, sannsynligvis på grunn av kronisk lavere ekstracellulære DNA-konsentrasjoner. Men under en akutt virus- og bakterieinfeksjon kan en sterk inflammatorisk respons midlertidig forårsake høy ekstracellulær DNA-konsentrasjon og redusere luftveisklaring. Derfor kan rask ex vivo-testing av rhDNase-effekt fra sak til sak gi veiledning for behandling av viral- og bakterieindusert lungebetennelse. Dette kan være spesielt verdifullt blant COVID-19-pandemien, som er forårsaket av luftveisviruset SARS-CoV-2.
Oppsummert gir den beskrevne enheten gjennomførbare, raske og nøyaktige reologiske tiltak. Disse egenskapene gir potensial til å undersøke og overvåke statusen til luftveissykdommer, samt teste effekten av nye mucoactive forbindelser. Hurtigheten og enkelheten i målinger gjør det mulig å utføre analyser uten å pådra seg komplikasjoner knyttet til frysing og/eller tidsmessige effekter av langvarig lagring eller transport, samtidig som disse analysene er gjennomførbare i en rekke innstillinger. Til syvende og sist kan denne tilnærmingen utforskes for valg av personlige terapier fra et panel av alternativer, noe som muliggjør sanntids skreddersy av pasientbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Dette dokumentet støttes av tilskudd fra Vertex Pharmaceuticals (Ehre RIA Award) og CFF-støttet Research EHRE20XX0.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capillary Pistons Tips | Gilson | CP1000 | |
| Discovery Hybrid Rheometer-3 | TA Instruments | DHR-3 Bulk Rheometer manufactured by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests. |
|
| Graphing Software | GraphPad Prism | GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis | |
| Microcentrifuge Tube | Costar | 3621 | |
| Peltier plate | TA Instruments | Temperature control system manufactured by TA Instruments in New Castle, DE |
|
| Polyethylene oxide | Sigma | 372838 | 8 MDa polymer used as mucus simulant |
| Positive Displacement Pipette | Gilson | M1000 | Pipette used for handling viscous solutions |
| Rheomuco | Rheonova | Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests. | |
| Rough Lower Geometries | Rheonova | D-1811-007 | 25mm Diameter |
| Rough Upper Geometries | Rheonova | U-1811-007 | 25mm Diameter |
| Smooth Upper Parallel Plate | TA Instruments | 20mm Diameter | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Sigma | 646547-10X1ML | TCEP: Potent reducing agent. |
References
- Button, B., et al. A periciliary brush promotes the lung health by separating the mucus layer from airway epithelia. Science. 337 (6097), 937-941 (2012).
- Boucher, R. C. Muco-obstructive lung diseases. New England Journal of Medicine. 380 (20), 1941-1953 (2019).
- Rose, M. C., Voynow, J. A. Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in health and disease. Physiological Reviews. 86 (1), 245-278 (2006).
- Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. Cystic fibrosis: An inherited disease affecting mucin-producing organs. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 52, 136-145 (2014).
- Morrison, C. B., Markovetz, M. R., Ehre, C. Mucus, mucins, and cystic fibrosis. Pediatric Pulmonology. 54, 84-96 (2019).
- Hill, D. B., Button, B., Rubinstein, M., Boucher, R. C. Physiology and Pathophysiology of Human Airway Mucus. Physiological Reviews. , (2022).
- Lin, V. Y., et al. Excess mucus viscosity and airway dehydration impact COPD airway clearance. European Respiratory Journal. 55 (1), 1900419 (2020).
- Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. The New England Journal of Medicine. 363 (23), 2233-2247 (2010).
- Tomaiuolo, G., et al. A new method to improve the clinical evaluation of cystic fibrosis patients by mucus viscoelastic properties. PloS One. 9 (1), 82297 (2014).
- Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (23), 9188-9192 (1990).
- Zahm, J. M., et al. Dose-dependent in vitro effect of recombinant human DNase on rheological and transport properties of cystic fibrosis respiratory mucus. The European Respiratory Journal. 8 (3), 381-386 (1995).
- Fuchs, H. J., et al. Effect of aerosolized recombinant human DNase on exacerbations of respiratory symptoms and on pulmonary function in patients with cystic fibrosis. The Pulmozyme Study Group. The New England Journal of Medicine. 331 (10), 637-642 (1994).
- Hubbard, R. C., et al. A preliminary study of aerosolized recombinant human deoxyribonuclease I in the treatment of cystic fibrosis. The New England Journal of Medicine. 326 (12), 812-815 (1992).
- Shak, S. Aerosolized recombinant human DNase I for the treatment of cystic fibrosis. Chest. 107, 2 Suppl 65-70 (1995).
- Ma, J. T., Tang, C., Kang, L., Voynow, J. A., Rubin, B. K. Cystic fibrosis sputum rheology correlates with both acute and longitudinal changes in lung function. Chest. 154 (2), 370-377 (2018).
- Donaldson, S. H., et al. Mucus clearance and lung function in cystic fibrosis with hypertonic saline. The New England Journal of Medicine. 354 (3), 241-250 (2006).
- Patarin, J., et al. Rheological analysis of sputum from patients with chronic bronchial diseases. Scientific Reports. 10 (1), 15685 (2020).
- Markovetz, M. R., et al. Endotracheal tube mucus as a source of airway mucus for rheological study. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (4), 498-509 (2019).
- Ramsey, K. A., et al. Airway mucus hyperconcentration in non-cystic fibrosis bronchiectasis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (6), 661-670 (2020).
- Dunican, E. M., et al. Mucus plugs in patients with asthma linked to eosinophilia and airflow obstruction. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 997-1009 (2018).
- Ehre, C., et al. An improved inhaled mucolytic to treat airway muco-obstructive diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (2), 171-180 (2019).
- Morrison, C. B., et al. Treatment of cystic fibrosis airway cells with CFTR modulators reverses aberrant mucus properties via hydration. The European Respiratory Journal. 59 (2), 2100185 (2021).
- Puchelle, E., Jacquot, J., Beck, G., Zahm, J. M., Galabert, C. Rheological and transport properties of airway secretions in cystic fibrosis-relationships with the degree of infection and severity of the disease. European Journal of Clinical Investigation. 15 (6), 389-394 (1985).
- Puchelle, E., Zahm, J. M., Quemada, D. Rheological properties controlling mucociliary frequency and respiratory mucus transport. Biorheology. 24 (6), 557-563 (1987).
- Cardinaels, R., Reddy, N. K., Clasen, C. Quantifying the errors due to overfilling for Newtonian fluids in rotational rheometry. Rheologica Acta. 58 (8), 525-538 (2019).
- Hancock, L. A., et al. Muc5b overexpression causes mucociliary dysfunction and enhances lung fibrosis in mice. Nature Communications. 9 (1), 5363 (2018).
- Adewale, A. T., et al. Novel therapy of bicarbonate, glutathione, and ascorbic acid improves cystic fibrosis mucus transport. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 63 (3), 362-373 (2020).
- Fernandez-Petty, C. M., et al. A glycopolymer improves vascoelasticity and mucociliary transport of abnormal cystic fibrosis mucus. JCI Insight. 4 (8), 125954 (2019).
