Summary
Le proprietà viscoelastiche del muco svolgono un ruolo fondamentale nella clearance mucociliare. Tuttavia, le tecniche reologiche tradizionali del muco richiedono approcci complessi e dispendiosi in termini di tempo. Questo studio fornisce un protocollo dettagliato per l'uso di un reometro da banco in grado di eseguire in modo rapido e affidabile misurazioni viscoelastiche.
Abstract
Nelle malattie polmonari muco-ostruttive (ad esempio, asma, broncopneumopatia cronica ostruttiva, fibrosi cistica) e in altre condizioni respiratorie (ad esempio, infezioni virali / batteriche), le proprietà biofisiche del muco sono alterate dall'ipersecrezione delle cellule caliciformi, dalla disidratazione delle vie aeree, dallo stress ossidativo e dalla presenza di DNA extracellulare. Studi precedenti hanno dimostrato che la viscoelasticità dell'espettorato è correlata alla funzione polmonare e che i trattamenti che influenzano la reologia dell'espettorato (ad esempio, i mucolitici) possono portare a notevoli benefici clinici. In generale, le misurazioni reologiche di fluidi non newtoniani impiegano approcci elaborati e dispendiosi in termini di tempo (ad esempio, reometri paralleli / cone-plate e / o tracciamento delle particelle di microsfere) che richiedono una formazione approfondita per eseguire il test e interpretare i dati. Questo studio ha testato l'affidabilità, la riproducibilità e la sensibilità di Rheomuco, un dispositivo da banco di facile utilizzo progettato per eseguire misurazioni rapide utilizzando l'oscillazione dinamica con una sweep di taglio-deformazione per fornire moduli viscoelastici lineari (G', G", G * e δ di abbronzatura) e caratteristiche del punto gel (γc e σc) per campioni clinici entro 5 minuti. Le prestazioni del dispositivo sono state convalidate utilizzando diverse concentrazioni di un simulante di muco, 8 MDa ossido di polietilene (PEO) e rispetto alle tradizionali misurazioni di reologia di massa. Un isolato clinico prelevato da un paziente intubato con stato asmatico (SA) è stato quindi valutato in misurazioni triplicate e il coefficiente di variazione tra le misurazioni è <10%. L'uso ex vivo di un potente agente riducente del muco, TCEP, sul muco SA ha comportato una diminuzione di cinque volte del modulo elastico e un cambiamento verso un comportamento più "liquido" in generale (ad esempio, una maggiore δ di abbronzatura). Insieme, questi risultati dimostrano che il reometro da banco testato può effettuare misurazioni affidabili della viscoelasticità del muco in contesti clinici e di ricerca. In sintesi, il protocollo descritto potrebbe essere utilizzato per esplorare gli effetti dei farmaci mucoattivi (ad esempio, rhDNasi, N-acetil cisteina) in loco per adattare il trattamento caso per caso o in studi preclinici di nuovi composti.
Introduction
Le malattie muco-ostruttive delle vie aeree, tra cui l'asma, la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), la fibrosi cistica (FC) e altre condizioni respiratorie, come la polmonite virale e batterica, sono preoccupazioni per la salute prevalenti in tutto il mondo. Mentre la fisiopatologia varia notevolmente tra ogni condizione, una caratteristica chiave comune è la clearance mucociliare anormale. Nei polmoni sani, il muco allinea l'epitelio delle vie aeree per intrappolare le particelle inalate e fornire una barriera fisica contro gli agenti patogeni. Una volta secreto, il muco delle vie aeree, composto da ~ 97,5% di acqua, 0,9% di sale, ~ 1,1% di proteine globulari e ~ 0,5% di mucine, viene gradualmente trasportato verso la glottide dal battito coordinato delle ciglia 1,2. Le mucine sono grandi glicoproteine legate all'O che interagiscono attraverso legami non covalenti e covalenti per fornire le distinte proprietà viscoelastiche del muco, che è necessario per un trasporto efficiente3. I cambiamenti nell'ultrastruttura della rete di mucina causati da alterato trasporto ionico, dispiegamento di mucina, interazioni elettrostatiche, reticolazione o cambiamenti nella composizione possono influenzare significativamente la viscoelasticità del muco e compromettere la clearance mucociliare 4,5. Quindi, identificare i cambiamenti nelle proprietà biofisiche del muco delle vie aeree è essenziale per comprendere la patogenesi della malattia e testare nuovi composti mucoattivi6.
Vari fattori possono portare alla produzione di muco aberrante nei polmoni. Nella BPCO, l'inalazione cronica di fumo di sigaretta innesca l'ipersecrezione del muco a causa della metaplasia delle cellule caliciformi, così come la disidratazione delle vie aeree attraverso la downregulation del canale del regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR), causando iperconcentrazione del muco e piccola ostruzione delle vie aeree 7,8. Allo stesso modo, la FC, una malattia genetica associata a mutazioni nel gene CFTR, è caratterizzata dalla produzione di muco viscoso e aderente che è inadeguato per il trasporto 8,9. In breve, la disfunzione CFTR induce l'esaurimento del liquido superficiale delle vie aeree, l'entanglement polimerico della mucina e l'aumento delle interazioni biochimiche, che provocano infiammazione cronica e infezioni batteriche. Inoltre, le cellule infiammatorie intrappolate nel muco statico esacerbano ulteriormente la viscoelasticità del muco aggiungendo un'altra grande molecola, il DNA, nella matrice del gel, peggiorando l'ostruzione delle vie aeree5. Uno dei migliori esempi dell'importanza della reologia del muco sulla salute generale dei polmoni è fornito dall'esempio della DNFase umana ricombinante (rhDNasi) nel trattamento dei pazienti con fibrosi cistica. Gli effetti della rhDNasi sono stati dimostrati per la prima volta ex vivo sull'espettorato espettorato, che ha mostrato una transizione dal muco viscoso a un liquido fluente entropochi minuti 10,11. Studi clinici in pazienti con FC hanno dimostrato che la riduzione della viscoelasticità del muco delle vie aeree con l'inalazione di rhDNasi ha ridotto il tasso di esacerbazioni polmonari e ha migliorato la funzione polmonare e il benessere generale delpaziente 12,13,14. Di conseguenza, l'inalazione di rhDNasi volta a facilitare la clearance è diventata lo standard di cura per i pazienti con FC per più di due decenni. Benefici clinici simili sono stati osservati con l'uso di soluzione salina ipertonica per via inalatoria per l'idratazione del muco nella FC, che è correlata con cambiamenti nelle proprietà reologiche e ha determinato un'accelerazione della clearance mucociliare e un miglioramento della funzione polmonare15,16. Pertanto, un protocollo rapido e affidabile per misurare le proprietà viscoelastiche del muco in contesti clinici è importante per ottimizzare gli approcci terapeutici.
Il reometro da banco qui testato offre un'alternativa rapida e conveniente per eseguire misurazioni viscoelastiche complete di campioni di muco / espettorato. Utilizzando oscillazioni dinamiche con spostamento angolare controllato, lo strumento fornisce la deformazione tramite una coppia di piastre parallele regolabili (ad esempio, geometrie ruvide o lisce) per misurare la coppia e la cilindrata con risoluzioni di 15 nN. m e 150 nm, rispettivamente17. Una calibrazione standardizzata predefinita combinata con le linee guida per l'utente adattate per gli specialisti non reologici consente misurazioni semplici e riduce il rischio di errori dell'operatore. Il dispositivo produce una curva di sweep di deformazione che viene elaborata e analizzata in tempo reale (entro ~ 5 minuti) e fornisce automaticamente sia le caratteristiche viscoelastiche lineari (G', G", G * e tan δ) che del punto gel (γc e σc) (vedere Tabella 1). Il modulo elastico o di stoccaggio (G') descrive come un campione risponde allo stress (cioè la capacità di tornare alla sua forma originale), mentre il modulo viscoso o di perdita (G") descrive l'energia dissipata per ciclo di deformazione sinusoidale (cioè l'energia persa a causa dell'attrito delle molecole). Il modulo complesso o dinamico (G*) è il rapporto tra sollecitazione e deformazione, che descrive la quantità di accumulo di forza interna in risposta a uno spostamento di taglio (cioè le proprietà viscoelastiche complessive). Il fattore di smorzamento (tan δ) è il rapporto tra il modulo viscoso e il modulo elastico, che indica la capacità di un campione di dissipare energia (cioè un basso tan δ indica un comportamento elastico-dominante / solido, mentre un alto tan δ indica un comportamento viscoso-dominante / liquido-simile). Per le caratteristiche del punto gel, la deformazione crossover (γc) è la misura della deformazione di taglio, calcolata dal rapporto tra il percorso di deflessione e l'altezza del gap di taglio, alla quale il campione passa da un comportamento simile a un solido a un comportamento simile a un liquido e si verifica, per definizione, a deformazione di oscillazione dove G' = G" o tan δ = 1. La tensione di snervamento crossover (σc) è una misura della quantità di sollecitazione applicata dal dispositivo a cui si incrociano i moduli elastici e viscosi. Nella sputa sana, l'elasticità domina la risposta meccanica allo sforzo (G' > G"). Nelle malattie muco-ostruttive, sia G' che G" aumentano a seguito di cambiamenti patologici del muco 17,18,19. La semplicità operativa del dispositivo facilita le misurazioni in loco ed elude la necessità di stoccaggio/trasporto/spedizione dei campioni a una struttura fuori sede per l'analisi, evitando così gli effetti di tempo e congelamento-disgelo sulle proprietà di questi campioni biologici.
In questo studio, 8 soluzioni di ossido di polietilene (PEO) MDa di diverse concentrazioni (1%-3%) sono state utilizzate per convalidare il campo di misura di un reometro da banco commerciale (Table of Materials) e la curva concentrazione-dipendente ottenuta è stata confrontata direttamente con le misurazioni acquisite con un reometro di massa tradizionale (Table of Materials ). La ripetibilità delle misurazioni reologiche è stata quindi valutata utilizzando muco raccolto per via broncoscopica da un paziente intubato affetto da stato asmatico (SA), una forma estrema di esacerbazione dell'asma caratterizzata da broncospasmo, infiammazione eosinofila e iperproduzione di muco in risposta a un agente ambientale o infettivo 8,20 . In questo caso, il paziente SA era stato intubato per grave insufficienza respiratoria e aveva richiesto ECMO (ossigenazione extracorporea a membrana) a causa dell'incapacità di supportare il paziente in modo efficace e sicuro con la sola ventilazione meccanica, nonostante le aggressive terapie standard per l'asma. Durante una broncoscopia clinicamente indicata per il collasso lobare, secrezioni spesse, chiare e tenaci sono state notate per ostruire i bronchi lobari e sono state aspirate con lavaggi salini. Immediatamente dopo la raccolta, la soluzione salina in eccesso è stata rimossa dall'aspirato e le proprietà viscoelastiche del campione SA rimanente sono state analizzate utilizzando il dispositivo da banco. Ulteriori aliquote del campione sono state trattate con un agente riducente, tris (2-carbossiletil) fosfina cloridrato (TCEP), per determinare se questo protocollo potrebbe essere utilizzato per caratterizzare l'efficacia del composto terapeutico ex vivo.
I risultati hanno mostrato che questo protocollo e il dispositivo da banco possono essere utilizzati efficacemente in ambito clinico. Le proprietà reologiche determinate dalle curve dipendenti dalla concentrazione di PEO (Figura 1A) erano indistinguibili tra il dispositivo da banco testato e un reometro tradizionale a piastre parallele (Figura 1B). Le misurazioni triplicate del muco SA erano ripetibili, con un coefficiente di variazione del 10% per gli endpoint G*, G' e G" e riflettevano le anomalie sostanziali nella viscoelasticità del muco che erano clinicamente evidenti nel caso di questo paziente (Figura 1D). Infine, il trattamento ex vivo con TCEP ha comportato una significativa riduzione di G' e G" e un aumento dell'abbronzatura δ, dimostrando la reattività al trattamento mediante alterazioni della rete mucina (Figura 2). In conclusione, questo protocollo che utilizza un reometro da banco fornisce un approccio semplice ed efficace per valutare le proprietà viscoelastiche dei campioni di muco ottenuti dalla clinica. Questa capacità può essere utilizzata per facilitare gli approcci di medicina di precisione alla cura, in quanto i medici possono testare l'efficacia dei farmaci mucoattivi approvati in loco, che possono aiutare a identificare opzioni di trattamento alternative. Inoltre, questo approccio può essere utilizzato negli studi clinici per esaminare gli effetti dei farmaci sperimentali.
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Protocol
Nel presente studio, i campioni sono stati raccolti durante una broncoscopia clinicamente indicata dopo aver ottenuto il consenso informato in base a un protocollo approvato dal Comitato di revisione istituzionale dell'UNC.
1. Raccolta e conservazione dell'espettorato/muco
- Raccogliere il muco delle vie aeree tramite la raccolta dell'espettorato o l'aspirazione per broncoscopia.
- Raccogliere l'espettorato tramite espettorazione spontanea o indurre l'espettorato per inalazione salina ipertonica al 3%. In alternativa, aspirare direttamente il muco dalle vie aeree durante una procedura di broncoscopia.
- Conservare l'espettorato/muco delle vie aeree raccolto in tazze di campioni sterili. Nel caso dell'espettorato, rimuovere la saliva in eccesso dal campione immediatamente dopo la raccolta.
- Posizionare i campioni sul ghiaccio per il trasporto. Limitare il tempo di trasporto a meno di 4 ore.
- Analizzare i campioni al momento della raccolta o conservare a -80 °C fino alla lavorazione.
- Prima dello stoccaggio, omogeneizzare il muco tubando delicatamente su e giù da tre a cinque volte con una pipetta a spostamento positivo o una pipetta direttamente nei tubi del microcentrifuga.
- Aliquotare i campioni per la conservazione in volumi ≥500 μL per garantire un volume sufficiente per gli esperimenti.
NOTA: il congelamento e lo scongelamento possono influire sulle proprietà viscoelastiche del campione. Confronta solo i campioni che hanno subito cicli di congelamento / disgelo simili.
2. Preparazione del campione
- Pipettare direttamente sputa/muco fresco e congelato o omogeneizzare i campioni utilizzando una pipetta a spostamento positivo tubando delicatamente su e giù da tre a cinque volte prima dell'aliquotazione.
NOTA: l'omogeneizzazione è importante per i campioni che contengono tappi spessi che possono influire sulla riproducibilità. - Aliquota 400-500 μL del campione in tubi microcentrifuga separati. Preparare tutte le aliquote necessarie per ripetere le misurazioni e/o il trattamento con reagenti farmacologici (ad esempio, rhDNasi, N-acetil cisteina). Incubare le aliquote da testare a 37 °C per un minimo di 5 minuti prima della misurazione.
- Per testare gli agenti farmacologici (facoltativo), utilizzare alte concentrazioni di soluzioni stock per evitare la diluizione del campione.
- Aggiungere tra lo 0,4% e il 10% di volume (per ridurre al minimo la diluizione del campione) del reagente desiderato (ad esempio, TCEP) direttamente sul campione. Assicurarsi che nessuna goccia del composto rimanga sul lato del tubo.
- Incubare i campioni a 37 °C per il periodo di tempo desiderato per consentire una reazione chimica (<1 h per prevenire la degradazione proteolitica del muco).
- Mescolare il campione di muco e il reagente facendo scorrere il fondo della provetta di microcentrifuga ogni 2 minuti per consentire la progressiva penetrazione del reagente nel campione di muco senza compromettere la rete di mucina (ad esempio, imitando il battito ciliare e la clearance mucociliare). Quando si confrontano più reagenti farmacologici, assicurarsi che il tempo di incubazione sia simile.
3. Inizializzazione e calibrazione dello strumento
- Accendere la macchina (Tabella dei materiali) e inizializzare il software.
- Selezionare Nuova misurazione. Immettere il numero di identificazione del campione in ID misura e il nome dell'operatore in Operatore per continuare. Immettere ulteriori informazioni o commenti in Commenti.
- Selezionare un set di geometrie (ad esempio, piastre parallele ruvide o lisce da 25 mm) e ispezionare attentamente piastre grandi e piccole per assicurarsi che le piastre siano pulite e in perfette condizioni).
NOTA: le piastre ruvide sono progettate per grandi volumi (350-500 μL) e le piastre lisce sono progettate per volumi più piccoli (250-350 μL). L'utilizzo di un volume di campione inferiore o superiore a quello raccomandato può causare misurazioni imprecise. - Inserire saldamente la grande piastra sul pulpito inferiore.
- Inserire delicatamente la piccola piastra sul pulpito superiore e bloccare la piastra ruotando leggermente fino a sentire un "clic", che indica che la piastra è correttamente bloccata. Si noti che l'oscillazione libera della piastra superiore è normale.
- Attendere che la temperatura raggiunga il valore target di 37 °C. Quindi, avviare la calibrazione automatica come richiesto dal software.
NOTA: non disturbare la macchina o la superficie del banco durante questo processo.
4. Caricamento del campione
- Utilizzando una pipetta a spostamento positivo, pipettare lentamente tra 250 e 500 μL del campione al centro della grande piastra inferiore. Una volta depositati sulla piastra, i campioni viscosi adotteranno una forma a cupola, mentre i campioni altamente elastici possono richiedere il taglio fisico (utilizzare forbici per sezionare).
NOTA: Evitare di introdurre bolle d'aria. Se necessario, rimuovere le bolle residue spingendo via con una punta di pipetta. - Abbassare la testa di misura che trasporta la piccola piastra tramite il software e osservare il campione. Se caricato correttamente sulla piastra inferiore, il campione entrerà in contatto e sarà centrato tra le due piastre.
- Per garantire che il campione riempia lo spazio (ad esempio, diffondendosi ai bordi delle piastre), utilizzare la funzione Riduci spazio fino a quando il campione non è più in una forma biconcava o è allineato con il bordo delle piastre. La funzione Reduce Gap abbassa la testa di misura con incrementi di 0,1 mm ed è limitata a sette incrementi.
NOTA: monitorare attentamente il campione e regolare progressivamente lo spazio per evitare sovraspole.- Se rimane uno spazio vuoto dopo sette incrementi, fare clic su Ripeti installazione per tornare alla posizione iniziale e regolare la posizione e/o il volume del campione.
- Se lo spazio è eccessivamente ridotto (ad esempio, forma biconvessa), rimuovere il campione in eccesso con una spatola con un movimento circolare lungo il bordo della piastra superiore. Assicurarsi di tagliare delicatamente il campione in eccesso per evitare lo stress da taglio.
NOTA: alla fine di questo passaggio, il bordo del campione deve essere allineato con il bordo della piastra superiore, come illustrato nelle linee guida per l'utente.
- Abbassare il coperchio protettivo per evitare qualsiasi proiezione accidentale di fluidi contaminati durante l'oscillazione.
5. Avviare la misurazione biofisica
- Per avviare la misurazione, fare clic su Avvia analisi. Un ciclo completo richiederà 4-7 minuti.
- Evitare di parlare ad alta voce e toccare il dispositivo o il banco durante l'intera durata del ciclo. Un ambiente tranquillo è particolarmente importante per i primi 2 minuti.
NOTA: Durante il ciclo, lo strumento esegue una prova di deformazione standardizzata, che consiste in fasi oscillanti successive. Ogni passo è una serie di 10 oscillazioni ad ampiezza e frequenza costanti (1 Hz), durante le quali la coppia corrispondente viene misurata in tempo reale. I segnali di deformazione e coppia consentono il calcolo dei moduli complessi (G*), elastici (G') e viscosi (G"), nonché del rapporto di smorzamento (tan δ) ad ogni passo. Le oscillazioni aumentano gradualmente di ampiezza, il che intensifica la deformazione imposta al campione.
- Evitare di parlare ad alta voce e toccare il dispositivo o il banco durante l'intera durata del ciclo. Un ambiente tranquillo è particolarmente importante per i primi 2 minuti.
6. Rimozione del campione
- Una volta completato il ciclo, fare clic su Avanti per sollevare la testa di misura e generare il rapporto di analisi del campione.
NOTA: Per il report, il software calcola i dati registrati e rappresenta automaticamente due curve che mostrano l'evoluzione dei moduli viscosi ed elastici in relazione alla deformazione esercitata al campione e visualizza il regime viscoelastico lineare (cioè un plateau a bassa deformazione) se presente. Se non viene rilevato alcun regime lineare, i valori di G', G", G* e tan δ vengono estratti a 0,05 ceppi. Inoltre, la deformazione crossover e la tensione di snervamento (γc e σc) sono calcolate a tan δ = 1. I dati sono anche forniti in fogli di calcolo per ogni passaggio per ulteriori analisi. - Una volta che la testa di misurazione è completamente retratta, sollevare il coperchio protettivo, scartare il campione e rimuovere con cura le piastre. Pulire e disinfettare le piastre con acqua tiepida e sapone.
NOTA: asciugare accuratamente la geometria impostata prima di un uso ripetuto.
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Representative Results
La Figura 1 mostra l'accuratezza e la ripetibilità delle misurazioni reologiche utilizzando curve dipendenti dalla concentrazione del controllo viscoelastico, cioè soluzione di ossido di polietilene (PEO) e stato asmatico (SA) muco. Le misurazioni delle caratteristiche viscoelastiche di 8 MDa PEO a cinque diverse concentrazioni (1%, 1,5%, 2%, 2,5% e 3%) sono state confrontate direttamente tra il reometro da banco valutato e un reometro sfuso tradizionale (Table of Materials). A differenza del muco SA, le soluzioni PEO erano dominate dalla viscosità (G" > G') nell'intero intervallo di deformazione e non mostravano crossover e, quindi, presentavano un comportamento simile a solido. Inoltre, le misurazioni triplicate eseguite su una soluzione di PEO all'1,5% e su un campione clinico di muco SA hanno confermato che le caratteristiche viscoelastiche lineari (G*, G' e G") erano altamente ripetibili (coefficiente di variazione <10%) per i valori ottenuti dal campione biologico.
L'osservazione del collasso lobare nel paziente SA ha suggerito che l'intasamento del muco potrebbe complicare la capacità di ventilare meccanicamente i polmoni e ha sollevato la possibilità che possano essere prese in considerazione terapie mucolitiche non standard. Nella Figura 2, il protocollo qui descritto è stato utilizzato per misurare i cambiamenti nelle proprietà viscoelastiche del muco dopo il trattamento con un agente mucolitico. Mentre NAC è stato approvato per l'uso con BPCO e CF, è stato dimostrato che ha una cinetica lenta e una bassa potenza come agente riducente21. Il TCEP ha dimostrato di essere altamente efficace nel modificare le proprietà biofisiche del muco22. Gli effetti del TCEP sulla viscoelasticità del muco SA sono stati testati in un ambiente clinico utilizzando il reometro da banco. Il trattamento mucolitico ha portato a un campione più fluido con una diminuzione del modulo complesso (G*) di 4,6 volte, modulo elastico (G') di 5,1 volte, modulo viscoso (G") di 1,9 volte, deformazione crossover (γc) di 3,3 volte e stress di resa crossover (σc) di 5,7 volte e un aumento del rapporto di smorzamento (tan δ) di 2,8 volte.
| Zona | Parametro | Simbolo | Unità | Definizione | Significato | ||||
| Regime viscoelastico lineare (LVR) | Modulo complesso | G* | Babbo | Comportamento viscoelastico rappresentativo nel regime lineare | Resistenza complessiva alla deformazione della rete molecolare | ||||
| G* = σ/γ | |||||||||
| Modulo elastico | G' | Babbo | Elasticità del materiale nel regime lineare | Rigidità della struttura molecolare a riposo, correlata alla rigidità della rete molecolare | |||||
| →0 : morbido →∞ : rigido |
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| Modulo viscoso | G" | Babbo | Viscosità del materiale nel regime lineare | Perdita irreversibile di energia mentre la struttura si muove sotto sforzo molto basso | |||||
| →0 : solido puro →∞ : dissipativo |
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| Fattore di smorzamento | δ abbronzatura | Senza unità | Fattore di smorzamento nel regime lineare | Fattore di dissipazione dell'energia, correlato alla morfologia della rete molecolare. Qualsiasi cambiamento indica un cambiamento nella natura molecolare. | |||||
| tan δ= G''/G' | →0 : solido puro =1: transizione sporca/liquida →∞ : liquido puro |
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| Punto Gel | Deformazione critica o crossover | γc | Senza unità | Sforzo quando si passa dal gel al comportamento del flusso | Elasticità del gel, la deformazione totale necessaria per avviare un flusso o rompere un solido | ||||
| →0 : fragile →∞ : flessibile |
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| Stress di snervamento critico o crossover | σc | Babbo | Stress quando si passa al comportamento del flusso | Forza del gel, la quantità di forza necessaria per avviare un flusso o rompere un solido | |||||
| →0 : debole →∞ : forte |
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Tabella 1: Moduli viscoelastici lineari e caratteristiche del punto gel misurate dal reometro da banco. Il dispositivo esegue misurazioni rapide utilizzando l'oscillazione dinamica con una sweep di deformazione di taglio per fornire caratteristiche lineari viscoelastiche (G', G", G * e tan δ) moduli e punti gel (γc e σc) entro ~ 5 minuti. Vengono forniti parametri, simboli, unità e una breve descrizione delle misurazioni.
Figura 1: Misurazioni delle proprietà viscoelastiche delle soluzioni PEO e del muco SA. Le soluzioni di 8 MDa PEO sono state preparate a concentrazioni dell'1%, 1,5%, 2%, 2,5% e 3%. Il muco SA è stato raccolto durante una procedura di broncoscopia. Per le misurazioni con il reometro da banco sono state utilizzate piastre ruvide da 25 mm e 500 μL del campione. Per le misurazioni con il tradizionale reometro sfuso sono state utilizzate piastre lisce parallele da 20 mm e 30 μL di soluzioni PEO. Entrambe le misurazioni sono state eseguite ad una frequenza di 1 Hz. (A) Curve ottenute da un singolo ciclo analizzando l'1%, l'1,5%, il 2%, il 2,5% e il 3% 8 MDa PEO, mostrando l'evoluzione del modulo elastico (G') in blu (i) e del modulo viscoso (G") in rosso (ii). (B) Curve che confrontano moduli elastici (i) e viscosi (ii) per aumentare le concentrazioni di soluzioni PEO, analizzate da reometri da banco e tradizionali al 5% di deformazione. (C) Curve che mostrano l'evoluzione di G' e G" del muco SA, misurata dal reometro da banco. La freccia indica la deformazione crossover (γc), che denota una transizione dal comportamento morbido-solido a quello liquido.(D) Grafici che mostrano tre misurazioni replicate dei valori (i) G*, (ii) G' e (iii) G" per l'1,5% di PEO (barre nere) e sa muco (barre grigie) nel regime viscoelastico lineare (LVR) o al 5% di ceppo, rispettivamente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Effetti del trattamento TCEP sulla viscoelasticità del muco SA. Il muco SA è stato analizzato prima (non trattato o NT) e dopo il trattamento TCEP (TCEP). Il trattamento consisteva nell'aggiunta di 2 μL di 5 mM di soluzione di TCEP in aliquote da 500 μL (concentrazione finale di TCEP di 20 μM). I campioni trattati con NT e TCEP sono stati incubati per 20 minuti a 37 °C e miscelati facendo scorrere il fondo della provetta ogni 2 minuti prima dell'analisi. Le misurazioni sono state eseguite sotto deformazione oscillante ad una frequenza di 1 Hz. (A) Curve da muco SA trattato con NT e TCEP che mostrano l'evoluzione di (i) moduli elastici (G') e (ii) viscosi (G"). La linea tratteggiata nera orizzontale indica il regime viscoelastico lineare (LVR) e la linea tratteggiata nera verticale indica il riferimento di deformazione del 5% nel caso in cui non sia stato possibile stabilire un LVR. (B) Confronto tra il modulo complesso (G*), il modulo elastico (G'), il modulo viscoso (G), il rapporto di smorzamento (tan δ), la deformazione crossover (γc) e lo sforzo di snervamento crossover (σc) del muco trattato con NT e TCEP derivato dalle curve corrispondenti. È stata eseguita un'analisi statistica e i valori p sono stati acquisiti utilizzando t-test accoppiati. I valori per tutti i grafici sono mostrati come ±SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Le proprietà viscoelastiche uniche del muco sono essenziali per mantenere le vie aeree sane. Fattori interni ed esterni possono alterare le proprietà biofisiche del muco delle vie aeree, causando complicanze cliniche caratteristiche delle malattie muco-ostruttive. Pertanto, il monitoraggio dei cambiamenti nella viscoelasticità del muco potrebbe essere preso in considerazione durante le valutazioni dello stato della malattia e l'esplorazione di terapie che riducono la viscoelasticità del muco. Studi empirici degli anni 1980 hanno dimostrato una forte correlazione tra reologia del muco e clearance delle vie aeree utilizzando i reometri magnetici a perline23,24. Negli ultimi anni, la reologia si è evoluta per sfruttare diverse tecniche che analizzano il muco a varie scale. Ad esempio, i saggi microreologici utilizzano sonde microscopiche per descrivere le proprietà locali del muco in base al movimento di particelle magnetiche o fluorescenti di dimensioni micrometriche. Tuttavia, poiché questa tecnica utilizza piccoli volumi di campioni, potrebbe essere difficile ottenere dati rappresentativi che descrivano campioni eterogenei come l'espettorato. Inoltre, i test microreologici richiedono microscopi ad alta risoluzione, capacità di calcolo significative e analisi dispendiose in termini di tempo, e quindi sono poco adatti all'uso diffuso in laboratorio o in clinica.
Mentre la microreologia e la macroreologia non sono in genere comparabili, limitazioni simili si applicano a dispositivi di lunga data, come i reometri di massa a cono / piastra parallela. La macroreologia viene eseguita utilizzando strumenti di precisione dotati di coni rotanti, piastre, tazze e/o rotori di varie dimensioni per misurare coppie e spostamenti estremamente ridotti fino al sub nN. Intervalli m e sub Å. Per raggiungere una precisione così elevata, la maggior parte dei reometri commerciali richiede una connessione diretta con un sistema di alimentazione e raffreddamento dell'aria compressa in un ambiente privo di olio, polvere o rumore e con una temperatura e un'umidità ambiente controllate per prevenire la formazione di artefatti. Inoltre, mentre i reometri sfusi tradizionali possono misurare un'ampia gamma di materiali tramite la regolazione di variabili specifiche, la calibrazione di questi strumenti richiede molto tempo e richiede una formazione approfondita.
Al contrario, il reometro da banco Rheomuco è stato specificamente progettato per misurare le proprietà viscoelastiche del muco e dell'espettorato e richiede una singola fase di calibrazione per eseguire misurazioni lineari viscoelastiche e del punto gel in pochi minuti. Questo dispositivo da banco utilizza un protocollo semplice e standardizzato per produrre misurazioni viscoelastiche rapide e accurate senza la necessità di una formazione approfondita nella calibrazione dello strumento o nell'analisi / calcolo dei dati reologici. Il dispositivo funziona misurando la coppia e lo spostamento in seguito a oscillazioni con spostamento angolare controllato per produrre una curva di sweep di deformazione e stabilire un regime viscoelastico lineare o LVR (una regione di risposta viscoelastica uniforme alla deformazione, indicata con una linea tratteggiata orizzontale nella Figura 2A), prima di raggiungere il punto in cui il campione cede. Nella maggior parte dei casi, i campioni di espettorato si trovano all'interno dell'LVR nell'intervallo di deformazione dell'1% -10%. Quando un LVR non viene rilevato, il valore al 5% del ceppo viene comunemente indicato per riportare le caratteristiche viscoelastiche del campione. L'assenza di un LVR rilevato non invalida la misurazione, ma piuttosto riflette un campione le cui proprietà sono distinte (più plastiche) da quelle della maggior parte dei campioni. La sensibilità di questo strumento è ottimizzata per soddisfare le esigenze di fluidi viscosi ed elastici vicini al muco fornendo al contempo un'elevata tolleranza al rumore meccanico, il che lo rende ideale per lo studio di fluidi biologici in contesti clinici; tuttavia, potrebbe non essere adatto per studiare altri materiali viscoelastici con moduli elastici o viscosi estremamente bassi (ad esempio, saliva) o estremamente elevati (ad esempio, catrame di carbone) a causa di parametri software limitati e dell'incapacità di manipolare variabili come la forma della piastra, la superficie, la distanza e la frequenza rotazionale. Le misurazioni reologiche dipendenti dalla concentrazione su PEO 8 MDa (Figura 1) hanno permesso di stimare la sensibilità (cioè il limite inferiore di rilevazione) di questo dispositivo, che è compresa tra lo 0,3% e lo 0,4% di 8 MDa PEO o <0,05 Pa per G*. Non è stato tuttavia possibile stabilire un limite superiore a causa della difficoltà di solubilizzare concentrazioni di PEO superiori al 3%. Tuttavia, il dispositivo è stato in grado di segnalare G ' e G ' per il 3% 8 MDa PEO, che è più viscoelastico rispetto ai campioni di muco SA (~ 5 volte maggiore G ' e 25 volte maggiore G" rispetto a SA), suggerendo una gamma dinamica rilevante per i biocampioni del muco. Va notato che per ottenere misurazioni accurate durante le oscillazioni, un volume appropriato del campione deve essere posizionato al centro della piastra senza la presenza di bolle. Durante il caricamento del campione, il volume insufficiente, le bolle d'aria e/o il posizionamento fuori centro creeranno un contatto inadeguato con le piastre, con conseguenti valori registrati inferiori. Al contrario, l'overflow del campione creerà un'eccessiva sollecitazione di taglio a causa della forza di trascinamento aggiuntiva25.
Questo studio descrive come elaborare, conservare e trattare campioni di muco denso immediatamente dopo la raccolta. Una delle principali sfide che gli studi di reologia dell'espettorato devono affrontare è la natura eterogenea di questi campioni e lo sviluppo di approcci di misurazione standardizzati. L'espettorato è una sostanza espettorata spesso contaminata dalla saliva che contiene batteri ed enzimi digestivi che possono alterare rapidamente la rete di mucina e influenzare la viscoelasticità del muco. Pertanto, è fondamentale rimuovere la saliva dai campioni di espettorato immediatamente dopo la raccolta e / o prima dell'omogeneizzazione. Per natura, il muco è appiccicoso e difficile da maneggiare, ma l'uso di pipette a spostamento positivo facilita l'omogeneizzazione senza compromettere la rete di mucina, consente un'accurata preparazione dell'aliquota e semplifica il caricamento del campione. A seconda dell'esperimento, l'omogeneizzazione del campione potrebbe non essere richiesta, ma può ridurre al minimo la variabilità tra le repliche. Mentre si raccomanda la lavorazione dell'espettorato immediatamente dopo la raccolta, il muco delle vie aeree mantiene proprietà biofisiche uniche dopo il congelamento e lo scongelamento. Tuttavia, il congelamento e lo scongelamento possono influenzare la reologia generale di un campione. Pertanto, solo i campioni che hanno subito cicli di congelamento / disgelo simili dovrebbero essere confrontati tra loro. Quando si testano gli effetti degli agenti mucoattivi, l'omogeneizzazione iniziale del campione è importante per ottimizzare la diffusione del composto. La somministrazione di farmaci ai polmoni tramite inalazione limita i volumi che accedono al bersaglio (cioè il tappo di muco), ma il costante battito delle ciglia combinato con il trasporto mucociliare genera una certa miscelazione del farmaco e del bersaglio. Per simulare il trattamento in vivo, piccoli volumi di un agente farmacologico possono essere applicati direttamente sui campioni e gradualmente miscelati mediante agitazione regolare durante il tempo di incubazione. Tuttavia, altri metodi di trattamento (ad esempio, la nebulizzazione del farmaco sul campione in una capsula di Petri) possono essere studiati. Un'agitazione delicata durante l'incubazione garantirà una progressiva penetrazione del farmaco senza compromettere la rete di mucina a causa di interruzioni meccaniche (ad esempio, vortice o sonicazione). Attualmente, TCEP non è utilizzato in contesti clinici, ma altri reagenti mucoattivi, come NAC, rhDNasi, P-2119, ARINA-1 e PAAG sono in fase di studio per una vasta gamma di condizioni muco-ostruttive 21,26,27,28. Per la convalida del concetto, è stato dimostrato che questo protocollo può essere utilizzato per rilevare cambiamenti significativi nel muco asmatico in risposta al trattamento TCEP. Un muco più fluido è stato prodotto mediante trattamento con un agente riducente, che è evidente dai marcatori viscoelastici lineari inferiori e dal punto gel, suggerendo un miglioramento della capacità di clearance. Sebbene la rhDNasi abbia prodotto enormi benefici clinici nella FC, non è tipicamente utilizzata per altre malattie muco-ostruttive, probabilmente a causa di concentrazioni di DNA extracellulare cronicamente più basse. Tuttavia, durante un'infezione virale e batterica acuta, una forte risposta infiammatoria può causare temporaneamente un'elevata concentrazione di DNA extracellulare e ridurre la clearance delle vie aeree. Pertanto, test rapidi ex vivo dell'efficacia della rhDNasi caso per caso potrebbero fornire indicazioni per il trattamento della polmonite indotta da virus e batteri. Ciò potrebbe essere particolarmente prezioso durante la pandemia di COVID-19, causata dal virus respiratorio, SARS-CoV-2.
In sintesi, il dispositivo descritto fornisce misure reologiche fattibili, rapide e accurate. Queste caratteristiche forniscono il potenziale per indagare e monitorare lo stato delle malattie delle vie aeree, nonché testare gli effetti di nuovi composti mucoattivi. La rapidità e la semplicità delle misurazioni consentono di eseguire i saggi senza incorrere in complicazioni legate al congelamento e/o agli effetti temporali della conservazione o del trasporto prolungati, rendendo questi saggi fattibili in un'ampia varietà di contesti. In definitiva, questo approccio potrebbe essere esplorato per la selezione di terapie personalizzate da un pannello di opzioni, consentendo la personalizzazione in tempo reale del trattamento del paziente.
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Disclosures
Nessuno
Acknowledgments
Questo documento è supportato da sovvenzioni di Vertex Pharmaceuticals (Ehre RIA Award) e Research EHRE20XX0 supportato da CFF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capillary Pistons Tips | Gilson | CP1000 | |
| Discovery Hybrid Rheometer-3 | TA Instruments | DHR-3 Bulk Rheometer manufactured by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests. |
|
| Graphing Software | GraphPad Prism | GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis | |
| Microcentrifuge Tube | Costar | 3621 | |
| Peltier plate | TA Instruments | Temperature control system manufactured by TA Instruments in New Castle, DE |
|
| Polyethylene oxide | Sigma | 372838 | 8 MDa polymer used as mucus simulant |
| Positive Displacement Pipette | Gilson | M1000 | Pipette used for handling viscous solutions |
| Rheomuco | Rheonova | Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests. | |
| Rough Lower Geometries | Rheonova | D-1811-007 | 25mm Diameter |
| Rough Upper Geometries | Rheonova | U-1811-007 | 25mm Diameter |
| Smooth Upper Parallel Plate | TA Instruments | 20mm Diameter | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Sigma | 646547-10X1ML | TCEP: Potent reducing agent. |
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