Summary
Mukusun viskoelastik özellikleri mukosiliyer klirenste kritik bir rol oynamaktadır. Bununla birlikte, geleneksel mukus reolojik teknikleri karmaşık ve zaman alıcı yaklaşımlar gerektirir. Bu çalışma, viskoelastik ölçümleri hızlı ve güvenilir bir şekilde gerçekleştirebilen bir tezgah üstü reometrenin kullanımı için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır.
Abstract
Muko-obstrüktif akciğer hastalıklarında (örneğin, astım, kronik obstrüktif akciğer hastalığı, kistik fibroz) ve diğer solunum koşullarında (örneğin, viral / bakteriyel enfeksiyonlar), mukus biyofiziksel özellikleri kadeh hücresi hipersekresyonu, hava yolu dehidrasyonu, oksidatif stres ve hücre dışı DNA varlığı ile değişir. Önceki çalışmalar, balgam viskoelastisitesinin solunum fonksiyonu ile ilişkili olduğunu ve balgam reolojisini etkileyen tedavilerin (örneğin, mukolitikler) dikkate değer klinik faydalarla sonuçlanabileceğini göstermiştir. Genel olarak, Newton olmayan sıvıların reolojik ölçümleri, tahlili gerçekleştirmek ve verileri yorumlamak için kapsamlı eğitim gerektiren ayrıntılı, zaman alıcı yaklaşımlar (örneğin, paralel / koni plakası reometreleri ve / veya mikroboncuk parçacık izleme) kullanır. Bu çalışma, 5 dakika içinde klinik numuneler için doğrusal viskoelastik modül (G', G", G * ve bronzluk δ) ve jel noktası özellikleri (γ c ve σc) sağlamak için kesme gerinimi süpürme ile dinamik salınım kullanarak hızlı ölçümler yapmak üzere tasarlanmış kullanıcı dostu bir tezgah üstü cihaz olan Rheomuco'nun güvenilirliğini, tekrarlanabilirliğini ve hassasiyetini test etmiştir. Cihaz performansı, mukus simulantının farklı konsantrasyonları, 8 MDa polietilen oksit (PEO) kullanılarak ve geleneksel toplu reoloji ölçümlerine karşı doğrulandı. Daha sonra status asthmaticus (SA) olan entübe edilmiş bir hastadan alınan klinik izolat, üçlü ölçümlerde değerlendirildi ve ölçümler arasındaki varyasyon katsayısı %<10'dur. SA mukus üzerinde güçlü bir mukus indirgeyici ajan olan TCEP'in ex-vivo kullanımı, elastik modülde beş kat azalmaya ve genel olarak daha "sıvı benzeri" bir davranışa doğru bir değişikliğe neden olmuştur (örneğin, daha yüksek bronzluk δ). Birlikte, bu sonuçlar test edilen tezgah üstü reometrenin klinik ve araştırma ortamlarında mukus viskoelastisitesinin güvenilir ölçümlerini yapabileceğini göstermektedir. Özetle, tarif edilen protokol, mukoaktif ilaçların (örneğin, rhDNaz, N-asetil sistein) vaka bazında tedaviyi uyarlamak için yerinde veya yeni bileşiklerin klinik öncesi çalışmalarında etkilerini araştırmak için kullanılabilir.
Introduction
Astım, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), kistik fibroz (KF) ve viral ve bakteriyel pnömoni gibi diğer solunum yolu rahatsızlıkları dahil olmak üzere muko-obstrüktif hava yolu hastalıkları dünya çapında yaygın sağlık sorunlarıdır. Patofizyoloji her durum arasında büyük farklılıklar gösterse de, ortak bir anahtar özellik anormal mukosiliyer klirenstir. Sağlıklı akciğerlerde mukus, solunan parçacıkları yakalamak ve patojenlere karşı fiziksel bir bariyer sağlamak için hava yolu epitelini hizalar. Salgılandıktan sonra, ~% 97.5 su,% 0.9 tuz, ~% 1.1 küresel proteinler ve ~% 0.5 müsinlerden oluşan hava yolu mukusları, kirpiklerin koordineli bir şekilde atılmasıyla kademeli olarak glottise doğru taşınır 1,2. Müsinler, verimli taşıma için gerekli olan mukusun farklı viskoelastik özelliklerini sağlamak için kovalent olmayan ve kovalent bağlar yoluyla etkileşime giren büyük O'ya bağlı glikoproteinlerdir3. Değişmiş iyon taşınması, müsin açılması, elektrostatik etkileşimler, çapraz bağlanma veya bileşimdeki değişikliklerin neden olduğu müsin ağının ultrayapısındaki değişiklikler, mukus viskoelastisitesini önemli ölçüde etkileyebilir ve mukosiliyer klirensi bozabilir 4,5. Bu nedenle, hava yolu mukusunun biyofiziksel özelliklerindeki değişikliklerin belirlenmesi, hastalık patogenezini anlamak ve yeni mukoaktif bileşiklerin test edilmesi için gereklidir6.
Çeşitli faktörler akciğerlerde anormal mukus üretimine yol açabilir. KOAH'ta sigara dumanının kronik olarak solunması, kadeh hücresi metaplazisinin bir sonucu olarak mukus hipersekresyonunu ve ayrıca kistik fibroz transmembran iletkenlik düzenleyicisi (CFTR) kanalının downregülasyonu yoluyla hava yolu dehidrasyonunu tetikleyerek mukus hiperkonsantrasyonuna ve küçük hava yolu tıkanıklığına neden olur 7,8. Benzer şekilde, CFTR genindeki mutasyonlarla ilişkili genetik bir bozukluk olan CF, taşımaiçin yetersiz olan viskoz, yapışkan mukus üretimi ile karakterizedir 8,9. Kısacası, CFTR disfonksiyonu, hava yolu yüzey sıvısının tükenmesine, polimerik müsin dolaşıklığına ve artmış biyokimyasal etkileşimlere neden olarak kronik inflamasyon ve bakteriyel enfeksiyonlara neden olur. Ek olarak, statik mukusta sıkışmış enflamatuar hücreler, jel matrisine başka bir büyük molekül olan DNA'yı ekleyerek mukusun viskoelastisitesini daha da kötüleştirir ve hava yolu tıkanıklığını kötüleştirir5. Mukus reolojisinin akciğerlerin genel sağlığı üzerindeki öneminin en iyi örneklerinden biri, kistik fibrozis hastalarının tedavisinde rekombinant insan DNFaz (rhDNaz) örneği ile sağlanmaktadır. RhDNaz'ın etkileri ilk olarak10,11 dakika içinde viskoz mukustan akan bir sıvıya geçiş gösteren balgam söktürücü balgam üzerinde ex vivo olarak gösterilmiştir. KF hastalarında yapılan klinik çalışmalar, rhDNaz inhalasyonu ile hava yolu mukus viskoelastisitesinin azaltılmasının pulmoner alevlenme oranını azalttığını ve akciğer fonksiyonunu ve genel hasta refahını iyileştirdiğini göstermiştir12,13,14. Sonuç olarak, klirensi kolaylaştırmayı amaçlayan rhDNaz inhalasyonu, yirmi yıldan fazla bir süredir KF hastaları için standart bakım haline gelmiştir. Benzer klinik faydalar, KF'de mukus hidrasyonu için inhale hipertonik salin kullanımı ile gözlenmiştir, bu da reolojik özelliklerdeki değişikliklerle korelasyon göstermiş ve mukosiliyer klirens ivmesi ve akciğer fonksiyonunun iyileşmesi ile sonuçlanmıştır15,16. Bu nedenle, klinik ortamlarda mukus viskoelastik özelliklerini ölçmek için hızlı ve güvenilir bir protokol, terapötik yaklaşımları optimize etmek için önemlidir.
Burada test edilen tezgah üstü reometre, mukus/balgam numunelerinin kapsamlı viskoelastik ölçümlerini gerçekleştirmek için hızlı ve kullanışlı bir alternatif sunmaktadır. Kontrollü açısal yer değiştirmeli dinamik salınımlar kullanan cihaz, torku ve yer değiştirmeyi 15 nN çözünürlüklerle ölçmek için bir çift ayarlanabilir paralel plaka (örneğin, kaba veya pürüzsüz geometriler) aracılığıyla deformasyon sağlar. m ve 150 nm, sırasıyla17. Reoloji uzmanı olmayanlar için uyarlanmış kullanıcı kılavuzlarıyla birlikte varsayılan standartlaştırılmış kalibrasyon, basit ölçümlere olanak tanır ve operatör hataları riskini azaltır. Cihaz, gerçek zamanlı olarak (~ 5 dakika içinde) işlenen ve analiz edilen bir gerinim süpürme eğrisi üretir ve otomatik olarak hem doğrusal viskoelastik (G', G", G * ve ten rengi δ) hem de jel noktası (γ c ve σc) özelliklerini sağlar (bkz. Tablo 1). Elastik veya depolama modülü (G'), bir numunenin strese nasıl tepki verdiğini (yani, orijinal şekline geri dönme yeteneğini) tanımlarken, viskoz veya kayıp modülü (G), sinüzoidal deformasyon döngüsü başına dağılan enerjiyi (yani, moleküllerin sürtünmesi nedeniyle kaybedilen enerjiyi) tanımlar. Karmaşık veya dinamik modül (G *), bir kesme yer değiştirmesine (yani, genel viskoelastik özelliklere) yanıt olarak iç kuvvet birikimi miktarını tanımlayan gerilmenin gerinimlere oranıdır. Sönümleme faktörü (bronz δ), viskoz modülün elastik modüle oranıdır, bu da bir numunenin enerjiyi dağıtma yeteneğini gösterir (yani, düşük bir bronzluk δ elastik-baskın / katı benzeri bir davranışı gösterirken, yüksek bir bronzluk δ viskoz-baskın / sıvı benzeri bir davranışı gösterir). Jel noktası özellikleri için, çapraz gerinim (γc), sapma yolunun kesme boşluğu yüksekliğine oranı ile hesaplanan, numunenin katı benzeri bir davranıştan sıvı benzeri bir davranışa geçtiği ve tanım gereği, G' = G" veya bronzluk δ = 1 olduğu salınım geriniminde meydana geldiği kesme geriniminin ölçüsüdür. Çapraz akma gerilimi (σc), elastik ve viskoz modülün kesiştiği cihaz tarafından uygulanan gerilim miktarının bir ölçüsüdür. Sağlıklı balgamda, elastikiyet, gerinime karşı mekanik tepkiye hükmeder (G' > G"). Muko-obstrüktif hastalıklarda, patolojik mukus değişiklikleri sonucu hem G' hem de G" artışı17,18,19. Cihazın operasyonel basitliği, yerinde ölçümleri kolaylaştırır ve analiz için numune depolama/nakliye/tesis dışındaki bir tesise sevkiyat ihtiyacını ortadan kaldırır, böylece bu biyolojik numunelerin özellikleri üzerindeki zaman ve donma-çözülme etkilerini önler.
Bu çalışmada, ticari bir tezgah üstü reometrenin (Malzeme Tablosu) ölçüm aralığını doğrulamak için farklı konsantrasyonlarda (% 1-3) 8 MDa polietilen oksit (PEO) çözeltisi kullanılmış ve elde edilen konsantrasyona bağlı eğri, geleneksel bir dökme reometre (Malzeme Tablosu) ile elde edilen ölçümlerle doğrudan karşılaştırılmıştır. ). Reolojik ölçümlerin tekrarlanabilirliği daha sonra, çevresel veya enfeksiyöz bir ajana yanıt olarak bronkospazm, eozinofilik inflamasyon ve mukus hiperüretimi ile karakterize aşırı bir astım alevlenmesi formu olan status asthmaticus'tan (SA) muzdarip entübe edilmiş bir hastadan bronkoskopik olarak toplanan mukus kullanılarak değerlendirildi 8,20 . Bu olguda SA hastası ağır solunum yetmezliği nedeniyle entübe edilmiş ve agresif standart astım tedavilerine rağmen tek başına mekanik ventilasyon ile etkin ve güvenli bir şekilde desteklenememesi nedeniyle ECMO (ekstrakorporeal membran oksijenasyonu) gerekmiştir. Lober kollaps için klinik olarak endike olan bronkoskopi sırasında, kalın, berrak, inatçı sekresyonların lober bronşları tıkadığı kaydedildi ve salin yıkamaları kullanılarak aspire edildi. Toplandıktan hemen sonra, aspirattan fazla salin çıkarıldı ve kalan SA örneğinin viskoelastik özellikleri tezgah üstü cihaz kullanılarak analiz edildi. Ek örnek alikotlar, bu protokolün terapötik bileşik etkinliğini ex vivo olarak karakterize etmek için kullanılıp kullanılamayacağını belirlemek için bir indirgeyici ajan olan tris (2-karboksiletil) fosfin hidroklorür (TCEP) ile muamele edildi.
Sonuçlar, bu protokolün ve tezgah üstü cihazın klinik ortamda etkili bir şekilde kullanılabileceğini göstermiştir. PEO konsantrasyonuna bağımlı eğrilerden (Şekil 1A) belirlenen reolojik özellikler, test edilen tezgah üstü cihaz ile geleneksel paralel plaka reometresi (Şekil 1B) arasında ayırt edilemezdi. SA mukusunun üçlü ölçümleri, G *, G' ve G" sonlanım noktaları için% 10'luk bir varyasyon katsayısı ile tekrarlanabilir ve bu hastanın olgusunda klinik olarak belirgin olan mukus viskoelastisitesindeki önemli anormallikleri yansıtıyordu (Şekil 1D). Son olarak, TCEP ile ex vivo tedavi, G' ve G" de önemli bir azalma ve bronzluk δ bir artış ile sonuçlandı ve müsin ağındaki değişikliklerle tedaviye yanıt verdiğini gösterdi (Şekil 2). Sonuç olarak, tezgah üstü reometre kullanan bu protokol, klinikten elde edilen mukus örneklerinin viskoelastik özelliklerini değerlendirmek için basit ve etkili bir yaklaşım sunmaktadır. Bu yetenek, klinisyenler onaylanmış mukoaktif ilaçların etkinliğini yerinde test edebildiğinden, bakıma hassas tıp yaklaşımlarını kolaylaştırmak için kullanılabilir ve bu da alternatif tedavi seçeneklerinin belirlenmesine yardımcı olabilir. Ek olarak, bu yaklaşım araştırma ilaçlarının etkilerini incelemek için klinik çalışmalarda kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada, UNC Kurumsal Gözden Geçirme Kurulu tarafından onaylanan bir protokol kapsamında bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra klinik olarak belirtilen bir bronkoskopi sırasında örnekler toplanmıştır.
1. Balgam/mukus toplama ve depolama
- Balgam toplama veya bronkoskopi aspirasyonu yoluyla hava yolu mukusunu toplayın.
- Balgamı spontan balgam söktürücü yoluyla toplayın veya% 3 hipertonik salin inhalasyonu ile balgamı indükleyin. Alternatif olarak, bronkoskopi prosedürü sırasında hava yollarından mukusun doğrudan aspire edilmesi.
- Toplanan hava yolu balgamını/mukusunu steril numune kaplarında saklayın. Balgam durumunda, toplandıktan hemen sonra numuneden fazla tükürüğü çıkarın.
- Örnekleri taşımak için buzun üzerine yerleştirin. Taşıma süresini 4 saatten az bir saatle sınırlayın.
- Numuneleri toplama sırasında analiz edin veya işlenene kadar -80 °C'de saklayın.
- Depolamadan önce, pozitif yer değiştirmeli bir pipet veya pipetle doğrudan mikrosantrifüj tüplerine üç ila beş kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetle pipetleyerek mukusun homojenizasyonu yapılır.
- Deneyler için yeterli hacim sağlamak için numuneleri ≥500 μL hacimlerde depolamak için Aliquot.
NOT: Donma ve çözülme, numunenin viskoelastik özelliklerini etkileyebilir. Sadece benzer donma/çözülme döngülerinden geçmiş numuneleri karşılaştırın.
2. Numune hazırlama
- Pipetleri taze ve dondurulmuş balgam/mukus doğrudan veya pozitif yer değiştirmeli pipet kullanarak numuneleri homojenize edin, alikote etmeden önce üç ila beş kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek.
NOT: Homojenizasyon, tekrarlanabilirliği etkileyebilecek kalın tapalar içeren numuneler için önemlidir. - Aliquot 400-500 μL numune ayrı mikrosantrifüj tüplerine yerleştirilir. Farmakolojik reaktiflerle (örneğin, rhDNaz, N-asetil sistein) tekrarlanan ölçümler ve / veya tedavi için gerektiği kadar alikot hazırlayın. Ölçümden önce en az 5 dakika boyunca 37 ° C'de test edilecek alikotları inkübe edin.
- Farmakolojik ajanları test etmek için (isteğe bağlı), numune seyreltmesini önlemek için yüksek konsantrasyonlarda stok çözeltileri kullanın.
- İstenilen reaktifin (örneğin, TCEP) %0,4 ila %10 arasında hacmini (numune seyreltmesini en aza indirmek için) doğrudan numunenin üzerine ekleyin. Bileşiğin hiçbir damlasının tüpün yanında kalmadığından emin olun.
- Kimyasal reaksiyona izin vermek için numuneleri istenen süre boyunca 37 ° C'de inkübe edin (mukusun proteolitik bozulmasını önlemek için <1 saat).
- Mukus örneğini ve reaktifi, müsin ağından ödün vermeden (örneğin, siliyer dayak ve mukosiliyer klirensi taklit ederek) reaktifin mukus numunesine ilerleyici penetrasyonuna izin vermek için her 2 dakikada bir mikrosantrifüj tüpünün dibine hafifçe vurarak karıştırın. Birden fazla ilaç reaktifini karşılaştırırken, inkübasyon süresinin benzer olduğundan emin olun.
3. Cihaz başlatma ve kalibrasyon
- Makineyi açın (Malzeme Tablosu) ve yazılımı başlatın.
- Yeni Ölçüm'ü seçin. Devam etmek için Ölçüm Kimliği altına örnek kimlik numarasını ve İşleç altında operatörün adını girin. Yorumlar altına ek bilgiler veya yorumlar girin.
- Bir geometri seti seçin (yani, pürüzlü veya pürüzsüz 25 mm paralel plakalar) ve plakaların temiz ve mükemmel durumda olduğundan emin olmak için büyük ve küçük plakaları dikkatlice inceleyin).
NOT: Kaba plakalar büyük hacimler (350-500 μL) için tasarlanmıştır ve pürüzsüz plakalar daha küçük hacimler (250-350 μL) için tasarlanmıştır. Önerilenden daha düşük veya daha yüksek bir numune hacmi kullanmak yanlış ölçümlere neden olabilir. - Büyük plakayı alt minbere sıkıca yerleştirin.
- Küçük plakayı yavaşça üst minbere yerleştirin ve plakanın düzgün bir şekilde kelepçelendiğini gösteren bir "tıklama" duyana kadar hafifçe döndürerek plakayı kilitleyin. Üst plakanın serbest salınımının normal olduğunu unutmayın.
- Sıcaklık 37 °C hedef değerine ulaşana kadar bekleyin. Ardından, yazılım tarafından istendiği şekilde otomatik kalibrasyonu başlatın.
NOT: Bu işlem sırasında makineyi veya tezgah üstü yüzeyi rahatsız etmeyin.
4. Örnek yükleme
- Pozitif deplasmanlı pipet kullanarak, büyük alt plakanın ortasındaki numunenin 250 ila 500 μL'si arasında yavaşça pipet edin. Plaka üzerinde biriktikten sonra, viskoz numuneler bir kubbe şeklini benimserken, yüksek elastik numuneler fiziksel olarak ayrılmayı gerektirebilir (diseksiyon makası kullanın).
NOT: Hava kabarcıkları sokmaktan kaçının. Gerekirse, artık kabarcıkları bir pipet ucuyla iterek çıkarın. - Küçük plakayı taşıyan ölçüm kafasını yazılım aracılığıyla indirin ve numuneyi gözlemleyin. Alt plakaya düzgün bir şekilde yüklenirse, numune temas edecek ve iki plaka arasında ortalanacaktır.
- Numunenin boşluğu doldurduğundan emin olmak için (yani, plakaların kenarlarına yayılarak), numune artık iki içbükey bir şekilde kalmayana veya plakaların kenarıyla hizalanana kadar Boşluğu Azalt işlevini kullanın. Boşluğu Azalt işlevi, ölçüm kafasını 0,1 mm'lik artışlarla indirir ve yedi artışla sınırlıdır.
NOT: Numuneyi dikkatlice izleyin ve aşırı dökülmeyi önlemek için boşluğu aşamalı olarak ayarlayın.- Yedi artıştan sonra bir boşluk kalırsa, başlangıç konumuna dönmek ve numunenin konumunu ve / veya hacmini ayarlamak için Kurulumu Yeniden Yap'a tıklayın.
- Boşluk aşırı derecede azalırsa (örneğin, bikonveks şekil), fazla numuneyi üst plakanın kenarı boyunca dairesel bir hareketle bir spatula ile çıkarın. Kayma gerilmesini önlemek için fazla numuneyi nazikçe kestiğinizden emin olun.
NOT: Bu adımın sonunda, numunenin kenarı, kullanıcı kılavuzlarında gösterildiği gibi üst plakanın kenarı ile hizalanmalıdır.
- Salınım sırasında kontamine olmuş sıvıların kazara yansıtılmasını önlemek için koruyucu kapağı indirin.
5. Biyofiziksel ölçümü başlatın
- Ölçümü başlatmak için Analizi Başlat'a tıklayın. Tam bir döngü 4-7 dakika sürecektir.
- Döngünün tüm uzunluğu boyunca yüksek sesle konuşmaktan ve cihaza veya tezgaha dokunmaktan kaçının. Sessiz bir ortam özellikle ilk 2 dakika için önemlidir.
NOT: Döngü sırasında cihaz, ardışık salınımlı adımlardan oluşan standartlaştırılmış bir gerinim süpürme testi gerçekleştirir. Her adım, karşılık gelen torkun gerçek zamanlı olarak ölçüldüğü sabit genlik ve frekansta (1 Hz) 10 salınımdan oluşan bir seridir. Gerinim ve tork sinyalleri, karmaşık (G *), elastik (G') ve viskoz (G") modüllerin yanı sıra her adımda sönümleme oranının (bronz δ) hesaplanmasına izin verir. Salınımlar genlikte kademeli olarak artar ve bu da numuneye uygulanan deformasyonu yoğunlaştırır.
- Döngünün tüm uzunluğu boyunca yüksek sesle konuşmaktan ve cihaza veya tezgaha dokunmaktan kaçının. Sessiz bir ortam özellikle ilk 2 dakika için önemlidir.
6. Numune çıkarma
- Döngü tamamlandıktan sonra, ölçüm kafasını kaldırmak ve numune analiz raporunu oluşturmak için İleri'ye tıklayın.
NOT: Rapor için, yazılım kaydedilen verileri hesaplar ve numuneye uygulanan deformasyonla ilgili olarak viskoz ve elastik modülün evrimini gösteren iki eğriyi otomatik olarak grafiklendirir ve varsa doğrusal viskoelastik rejimi (yani, düşük deformasyonda bir plato) görüntüler. Doğrusal bir rejim tespit edilmezse, G', G", G * ve tan δ değerleri 0.05 gerinimde çıkarılır. Ek olarak, çapraz gerinim ve akma gerilimi (γ c ve σc) tan δ = 1'de hesaplanır. Veriler, daha fazla analiz için her adım için elektronik tablolarda da sağlanır. - Ölçüm kafası tamamen geri çekildikten sonra, koruyucu kapağı kaldırın, numuneyi atın ve plakaları dikkatlice çıkarın. Plakaları ılık su ve sabun kullanarak temizleyin ve dezenfekte edin.
NOT: Tekrarlanan kullanımdan önce geometri setini iyice kurulayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 , viskoelastik kontrolün konsantrasyona bağlı eğrilerini, yani polietilen oksit (PEO) çözeltisini ve status asthmaticus (SA) mukusunu kullanarak reolojik ölçümlerin doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini göstermektedir. 8 MDa PEO'nun viskoelastik özelliklerinin beş farklı konsantrasyonda (%1, %1,5, %2,5 ve %3) ölçümleri, değerlendirilen tezgah üstü reometre ile geleneksel dökme reometre (Malzeme Tablosu) arasında doğrudan karşılaştırılmıştır. SA mukusunun aksine, PEO çözeltileri tüm gerinim aralığında viskoz baskındı (G" > G') ve çapraz geçiş göstermedi ve bu nedenle katı benzeri bir davranış sergiledi. Ek olarak,% 1.5 PEO çözeltisi ve klinik SA mukus numunesi üzerinde yapılan üçlü ölçümler, biyolojik numuneden elde edilen değerler için doğrusal viskoelastik özelliklerin (G *, G ' ve G") yüksek oranda tekrarlanabilir (<% 10 varyasyon katsayısı) olduğunu doğruladı.
SA hastasında lober kollapsın gözlenmesi, mukus tıkanmasının akciğerleri mekanik olarak havalandırma yeteneğini zorlaştırabileceğini ve standart dışı, mukolitik tedavilerin düşünülebileceği olasılığını artırdığını düşündürmüştür. Şekil 2'de, burada açıklanan protokol, mukolitik bir ajanla tedaviyi takiben mukusun viskoelastik özelliklerindeki değişiklikleri ölçmek için kullanılmıştır. NAC, KOAH ve KF ile kullanım için onaylanmış olsa da, indirgeyici ajan21 olarak yavaş kinetiği ve düşük potansiyele sahip olduğu gösterilmiştir. TSEP'in mukus22'nin biyofiziksel özelliklerini değiştirmede oldukça etkili olduğu gösterilmiştir. TCHEP'in SA mukus viskoelastisitesi üzerindeki etkileri, tezgah üstü reometre kullanılarak klinik bir ortamda test edilmiştir. Mukolitik işlem, kompleks modülde (G *) 4.6 kat, elastik modülde (G') 5.1 kat, viskoz modülde (G") 1.9 kat, çapraz gerinimde (γ c) 3.3 kat ve çapraz akma geriliminde (σc) 5.7 kat azalma ve sönümleme oranında (bronzlaşma δ) 2.8 kat artış ile daha akışkan benzeri bir numune ile sonuçlandı.
| Bölge | Parametre | Sembol | Birim | Tanım | Anlam | ||||
| Lineer Viskoelastik Rejim (LVR) | Karmaşık Modül | G* | Pa | Doğrusal rejimde temsili viskoelastik davranış | Moleküler ağın deformasyonuna karşı genel direnç | ||||
| G* = σ/γ | |||||||||
| Elastik Modül | G' | Pa | Malzemenin doğrusal rejimdeki esnekliği | İstirahatteki moleküler yapının sertliği, moleküler ağ sertliği ile ilgili | |||||
| →0 : yumuşak →∞ : sert |
|||||||||
| Viskoz Modül | G" | Pa | Malzemenin doğrusal rejimdeki viskozitesi | Yapı çok düşük gerilim altında hareket ederken geri dönüşümsüz enerji kaybı | |||||
| →0 : saf katı →∞ : dağıtıcı |
|||||||||
| Sönümleme Faktörü | tan δ | Birimsiz | Doğrusal rejimde sönümleme faktörü | Enerji dağılım faktörü, moleküler ağ morfolojisi ile ilgilidir. Herhangi bir değişiklik, moleküler doğada bir değişikliği gösterir. | |||||
| tan δ= G''/G' | →0 : saf katı =1: kirli/sıvı geçişi →∞ : saf sıvı |
||||||||
| Jel Noktası | Kritik veya Çapraz Gerinim | γc | Birimsiz | Jelden akış davranışına geçerken zorlanma | Jelin gerilebilirliği, bir akışı başlatmak veya bir katı kırmak için gereken toplam deformasyon | ||||
| →0 : kırılgan →∞ : esnek |
|||||||||
| Kritik veya Crossover Akma Gerilimi | σc | Pa | Akış davranışına geçerken stres | Jelin mukavemeti, bir akışı başlatmak veya bir katı kırmak için gereken kuvvet miktarı | |||||
| →0 : zayıf →∞ : güçlü |
|||||||||
Tablo 1: Masaüstü reometresi ile ölçülen lineer viskoelastik modül ve jel noktası özellikleri. Cihaz, ~5 dakika içinde doğrusal viskoelastik (G', G", G * ve bronz δ) modül ve jel noktası özellikleri (γ c ve σc) sağlamak için bir kesme gerinimi süpürme ile dinamik salınım kullanarak hızlı ölçümler gerçekleştirir. Parametreler, semboller, birimler ve ölçümlerin kısa bir açıklaması sağlanır.
Şekil 1: PEO çözeltilerinin ve SA mukusunun viskoelastik özelliklerinin ölçümleri. 8 MDa PEO çözeltileri% 1,% 1.5,% 2,% 2.5 ve% 3 konsantrasyonlarında hazırlandı. SA mukus, bronkoskopi prosedürü sırasında toplandı. Masaüstü reometresi kullanılarak yapılan ölçümler için 25 mm pürüzlü plakalar ve numunenin 500 μL'si kullanılmıştır. Geleneksel dökme reometre kullanılarak yapılan ölçümler için 20 mm paralel pürüzsüz plakalar ve 30 μL PEO çözeltileri kullanılmıştır. Her iki ölçüm de 1 Hz frekansında gerçekleştirildi. (A) Tek bir döngüden elde edilen eğriler,% 1,5,% 2,% 2,5 ve% 3 MDa PEO, mavi (i) ve viskoz modülün (G") evrimini gösteren 8 MDa PEO, mavi (i) ve viskoz modülün (G") kırmızı (ii) cinsinden evrimini göstermektedir. (B) PEO çözeltilerinin konsantrasyonlarını arttırmak için elastik (i) ve viskoz modülleri (ii) karşılaştıran eğriler, tezgah üstü ve geleneksel reometreler tarafından %5 gerinimde analiz edilir. (C) SA mukusunun G' ve G" evrimini gösteren eğriler, tezgah üstü reometre ile ölçülür. Ok, yumuşak-katıdan sıvı benzeri davranışa geçişi gösteren çapraz gerinimi (γc) gösterir. (D) Doğrusal viskoelastik rejimde (LVR) veya% 5 gerinimde sırasıyla% 1.5 PEO (siyah çubuklar) ve SA mukus (gri çubuklar) için (i) G *, (ii) G' ve (iii) G" değerlerinin üç kopya ölçümünü gösteren grafikler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: TCEP tedavisinin SA mukusunun viskoelastisitesi üzerine etkileri. SA mukus, TCEP tedavisinden (TCEP) önce (tedavi edilmemiş veya NT) sonra analiz edildi. Tedavi, 500 μL alikotlara 2 μL 5 mM TCEP çözeltisi eklenmesinden oluşuyordu (20 μM'lik nihai TCEP konsantrasyonu). NT ve TCEP ile muamele edilmiş numuneler, 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edildi ve analizden önce her 2 dakikada bir tüpün dibine hafifçe vurarak karıştırıldı. Ölçümler 1 Hz frekansında salınımlı gerinim altında gerçekleştirildi. (A) NT ve TCEP ile muamele edilmiş SA mukusundan eğriler (i) elastik (G') ve (ii) viskoz (G") modüllerinin evrimini gösterir. Yatay siyah kesikli çizgi, doğrusal viskoelastik rejimi (LVR) ve dikey siyah noktalı çizgi, bir LVR'nin kurulamaması durumunda% 5 gerinim referansını gösterir. (B) NT ve TCEP ile muamele edilmiş mukusun karşılık gelen eğrilerden türetilen karmaşık modülü (G*), elastik modülü (G'), viskoz modülü (G"), sönümleme oranı (tan δ), çapraz gerinim (γc) ve çapraz akma gerilmesinin (σc) karşılaştırılması. İstatistiksel analiz yapıldı ve eşleştirilmiş t-testleri kullanılarak p değerleri elde edildi. Tüm grafiklerin değerleri ±SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 olarak gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mukusun eşsiz viskoelastik özellikleri, sağlıklı hava yollarının korunmasında esastır. İç ve dış faktörler hava yolu mukusunun biyofiziksel özelliklerini değiştirerek muko-obstrüktif hastalıkların karakteristik klinik komplikasyonlarına neden olabilir. Bu nedenle, mukus viskoelastisitesindeki değişikliklerin izlenmesi, hastalık durumunun değerlendirilmesi ve mukus viskoelastisitesini azaltan tedavilerin araştırılması sırasında düşünülebilir. 1980'lerden itibaren yapılan ampirik çalışmalar, mukus reolojisi ile manyetik boncuk reometreleri23,24 kullanılarak hava yolu klerensi arasında güçlü bir korelasyon olduğunu göstermiştir. Son yıllarda, reoloji, mukusun çeşitli ölçeklerde analiz edildiği çeşitli tekniklerden yararlanmak için gelişmiştir. Örneğin, mikroreolojik analizler, manyetik veya floresan mikrometre boyutundaki parçacıkların hareketine dayanan yerel mukus özelliklerini tanımlamak için mikroskobik problar kullanır. Bununla birlikte, bu teknik küçük numune hacimleri kullandığından, balgam gibi heterojen numuneleri tanımlayan temsili veriler elde etmek zor olabilir. Ayrıca, mikroreoloji tahlilleri yüksek çözünürlüklü mikroskoplar, önemli hesaplama becerileri ve zaman alıcı analizler gerektirir ve bu nedenle yaygın laboratuvar veya klinik kullanımı için uygun değildir.
Mikroreoloji ve makroreoloji tipik olarak karşılaştırılabilir olmasa da, benzer sınırlamalar koni / paralel plaka yığın reometreleri gibi uzun süredir kurulmuş cihazlar için de geçerlidir. Makroreoloji, son derece küçük torkları ve alt nN'ye kadar olan yer değiştirmeleri ölçmek için çeşitli boyutlarda dönen koniler, plakalar, bardaklar ve / veya rotorlarla donatılmış hassas aletler kullanılarak gerçekleştirilir. m ve alt şaralıkları. Bu kadar yüksek hassasiyete ulaşmak için, çoğu ticari reometre, yağ, toz veya gürültü içermeyen bir ortamda ve artefakt oluşumunu önlemek için kontrollü bir ortam sıcaklığı ve nemi ile basınçlı hava beslemesi ve soğutma sistemi ile doğrudan bağlantı gerektirir. Ek olarak, geleneksel dökme reometreler belirli değişkenlerin ayarlanması yoluyla çok çeşitli malzemeleri ölçebilirken, bu cihazların kalibrasyonu önemli ölçüde zaman alır ve kapsamlı eğitim gerektirir.
Buna karşılık, Rheomuco tezgah üstü reometre, mukus ve balgamın viskoelastik özelliklerini ölçmek için özel olarak tasarlanmıştır ve dakikalar içinde doğrusal viskoelastik ve jel noktası ölçümleri yapmak için tek bir kalibrasyon adımı gerektirir. Bu tezgah üstü cihaz, cihaz kalibrasyonu veya reolojik veri analizi/hesaplaması konusunda kapsamlı bir eğitime ihtiyaç duymadan hızlı ve doğru viskoelastik ölçümler üretmek için basit ve standartlaştırılmış bir protokol kullanır. Cihaz, bir gerinim süpürme eğrisi üretmek ve numunenin verildiği noktaya ulaşmadan önce doğrusal bir viskoelastik rejim veya LVR ( Şekil 2A'da yatay kesikli bir çizgi ile gösterilen, gerinime eşit viskoelastik tepki bölgesi) oluşturmak için kontrollü açısal yer değiştirmeli salınımları takiben tork ve yer değiştirmeyi ölçerek çalışır. Çoğu durumda, balgam örnekleri LVR içinde% 1 -% 10 gerinim aralığındadır. Bir LVR tespit edilmediğinde, numunenin viskoelastik özelliklerini raporlamak için% 5 gerinimdeki değere yaygın olarak başvurulur. Tespit edilen bir LVR'nin yokluğu ölçümü geçersiz kılmaz, bunun yerine özellikleri çoğu numuneninkinden farklı (daha plastik) olan bir numuneyi yansıtır. Bu cihazın hassasiyeti, mukusa yakın viskoz ve elastik sıvıların ihtiyaçlarını karşılayacak şekilde optimize edilirken, mekanik gürültüye karşı yüksek tolerans sağlar, bu da onu klinik ortamlarda biyolojik sıvıların incelenmesi için ideal kılar; Bununla birlikte, sınırlı yazılım parametreleri ve plaka şekli, yüzey, mesafe ve dönme frekansı gibi değişkenlerin manipüle edilememesinin bir sonucu olarak, aşırı düşük (örneğin, tükürük) veya aşırı yüksek (örneğin, kömür katranı) elastik veya viskoz modüle sahip diğer viskoelastik malzemeleri incelemek uygun olmayabilir. PEO 8 MDa (Şekil 1) üzerindeki konsantrasyona bağlı reolojik ölçümler, 8 MDa PEO'nun% 0.3 ila% 0.4'ü veya G * için <0.05 Pa arasında olan bu cihazın duyarlılığının (yani, alt tespit sınırı) tahmin edilmesine izin verdi. Bununla birlikte,% 3'ten daha yüksek PEO konsantrasyonlarını çözmenin zorluğu nedeniyle bir üst sınır belirlenemedi. Bununla birlikte, cihaz, SA mukus örneklerinden daha viskoelastik olan (SA ile karşılaştırıldığında ~ 5 kat daha büyük G ' ve 25 kat daha büyük G") olan% 3 8 MDa PEO için G 've G'yi rapor edebildi, bu da mukus biyoörnekleri için ilgili bir dinamik aralık olduğunu düşündürdü. Salınımlar sırasında doğru ölçümler elde etmek için, numunenin uygun bir hacminin, kabarcıkların varlığı olmadan plakanın ortasına yerleştirilmesi gerektiğine dikkat edilmelidir. Numune yükleme sırasında, yetersiz hacim, hava kabarcıkları ve / veya merkez dışı yerleştirme, plakalarla yetersiz temas oluşturacak ve bu da daha düşük kaydedilen değerlere neden olacaktır. Tersine, numune taşması, ek sürükleme kuvveti25 nedeniyle aşırı kesme gerilimi yaratacaktır.
Bu çalışma, kalın mukus örneklerinin toplandıktan hemen sonra nasıl işleneceğini, saklanacağını ve tedavi edileceğini açıklamaktadır. Balgam reolojisi çalışmalarının karşılaştığı ana zorluklardan biri, bu örneklerin heterojen doğası ve standartlaştırılmış ölçüm yaklaşımlarının geliştirilmesidir. Balgam, genellikle müsin ağını hızla değiştirebilen ve mukus viskoelastisitesini etkileyebilen bakteri ve sindirim enzimleri içeren tükürük ile kontamine olmuş balgam söktürücü bir maddedir. Bu nedenle, balgam örneklerinden tükürüğün toplanmasından hemen sonra ve / veya homojenizasyondan önce çıkarılması çok önemlidir. Doğası gereği, mukus yapışkandır ve kullanımı zordur, ancak pozitif yer değiştirmeli pipetlerin kullanımı, müsin ağından ödün vermeden homojenizasyonu kolaylaştırır, doğru aliquot hazırlamayı sağlar ve numune yüklemesini basitleştirir. Deneye bağlı olarak, numune homojenizasyonu gerekli olmayabilir, ancak replikalar arasındaki değişkenliği en aza indirebilir. Balgamın toplandıktan hemen sonra işlenmesi önerilirken, hava yolu mukusunun dondurulması ve çözülmesinden sonra benzersiz biyofiziksel özellikleri korur. Bununla birlikte, donma ve çözülme bir numunenin genel reolojisini etkileyebilir. Bu nedenle, yalnızca benzer donma/çözülme döngüleri geçirmiş numuneler birbirleriyle karşılaştırılmalıdır. Mukoaktif ajanların etkilerini test ederken, ilk numune homojenizasyonu bileşik difüzyonunu optimize etmek için önemlidir. İnhalasyon yoluyla akciğerlere ilaç verilmesi, hedefe erişen hacimleri sınırlar (yani, mukus tıkacı), ancak kirpiklerin mukosiliyer taşıma ile birlikte sürekli dövülmesi, ilacın ve hedefin bir miktar karışmasını sağlar. İn vivo tedaviyi simüle etmek için, küçük hacimlerde farmakolojik bir ajan doğrudan numunelere uygulanabilir ve inkübasyon süresi boyunca düzenli ajitasyonla kademeli olarak karıştırılabilir. Bununla birlikte, diğer tedavi yöntemleri (örneğin, bir Petri kabındaki numuneye ilaç nebülizasyonu) araştırılabilir. Kuluçka sırasında nazik ajitasyon, mekanik bozulma (örneğin, vorteks veya sonikasyon) nedeniyle müsin ağından ödün vermeden ilerleyici ilaç penetrasyonunu sağlayacaktır. Şu anda, TCEP klinik ortamlarda kullanılmamaktadır, ancak NAC, rhDNaz, P-2119, ARINA-1 ve PAAG gibi diğer mukoaktif reaktifler çok çeşitli muko-obstrüktif durumlar için araştırılmaktadır21,26,27,28. Kavram doğrulaması için, bu protokolün TCEP tedavisine yanıt olarak astımlı mukustaki önemli değişiklikleri tespit etmek için kullanılabileceği gösterilmiştir. Daha düşük lineer viskoelastik ve jel noktası belirteçlerinden belirgin olan ve klirens kabiliyetinde bir iyileşme olduğunu düşündüren bir indirgeyici ajanla muamele edilerek daha sıvı benzeri bir mukus üretildi. RFNaz, KF'de muazzam klinik faydalar sağlasa da, muhtemelen kronik olarak daha düşük hücre dışı DNA konsantrasyonları nedeniyle tipik olarak diğer muko-obstrüktif hastalıklar için kullanılmaz. Bununla birlikte, akut viral ve bakteriyel bir enfeksiyon sırasında, güçlü bir enflamatuar yanıt geçici olarak yüksek hücre dışı DNA konsantrasyonuna neden olabilir ve hava yolu klerensini azaltabilir. Bu nedenle, rhDNaz etkinliğinin vaka bazında hızlı ex vivo testi, viral ve bakteriyel kaynaklı pnömoninin tedavisinde rehberlik sağlayabilir. Bu, solunum virüsü SARS-CoV-2'nin neden olduğu COVID-19 pandemisinin ortasında özellikle değerli olabilir.
Özetle, tarif edilen cihaz uygulanabilir, hızlı ve doğru reolojik önlemler sağlar. Bu özellikler, hava yolu hastalıklarının durumunu araştırmak ve izlemek ve ayrıca yeni mukoaktif bileşiklerin etkilerini test etmek için potansiyel sağlar. Ölçümlerin hızı ve basitliği, uzun süreli depolama veya taşımanın donma ve / veya zamansal etkileri ile ilgili komplikasyonlara neden olmadan tahlillerin yapılmasına izin verirken, bu tahlilleri çok çeşitli ortamlarda uygulanabilir hale getirir. Nihayetinde, bu yaklaşım, hasta tedavisinin gerçek zamanlı olarak uyarlanmasına izin veren bir seçenek panelinden kişiselleştirilmiş tedavilerin seçimi için araştırılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiç kimse
Acknowledgments
Bu makale Vertex Pharmaceuticals (Ehre RIA Ödülü) ve CFF destekli Research EHRE20XX0 hibeleri ile desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capillary Pistons Tips | Gilson | CP1000 | |
| Discovery Hybrid Rheometer-3 | TA Instruments | DHR-3 Bulk Rheometer manufactured by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests. |
|
| Graphing Software | GraphPad Prism | GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis | |
| Microcentrifuge Tube | Costar | 3621 | |
| Peltier plate | TA Instruments | Temperature control system manufactured by TA Instruments in New Castle, DE |
|
| Polyethylene oxide | Sigma | 372838 | 8 MDa polymer used as mucus simulant |
| Positive Displacement Pipette | Gilson | M1000 | Pipette used for handling viscous solutions |
| Rheomuco | Rheonova | Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests. | |
| Rough Lower Geometries | Rheonova | D-1811-007 | 25mm Diameter |
| Rough Upper Geometries | Rheonova | U-1811-007 | 25mm Diameter |
| Smooth Upper Parallel Plate | TA Instruments | 20mm Diameter | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Sigma | 646547-10X1ML | TCEP: Potent reducing agent. |
References
- Button, B., et al. A periciliary brush promotes the lung health by separating the mucus layer from airway epithelia. Science. 337 (6097), 937-941 (2012).
- Boucher, R. C. Muco-obstructive lung diseases. New England Journal of Medicine. 380 (20), 1941-1953 (2019).
- Rose, M. C., Voynow, J. A. Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in health and disease. Physiological Reviews. 86 (1), 245-278 (2006).
- Ehre, C., Ridley, C., Thornton, D. J. Cystic fibrosis: An inherited disease affecting mucin-producing organs. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 52, 136-145 (2014).
- Morrison, C. B., Markovetz, M. R., Ehre, C. Mucus, mucins, and cystic fibrosis. Pediatric Pulmonology. 54, 84-96 (2019).
- Hill, D. B., Button, B., Rubinstein, M., Boucher, R. C. Physiology and Pathophysiology of Human Airway Mucus. Physiological Reviews. , (2022).
- Lin, V. Y., et al. Excess mucus viscosity and airway dehydration impact COPD airway clearance. European Respiratory Journal. 55 (1), 1900419 (2020).
- Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. The New England Journal of Medicine. 363 (23), 2233-2247 (2010).
- Tomaiuolo, G., et al. A new method to improve the clinical evaluation of cystic fibrosis patients by mucus viscoelastic properties. PloS One. 9 (1), 82297 (2014).
- Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (23), 9188-9192 (1990).
- Zahm, J. M., et al. Dose-dependent in vitro effect of recombinant human DNase on rheological and transport properties of cystic fibrosis respiratory mucus. The European Respiratory Journal. 8 (3), 381-386 (1995).
- Fuchs, H. J., et al. Effect of aerosolized recombinant human DNase on exacerbations of respiratory symptoms and on pulmonary function in patients with cystic fibrosis. The Pulmozyme Study Group. The New England Journal of Medicine. 331 (10), 637-642 (1994).
- Hubbard, R. C., et al. A preliminary study of aerosolized recombinant human deoxyribonuclease I in the treatment of cystic fibrosis. The New England Journal of Medicine. 326 (12), 812-815 (1992).
- Shak, S. Aerosolized recombinant human DNase I for the treatment of cystic fibrosis. Chest. 107, 2 Suppl 65-70 (1995).
- Ma, J. T., Tang, C., Kang, L., Voynow, J. A., Rubin, B. K. Cystic fibrosis sputum rheology correlates with both acute and longitudinal changes in lung function. Chest. 154 (2), 370-377 (2018).
- Donaldson, S. H., et al. Mucus clearance and lung function in cystic fibrosis with hypertonic saline. The New England Journal of Medicine. 354 (3), 241-250 (2006).
- Patarin, J., et al. Rheological analysis of sputum from patients with chronic bronchial diseases. Scientific Reports. 10 (1), 15685 (2020).
- Markovetz, M. R., et al. Endotracheal tube mucus as a source of airway mucus for rheological study. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (4), 498-509 (2019).
- Ramsey, K. A., et al. Airway mucus hyperconcentration in non-cystic fibrosis bronchiectasis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 201 (6), 661-670 (2020).
- Dunican, E. M., et al. Mucus plugs in patients with asthma linked to eosinophilia and airflow obstruction. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 997-1009 (2018).
- Ehre, C., et al. An improved inhaled mucolytic to treat airway muco-obstructive diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (2), 171-180 (2019).
- Morrison, C. B., et al. Treatment of cystic fibrosis airway cells with CFTR modulators reverses aberrant mucus properties via hydration. The European Respiratory Journal. 59 (2), 2100185 (2021).
- Puchelle, E., Jacquot, J., Beck, G., Zahm, J. M., Galabert, C. Rheological and transport properties of airway secretions in cystic fibrosis-relationships with the degree of infection and severity of the disease. European Journal of Clinical Investigation. 15 (6), 389-394 (1985).
- Puchelle, E., Zahm, J. M., Quemada, D. Rheological properties controlling mucociliary frequency and respiratory mucus transport. Biorheology. 24 (6), 557-563 (1987).
- Cardinaels, R., Reddy, N. K., Clasen, C. Quantifying the errors due to overfilling for Newtonian fluids in rotational rheometry. Rheologica Acta. 58 (8), 525-538 (2019).
- Hancock, L. A., et al. Muc5b overexpression causes mucociliary dysfunction and enhances lung fibrosis in mice. Nature Communications. 9 (1), 5363 (2018).
- Adewale, A. T., et al. Novel therapy of bicarbonate, glutathione, and ascorbic acid improves cystic fibrosis mucus transport. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 63 (3), 362-373 (2020).
- Fernandez-Petty, C. M., et al. A glycopolymer improves vascoelasticity and mucociliary transport of abnormal cystic fibrosis mucus. JCI Insight. 4 (8), 125954 (2019).
