Summary
Las propiedades viscoelásticas del moco juegan un papel crítico en el aclaramiento mucociliar. Sin embargo, las técnicas reológicas tradicionales de moco requieren enfoques complejos y lentos. Este estudio proporciona un protocolo detallado para el uso de un reómetro de sobremesa que puede realizar mediciones viscoelásticas de forma rápida y confiable.
Abstract
En las enfermedades pulmonares mucoobstructivas (por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis quística) y otras afecciones respiratorias (por ejemplo, infecciones virales / bacterianas), las propiedades biofísicas del moco se ven alteradas por la hipersecreción de células caliciformes, la deshidratación de las vías respiratorias, el estrés oxidativo y la presencia de ADN extracelular. Estudios anteriores mostraron que la viscoelasticidad del esputo se correlacionaba con la función pulmonar y que los tratamientos que afectan la reología del esputo (por ejemplo, mucolíticos) pueden dar lugar a notables beneficios clínicos. En general, las mediciones reológicas de fluidos no newtonianos emplean enfoques elaborados y lentos (por ejemplo, reómetros paralelos / de placa cónica y / o seguimiento de partículas de microperlas) que requieren una capacitación extensa para realizar el ensayo e interpretar los datos. Este estudio probó la confiabilidad, reproducibilidad y sensibilidad de Rheomuco, un dispositivo de sobremesa fácil de usar que está diseñado para realizar mediciones rápidas utilizando oscilación dinámica con un barrido de cizallamiento para proporcionar módulos viscoelásticos lineales (G', G", G * y δ de bronceado) y características de punto de gel (γc y σc) para muestras clínicas dentro de los 5 minutos. El rendimiento del dispositivo se validó utilizando diferentes concentraciones de un simulante de moco, óxido de polietileno (PEO) de 8 MDa, y contra mediciones reológicas a granel tradicionales. Luego se evaluó un aislado clínico extraído de un paciente intubado con estado asmático (SA) en mediciones por triplicado y el coeficiente de variación entre las mediciones es de <10%. El uso ex vivo de un potente agente reductor de moco, TCEP, en el moco SA resultó en una disminución de cinco veces en el módulo elástico y un cambio hacia un comportamiento más "líquido" en general (por ejemplo, un bronceado más alto δ). Juntos, estos resultados demuestran que el reómetro de sobremesa probado puede hacer mediciones confiables de la viscoelasticidad del moco en entornos clínicos y de investigación. En resumen, el protocolo descrito podría utilizarse para explorar los efectos de los fármacos mucoactivos (por ejemplo, rhDNasa, N-acetil cisteína) in situ para adaptar el tratamiento caso por caso, o en estudios preclínicos de nuevos compuestos.
Introduction
Las enfermedades mucoobstructivas de las vías respiratorias, como el asma, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), la fibrosis quística (FQ) y otras afecciones respiratorias, como la neumonía viral y bacteriana, son problemas de salud prevalentes en todo el mundo. Si bien la fisiopatología varía mucho entre cada afección, una característica clave común es el aclaramiento mucociliar anormal. En los pulmones sanos, el moco recubre el epitelio de las vías respiratorias para atrapar las partículas inhaladas y proporcionar una barrera física contra los patógenos. Una vez secretado, el moco de las vías respiratorias, compuesto de ~ 97.5% de agua, 0.9% de sal, ~ 1.1% de proteínas globulares y ~ 0.5% de mucinas, se transporta gradualmente hacia la glotis mediante el latido coordinado delos cilios 1,2. Las mucinas son grandes glicoproteínas ligadas a O que interactúan a través de enlaces no covalentes y covalentes para proporcionar las distintas propiedades viscoelásticas del moco, que se requieren para un transporte eficiente3. Los cambios en la ultraestructura de la red de mucina causados por el transporte de iones alterados, el despliegue de mucina, las interacciones electrostáticas, la reticulación o los cambios en la composición pueden afectar significativamente la viscoelasticidad del moco y afectar el aclaramiento mucociliar 4,5. Por lo tanto, identificar cambios en las propiedades biofísicas del moco de las vías respiratorias es esencial para comprender la patogénesis de la enfermedad y probar nuevos compuestos mucoactivos6.
Varios factores pueden conducir a la producción de moco aberrante en los pulmones. En la EPOC, la inhalación crónica de humo de cigarrillo desencadena la hipersecreción de moco como resultado de la metaplasia de células caliciformes, así como la deshidratación de las vías respiratorias a través de la regulación a la baja del canal regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), causando hiperconcentración de moco y pequeña obstrucción de las vías respiratorias 7,8. Del mismo modo, la FQ, un trastorno genético asociado con mutaciones en el gen CFTR, se caracteriza por la producción de moco viscoso y adherente que es inadecuado para el transporte 8,9. En resumen, la disfunción de CFTR induce el agotamiento del líquido de la superficie de las vías respiratorias, el entrelazamiento polimérico de la mucina y el aumento de las interacciones bioquímicas, que resultan en inflamación crónica e infecciones bacterianas. Además, las células inflamatorias atrapadas en el moco estático exacerban aún más la viscoelasticidad del moco al agregar otra molécula grande, el ADN, a la matriz del gel, empeorando la obstrucción de las vías respiratorias5. Uno de los mejores ejemplos de la importancia de la reología del moco en la salud general de los pulmones lo proporciona el ejemplo de la DNFase humana recombinante (rhDNasa) en el tratamiento de pacientes con fibrosis quística. Los efectos de la rhDNasa se demostraron por primera vez ex vivo sobre el esputo expectorado, que mostró una transición de moco viscoso a un líquido que fluye en cuestión de minutos10,11. Los ensayos clínicos en pacientes con FQ demostraron que la reducción de la viscoelasticidad del moco de las vías respiratorias con la inhalación de rhDNasa disminuyó la tasa de exacerbaciones pulmonares y mejoró la función pulmonar y el bienestar general del paciente 12,13,14. Como resultado, la inhalación de rhDNasa destinada a facilitar el aclaramiento se convirtió en el estándar de atención para los pacientes con FQ durante más de dos décadas. Se observaron beneficios clínicos similares con el uso de solución salina hipertónica inhalada para la hidratación del moco en la FQ, que se correlacionó con cambios en las propiedades reológicas y dio lugar a la aceleración del aclaramiento mucociliar y a una mejora de la función pulmonar15,16. Por lo tanto, un protocolo rápido y confiable para medir las propiedades viscoelásticas del moco en entornos clínicos es importante para optimizar los enfoques terapéuticos.
El reómetro de sobremesa probado aquí ofrece una alternativa rápida y conveniente para realizar mediciones viscoelásticas completas de muestras de moco / esputo. Utilizando oscilaciones dinámicas con desplazamiento angular controlado, el instrumento proporciona deformación a través de un par de placas paralelas ajustables (por ejemplo, geometrías rugosas o lisas) para medir el par y el desplazamiento con resoluciones de 15 nN. m y 150 nm, respectivamente17. Una calibración estandarizada predeterminada combinada con pautas de usuario adaptadas para especialistas no reológicos permite mediciones sencillas y reduce el riesgo de errores del operador. El dispositivo produce una curva de barrido de deformación que se procesa y analiza en tiempo real (dentro de ~ 5 min) y proporciona automáticamente características viscoelásticas lineales (G', G", G * y δ bronceado) y de punto de gel (γc y σc) (consulte la Tabla 1). El módulo elástico o de almacenamiento (G') describe cómo responde una muestra a la tensión (es decir, la capacidad de volver a su forma original), mientras que el módulo viscoso o de pérdida (G") describe la energía disipada por ciclo de deformación sinusoidal (es decir, la energía perdida debido a la fricción de las moléculas). El módulo complejo o dinámico (G*) es la relación entre tensión y deformación, que describe la cantidad de acumulación de fuerza interna en respuesta a un desplazamiento de cizallamiento (es decir, las propiedades viscoelásticas generales). El factor de amortiguación (δ de bronceado) es la relación entre el módulo viscoso y el módulo elástico, que indica la capacidad de una muestra para disipar energía (es decir, un bronceado bajo δ indica un comportamiento elástico dominante / sólido, mientras que un bronceado alto δ indica un comportamiento viscoso dominante / líquido). Para las características del punto de gel, la deformación cruzada (γc) es la medida de la deformación de cizallamiento, calculada por la relación entre la trayectoria de deflexión y la altura del espacio de cizallamiento, en la que la muestra pasa de un comportamiento sólido a uno líquido y ocurre, por definición, en la tensión de oscilación donde G' = G" o bronceado δ = 1. La tensión de rendimiento cruzado (σc) es una medida de la cantidad de tensión aplicada por el dispositivo en el que se cruzan los módulos elásticos y viscosos. En sputa sana, la elasticidad domina la respuesta mecánica a la tensión (G' > G"). En las enfermedades mucoobstructivas, tanto G' como G" aumentan como consecuencia de cambios patológicos en el moco 17,18,19. La simplicidad operativa del dispositivo facilita las mediciones in situ y evita la necesidad de almacenamiento / transporte / envío de muestras a una instalación externa para su análisis, evitando así el tiempo y los efectos de congelación-descongelación en las propiedades de estas muestras biológicas.
En este estudio, se utilizaron soluciones de óxido de polietileno (PEO) de 8 MDa de diferentes concentraciones (1%-3%) para validar el rango de medición de un reómetro de sobremesa comercial (Tabla de Materiales) y la curva dependiente de la concentración obtenida se comparó directamente con las mediciones adquiridas con un reómetro a granel tradicional (Tabla de Materiales). ). Luego se evaluó la repetibilidad de las mediciones reológicas utilizando moco extraído broncoscópicamente de un paciente intubado que sufría de estado asmático (SA), una forma extrema de exacerbación del asma caracterizada por broncoespasmo, inflamación eosinofílica e hiperproducción de moco en respuesta a un agente ambiental o infeccioso 8,20 . En este caso, el paciente con SA había sido intubado por insuficiencia respiratoria grave y requirió ECMO (oxigenación por membrana extracorpórea) debido a la incapacidad de apoyar al paciente de manera efectiva y segura con ventilación mecánica sola, a pesar de las agresivas terapias estándar para el asma. Durante una broncoscopia clínicamente indicada para el colapso lobar, se observó que las secreciones gruesas, claras y tenaces obstruían los bronquios lobares y se aspiraron mediante lavados salinos. Inmediatamente después de la recolección, se eliminó el exceso de solución salina del aspirado y se analizaron las propiedades viscoelásticas de la muestra de SA restante utilizando el dispositivo de sobremesa. Se trataron alícuotas de muestra adicionales con un agente reductor, tris (2-carboxiletil) clorhidrato de fosfina (TCEP), para determinar si este protocolo podría usarse para caracterizar la eficacia del compuesto terapéutico ex vivo.
Los resultados mostraron que este protocolo y el dispositivo de sobremesa se pueden utilizar de manera efectiva en un entorno clínico. Las propiedades reológicas determinadas a partir de curvas dependientes de la concentración de PEO (Figura 1A) fueron indistinguibles entre el dispositivo de sobremesa probado y un reómetro de placa paralelo tradicional (Figura 1B). Las mediciones triplicadas del moco SA fueron repetibles, con un coeficiente de variación del 10% para los criterios de valoración G*, G' y G" y reflejaron las anomalías sustanciales en la viscoelasticidad del moco que fueron clínicamente evidentes en el caso de este paciente (Figura 1D). Finalmente, el tratamiento ex vivo con TCEP resultó en una reducción significativa de G' y G", y un aumento en el bronceado δ, demostrando la capacidad de respuesta al tratamiento por alteraciones en la red de mucina (Figura 2). En conclusión, este protocolo que utiliza un reómetro de sobremesa proporciona un enfoque simple y efectivo para evaluar las propiedades viscoelásticas de las muestras de moco obtenidas de la clínica. Esta capacidad se puede utilizar para facilitar los enfoques de atención de la medicina de precisión, ya que los médicos pueden probar la eficacia de los medicamentos mucoactivos aprobados en el sitio, lo que puede ayudar a identificar opciones de tratamiento alternativas. Además, este enfoque se puede utilizar en ensayos clínicos para examinar los efectos de los fármacos en investigación.
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Protocol
En el presente estudio, las muestras se recolectaron durante una broncoscopia clínicamente indicada después de obtener el consentimiento informado bajo un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la UNC.
1. Recolección y almacenamiento de esputo /moco
- Recolecte moco de las vías respiratorias a través de la recolección de esputo o la aspiración por broncoscopia.
- Recolectar esputo ya sea a través de expectoración espontánea o inducir esputo por inhalación salina hipertónica al 3%. Alternativamente, aspire directamente el moco de las vías respiratorias durante un procedimiento de broncoscopia.
- Guarde el esputo/moco de las vías respiratorias recolectado en tazas de muestra estériles. En el caso del esputo, retire el exceso de saliva de la muestra inmediatamente después de la recolección.
- Coloque las muestras en hielo para su transporte. Limite el tiempo de transporte a menos de 4 h.
- Analizar las muestras en el momento de la recogida o almacenarlas a -80 °C hasta su procesado.
- Antes del almacenamiento, homogeneice el moco canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces con una pipeta de desplazamiento positivo o pipeta directamente en los tubos de la microcentrífuga.
- Alícuota las muestras para su almacenamiento en volúmenes ≥500 μL para garantizar un volumen suficiente para los experimentos.
NOTA: La congelación y descongelación pueden afectar las propiedades viscoelásticas de la muestra. Solo compare muestras que se hayan sometido a ciclos de congelación/descongelación similares.
2. Preparación de la muestra
- Pipetear sputa/moco fresco y congelado directamente u homogeneizar las muestras utilizando una pipeta de desplazamiento positivo canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces antes de la alícuota.
NOTA: La homogeneización es importante para las muestras que contienen tapones gruesos que pueden afectar la reproducibilidad. - Alícuota 400-500 μL de la muestra en tubos de microcentrífuga separados. Preparar tantas alícuotas como sea necesario para repetir las mediciones y/o el tratamiento con reactivos farmacológicos (por ejemplo, rhDNasa, N-acetil cisteína). Incubar las alícuotas que se van a ensayar a 37 °C durante un mínimo de 5 min antes de la medición.
- Para probar agentes farmacológicos (opcional), utilice altas concentraciones de soluciones madre para evitar la dilución de la muestra.
- Agregue entre 0.4% y 10% de volumen (para minimizar la dilución de la muestra) del reactivo deseado (por ejemplo, TCEP) directamente sobre la muestra. Asegúrese de que ninguna gota del compuesto permanezca en el lado del tubo.
- Incubar las muestras a 37 °C durante el tiempo deseado para permitir una reacción química (<1 h para evitar la degradación proteolítica del moco).
- Mezcle la muestra de moco y el reactivo moviendo la parte inferior del tubo de la microcentrífuga cada 2 minutos para permitir la penetración progresiva del reactivo en la muestra de moco sin comprometer la red de mucina (por ejemplo, imitando el latido ciliar y el aclaramiento mucociliar). Al comparar múltiples reactivos farmacológicos, asegúrese de que el tiempo de incubación sea similar.
3. Inicialización y calibración del instrumento
- Encienda la máquina (Tabla de materiales) e inicialice el software.
- Seleccione Nueva medición. Introduzca el número de identificación de la muestra en ID de medida y el nombre del operador en Operador para continuar. Introduzca información adicional o comentarios en Comentarios.
- Seleccione un conjunto de geometría (es decir, placas paralelas de 25 mm rugosas o lisas) e inspeccione cuidadosamente las placas grandes y pequeñas para asegurarse de que las placas estén limpias y en perfectas condiciones).
NOTA: Las placas rugosas están diseñadas para grandes volúmenes (350-500 μL) y las placas lisas están diseñadas para volúmenes más pequeños (250-350 μL). El uso de un volumen de muestra más bajo o más alto que el recomendado puede causar mediciones inexactas. - Inserte la placa grande firmemente en el púlpito inferior.
- Inserte la placa pequeña suavemente en el púlpito superior y bloquee la placa girando ligeramente hasta escuchar un "clic", lo que indica que la placa está correctamente sujeta. Tenga en cuenta que la oscilación libre de la placa superior es normal.
- Espere hasta que la temperatura alcance el valor objetivo de 37 °C. Luego, inicie la calibración automática según lo solicite el software.
NOTA: No moleste la máquina o la superficie de la mesa de trabajo durante este proceso.
4. Carga de muestras
- Usando una pipeta de desplazamiento positivo, pipetee lentamente entre 250 y 500 μL de la muestra en el centro de la placa inferior grande. Una vez depositadas en la placa, las muestras viscosas adoptarán una forma de cúpula, mientras que las muestras altamente elásticas pueden requerir un corte físico (use tijeras de disección).
NOTA: Evite introducir burbujas de aire. Si es necesario, elimine las burbujas residuales empujando con una punta de pipeta. - Baje el cabezal de medición que transporta la placa pequeña a través del software y observe la muestra. Si se carga correctamente en la placa inferior, la muestra hará contacto y se centrará entre las dos placas.
- Para asegurarse de que la muestra llena el espacio (es decir, extendiéndose a los bordes de las placas), utilice la función Reducir espacio hasta que la muestra ya no tenga forma bicóncava o esté alineada con el borde de las placas. La función Reducir brecha reduce el cabezal de medición en incrementos de 0,1 mm y se limita a siete incrementos.
NOTA: Supervise la muestra cuidadosamente y ajuste el espacio progresivamente para evitar el derrame excesivo.- Si queda un hueco después de siete incrementos, haga clic en Rehacer instalación para volver a la posición inicial y ajustar la posición y/o el volumen de la muestra.
- Si el espacio es extremadamente reducido (por ejemplo, forma biconvexa), retire el exceso de muestra con una espátula mediante un movimiento circular a lo largo del borde de la placa superior. Asegúrese de recortar el exceso de muestra suavemente para evitar el estrés por cizallamiento.
NOTA: Al final de este paso, el borde de la muestra debe estar alineado con el borde de la placa superior como se muestra en las directrices del usuario.
- Baje la cubierta protectora para evitar cualquier proyección accidental de fluidos contaminados durante la oscilación.
5. Iniciar la medición biofísica
- Para iniciar la medición, haga clic en Iniciar análisis. Un ciclo completo tomará de 4 a 7 minutos.
- Evite hablar en voz alta y tocar el dispositivo o el banco durante toda la duración del ciclo. Un ambiente tranquilo es particularmente importante durante los primeros 2 minutos.
NOTA: Durante el ciclo, el instrumento realiza una prueba estandarizada de barrido de deformación, que consiste en pasos oscilantes sucesivos. Cada paso es una serie de 10 oscilaciones a amplitud y frecuencia constantes (1 Hz), durante las cuales se mide el par correspondiente en tiempo real. Las señales de tensión y par permiten el cálculo de los módulos complejos (G*), elásticos (G') y viscosos (G"), así como la relación de amortiguación (bronceado δ) en cada paso. Las oscilaciones aumentan gradualmente en amplitud, lo que intensifica la deformación impuesta a la muestra.
- Evite hablar en voz alta y tocar el dispositivo o el banco durante toda la duración del ciclo. Un ambiente tranquilo es particularmente importante durante los primeros 2 minutos.
6. Eliminación de muestras
- Una vez completado el ciclo, haga clic en Siguiente para levantar el cabezal de medición y generar el informe de análisis de muestra.
NOTA: Para el informe, el software calcula los datos registrados y grafica automáticamente dos curvas que muestran la evolución de los módulos viscosos y elásticos en relación con la deformación ejercida a la muestra y muestra el régimen viscoelástico lineal (es decir, una meseta a baja deformación) si está presente. Si no se detecta ningún régimen lineal, los valores de G', G", G* y δ bronceados se extraen a 0,05 cepas. Además, la tensión cruzada y la tensión de rendimiento (γc y σc) se calculan a δ de bronceado = 1. Los datos también se proporcionan en hojas de cálculo para cada paso para su posterior análisis. - Una vez que el cabezal de medición esté completamente retraído, levante la cubierta protectora, deseche la muestra y retire cuidadosamente las placas. Limpie y desinfecte los platos con agua tibia y jabón.
NOTA: Seque bien el conjunto de geometría antes de repetirlo.
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Representative Results
La Figura 1 muestra la precisión y repetibilidad de las mediciones reológicas utilizando curvas dependientes de la concentración de control viscoelástico, es decir, solución de óxido de polietileno (PEO) y moco de estado asmático (SA). Las mediciones de las características viscoelásticas de 8 MDa PEO a cinco concentraciones diferentes (1%, 1,5%, 2%, 2,5% y 3%) se compararon directamente entre el reómetro de sobremesa evaluado y un reómetro a granel tradicional (Tabla de Materiales). A diferencia del moco SA, las soluciones de PEO estaban dominadas por el viscoso (G" > G') en todo el rango de deformación y no exhibían cruce y, por lo tanto, presentaban un comportamiento sólido. Además, las mediciones triplicadas realizadas en solución de PEO al 1,5% y muestra clínica de moco SA confirmaron que las características viscoelásticas lineales (G*, G' y G") eran altamente repetibles (coeficiente de variación del <10%) para los valores obtenidos de la muestra biológica.
La observación del colapso lobar en el paciente con SA sugirió que el taponamiento de moco podría complicar la capacidad de ventilar mecánicamente los pulmones y planteó la posibilidad de que se pudieran considerar terapias mucolíticas no estándar. En la Figura 2, el protocolo descrito en este documento se utilizó para medir los cambios en las propiedades viscoelásticas del moco después del tratamiento con un agente mucolítico. Si bien NAC ha sido aprobado para su uso con EPOC y FQ, se demostró que tiene una cinética lenta y baja potencia como agente reductor21. Se ha demostrado que el TCEP es altamente efectivo para modificar las propiedades biofísicas del moco22. Los efectos del TCEP sobre la viscoelasticidad del moco SA se probaron en un entorno clínico utilizando el reómetro de sobremesa. El tratamiento mucolítico dio como resultado una muestra más fluida con una disminución del módulo complejo (G*) en 4,6 veces, el módulo elástico (G') en 5,1 veces, el módulo viscoso (G") en 1,9 veces, la tensión cruzada (γc) en 3,3 veces y la tensión de rendimiento cruzada (σc) en 5,7 veces, y un aumento en la relación de amortiguación (δ bronceado) en 2,8 veces.
| Zona | Parámetro | Símbolo | Unidad | Definición | Significado | ||||
| Régimen viscoelástico lineal (LVR) | Módulo complejo | G* | Papá | Comportamiento viscoelástico representativo en el régimen lineal | Resistencia general a la deformación de la red molecular | ||||
| G* = σ/γ | |||||||||
| Módulo elástico | G' | Papá | Elasticidad del material en el régimen lineal | Rigidez de la estructura molecular en reposo, relacionada con la rigidez de la red molecular | |||||
| →0 : suave →∞ : rígido |
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| Módulo viscoso | G" | Papá | Viscosidad del material en régimen lineal | Pérdida irreversible de energía mientras la estructura se mueve bajo una tensión muy baja | |||||
| →0 : sólido puro →∞ : disipativo |
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| Factor de amortiguación | δ bronceado | Sin unidad | Factor de amortiguación en el régimen lineal | Factor de disipación de energía, relacionado con la morfología de la red molecular. Cualquier cambio indica un cambio en la naturaleza molecular. | |||||
| tan δ= G''/G' | →0 : sólido puro =1: transición suciedad/líquido →∞ : líquido puro |
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| Punto de gel | Tensión crítica o cruzada | γc | Sin unidad | Tensión al cambiar de comportamiento de gel a flujo | Estirabilidad del gel, la deformación total necesaria para iniciar un flujo o romper un sólido | ||||
| →0 : quebradizo →∞ : flexible |
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| Estrés de rendimiento crítico o cruzado | σc | Papá | Estrés al cambiar al comportamiento de flujo | Fuerza del gel, la cantidad de fuerza necesaria para iniciar un flujo o romper un sólido | |||||
| →0 : débil →∞ : fuerte |
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Tabla 1: Características lineales de los módulos viscoelásticos y del punto de gel medidos por el reómetro de sobremesa. El dispositivo realiza mediciones rápidas utilizando oscilación dinámica con un barrido de cizallamiento-deformación para proporcionar módulos viscoelásticos lineales (G', G", G* y δ bronceado) y características de punto de gel (γc y σc) en ~ 5 min. Se proporcionan parámetros, símbolos, unidades y una breve descripción de las mediciones.
Figura 1: Mediciones de las propiedades viscoelásticas de las soluciones PEO y moco SA. Las soluciones de 8 MDa PEO se prepararon en concentraciones de 1%, 1,5%, 2%, 2,5% y 3%. El moco sa se recolectó durante un procedimiento de broncoscopia. Para las mediciones utilizando el reómetro de sobremesa se utilizaron placas rugosas de 25 mm y 500 μL de la muestra. Para las mediciones utilizando el reómetro a granel tradicional, se utilizaron placas lisas paralelas de 20 mm y 30 μL de soluciones de PEO. Ambas mediciones se ejecutaron a una frecuencia de 1 Hz. (A) Curvas obtenidas de un solo ciclo analizando 1%, 1.5%, 2%, 2.5% y 3% 8 MDa PEO, mostrando la evolución del módulo elástico (G') en azul (i) y el módulo viscoso (G") en rojo (ii). (B) Curvas que comparan módulos elásticos (i) y viscosos (ii) para aumentar las concentraciones de soluciones de PEO, analizadas por reómetros tradicionales y de sobremesa a una deformación del 5%. (C) Curvas que muestran la evolución de G' y G" de moco SA, medidas por el reómetro de sobremesa. La flecha indica la deformación cruzada (γc), que denota una transición de comportamiento blando-sólido a líquido. (D) Gráficos que muestran tres medidas replicadas de (i) valores de G*, (ii) G' y (iii) G" para 1.5% peO (barras negras) y MOco SA (barras grises) en el régimen viscoelástico lineal (LVR) o a 5% de deformación, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Efectos del tratamiento con TCEP sobre la viscoelasticidad del moco SA. El moco SA se analizó antes (no tratado o NT) y después del tratamiento con TCEP (TCEP). El tratamiento consistió en añadir 2 μL de solución de TCEP de 5 mM en alícuotas de 500 μL (concentración final de TCEP de 20 μM). Las muestras tratadas con NT y TCEP se incubaron durante 20 min a 37 °C y se mezclaron moviendo el fondo del tubo cada 2 min antes del análisis. Las mediciones se realizaron bajo tensión oscilante a una frecuencia de 1 Hz. (A) Curvas de moco SA tratado con NT y TCEP que muestran la evolución de (i) módulos elásticos (G') y (ii) viscosos (G"). La línea discontinua negra horizontal indica el régimen viscoelástico lineal (LVR) y la línea punteada negra vertical indica la referencia de deformación del 5% en caso de que no se pueda establecer un LVR. (B) Comparación del módulo complejo (G*), el módulo elástico (G'), el módulo viscoso (G"), la relación de amortiguación (δ de bronceado), la deformación cruzada (γc) y la tensión de rendimiento de cruce (σc) del moco tratado con NT y TCEP derivado de las curvas correspondientes. Se realizó un análisis estadístico y se adquirieron valores de p mediante pruebas t pareadas. Los valores de todos los gráficos se muestran como ±SEM. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las propiedades viscoelásticas únicas del moco son esenciales para mantener las vías respiratorias sanas. Los factores internos y externos pueden alterar las propiedades biofísicas del moco de las vías respiratorias, causando complicaciones clínicas características de las enfermedades mucoobstructivas. Por lo tanto, el monitoreo de los cambios en la viscoelasticidad del moco podría considerarse durante las evaluaciones del estado de la enfermedad y la exploración de terapias que reducen la viscoelasticidad del moco. Los estudios empíricos de la década de 1980 demostraron una fuerte correlación entre la reología del moco y el aclaramiento de las vías respiratorias utilizando reómetros magnéticosde cuentas 23,24. En los últimos años, la reología ha evolucionado para aprovechar varias técnicas que analizan el moco a diversas escalas. Por ejemplo, los ensayos microrreológicos utilizan sondas microscópicas para describir las propiedades del moco local en función del movimiento de partículas magnéticas o fluorescentes de tamaño micrométrico. Sin embargo, debido a que esta técnica utiliza pequeños volúmenes de muestra, puede ser difícil obtener datos representativos que describan muestras heterogéneas como el esputo. Además, los ensayos de microrreología requieren microscopios de alta resolución, habilidades informáticas significativas y análisis que consumen mucho tiempo, y por lo tanto son poco adecuados para el uso generalizado en laboratorio o clínica.
Si bien la microrreología y la macrorreología no suelen ser comparables, se aplican limitaciones similares a los dispositivos establecidos desde hace mucho tiempo, como los reómetros a granel de placas cono/paralelas. La macrorreología se realiza utilizando instrumentos de precisión equipados con conos giratorios, placas, copas y / o rotores de varias dimensiones para medir torques y desplazamientos extremadamente pequeños hasta el sub nN. rangos m y sub Å. Para alcanzar una precisión tan alta, la mayoría de los reómetros comerciales requieren una conexión directa con un sistema de suministro y enfriamiento de aire comprimido en un entorno libre de aceite, polvo o ruido y con una temperatura ambiente y humedad controladas para evitar la formación de artefactos. Además, mientras que los reómetros a granel tradicionales pueden medir una amplia gama de materiales a través del ajuste de variables específicas, la calibración de estos instrumentos lleva un tiempo significativo y requiere una capacitación extensa.
Por el contrario, el reómetro de sobremesa Rheomuco fue diseñado específicamente para medir las propiedades viscoelásticas del moco y el esputo y requiere un solo paso de calibración para realizar mediciones viscoelásticas lineales y de punto de gel en cuestión de minutos. Este dispositivo de sobremesa utiliza un protocolo sencillo y estandarizado para producir mediciones viscoelásticas rápidas y precisas sin la necesidad de una amplia capacitación en calibración de instrumentos o análisis / cálculo de datos reológicos. El dispositivo funciona midiendo el par y el desplazamiento después de oscilaciones con desplazamiento angular controlado para producir una curva de barrido de deformación y establecer un régimen viscoelástico lineal o LVR (una región de respuesta viscoelástica uniforme a la deformación, indicada con una línea discontinua horizontal en la Figura 2A), antes de llegar al punto donde cede la muestra. En la mayoría de los casos, las muestras de esputo están dentro del LVR en el rango de cepa del 1% al 10%. Cuando no se detecta un LVR, comúnmente se hace referencia al valor de la cepa al 5% para informar sobre las características viscoelásticas de la muestra. La ausencia de un LVR detectado no invalida la medición, sino que refleja una muestra cuyas propiedades son distintas (más plásticas) de las de la mayoría de las muestras. La sensibilidad de este instrumento está optimizada para satisfacer las necesidades de fluidos viscosos y elásticos cercanos al moco, al tiempo que proporciona una alta tolerancia al ruido mecánico, lo que lo hace ideal para el estudio de fluidos biológicos en entornos clínicos; sin embargo, puede no ser adecuado para estudiar otros materiales viscoelásticos con módulos elásticos o viscosos extremadamente bajos (por ejemplo, saliva) o extremadamente altos (por ejemplo, alquitrán de hulla) como resultado de parámetros de software restringidos y la incapacidad de manipular variables como la forma de la placa, la superficie, la distancia y la frecuencia de rotación. Las mediciones reológicas dependientes de la concentración en PEO 8 MDa (Figura 1) permitieron estimar la sensibilidad (es decir, el límite inferior de detección) de este dispositivo, que está entre el 0,3% y el 0,4% de 8 MDa PEO o <0,05 Pa para G*. Sin embargo, no se pudo establecer un límite superior debido a la dificultad de solubilizar concentraciones de PEO superiores al 3%. Sin embargo, el dispositivo fue capaz de reportar G' y G" para 3% 8 MDa PEO, que es más viscoelástico que las muestras de moco SA (~5 veces mayor G' y 25 veces mayor G" en comparación con SA), lo que sugiere un rango dinámico relevante para las bioespecímenes de moco. Cabe señalar que para obtener mediciones precisas durante las oscilaciones, se debe colocar un volumen apropiado de la muestra en el centro de la placa sin la presencia de burbujas. Durante la carga de la muestra, el volumen insuficiente, las burbujas de aire y / o la colocación descentrada crearán un contacto inadecuado con las placas, lo que resultará en valores registrados más bajos. Por el contrario, el desbordamiento de la muestra creará una tensión de cizallamiento excesiva debido a la fuerza de arrastre adicional25.
Este estudio describe cómo procesar, almacenar y tratar muestras de moco espeso inmediatamente después de la recolección. Uno de los principales desafíos a los que se enfrentan los estudios de reología del esputo es la naturaleza heterogénea de estas muestras y el desarrollo de enfoques de medición estandarizados. El esputo es una sustancia expectorada a menudo contaminada con saliva que contiene bacterias y enzimas digestivas que pueden alterar rápidamente la red de mucina y afectar la viscoelasticidad del moco. Por lo tanto, es fundamental eliminar la saliva de las muestras de esputo inmediatamente después de la recolección y / o antes de la homogeneización. Por naturaleza, el moco es pegajoso y difícil de manejar, pero el uso de pipetas de desplazamiento positivo facilita la homogeneización sin comprometer la red de mucina, permite una preparación precisa de la alícuota y simplifica la carga de la muestra. Dependiendo del experimento, la homogeneización de la muestra puede no ser necesaria, pero puede minimizar la variabilidad entre réplicas. Si bien se recomienda procesar el esputo inmediatamente después de la recolección, el moco de las vías respiratorias mantiene propiedades biofísicas únicas después de la congelación y la descongelación. Sin embargo, la congelación y la descongelación pueden afectar la reología general de una muestra. Por lo tanto, solo las muestras que se han sometido a ciclos similares de congelación / descongelación deben compararse entre sí. Al probar los efectos de los agentes mucoactivos, la homogeneización inicial de la muestra es importante para optimizar la difusión de compuestos. La administración de medicamentos a los pulmones a través de la inhalación limita los volúmenes que acceden al objetivo (es decir, el tapón de moco), pero el latido constante de los cilios combinado con el transporte mucociliar genera cierta mezcla del fármaco y el objetivo. Para simular el tratamiento in vivo, se pueden aplicar pequeños volúmenes de un agente farmacológico directamente a las muestras y mezclarlos gradualmente mediante agitación regular durante todo el tiempo de incubación. Sin embargo, se pueden investigar otros métodos de tratamiento (por ejemplo, nebulización del fármaco en la muestra en una placa de Petri). La agitación suave durante la incubación asegurará la penetración progresiva del fármaco sin comprometer la red de mucina debido a una interrupción mecánica (por ejemplo, vórtice o sonicación). Actualmente, el TCEP no se utiliza en entornos clínicos, pero otros reactivos mucoactivos, como NAC, rhDNasa, P-2119, ARINA-1 y PAAG se están investigando para una amplia gama de afecciones mucoobstructivas 21,26,27,28. Para la validación del concepto, se demostró que este protocolo se puede utilizar para detectar cambios significativos en el moco asmático en respuesta al tratamiento con TCEP. Se produjo un moco más fluido mediante el tratamiento con un agente reductor, que es evidente a partir de los marcadores viscoelásticos lineales y de punto de gel más bajos, lo que sugiere una mejora en la capacidad de aclaramiento. Aunque la rhDNasa produjo enormes beneficios clínicos en la FQ, no se usa típicamente para otras enfermedades mucoobstructivas, probablemente debido a concentraciones crónicamente más bajas de ADN extracelular. Sin embargo, durante una infección viral y bacteriana aguda, una fuerte respuesta inflamatoria puede causar temporalmente una alta concentración de ADN extracelular y reducir el aclaramiento de las vías respiratorias. Por lo tanto, las pruebas rápidas ex vivo de la eficacia de la rhDNasa caso por caso podrían proporcionar orientación para el tratamiento de la neumonía inducida por virus y bacterias. Esto podría ser especialmente valioso en medio de la pandemia de COVID-19, que es causada por el virus respiratorio, SARS-CoV-2.
En resumen, el dispositivo descrito proporciona medidas reológicas factibles, rápidas y precisas. Estas características proporcionan el potencial para investigar y monitorear el estado de las enfermedades de las vías respiratorias, así como para probar los efectos de los nuevos compuestos mucoactivos. La rapidez y simplicidad de las mediciones permiten realizar ensayos sin incurrir en complicaciones relacionadas con la congelación y / o los efectos temporales del almacenamiento o transporte prolongado, al tiempo que hacen que estos ensayos sean factibles en una amplia variedad de entornos. En última instancia, este enfoque podría explorarse para la selección de terapias personalizadas de un panel de opciones, lo que permite la adaptación en tiempo real del tratamiento del paciente.
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Disclosures
Ninguno
Acknowledgments
Este documento está respaldado por subvenciones de Vertex Pharmaceuticals (Premio Ehre RIA) y Research EHRE20XX0 apoyado por CFF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capillary Pistons Tips | Gilson | CP1000 | |
| Discovery Hybrid Rheometer-3 | TA Instruments | DHR-3 Bulk Rheometer manufactured by TA Instruments in New Castle, DE: Used to preform rheological tests. |
|
| Graphing Software | GraphPad Prism | GraphPad Software (San Diego, CA) used for data analysis | |
| Microcentrifuge Tube | Costar | 3621 | |
| Peltier plate | TA Instruments | Temperature control system manufactured by TA Instruments in New Castle, DE |
|
| Polyethylene oxide | Sigma | 372838 | 8 MDa polymer used as mucus simulant |
| Positive Displacement Pipette | Gilson | M1000 | Pipette used for handling viscous solutions |
| Rheomuco | Rheonova | Benchtop Rheometer manufactured by Rheonova in France: Used to preform rheological tests. | |
| Rough Lower Geometries | Rheonova | D-1811-007 | 25mm Diameter |
| Rough Upper Geometries | Rheonova | U-1811-007 | 25mm Diameter |
| Smooth Upper Parallel Plate | TA Instruments | 20mm Diameter | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine | Sigma | 646547-10X1ML | TCEP: Potent reducing agent. |
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