Summary
Nylige fremskridt inden for humane inducerede pluripotente stamcelledifferentieringsprotokoller giver mulighed for trinvis afledning af organspecifikke celletyper. Her giver vi detaljerede trin til vedligeholdelse og udvidelse af iPSC-afledte luftvejsbasalceller og deres differentiering til et mucociliært epitel i luft-væske-grænsefladekulturer.
Abstract
Sygdomme i de ledende luftveje såsom astma, cystisk fibrose (CF), primær ciliær dyskinesi (PCD) og virale luftvejsinfektioner er hovedårsager til sygelighed og dødelighed over hele verden. In vitro-platforme , der bruger humane bronchiale epitelceller (HBEC'er), har været medvirkende til vores forståelse af luftvejsepitelet i sundhed og sygdom. Adgang til HBEC'er fra personer med sjældne genetiske sygdomme eller sjældne mutationer er en flaskehals i lungeforskningen.
Inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) genereres let ved at "omprogrammere" somatiske celler og bevarer den enkelte donors unikke genetiske baggrund. Nylige fremskridt giver mulighed for rettet differentiering af iPSC'er til lungeepitelprogenitorceller, alveolære type 2-celler samt cellerne i det ledende luftvejsepitel via basalceller, de vigtigste luftvejsstamceller.
Her skitserer vi en protokol til vedligeholdelse og udvidelse af iPSC-afledte luftvejsbasalceller (herefter iBC'er) samt deres trilineagedifferentiering i luft-væske-grænseflade (ALI) kulturer. iBC'er opretholdes og udvides som epitelkugler suspenderet i dråber af ekstracellulær matrix dyrket i et primært basalcellemedium suppleret med hæmmere af TGF-ß- og BMP-signalveje. iBC'er inden for disse epitelsfærer udtrykker vigtige basale markører TP63 og NGFR, kan renses ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS), og når de er belagt på porøse membraner under standard ALI-kulturbetingelser, differentieres til et funktionelt luftvejsepitelatel. ALI-kulturer afledt af raske donorer består af basale, sekretoriske og multicilierede celler og demonstrerer epitelbarriereintegritet, bevægelige cilier og slimsekretion. Kulturer afledt af individer med CF eller PCD rekapitulerer den dysfunktionelle CFTR-medierede chloridtransport eller immotile cilia, de respektive sygdomsfremkaldende epiteldefekter.
Her præsenterer vi en protokol til generering af humane celler, der kan anvendes til modellering og forståelse af luftvejssygdomme.
Introduction
Kroniske lungesygdomme tegner sig for en stor byrde af sygelighed og dødelighed på verdensplan1. Tilstande, der påvirker de ledende luftveje, såsom astma, cystisk fibrose (CF), primær ciliær dyskinesi (PCD) og virusinfektioner repræsenterer både almindelige og sjældnere sygdomme, erhvervet og genetisk, der bidrager til denne verdensomspændende byrde. De ledende luftvejes vigtigste funktioner er at: 1) fungere som en kanal for den laminære luftstrøm og 2) give mucociliær clearance af patogener og snavs. Sekretoriske, multicilierede og basale celler repræsenterer de vigtigste epitelcelletyper i den ledende luftvej. Sjældnere epitelcelletyper omfatter ionocytter, tuftceller og neuroendokrine celler og er blevet gennemgået andetsteds2.
Generelt har en stor barriere for at forstå sygdomsmekanismer og fremme terapeutiske tilgange været en konsekvent mangel på humant primært væv til brug i prækliniske modeller. HBEC'er betragtes generelt som guldstandard in vitro-modellen for human luftvejsepitelbiologi og har spillet nøgleroller i CF-forskning, især3. Imidlertid isoleres de typisk enten fra bronkoskopiske biopsier, fra lungevæv efter operationen eller fra lunger, der afvises til transplantationsformål. Adgang til HCFC'er fra personer med genetiske sygdomme, herunder forskningsprioriteterne for CF og PCD, er sjælden og uforudsigelig. Overvinde denne flaskehals for patientafledte luftvejsepitelceller er nødvendig. iPSC'er genereres let fra ethvert individ, de bevarer donorens unikke genetiske baggrund og har en bemærkelsesværdig evne til at sprede sig og overleve på lang sigt under cellekulturforhold 4,5,6. Ved at rekapitulere vigtige embryologiske trin gennemgår iPSC'er "rettet differentiering" i organspecifikke celletyper. Vi og andre har udviklet protokoller til at generere iPSC-afledte lungeforfædre, alveolære type 2-celler 7,8 og cellerne i den ledende luftvej inklusive luftvejsbasalceller 9,10,11,12.
Luftvejsbasalcellen er stamcellen i den ledende luftvej13. I tidligere offentliggjort arbejde har vores gruppe genereret iPSC-afledte luftvejsepitelceller, herunder en delmængde (iBC'er), der udtrykker kanoniske basalcellemarkører, herunder TP63, KRT5 og NGFR. Efter signaler fra voksen basalcellebiologi fører hæmning af dobbelte SMAD-veje (TGF-β og BMP) til opregulering af NGFR + iBC'er11,14. NGFR + iBC'er resuspenderes som enkeltceller i dråber af ekstracellulær matrix og dyrkes i et basalcellemedium. De fornyer sig selv for at opretholde en iBC-population og danner epitel-sfæroider; imidlertid differentierer en andel sig også i sekretoriske celler i dette format (kaldet 3D-kultur). I den følgende protokol beskriver vi trinene til at opretholde og udvide disse iBC'er i 3D-kultur samt de trin, der kræves for at generere en funktionel 2-D mucociliær ALI-kultur.
De indledende trin i denne differentieringsprotokol er tidligere blevet offentliggjort og vil ikke blive gennemgået her11,12. Dette manuskript vil centrere sig om udvidelse og rensning af iBC'er og deres efterfølgende differentiering i funktionelle sekretoriske og multicilierede celler i ALI-kultur.
Protocol
Hvert af følgende trin skal udføres ved hjælp af steril teknik i en biosikkerhedsniveau 2 laminær flowhætte. Alle medier skal opvarmes til stuetemperatur (22 °C), inden de tilsættes celler, medmindre andet specifikt er nævnt. Hvert centrifugeringstrin skal udføres ved stuetemperatur (ca. 22 °C). Figur 1 skitserer protokollens skemaer.
1. Forberedelse af nødvendige medier
BEMÆRK: Se supplerende fil 1 for yderligere oplysninger.
- Basalcelle medium
- Forbered basismediet i henhold til producentens anvisninger.
- Til hver 50 ml af basismediet tilsættes 5 μL A83-01 (10 ml), 5 μL DMH1 (10 mM), 50 μL Y-27632 (10 mlM) og 100 μL Primocin (50 mg / ml). Herefter kaldes dette medie basalcellemedium.
- Opbevares ved 4 °C i op til 1 måned.
- ALI differentiering Medium
- Forbered mediet i henhold til producentens anvisninger.
- Til hver 50 ml ALI-differentieringsmedium tilsættes 100 μL Primocin (50 mg / ml).
- Opbevares beskyttet mod lys ved 4 °C i op til 1 måned.
- Buffer til sortering
- For hver 50 ml sorteringsbuffer kombineres 47,5 ml Hanks 'afbalancerede saltopløsning, 1 ml FBS, 200 μL EDTA (500 mM), 1,25 ml HEPES-buffer (1 M), 50 μL Y-27632 (10 mM) og 100 μL Primocin (50 mg / ml).
- Filtreriliseres ved hjælp af en porestørrelse på 0,4 μm.
- Opbevares ved 4 °C i op til 1 måned.
- Kryopræservering medium
- For hver 50 ml kryopræserveringsmedium kombineres 45 ml basalcellemedium og 5 ml dimethylsulfoxid (DMSO).
- Filtreriliseres ved hjælp af en porestørrelse på 0,4 μm.
- Opbevares ved 4 °C i op til 1 måned.
2. Optøning af kryopreserverede iBC'er
- Optø (på is) et tilstrækkeligt volumen af 3-D vækstfaktor reduceret ekstracellulær matrix (herefter 3-D matrix). Opbevares på is, indtil den er klar til brug.
BEMÆRK: Ved optøning af et hætteglas (indeholdende 250.000 celler) optøes 100-200 μL 3-D matrix. - Optø et hætteglas med tidligere kryopreserverede enkeltcellesuspensioner af iBC'er ved at inkubere i et 37 °C vand- eller perlebad, lige indtil der ikke er synlige frosne medier (1-2 min).
- Ved hjælp af en 5 ml serologisk pipette tilsættes cellesuspension til et 15 ml konisk rør.
- Tilsæt 6-10 ml DMEM / F12 dråbevis til cellesuspensionen, bland forsigtigt og centrifuger ved 300 x g i 5 minutter for at pelletere cellerne.
- Aspirer supernatanten og resuspend cellepillen i 1 ml basalcellemedium med en P1000 mikropipette. Fjern en 10 μL aliquot og udfør et celletal.
- Cellerne centrifugeres ved 300 x g i 5 min. Aspirere supernatanten og resuspender cellerne med en densitet på 4.000 celler / μL i tidligere optøet 3-D matrix med en P1000 mikropipette.
BEMÆRK: Det er vigtigt at undgå at tilføje bobler til 3D-matrix. Pipetter matrixen langsomt og omhyggeligt. - Med en P200 mikropipette tilsættes en dråbe (25 eller 50 μL) til bunden af hver brønd i en 12-brønd vævskulturbehandlet plade. Hvis man starter med 250.000 frosne celler, er det forventede antal dråber på dette trin mellem 3-4 (25 μL dråber), afhængigt af cellens levedygtighed.
- Pladen inkuberes ved 37 °C i ca. 15 min., og der tilsættes derefter nok basalcellemedium til hver brønd til at nedsænke dråben helt (1,5 ml for 50 μL; 1 ml for 25 μL) ved hjælp af en 5 ml serologisk pipette. Sæt pladen tilbage til en befugtet inkubator.
- Foder celler hver 2. dag ved hjælp af frisk basalcellemedium. Tilsæt frisk medium til siden af brønden med 5 ml serologisk pipette, og pas på ikke at forstyrre celledråben.
BEMÆRK: Tætheden af celler, der er belagt i dette trin, er 10 gange højere end rutinemæssig passaging af iBC'er i afsnit 3.
3. Dissociation af sfæroider og udvidelse af iBC'er i 3D-kultur
- Optø (på is) et tilstrækkeligt volumen 3D-matrix. Opbevares på is, indtil den er klar til brug.
BEMÆRK: Mængden af 3D-matrix, der kræves, varierer afhængigt af, hvor mange celler brugeren har brug for. - Ca. 5-7 dage senere aspireres mediet fra hver brønd og med en P1000 mikropipette tilsættes 1 ml Dispase II (1 U / ml) direkte på sfæroiderne for at adskille sig fra matrixens dråbe.
- Anbring pladen i 37 °C inkubator i 10-15 min.
- Brug en P1000 mikropipette til at pipettere Dispase op og ned 1-2 gange og bryde store klumper af 3D-matrix op. Pladen returneres til 37 °C i yderligere 30-40 minutter, så matrixen kan opløses fuldstændigt.
- Når dråben af 3D-matrix ikke længere er synlig under lysmikroskopet, tilsættes de frit flydende sfæroider til en 15 ml konisk ved hjælp af en 5 ml serologisk pipettespids. Der tilsættes DMEM/F12 for et slutvolumen på 10 ml pr. konisk og centrifugeres ved 200 x g i 3 min. for at pelletere sfæroiderne.
- Opsuge supernatanten og tilsæt 1 ml 0,05% trypsin (37 °C) for hver indledende dråbe, der dissocieres (f.eks. hvis du starter med fire dråber, tilsættes 4 ml trypsin til den koniske kolbe).
- Inkuberes ved 37 °C og tritureres ofte (hvert 2.-3. minut).
- Evaluer med lysmikroskopet hvert par minutter. Når størstedelen (>90%) af sfæroider er blevet dissocieret til enkeltceller, tilsættes 10% føtalt bovint serum (i DMEM / F12) i et volumenforhold på 1: 1 til trypsin.
- Cellerne filtreres gennem en 40 μm cellestam og centrifugeres ved 300 x g i 5 min.
- Udfør et celletal og resuspend cellerne jævnt ved en tæthed på 400 celler / μL optøet 3-D matrix. Undgå at indføre luftbobler. Resuspend så mange dråber som nødvendigt til downstream-applikation. Gentag trin 2.6-2.9 for hver brønd.
4. Evaluering og rensning af NGFR+ iBC'er
- Efter 10-14 dage efter den seneste passage dissocieres sfæroiderne til en enkeltcellesuspension som i trin 3.2-3.5 og udføres et celletal.
BEMÆRK: Forskellige iPSC-linjer opfører sig forskelligt; derfor kan intervallet på 10-14 dage variere for forskellige iBC'er. Se figur 2 for typiske forekomster af 3-D iBC'er efter 1, 4, 8 og 14 dage, når de er tilstrækkelige til NGFR+ cellesortering. Sortering tidligere end anbefalet (f.eks. dag 8 som i figur 2C) resulterer i et samlet lavere celletal med mindre hyppig NGFR-ekspression. Sortering senere end anbefalet (f.eks. mere end 14 dage efter den seneste passage) fører til dårlig celleoverlevelse efter sortering. - Resuspend cellerne med en tæthed på 1 x 106 celler / 100 μL i Sorteringsbuffer (hovedpopulation). Overfør en lille aliquot (25-50 μL) til et separat rør (mindre population).
- Der tilsættes konjugeret anti-NGFR-antistof (1:100 fortynding) til hovedcellepopulationen.
- Der tilsættes isotypekontrolantistof (1:200 fortynding) til den mindre cellepopulation.
- Beskyt cellerne mod lys og hold dem på is i 30 minutter, intermitterende (hvert 5-10 min)triturerer cellerne for at forhindre pelletering.
- Efter 30 minutter skal du tilføje sorteringsbufferen i forholdet 1:1 til hvert cellerør. Centrifuge celler ved 300 x g i 5 min.
- Aspirer supernatanten, resuspender de pelleterede celler i sorteringsbufferen med en densitet på 10 x 106 celler / ml, og tilsæt levende eller død celleplet.
- Ved hjælp af passende NGFR+ gating-strategi (baseret på isotypekontrol, se figur 3) sorteres nok levende NGFR+-celler til nødvendige downstream-applikationer.
BEMÆRK: Hvis du bruger iBC'er med fluorescerende reportere (dvs. NKX2-1GFP TP63tdTomato), anbefales det at sortere efter "tredobbelt positive" celler (dvs. NKX2-1GFP +, TP63tdTomato +, NGFR +) med passende portvalg og kompensation (figur 3). Under denne udvidelse af iBC'er differentieres en del celler til sekretoriske celler, og meget lille andel af multicilierede celler kan også detekteres. Begge disse populationer er NGFR-.
5. Generering af mucociliære ALI-kulturer
- 6,5 mm porøse membranindsatser fremstilles ved at tilsætte en 200 μL matrix til det apikale kammer (human embryonal stamcellekvalificeret matrix eller rekombinant human laminin-521) i henhold til fabrikantens anvisninger.
- Anbring ved 37 °C i mindst 2 timer, før det er nødvendigt.
- Opsuge belægningsmatrixen fra insertets apikale kammer. Der tilsættes 500 μL basalcellemedium til det basolaterale kammer.
- Resuspend mindst 30.000 sorterede NGFR + celler (fra trin 4.5) i 100-200 μL basalcellemedium og overfør til det apikale kammer ved hjælp af en P200 mikropipette. Gentag for så mange brønde som ønsket (og tilgængelige celler). Pladen anbringes i en befugtet 37 °C kuvøse.
- Om 2-3 dage aspireres apikale og basolaterale kamre og fodres med frisk basalcellemedium (500 μL til apikal, 100 μL til basolateral).
- Overvåg det apikale kammer dagligt med lysmikroskopi. Når celler er >80% sammenflydende (typisk 3-7 dage), skal du erstatte basalcellemedium med ALI-differentieringsmedium (ikke forvarmet) i både apikale og basolaterale kamre. Når du arbejder med ALI Differentiation Medium, skal du beskytte mod lys ved at holde mediebeholdere pakket ind i folie og ved at slukke for loftslys, når det er muligt.
- Den næste dag aspireres mediet fra det apikale kammer og udsætter således den apikale overflade for luft.
- Udskift ALI-differentieringsmediet i det basolaterale kammer hver 2-3 dag.
- Overvåg kulturens udseende hver 1-2 dag. Opsuge forsigtigt enhver akkumuleret væske fra det apikale kammer uden at forstyrre cellelaget.
- Vurder den transepiteliske elektriske modstand (TEER) for epitelintegritet.
BEMÆRK: TEER kan vurderes i dagene efter lufteksponering for at give en aflæsning af epitellagets integritet. Det ideelle tidspunkt at måle TEER er ikke fastlagt, selvom værdier, der er i overensstemmelse med mucociliær differentiering af høj kvalitet, typisk er >500 x cm2. - Hvis det er nødvendigt at fjerne snavs eller slim, tilsættes forsigtigt 100 μL PBS (uden Ca2+ eller Mg2+) til det apikale kammer. Inkuberes ved 37 °C i 10 minutter, og opsuges derefter PBS forsigtigt.
- Efter 7-10 dages lufteksponering vises bevægelige cilier typisk og kan ses ved hjælp af lysmikroskopi. Afhængigt af det planlagte eksperiment og udlæsning kan celler analyseres efter 14-28 dages lufteksponering.
BEMÆRK: Hvis fluorescerende reporterceller er blevet brugt, og hvis et levende celle fluorescerende mikroskop er tilgængeligt, kan celler spores med lysmikroskopi samt reporterfluorescens.
6. Valgfri (men anbefalet) kryopræservering af iBC'er
- Efter 10-14 dage med den seneste 3D-kulturpassage dissocieres sfæroiderne til enkeltcellesuspension som i trin 3.2-3.5. Udfør et celleantal.
- Resuspend i Cryopreservation Medium ved en tæthed på 250.000 celler / 500 μL i en kryofil.
- Kryovirale produkter anbringes i en beholder for at sikre et konstant temperaturfald (1 °C/min.), og der overføres til -80 °C i 24-48 timer, efterfulgt af overførsel til -150 °C ved langtidsopbevaring.
BEMÆRK: Gentagen kryopræservering samt kryopræservering af tidligere NGFR+ sorterede celler er blevet udført, men disse er ikke blevet tilstrækkeligt vurderet for cellelevedygtighed og evnen til at danne funktionelle ALI-kulturer. Især ved udvidet cellepasning anbefales det at vurdere for karyotypen, da dette er blevet bemærket at variere i iPSC'er og iPSC-afledte celler.
Representative Results
Efter denne protokol blev 200.000 kryoforbeholdne iBC'er (tidligere bekræftet at have en normal 46XY karyotype)11 optøet og udvidet i 3D-kultur. Fem dage senere blev de resulterende sfæroider dissocieret, talt og passeret igen for yderligere ekspansion. Ca. 480.000 celler blev opnået og re-suspenderet i 3-D matrix (12 x 50 μL dråber, densitet 400 celler / μL). Frisk basalcellemedium blev påført hver 2-3 dage. Ti dage senere blev cellerne igen dissocieret og talt. I alt 19,7 x 106 celler blev høstet og forberedt til FACS. 106 celler blev farvet med den APC-konjugerede IgG1κ isotypekontrol, og de resterende 18,7 x 106 celler blev farvet med det APC-konjugerede anti-NGFR-antistof i 30 minutter beskyttet mod lys (figur 3).
NGFR+ gating blev udført efter sammenligning med isotypekontrolcellerne og blev indstillet med vilje til at indsamle de højest udtrykkende NGFR+ celler (figur 3). Med denne gating-teknik var 28% af levende, enkeltceller NGFR +. Mens flere celler var tilgængelige, blev 750.000 celler indsamlet til nedstrøms kultur. Sorterede celler blev resuspenderet i basalcellemedium i en koncentration på 50.000 celler / 100 μL. 50.000 celler blev derefter podet på hver 6,5 mm porøs membranindsats, som var blevet belagt med human rekombinant laminin-521 (2 μg / 200 μL) i henhold til producentens retningslinjer. 500 μL basalcellemedium blev tilsat til basolateralkammeret for hver indsats, og pladen blev anbragt i en 37 ° C befugtet inkubator. Tre dage senere blev medierne i det apikale kammer opsuget, og cellerne var ~ 90% sammenflydende ved lysmikroskopi (figur 4B). Medierne fra det basolaterale kammer blev aspireret; ALI Differentiering Medium blev tilsat til de apikale (100 μL) og basolaterale (500 μL) kamre. Den næste dag blev medierne fra det apikale kammer aspireret.
I løbet af de følgende 21 dage blev cellerne evalueret ved lysmikroskopi med jævne mellemrum og fodret med frisk ALI-differentieringsmedium (kun basolateralt kammer) hver 2-3 dag. Individuelle celler var oprindeligt let identificerbare (figur 4A), havde et langstrakt og spindelformet udseende og dannede et løst pakket monolag (figur 4B). I løbet af de efterfølgende dage til uger dannede cellerne et tæt pakket, stærkt cellulært epitellag, og efter 7-10 dage var der den klare fremkomst af slående cilier og slimproduktion. TEER af prøverne blev beregnet og ligner primære cellekontroller (fra 700-1600 Ω x cm2)11. Efterfølgende fiksering (dag 21-28) med paraformaldehyd og immunomærkning for kanoniske luftvejsepitelcellemarkører blev udført for blandt andet MUC5AC og acetyleret α-tubulin (figur 4C). Samlet set konkluderede vi med vores observation af bevægelige cilier, slimproduktion samt bekræftende immunstaining af multicilierede og sekretoriske celler, der ligner primære HBEC'er, at vi med succes genererede luftvejsepitelceller fra inducerede pluripotente stamceller.
Figur 1: Samlet skema over protokol. Kryopreserverede iBC'er optøes, udvides og FACS renses inden plettering på porøse membranindsatser, hvor de differentieres til et funktionelt mucociliært epitel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative fasekontrastbilleder. Repræsentative fasekontrastbilleder, der viser sædvanligt udseende af iBC'er i 3D-kultur efter (A) 1 dag, (B) 4 dage, (C) 8 dage og (D) 14 dage (kun præ-NGFR-sortering). Skalabjælker repræsenterer 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative FACS-plots. Repræsentative FACS-plots for ikke-reporter og fluorescerende reporter iBC'er. Eksempler på isotypekontroller vises og blev brugt til at vælge for de højeste udtrykkende NGFR+-celler. Fluorescerende reporterholdige iPSC-linjer er "tredobbelt sorteret" for NKX2-1GFP+ TP63tdTomato+ NGFR+ celler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative billeder af iBC-kulturer på porøse membraner. Fasekontrastbilleder vises (A) 1 dag og (B) 3 dage efter plettering. Repræsentativ immunmærkning af mucociliære kulturer vist i (C); acetyleret alfa tubulin (grøn) og MUC5AC (rød). Skalabjælker repræsenterer 25 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Tabel over mediekomponenter. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
HBEC'er er guldstandardcelletypen til undersøgelse af sygdomme i luftvejsepitelet. På grund af deres begrænsninger (herunder tilgængelighed og vanskeligheder med at genmanipulere) har vi genereret en protokol til afledning af iBC'er og ALI-kulturer. Disse celler kan stamme fra enhver donor og bevare deres unikke genetiske baggrund, hvilket giver mulighed for grundlæggende udviklingsundersøgelser, sygdomsmodellering og ny terapeutisk udvikling.
Mens hvert enkelt trin i den beskrevne protokol er nødvendigt, er der flere, der fortjener ekstra omtale. For det første er det ved hvert trin, der kræver dissociation af sfæroider i enkeltceller, afgørende at undgå overdreven pipettering; enzymatisk fordøjelse (med dispase eller trypsin) fremmer bedre celleoverlevelse, mens overdreven pipettering fører til betydelig celledød. For det andet er det afgørende at udnytte isotypekontrollen ved rensning af NGFR+ iBC'er, og vi anbefaler at vælge de højest udtrykkende NGFR+-celler med FACS (figur 3). Denne tilgang resulterer i optimale ALI-kulturer med passende mucociliær differentiering. Endelig er fremstilling og såning af porøse membraner nøjagtigt som dokumenteret i protokollen grundlæggende for ALI-kulturens overlevelse. Mens vi typisk såer 30.000-60.000 celler pr. indsats, har vi haft succes med så få som 20.000 celler. Mens vellykkede kulturer kan genereres ved hjælp af den humane embryonale stamcellekvalificerede matrixbelægning, har vi for nylig brugt human rekombinant laminin-521 med en signifikant højere holdbarhed af ALI-kulturerne.
Meget sjældent kan iPSC-differentieringer undlade at regulere en passende procentdel af NGFR+ iBC'er. I dette tilfælde kan seriel passaging af iBC'er (i 3D-kultur) resultere i en øget NGFR-frekvens over tid. Begrænsninger i denne protokol inkluderer den tid, omkostninger og ekspertise, der er nødvendig for at generere disse celler. Derudover anerkender vi, at mange forskere er interesserede i de mindre almindelige celletyper af luftvejsepitelet (fx ionocytter, neuroendokrine celler). Mens vi har opdaget nogle af disse sjældnere celletyper, som i primære HBEC-kulturer, identificeres de ikke reproducerbart, sandsynligvis på grund af ufuldstændig viden om de udviklingssignaler, der kræves for at generere disse celler.
Som det er skrevet, begynder ovenstående protokol med optøning af allerede kryopreserverede iBC'er. Detaljerne forud for denne kryopræservering er tidligere beskrevet og uden for dette manuskripts anvendelsesområde11,12.
Vores luftvejsepitel ALI-dyrkningsmetode giver mulighed for generering af funktionelle luftvejsepitelceller fra næsten enhver donor. Dette øger i høj grad tilgængeligheden til dyrebare genetisk kontrollerede luftvejsepitelceller, der kan bruges til sygdomsmodellering, lægemiddelscreening, fremtidige cellebaserede terapier samt for at forbedre forståelsen af udviklingsmønstret i luftvejsepitelet.
Disclosures
Forfatterne har ingen afsløringer.
Acknowledgments
Vi takker medlemmerne af laboratorierne Hawkins, Kotton og Davis for deres nyttige input gennem årene vedrørende dette og andre projekter. Vi står også i gæld til Brian Tilton (BU Cell Sorting Director) for hans dedikation og tekniske ekspertise, og vi er taknemmelige for Greg Miller og Marianne James fra Boston University Center for Regenerative Medicine (CReM) for deres support og tekniske ekspertise inden for vedligeholdelse og karakterisering af patientspecifikke iPSC'er, understøttet af NIH-tilskud NO1 75N92020C00005 og U01TR001810. Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud U01HL148692, U01HL134745, U01HL134766 og R01HL095993 til D.N.K, R01HL139876 til B.R.D, R01 HL139799 til F.H., og Cystisk Fibrose Foundation (CFF) tilskud CFF 00987G220 og CFF WANG20GO til D.N.K, CFF DAVIS15XX1, DAVIS17XX0, DAVIS19XX0 til B.R.D, CFF SUZUKI19XX0 til S.S. og CFF HAWKIN20XX2 til F.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well tissue culture treated plate | Corning | 3515 | flat bottom |
| 3-D growth factor reduced Matrigel | Corning | 356230 | |
| A83-01 | ThermoFisher Scientific | 293910 | |
| Cell culture inserts (Transwell) | Corning | 3470 | 6.5mm diameter; 0.4μm pore size |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Dispase II, Powder | ThermoFisher Scientific | 17105-041 | |
| DMH1 | ThermoFisher Scientific | 412610 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture (DMEM):F-12 | ThermoFisher Scientific | 11330-032 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 14190-144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt solution (EDTA) | Sigma | E7889 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher | SH3007003E | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175-079 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| hESC-qualified Matrigel | Corning | 354277 | |
| Mouse IgG1kappa isotype control, APC-conjugated | Biolegend | 400122 | |
| Mouse monoclonal anti-human CD271/NGFR, APC-conjugated | Biolegend | 345108 | |
| PneumaCult-ALI Medium (ALI Differentiation Medium) | StemCell Technologies | 05001 | |
| PneumaCult-Ex Plus Medium (Basal Cell Base Medium) | StemCell Technologies | 05040 | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| rhLaminin-521 | ThermoFisher Scientific | A29248 | Final Concentration: 10ug/mL |
| Trypsin-EDTA Solution, 0.05% | Invitrogen | T3924 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
References
- GBD Chronic Respiratory Disease Collaborators. Prevalence and attributable health burden of chronic respiratory diseases, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet. Respiratory Medicine. 8 (6), 585-596 (2020).
- Alysandratos, K. -D., Herriges, M. J., Kotton, D. N. Epithelial stem and progenitor cells in lung repair and regeneration. Annual Review of Physiology. 83, 529-550 (2021).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).
- Jacob, A., et al. Derivation of self-renewing lung alveolar epithelial type II cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 14 (12), 3303-3332 (2019).
- Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).
- Huang, S. X. L., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2013).
- Mou, H., et al. Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell Stem Cell. 10 (4), 385-397 (2012).
- Hawkins, F. J., et al. Derivation of airway basal stem cells from human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 28 (1), 79-95 (2021).
- Suzuki, S., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional airway basal stem cells. STAR Protocols. 2 (3), 100683 (2021).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
