Summary
Nylige fremskritt i menneskeskapte pluripotente stamcelledifferensieringsprotokoller tillater trinnvis avledning av organspesifikke celletyper. Her gir vi detaljerte trinn for vedlikehold og utvidelse av iPSC-avledede luftveisbasalceller og deres differensiering i et mucociliary epitel i luft-væske grensesnittkulturer.
Abstract
Sykdommer i den ledende luftveiene som astma, cystisk fibrose (CF), primær ciliary dyskinesi (PCD) og virale luftveisinfeksjoner er viktige årsaker til sykelighet og dødelighet over hele verden. In vitro-plattformer som bruker humane bronkiale epitelceller (HBECs) har vært medvirkende til vår forståelse av luftveisepitelet i helse og sykdom. Tilgang til HBECer fra personer med sjeldne genetiske sykdommer eller sjeldne mutasjoner er en flaskehals i lungeforskning.
Induserte pluripotente stamceller (iPSCer) genereres lett av "omprogrammering" somatiske celler og beholder den unike genetiske bakgrunnen til den enkelte donor. Nylige fremskritt tillater rettet differensiering av iPSC til lunge epiteliale stamceller, alveolar type 2 celler, samt cellene i ledende luftveis epitel via basale celler, de store luftveis stamcellene.
Her skisserer vi en protokoll for vedlikehold og utvidelse av iPSC-avledede luftveisbasalceller (heretter iBO-er) samt deres trilineage differensiering i luft-væske grensesnitt (ALI) kulturer. iBO-er vedlikeholdes og utvides etter hvert som epitelsfærer suspenderes i dråper med ekstracellulær matrise dyrket i et primært basalcellemedium supplert med hemmere av TGF-ß- og BMP-signalveier. iBO-er innenfor disse epiteliale sfærene uttrykker viktige basale markører TP63 og NGFR, kan renses ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS), og når de er belagt på porøse membraner under standard ALI-kulturforhold, skille seg ut i et funksjonelt luftveisepitel. ALI-kulturer avledet fra friske givere består av basale, sekretoriske og multicilierte celler og demonstrerer epitelial barriereintegritet, motil cilia og slimsekresjon. Kulturer avledet fra personer med CF eller PCD rekapitulerer den dysfunksjonelle CFTR-medierte kloridtransporten eller immotile cilia, de respektive sykdomsfremkallende epitelfeilene.
Her presenterer vi en protokoll for generering av menneskelige celler som kan brukes til modellering og forståelse av luftveissykdommer.
Introduction
Kroniske lungesykdommer står for en stor byrde av sykelighet og dødelighet over hele verden1. Forhold som påvirker de ledende luftveiene, som astma, cystisk fibrose (CF), primær ciliary dyskinesi (PCD) og virusinfeksjoner representerer både vanlige og sjeldnere sykdommer, ervervet og genetisk, som bidrar til denne verdensomspennende byrden. De viktigste funksjonene i de ledende luftveiene er å: 1) fungere som en kanal for laminær luftstrøm, og 2) gi mucociliary clearance av patogener og rusk. Sekretoriske, multicilierte og basale celler representerer de viktigste epitelcelletypene i den ledende luftveien. Sjeldnere epitelceller inkluderer ionocytter, tuftceller og nevroendokrine celler, og har blitt gjennomgått andre steder2.
Generelt har en stor barriere for å forstå sykdomsmekanismer og fremme terapeutiske tilnærminger vært en konsekvent mangel på humant primærvev for bruk i prekliniske modeller. HBECer regnes generelt som den gullstandardiserte in vitro-modellen for human luftveis epitelbiologi og har spilt nøkkelroller i CF-forskning spesielt3. Imidlertid er de vanligvis isolert enten fra bronkoskopiske biopsier, fra lungevev etter operasjonen, eller fra lunger avvist for transplantasjonsformål. Tilgang til HBECer fra personer med genetiske sykdommer, inkludert forskningsprioritetene til CF og PCD, er sjeldne og uforutsigbare. Det er nødvendig å overvinne denne flaskehalsen til pasientavledede epitelceller i luftveiene. iPSCer genereres lett fra ethvert individ, de beholder donorens unike genetiske bakgrunn, og har en bemerkelsesverdig evne til å spre seg og overleve langsiktig i cellekulturforhold 4,5,6. Ved å rekapitulere viktige embryologiske trinn gjennomgår iPSCer "rettet differensiering" i organspesifikke celletyper. Vi og andre har utviklet protokoller for å generere iPSC-avledede lungeforfedre, alveolar type 2 celler 7,8 og cellene i den ledende luftveien, inkludert luftveisbasalceller 9,10,11,12.
Luftveisbasalcellen er stamcellen til den ledende luftveien13. I tidligere publisert arbeid har gruppen vår generert iPSC-avledede epitelceller i luftveier, inkludert et delsett (iBCer) som uttrykker kanoniske basale cellemarkører, inkludert TP63, KRT5 og NGFR. Etter signaler fra voksen basal cellebiologi fører hemming av doble SMAD-veier (TGF-β og BMP) til oppregulering av NGFR + iBCer11,14. NGFR+ iBO-er resuspenderes som enkeltceller i dråper med ekstracellulær matrise og dyrkes i et basalcellemedium. De fornyer seg selv for å opprettholde en iBC-befolkning og danne epitelske sfæroider; En andel skiller seg imidlertid også ut i sekretoriske celler i dette formatet (referert til som 3D-kultur). I følgende protokoll beskriver vi trinnene for å vedlikeholde og utvide disse iBO-ene i 3D-kultur, samt trinnene som kreves for å generere en funksjonell 2D-mucociliary ALI-kultur.
De første trinnene i denne differensieringsprotokollen er publisert tidligere og vil ikke bli gjennomgått her11,12. Dette manuskriptet vil dreie seg om utvidelse og rensing av iBO-er og deres påfølgende differensiering i funksjonelle sekretoriske og multicilierte celler i ALI-kulturen.
Protocol
Hvert av følgende trinn bør utføres ved hjelp av steril teknikk i en biosikkerhetsnivå 2 laminær strømningshette. Alle medier bør varmes opp til romtemperatur (22 °C) før de tilsettes celler, unntatt når det er spesifikt nevnt noe annet. Hvert sentrifugeringstrinn skal utføres ved romtemperatur (ca. 22 °C). Figur 1 viser skjemaene for protokollen.
1. Utarbeidelse av nødvendige medier
MERK: Se tilleggsfil 1 for mer informasjon.
- Basal celle middels
- Klargjør basemediet i henhold til produsentens instruksjoner.
- Til hver 50 ml av basismediet legger du til 5 μL A83-01 (10 mM), 5 μL DMH1 (10 mM), 50 μL Y-27632 (10mM) og 100 μL Primocin (50 mg/ml). Deretter kalles dette mediet basalcellemedium.
- Oppbevars ved 4 °C i opptil 1 måned.
- ALI differensieringsmedium
- Forbered mediet i henhold til produsentens instruksjoner.
- Tilsett 100 μL Primocin (50 mg/ml) til hver 50 ml ALI Differensieringsmedium.
- Oppbevar beskyttes mot lys ved 4 °C i opptil 1 måned.
- Sorter buffer
- For hver 50 ml sorte buffer, kombinere 47,5 ml hanks balansert saltløsning, 1 ml FBS, 200 μL EDTA (500 mM), 1,25 ml HEPES-buffer (1 M), 50 μL Y-27632 (10 mM) og 100 μL Primocin (50 mg/ml).
- Filtrer steriliser med en porestørrelse på 0,4 μm.
- Oppbevars ved 4 °C i opptil 1 måned.
- Kryopreserveringsmedium
- For hver 50 ml kryopreserveringsmedium kombinerer du 45 ml basalcellemedium og 5 ml dimetylsulfoksid (DMSO).
- Filtrer steriliser med en porestørrelse på 0,4 μm.
- Oppbevars ved 4 °C i opptil 1 måned.
2. Opptining av kryopreserverte iBO-er
- Tine (på is) et tilstrekkelig volum på 3D vekstfaktor redusert ekstracellulær matrise (heretter 3D-matrise). Hold på isen til den er klar til bruk.
MERK: Når du tiner ett hetteglass (som inneholder 250 000 celler), tiner du 100-200 μL 3D-matrise. - Tine et hetteglass med tidligere kryopreserverte encellede suspensjoner av iBO-er ved å inkubere i et 37 °C vann- eller perlebad bare til det ikke er synlige frosne medier (1-2 min).
- Bruk en 5 ml serologisk pipette, legg til cellefjæring til et 15 ml konisk rør.
- Tilsett 6-10 ml DMEM/F12 dråpevis til celleopphenget, bland forsiktig og sentrifuger ved 300 x g i 5 minutter for å pellet cellene.
- Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i 1 ml Basal Cell Medium med en P1000 mikropipette. Fjern en 10 μL aliquot og utfør et celleantall.
- Sentrifuger cellene på 300 x g i 5 min. Aspirer de supernatante og resuspend cellene med en tetthet på 4000 celler / μL i tidligere tint 3D-matrise med en P1000 mikropipette.
MERK: Det er viktig å unngå å legge til bobler i 3D-matrisen. Pipette matrisen sakte og forsiktig. - Med en P200 mikropipette, legg til en dråpe (25 eller 50 μL) til bunnen av hver brønn av en 12-brønns vevskulturbehandlet plate. Hvis du starter med 250 000 frosne celler, er forventet antall dråper i dette trinnet mellom 3-4 (25 μL dråper), avhengig av cellens levedyktighet.
- Inkuber platen ved 37 °C i ca. 15 minutter, og tilsett deretter nok Basal Cell Medium til hver brønn for å senke dråpen helt ned (1,5 ml i 50 μL; 1 ml for 25 μL), ved hjelp av en 5 ml serologisk pipette. Returner platen til en fuktet inkubator.
- Fôr celler annenhver dag ved hjelp av ferskt Basal Cell Medium. Tilsett friskt medium til siden av brønnen med 5 ml serologisk pipette, pass på at du ikke forstyrrer dråpen av celler.
MERK: Tettheten av celler som er belagt i dette stadiet er 10 ganger høyere enn rutinemessig passaging av iBO-er i avsnitt 3.
3. Dissosiasjon av sfæroider og utvidelse av iBO-er i 3D-kultur
- Tine (på is) et tilstrekkelig volum på 3D-matrise. Hold på isen til den er klar til bruk.
MERK: Volumet av 3D-matrise som kreves, vil variere avhengig av hvor mange celler brukeren vil kreve. - Omtrent 5-7 dager senere aspirerer du mediet fra hver brønn og med en P1000 mikropipette, tilsett 1 ml Dispase II (1 U/ ml) direkte på sfæroidene for å dissosiere fra matrisens dråpe.
- Plasser platen i 37 °C inkubator i 10-15 min.
- Bruk en P1000 mikropipette, pipette Dispase opp og ned 1-2 ganger, bryte opp store klumper av 3D matrise. Returner platen til 37 °C i ytterligere 30-40 minutter, slik at matrisen kan oppløses helt.
- Når dråpen av 3D-matrise ikke lenger er synlig under lysmikroskopet, legg de fritt flytende sfæroidene til en 15 ml konisk ved hjelp av en 5 ml serologisk pipettespiss. Tilsett DMEM/F12 for et endelig volum på 10 ml per konisk og sentrifuge ved 200 x g i 3 minutter for å pellets sfæroidene.
- Aspirer supernatanten og tilsett 1 ml 0,05 % trypsin (37 °C) for hver innledende dråpe som er dissosiert (f.eks. hvis du starter med fire dråper, tilsett 4 ml trypsin i den koniske kolben).
- Inkuber ved 37 °C, triturer ofte (hver 2-3 min).
- Evaluer med lysmikroskopet med noen få minutter. Når flertallet (>90%) av sfæroider har blitt dissosiert til enkeltceller, legg til 10% Fetal Bovine Serum (i DMEM / F12) med et volumforhold på 1:1 til trypsin.
- Filtrer cellene gjennom en 40 μm cellesil og sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter.
- Utfør et celleantall og resuspender cellene jevnt med en tetthet på 400 celler/μL tint 3D-matrise. Unngå å introdusere luftbobler. Resuspend så mange dråper som nødvendig for nedstrøms søknad. Gjenta trinn 2.6-2.9 for hver brønn.
4. Evaluering og rensing av NGFR+ iBO-er
- Etter 10-14 dager av den siste passasjen, dissosier sfæroidene til en enkelt celle suspensjon som i trinn 3,2-3,5 og utfør et celleantall.
MERK: Forskjellige iPSC-linjer oppfører seg annerledes; Derfor kan området 10-14 dager variere for forskjellige iBO-er. Se figur 2 for typiske utseender på 3D iBO-er etter 1, 4, 8 og 14 dager, når de er tilstrekkelige for NGFR+-cellesortering. Sortering tidligere enn anbefalt (f.eks. dag 8 som i figur 2C), resulterer i et generelt lavere celletall med mindre hyppig NGFR-uttrykk. Sortering senere enn anbefalt (f.eks. større enn 14 dager etter den siste passasjen) fører til dårlig celleoverlevelse etter sortering. - Resuspend cellene med en tetthet på 1 x 106 celler / 100 μL i sorteringsbuffer (hovedpopulasjon). Overfør en liten aliquot (25-50 μL) til et eget rør (mindre befolkning).
- Tilsett konjugert anti-NGFR antistoff (1:100 fortynning) til hovedcellepopulasjonen.
- Tilsett isotypekontrollantistoff (1:200 fortynning) til den mindre cellepopulasjonen.
- Beskytt cellene mot lys og hold på is i 30 min, periodisk (hver 5-10 min) triturere cellene for å forhindre pelletering.
- Etter 30 min legger du til sorteringsbufferen i forholdet 1:1 til hvert rør med celler. Sentrifuger celler ved 300 x g i 5 min.
- Aspirer de supernatante, resuspend de pelleterte cellene i sorteringsbufferen med en tetthet på 10 x 106 celler / ml, og legg til levende eller død celleflekk.
- Bruk passende NGFR+-gatingstrategi (basert på isotypekontroll, se figur 3), sorter nok levende NGFR+-celler for nødvendige nedstrømsapplikasjoner.
MERK: Hvis du bruker iBO-er med fluorescerende reportere (dvs. NKX2-1GFP TP63tdTomato), anbefales det å sortere etter "trippelpositive" celler (dvs. NKX2-1GFP+, TP63tdTomato+, NGFR+), med passende gatevalg og kompensasjon (figur 3). Under denne utvidelsen av iBO-er kan en andel celler som skiller seg ut i sekretoriske celler og svært liten andel av multicilierte celler også oppdages. Begge disse populasjonene er NGFR-.
5. Generasjon av mucociliary ALI kulturer
- Forbered 6,5 mm porøse membraninnlegg ved å legge til en 200 μL matrise til det apikale kammeret (human embryonal stamcellekvalifisert matrise eller rekombinant menneskelig laminin-521) i henhold til produsentens instruksjon.
- Plasser ved 37 °C i minst 2 timer før det er nødvendig.
- Aspirer beleggmatrisen fra innsatsens apikale kammer. Tilsett 500 μL av Basal Cell Medium til basolateralkammeret.
- Resuspend minst 30,000 sorterte NGFR + celler (fra trinn 4.5) i 100-200 μL Basal Cell Medium og overføre til det apikale kammeret ved hjelp av en P200 mikropipette. Gjenta for så mange brønner som ønsket (og celler tilgjengelig). Plasser platen i fuktet 37 °C inkubator.
- På 2-3 dager aspirerer aspirat apikale og basolaterale kamre og spiser med fersk Basal Cell Medium (500 μL til apical, 100 μL til basolateral).
- Overvåk det apikale kammeret daglig med lysmikroskopi. Når celler er >80% sammenfallende (vanligvis 3-7 dager), erstatt Basal Cell Medium med ALI Differensieringsmedium (ikke forhåndsvarmet) i både apikale og basolaterale kamre. Når du arbeider med ALI Differensieringsmedium, må du beskytte mot lys ved å holde mediebeholdere pakket inn i folie og ved å slå av overheadlys når du er i stand til det.
- Neste dag aspirerer du mediet fra det apikale kammeret, og utsetter dermed den apikale overflaten for luft.
- Bytt ut ALI Differensiering Medium media i basolateral kammeret hver 2-3 dager.
- Overvåk kulturutseendet hver 1-2 dager. Aspirer forsiktig eventuell akkumulert væske fra det apikale kammeret, uten å forstyrre cellelaget.
- Vurder den transepitheliale elektriske motstanden (TEER) for epitelintegritet.
MERK: TEER kan vurderes i dagene etter lufteksponering for å gi en avlesning av epitellagets integritet. Den ideelle tiden for å måle TEER er ikke fastslått, selv om verdier som samsvarer med høykvalitets slimhinnedifferensiering vanligvis er >500 x cm2. - Hvis det er nødvendig å fjerne rusk eller slim, tilsett forsiktig 100 μL PBS (uten Ca2 + eller Mg2 +) til det apikale kammeret. Inkuber ved 37 °C i 10 minutter, og aspirer deretter FORSIKTIG PBS.
- Etter 7-10 dager med lufteksponering vises motil cilia vanligvis og kan ses ved hjelp av lysmikroskopi. Avhengig av planlagt eksperiment og avlesning, kan celler analyseres etter 14-28 dager med lufteksponering.
MERK: Hvis fluorescerende reporterceller har blitt brukt, og hvis et levende cellefluorescerende mikroskop er tilgjengelig, kan celler spores med lysmikroskopi samt reporterfluorescens.
6. Valgfri (men anbefalt) kryopreservering av iBO-er
- Etter 10-14 dager med den siste 3D-kulturpassasjen, dissosier sfæroidene til encellet suspensjon som i trinn 3.2-3.5. Utføre et celleantall.
- Resuspend i Cryopreservation Medium med en tetthet på 250 000 celler / 500 μL i en kryofantial.
- Plasser kryopisial(er) i en beholder for å sikre en jevn temperaturfall (1 °C/min) og overfør til -80 °C i 24–48 timer, etterfulgt av overføring til -150 °C for langtidslagring.
MERK: Gjentatt kryopreservering samt kryopreservering av tidligere NGFR+ sorterte celler er utført, men disse er ikke tilstrekkelig vurdert for celle levedyktighet og evnen til å danne funksjonelle ALI-kulturer. Spesielt med utvidet cellepassasje anbefales det å vurdere for karyotypen, da dette har blitt notert å variere i iPSCer og iPSC-avledede celler.
Representative Results
Etter denne protokollen ble 200 000 kryoer serverte iBO-er (tidligere bekreftet å ha en normal 46XY karyotype)11 tint og utvidet i 3D-kultur. Fem dager senere ble de resulterende sfæroidene dissosiert, talt og passeret igjen for videre ekspansjon. Omtrent 480 000 celler ble hentet og suspendert på nytt i 3D-matrise (12 x 50 μL dråper, tetthet 400 celler / μL). Fersk Basal Cell Medium ble påført hver 2-3 dager. Ti dager senere ble cellene igjen dissosiert og talt. Totalt ble 19,7 x 106 celler høstet og forberedt på FACS. 106 celler ble farget med den APC-konjugerte IgG1κ isotype-kontrollen, og de resterende 18,7 x 106 cellene ble farget med APC-konjugert anti-NGFR-antistoff i 30 minutter beskyttet mot lys (figur 3).
NGFR+-gating ble utført etter sammenligning med isotypekontrollcellene og ble satt med hensikt for å samle de høyeste uttrykkende NGFR+-cellene (figur 3). Med denne gatingteknikken var 28% av levende, enkeltceller NGFR +. Mens flere celler var tilgjengelige, ble 750 000 celler samlet inn for nedstrømskultur. Sorterte celler ble resuspendert i Basal Cell Medium i en konsentrasjon på 50 000 celler/100 μL. 50 000 celler ble deretter sådd på hver 6,5 mm porøs membraninnsats, som hadde blitt belagt med human rekombinant laminin-521 (2 μg/200 μL) i henhold til produsentens retningslinjer. 500 μL basalcellemedium ble lagt til basolateralt kammer for hver innsats, og platen ble plassert i en 37 °C fuktet inkubator. Tre dager senere ble mediene i det apikale kammeret aspirert og cellene var ~ 90% sammenfallende ved lysmikroskopi (figur 4B). Mediene fra det basolaterale kammeret ble aspirert; ALI Differensieringsmedium ble lagt til de apikale (100 μL) og basolaterale (500 μL) kamrene. Dagen etter ble media fra det apikale kammeret aspirert.
I løpet av de følgende 21 dagene ble cellene evaluert ved lysmikroskopi periodisk og matet med fersk ALI Differensieringsmedium (kun basolateralt kammer) hver 2-3 dager. Individuelle celler var i utgangspunktet lett identifiserbare (figur 4A), hadde et langstrakt og spindelformet utseende, og dannet et løst pakket monolayer (figur 4B). I løpet av de påfølgende dagene til ukene dannet cellene et tettpakket, svært cellulært, epitellag, og etter 7-10 dager var det den klare fremveksten av å slå cilia og slimproduksjon. TEER av prøvene ble beregnet og ligner på primære cellekontroller (område fra 700-1600 Ω x cm2)11. Etterfølgende fiksering (dag 21-28) med paraformaldehyd og immunoblende for kanonisk luftveis epitelcellemarkører ble utført for blant annet MUC5AC og acetylert-α-tubulin (figur 4C). Totalt sett, med vår observasjon av motil cilia, slimproduksjon samt bekreftende immunostaining av multiciliated og sekretoriske celler som ligner på primære HBECer, konkluderte vi med at vi med hell genererte luftveis epitelceller fra induserte pluripotente stamceller.
Figur 1: Samlet protokollskjema. Cryopreserved iBO-er tines, utvides og FACS renses før plating på porøse membraninnlegg, hvor de skiller seg ut i et funksjonelt mucociliary epitel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative fasekontrastbilder. Representative fasekontrastbilder som viser vanlig utseende på iBO-er i 3D-kultur etter (A) 1 dag, (B) 4 dager, (C) 8 dager og (D) 14 dager (bare før NGFR-sortering). Skalastenger representerer 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative FACS-plott. Representative FACS-plott for ikke-reporter- og fluorescerende reporter-iBO-er. Eksempler på isotypekontroller vises og ble brukt til å velge de høyeste uttrykkende NGFR+-cellene. Fluorescerende reporterholdige iPSC-linjer er "trippel sortert" for NKX2-1GFP + TP63tdTomato + NGFR + celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative bilder av iBC-kulturer på porøse membraner. Fasekontrastbilder vises (A) 1 dag og (B) 3 dager etter plating. Representativ immunmerking av mucociliary kulturer vist i (C); acetylert alfa tubulin (grønn) og MUC5AC (rød). Skalastenger representerer 25 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Tabell for mediekomponent. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
HBECer er gullstandard celletypen for å studere sykdommer i luftveisepitelet. På grunn av deres begrensninger (inkludert tilgjengelighet og vanskeligheter med å genetisk manipulere), har vi generert en protokoll for avledning av iBO-er og ALI-kulturer. Disse cellene kan avledes fra enhver donor og beholde sin unike genetiske bakgrunn, og dermed tillate grunnleggende utviklingsstudier, sykdomsmodellering og ny terapeutisk utvikling.
Mens hvert enkelt trinn i den beskrevne protokollen er nødvendig, er det flere som fortjener ekstra omtale. For det første, på hvert trinn som krever dissosiasjon av sfæroider i enkeltceller, er det viktig å unngå overdreven pipettering; enzymatisk fordøyelse (med dispase eller trypsin) fremmer bedre celleoverlevelse, mens overdreven pipettering fører til betydelig celledød. For det andre, når du renser NGFR + iBCer, er utnyttelse av isotypekontrollen avgjørende, og vi anbefaler å velge for de høyeste uttrykkende NGFR + -cellene med FACS (figur 3). Denne tilnærmingen resulterer i optimale ALI-kulturer med passende mucociliary differensiering. Til slutt er tilberedning og såing av porøse membraner nøyaktig som dokumentert i protokollen grunnleggende for ALI-kulturoverlevelse. Mens vi vanligvis frø 30,000-60,000 celler per innsats, har vi hatt suksess med så få som 20,000 celler. Mens vellykkede kulturer kan genereres ved hjelp av det humane embryonale stamcellekvalifiserte matrisebelegget, har vi nylig brukt human rekombinant laminin-521 med en betydelig høyere holdbarhet av ALI-kulturene.
Svært sjelden kan iPSC-differensieringer mislykkes i å oppregulere en tilstrekkelig prosentandel av NGFR + iBCer. I dette tilfellet kan seriell passaging av iBO-er (i 3D-kultur) føre til økt NGFR-frekvens over tid. Begrensninger i denne protokollen inkluderer tiden, kostnadene og ekspertisen som trengs for å generere disse cellene. I tillegg erkjenner vi at mange forskere er interessert i de mindre vanlige celletypene av luftveisepitelet (f.eks. ionocytter, nevroendokrine celler). Selv om vi har oppdaget noen av disse sjeldnere celletypene, som i primære HBEC-kulturer, blir de ikke reprodusert identifisert, sannsynligvis på grunn av ufullstendig kunnskap om utviklingssignalene som kreves for å generere disse cellene.
Som det er skrevet, begynner ovennevnte protokoll med opptining av allerede kryopreserverte iBO-er. Detaljene før denne kryopreserveringen er tidligere beskrevet og utenfor omfanget av dette manuskriptet11,12.
Vår epitelkulturmetode for luftveier muliggjør generering av funksjonelle luftveisepitelceller fra nesten alle donorer. Dette øker i stor grad tilgjengeligheten til dyrebare genetisk kontrollerte luftveis epitelceller som kan brukes til sykdomsmodellering, legemiddelscreening, fremtidige cellebaserte terapier, samt for å forbedre forståelsen av utviklingsmønsteret i luftveisepitelet.
Disclosures
Forfatterne har ingen avsløringer.
Acknowledgments
Vi takker medlemmene av Laboratoriene Hawkins, Kotton og Davis for deres nyttige innspill gjennom årene angående dette og andre prosjekter. Vi står også i gjeld til Brian Tilton (BU Cell Sorting Director) for hans engasjement og tekniske ekspertise, og vi er takknemlige til Greg Miller og Marianne James fra Boston University Center for Regenerative Medicine (CReM) for deres støtte og tekniske ekspertise innen vedlikehold og karakterisering av pasientspesifikke iPSCer, støttet av NIH gir NO1 75N92020C00005 og U01TR005 og U01TR0018. Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskudd U01HL148692, U01HL134745, U01HL134766 og R01HL095993 til D.N.K, R01HL139876 til B.R.D, R01 HL139799 til F.H., og Cystic Fibrosis Foundation (CFF) gir CFF 00987G220 og CFF WANG20GO til D.N.K, CFF DAVIS15XX1, DAVIS17XX0, DAVIS19XX0 til B.R.D, CFF SUZUKI19XX0 til S.S, CFF BERICA2010 til A.B., og CFF HAWKIN20XX2 til F.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well tissue culture treated plate | Corning | 3515 | flat bottom |
| 3-D growth factor reduced Matrigel | Corning | 356230 | |
| A83-01 | ThermoFisher Scientific | 293910 | |
| Cell culture inserts (Transwell) | Corning | 3470 | 6.5mm diameter; 0.4μm pore size |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Dispase II, Powder | ThermoFisher Scientific | 17105-041 | |
| DMH1 | ThermoFisher Scientific | 412610 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture (DMEM):F-12 | ThermoFisher Scientific | 11330-032 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 14190-144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt solution (EDTA) | Sigma | E7889 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher | SH3007003E | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175-079 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| hESC-qualified Matrigel | Corning | 354277 | |
| Mouse IgG1kappa isotype control, APC-conjugated | Biolegend | 400122 | |
| Mouse monoclonal anti-human CD271/NGFR, APC-conjugated | Biolegend | 345108 | |
| PneumaCult-ALI Medium (ALI Differentiation Medium) | StemCell Technologies | 05001 | |
| PneumaCult-Ex Plus Medium (Basal Cell Base Medium) | StemCell Technologies | 05040 | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| rhLaminin-521 | ThermoFisher Scientific | A29248 | Final Concentration: 10ug/mL |
| Trypsin-EDTA Solution, 0.05% | Invitrogen | T3924 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
References
- GBD Chronic Respiratory Disease Collaborators. Prevalence and attributable health burden of chronic respiratory diseases, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet. Respiratory Medicine. 8 (6), 585-596 (2020).
- Alysandratos, K. -D., Herriges, M. J., Kotton, D. N. Epithelial stem and progenitor cells in lung repair and regeneration. Annual Review of Physiology. 83, 529-550 (2021).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).
- Jacob, A., et al. Derivation of self-renewing lung alveolar epithelial type II cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 14 (12), 3303-3332 (2019).
- Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).
- Huang, S. X. L., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2013).
- Mou, H., et al. Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell Stem Cell. 10 (4), 385-397 (2012).
- Hawkins, F. J., et al. Derivation of airway basal stem cells from human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 28 (1), 79-95 (2021).
- Suzuki, S., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional airway basal stem cells. STAR Protocols. 2 (3), 100683 (2021).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
