Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

كهربية الحمض النووي البلازميد في العضلات الهيكلية للفأر

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63916
Automatic Translation
1, 1
1Department of Cellular and Molecular Physiology, Penn State College of Medicine

Summary

يعد تحويل الحمض النووي البلازميدي بالكهرباء إلى العضلات الهيكلية طريقة قابلة للتطبيق لتعديل التعبير الجيني دون المساس بانقباض العضلات لدى الفئران.

Abstract

يعد تعديل التعبير الجيني العابر في العضلات الهيكلية الفئرانية بواسطة بالكهرباء البلازميدية أداة مفيدة لتقييم الفسيولوجيا الطبيعية والمرضية. إن الإفراط في التعبير عن الجينات المستهدفة أو إسقاطها يمكن الباحثين من التعامل مع الأحداث الجزيئية الفردية ، وبالتالي فهم أفضل للآليات التي تؤثر على كتلة العضلات ، واستقلاب العضلات ، والانقباض. بالإضافة إلى ذلك ، فإن إلكتروبورات بلازميدات الحمض النووي التي تشفر علامات الفلورسنت تسمح للباحثين بقياس التغيرات في التوطين تحت الخلوي للبروتينات في العضلات الهيكلية في الجسم الحي. يتضمن التقييم الوظيفي الرئيسي للعضلات الهيكلية قياس انقباض العضلات. في هذا البروتوكول ، نثبت أن دراسات انقباض العضلات الكاملة لا تزال ممكنة بعد حقن الحمض النووي البلازميد ، والكهربية ، وتعديل التعبير الجيني. الهدف من هذا الإجراء التعليمي هو إظهار الطريقة خطوة بخطوة للبلازميد الكهربائي للحمض النووي في العضلات الهيكلية للفأر لتسهيل الامتصاص والتعبير في الألياف العضلية للعضلات الطويلة الأمامية والباسطة الرقمية ، وكذلك لإثبات أن انقباض العضلات الهيكلية لا يتعرض للخطر عن طريق الحقن والكهرب.

Introduction

يعد كهربية الحمض النووي البلازميدي في العضلات الهيكلية في الجسم الحي أداة مهمة لتقييم التغيرات في فسيولوجيا العضلات الهيكلية والإشارات الجزيئية عن طريق تعديل التعبير الجيني في مجموعة متنوعة من الحالات الفسيولوجية والفسيولوجية المرضية1،2،3،4،5،6،7،8،9 . تم إثبات نقل الجينات التجريبية إلى العضلات الهيكلية في وقت مبكر من عام 1990 من قبل وولف وآخرون ، حيث تم نقل كل من الحمض النووي الريبي والحمض النووي بنجاح دون كهربية ، وتم الحفاظ على تعبير luciferase لمدة شهرين على الأقل10. إن كفاءة النقل المنخفضة نسبيا مع الحقن فقط تمثل مشكلة ، وقد أظهر أيهارا وميازاكي زيادة في نقل الجينات باستخدام الكهربية في عام 1998 عن طريق كهربية بناء pCAGGS-IL-5 في عضلة الظنبوب الأمامية (TA) وقياس تعبير المصل IL-511. منذ ذلك الوقت ، حققت العديد من الدراسات في فعالية تركيزات الحمض النووي المختلفة ، والأحجام ، ومعلمات الكهربية لضمان أقصى قدر من كفاءة نقل الجينات. اختبر مير وآخرون معلمات كهربائية مختلفة ، بما في ذلك الجهد ، وعدد النبض ، ومدة النبض ، والتردد ، بالإضافة إلى تركيز الحمض النووي ، وقرروا أن زيادة الجهد ، وعدد النبضات ، وتركيز الحمض النووي كلها ساهمت في زيادة كفاءة الكهربية12. أحد التحذيرات الرئيسية من الجهد الكهربائي العالي هو أنه في حين أنه يسهل زيادة امتصاص الحمض النووي في الألياف العضلية ، فإنه يسبب أيضا تلفا في العضلات ، مما قد يؤدي إلى إرباك النتائج. أظهر Schertzer et al. أن الكهربية عند 200 فولت تسببت في تلف حوالي 50٪ من الألياف العضلية بعد 3 أيام من المسام الكهربائية ، في حين أن 10٪ فقط من الألياف العضلية تضررت عند 50 فولت13. لقد أخذنا في الاعتبار المتغيرات التي تؤثر على نقل الحمض النووي بكفاءة مقابل تلف العضلات ووجدنا أن الجهد البالغ 125 فولت في المائة من عرض الفرجار يكفي لتحقيق نقل فعال للجينات.

يعد تحليل منطقة المقطع العرضي لألياف العضلات وانقباض العضلات بالكامل بعد الكهربية من الجوانب المهمة لطريقة قياس التغيرات في حجم العضلات ووظيفتها بسبب تعديل الجينات. لقد أثبتنا نحن وآخرون سابقا أن كهربية ناقلات المكافحة وحدها لا تسبب انخفاضا في منطقة الألياف العضلية. كان بناء بروتين الفلورسنت الأخضر (EGFP) مؤشرا فلوريا مفيدا لنقل الحمض النووي في هذه الدراسات13,14. قام عدد من الدراسات بالتحقيق في انقباض TA في الموقع بعد الكهربية ووجدوا نتائج متفاوتة. أظهرت إحدى الدراسات أن الكهربية 75 فولت / سم تسببت في انخفاض بنسبة 30٪ في قوة الكزاز بعد 3 أيام من الكهربية ، وبحلول 7 أيام بعد الكهربية ، عادت قوة الكزاز إلى مستوى التحكم ، في حين أن 50 فولت / سم من الكهربية لم تؤثر على القوة13,15. أظهرت دراسة أخرى أن هناك فقدانا بنسبة 30٪ لقوة الكزاز 3 ساعات بعد 180 فولت / سم من الكهرباء ، والتي تعافت إلى مستويات القوة الزائفة بعد 7 أيام16.

في الإجراء التفصيلي التالي ، نوضح الحقن والكهربية لبلازميد pcDNA3-EGFP في عضلات TA والعضلات الباسطة الرقمية الطويلة (EDL) للفئران. كما نثبت أن هذه الطريقة لا تؤثر على انقباض العضلات بالكامل لدى EDL. والهدف من ذلك هو إظهار كفاءة امتصاص البلازميد في الألياف العضلية دون التسبب في فقدان الوظيفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أجريت جميع التجارب باستخدام الحيوانات في كلية ولاية بنسلفانيا للطب، ووافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات في جامعة ولاية بنسلفانيا، وأجريت وفقا للمعايير الأخلاقية المنصوص عليها في إعلان هلسنكي لعام 1964 وتعديلاته اللاحقة. تم استخدام إناث C57BL / 6 الفئران البالغة من العمر 12 أسبوعا لهذا الإجراء. تم تعقيم جميع الأدوات الجراحية للعقم قبل التجريب.

1. TA و EDL حقن / إعداد الكهرباء

ملاحظة: هذه الخطوات متطابقة لإعداد الحقن / الكهربية TA و EDL.

  1. تنقية هياكل بلازميد التعبير إلى تركيز 1 ميكروغرام / ميكرولتر مخفف في PBS معقمة قبل التجربة. بالنسبة لهذا الإجراء ، تم استخدام مجموعة تنقية خالية من السموم الداخلية متاحة تجاريا لتنقية ناقل pcDNA3-EGFP (GFP) أو pcDNA3 الفارغ (السيطرة).
  2. حساب تركيز البلازميد لضمان حجم الحقن الكافي (TA 50 ميكروغرام من الحمض النووي في 50 ميكرولتر من PBS المعقمة; EDL 10 ميكروغرام من الحمض النووي في 10 ميكرولتر من PBS المعقمة) وعينات aliquot.
  3. قم ببرمجة إعدادات electroporator باستخدام عجلة التحديد وخفض العجلة لاختيار المعلمات على النحو التالي: الوضع - LV ، الجهد - 12.5 فولت / مم (ليتم تعديله في وقت الحقن) ، طول النبض - 20 مللي ثانية ، عدد النبضات - 5 ، الفاصل الزمني - 200 مللي ثانية ، القطبية - أحادية القطب.
  4. تخدير الفئران باستخدام غاز الايزوفلوران. ضع الفئران في صندوق تحريض يحتوي على 5٪ من الأيزوفلوران. تأكد من المستوى الجراحي للتخدير عن طريق عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم باستخدام الملقط وتقليل الأيزوفلوران إلى جرعة صيانة 2٪. انقل الفئران إلى مخروط الأنف المناسب الذي يستريح على صفيحة ماء متداولة عند 37 درجة مئوية لبقية الإجراء.
  5. إزالة الشعر من كلا الطرفين الخلفيين باستخدام ماكينات قص الشعر الصغيرة. فرك الأطراف السفلية بالتناوب 70٪ الإيثانول / البيتادين لتعقيم منطقة الحقن.

2. TA حقن / الكهربائي

  1. مع وجود الماوس في وضع ضعيف ، حدد موقع وتر TA المرئي من خلال الجلد على الجانب الجانبي من أسفل الساق. باستخدام حقنة صغيرة سعة 50 ميكرولتر مع إبرة 30 جم قابلة للفصل ، أدخل الإبرة 1-2 مم متفوقة على الوصلة العضلية بزاوية 5 درجات ضحلة حتى تصل الإبرة إلى الطرف العلوي للعضلات.
    ملاحظة: الحقن في منتصف العضلات هو الهدف.
  2. قم بخفض المكبس ببطء أثناء سحب الإبرة ببطء على طول مسار الحقن لتوفير 50 ميكرولتر من محلول البلازميد. يجب أن تنتفخ العضلات.
  3. اضبط المؤقت لمدة 1 دقيقة وقم بقياس سمك الساق في TA. اعتمادا على حجم الماوس ، يمكن أن يكون هذا من 5-10 ملم. اضبط أقطاب الفرجار على السماكة المقاسة واضبط جهد الكهربية على 12.5 فولت / مم.
  4. بعد 1 دقيقة ، ضع أقطاب الفرجار حول الطرف السفلي. يجب أن تكون الأقطاب الكهربائية مريحة ولكن ليست ضيقة للغاية. قم بتوصيل 5 نبضات بالموجات المربعة ، مع مدة 20 مللي ثانية وفترات 200 مللي ثانية (يجب أن ترتعش العضلات مع كل نبضة).
  5. كرر ذلك مع الطرف البديل باستخدام ناقل التحكم.
  6. قم بإزالة الماوس من التخدير واتركه يتعافى على وسادة تسخين مضبوطة على 37 درجة مئوية. بمجرد استردادها ، أعد الماوس إلى قفصه.

3. حقن EDL / الكهربائي

  1. مع وجود الماوس في وضع ضعيف ، حدد موقع القمة الأمامية لعظم الساق بصريا ومن خلال الجس اللطيف.
    1. باستخدام مشرط ، قم بعمل شق ضحل عبر الجلد على الجانب الجانبي من قمة الساق الأمامية 5 مم أقل من الركبة إلى 2 مم متفوقة على الوصلة العضلية TA.
    2. باستخدام مقص صغير ، تشريح حاد للفافة ، وكشف عضلة TA.
    3. مرة أخرى ، باستخدام تشريح حاد مع مقص ، افصل عضلة TA عن الساق بلطف عن طريق سحب العضلات أفقيا ، مما يعرض EDL. يمكن استخدام ملقط صغير منحني للحفاظ على TA واضحا من EDL أثناء العملية.
  2. باستخدام حقنة صغيرة سعة 50 ميكرولتر مع إبرة 30 جم قابلة للفصل ، أدخل الإبرة في EDL طوليا حتى تصل الإبرة إلى الطرف العلوي من العضلات.
  3. قم بخفض المكبس ببطء مع سحب الإبرة ببطء على طول مسار الحقن لحقن 10 ميكرولتر من محلول البلازميد (يجب أن تنتفخ العضلات).
  4. اضبط جهاز توقيت لمدة 1 دقيقة وقم بقياس سمك الساق في EDL. اعتمادا على حجم الماوس ، يمكن أن يكون هذا من 5-10 ملم. اضبط أقطاب الفرجار على السماكة المقاسة واضبط جهد الكهربية على 12.5 فولت / مم.
  5. بعد 1 دقيقة ، ضع أقطاب الفرجار حول الطرف السفلي. يجب أن تكون الأقطاب الكهربائية مريحة ولكن ليست ضيقة للغاية. قم بتقديم 5 نبضات بالموجات المربعة ، مع مدة 20 مللي ثانية وفترات 200 مللي ثانية (يجب أن ترتعش العضلات مع كل نبضة).
  6. أغلق الشق باستخدام خيوط نايلون غير قابلة للامتصاص يمكن التخلص منها 4/0.
  7. كرر ذلك مع الطرف البديل أو اترك الطرف دون أن يمسه أحد كتحكم مطلق.
  8. قم بإزالة الماوس من التخدير واتركه يتعافى على وسادة تسخين مضبوطة على 37 درجة مئوية. إعطاء مسكن مناسب تحت الجلد مباشرة بعد الجراحة و 12-24 ساعة بعد الجراحة. بمجرد استردادها ، أعد الماوس إلى قفصه.
    ملاحظة: أظهرت الدراسات السابقة عجزا في انقباض العضلات في TA مباشرة بعد الكهربية وأن التعافي من الانقباض يحدث على مدار 3 أيام13,15. لهذا السبب ، يتم إجراء تحليل كل من عضلات TA و EDL لعلم الأنسجة أو التعبير عن البروتين أو انقباض العضلات بعد 3-10 أيام من الكهربية. وقد لوحظ التعبير المطول عن EGFP لمدة تصل إلى 3 أسابيع بعد الإجراء13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الكهربية لتسهيل نقل الجينات في العضلات الهيكلية هي تقنية مفيدة تستخدم لتقييم التغيرات في فسيولوجيا العضلات. لقد أظهرنا إجراء مفصلا خطوة بخطوة لتحقيق نقل الجينات بكفاءة في كل من عضلات TA و EDL. تحدث الاختلافات في كفاءة النقل بسبب عدد من المتغيرات. من بين هذه المتغيرات معلمات الكهربية (النبضات ، الجهد ، مدة النبض ، إلخ) ، حجم بناء الجينات ، وتركيز / حجم الحمض النووي المحقون. لقد أظهرنا سابقا أن معلمات الكهربية ل 5 نبضات عند 125 فولت / سم ، مع مدة 20 مللي ثانية مفصولة بفترات 200 مللي ثانية ، كافية لتحقيق نقل الجينات الفعال في TA14. كما أثبتنا في الدراسة الحالية أن الحقن / الكهربية للحمض النووي لا يسبب فقدان انقباض العضلات في EDL بعد 3 أيام من التجربة.

من أجل تصور نقل الجينات ، تم تحويل بناء pcDNA3-EGFP أو pcDNA3 (التحكم) بالكهرباء إلى عضلات TA أو EDL للفأر. بعد 3 أيام من الإجراء ، تم تشريح TA أو EDL بعناية ، ووضعها في وسائط درجة حرارة القطع المثلى (OTC) ، وتجميدها في الأيزوبنتان السائل المبرد بالنيتروجين (2-methylbutane) ، كما هو موضح سابقا14،17،18،19. تم الحصول على 10 ميكرومتر من أقسام العضلات باستخدام كريوستات مأخوذة من منتصف بطن كل عضلة. ثم تم احتضان الأقسام في 1٪ paraformaldehyde لمدة 5 دقائق ، تليها غسلات 3-5 دقيقة في PBS. ثم تم احتضان أقسام في أغلوتينين جنين القمح مقترنة بتكساس الأحمر المخفف 1:100 في PBS لمدة 90 دقيقة في الظلام. تم غسل الأقسام مرة أخرى في PBS 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منها. ثم تم تغطية أقسام العضلات في وسائط تركيب مائية وتصويرها في الطول الموجي 594 نانومتر (الأحمر) لتصور ألياف العضلات الفردية وفي الطول الموجي 480 نانومتر للكشف عن GFP (الشكل 1A). تم تصوير عضلات التحكم التي تم حقنها باستخدام pcDNA3 في كلتا القناتين بنفس إعدادات التعرض للتحكم في التألق الذاتي المحتمل. أظهرت العضلات التي تم حقنها / بالكهرباء باستخدام EGFP ألياف خضراء إيجابية ، مما يدل على امتصاص بنية pcDNA3-EGFP ، في حين أن العضلات التي تم حقنها / كهربها باستخدام pcDNA3 (التحكم) لم تظهر أي ألياف إيجابية خضراء. لقد أظهرنا نحن وآخرون سابقا أن منطقة المقطع العرضي للألياف العضلية لا تتعرض للخطر بسبب تعبير GFP من خلال مقارنة الألياف الإيجابية GFP (الخضراء) بالألياف المعبرة عن GFP غير (السوداء) داخل نفس أقسام العضلات 4,6,19. عند تصويرها بتكبير أقل ، يتم تصور كفاءة نقل العضلات EDL من خلال ظهور الألياف الخضراء (الموجبة) مقابل الألياف السوداء (السلبية) (الشكل 1B). كانت كفاءة النقل باستخدام هذا الإجراء 56.6٪ ± 4.7٪ ، كما تم قياسها في 3 عضلات EDL. تظهر هذه البيانات أن الحقن والكهرباء لعضلة TA كافية لنقل الجينات بكفاءة. بالإضافة إلى ذلك، فإن الحقن والكهربية في EDL يثيران الامتصاص الفعال للتركيبات الجينية.

أداة مهمة لتقييم فسيولوجيا العضلات الهيكلية هي قياس انقباض العضلات. وقد أظهر باحثون سابقون أن انقباض TA الذي تم قياسه في الموقع قد يتعرض للخطر في وقت مبكر بعد الحقن والكهربية للطرف الخلفي13. من أجل اختبار ما إذا كان انقباض EDL قد تعرض للخطر بعد الحقن والكهربية ، قمنا بتعريض EDL جراحيا ، وحقنناه ب pcDNA3-EGFP أو البناء ، وقمنا بتحويل الطرف الخلفي بالكهرباء. كعنصر تحكم ، تم ترك الطرف البديل دون مساس للمقارنة. تم قتل الفئران الرحيم بعد 3 أيام ، وتم قياس انقباض العضلات بالكامل EDL باستخدام التحفيز الميداني في حمام فسيولوجي ، كما هو موضح سابقا14،19،20،21. باختصار ، تم تشريح EDL ، وتم ربط الأوتار عبر خياطة حريرية 4/0 إلى خطافات الفولاذ المقاوم للصدأ وتعليقها بين محول طاقة وقاعدة ثابتة. تم غسل العضلات في مخزن Tyrode المؤقت ، وهو محلول حمام فسيولوجي (121 mM NaCl ، 5.0 mM KCl ، 1.8 mM CaCl 2 ، 0.5 mM MgCl 2 ، 0.4 mM NaH2 PO4 ، 24 mM NaHCO3 ، 0.1 mM EDTA ، 5.5 mM glucose) وفقاعات مع الأكسجين 100٪ طوال الإجراء. تم تحفيز تقلص العضلات باستخدام أقطاب البلاتين لتقديم حافز فوق الأقصى. تم تعديل الطول الأمثل للعضلات (Lo) لإنتاج أقصى قوة في بداية الإجراء. تم تحديد العلاقة بين القوة والتردد باستخدام ترددات التحفيز بين 1-150 هرتز (نبضات 0.5 مللي ثانية عند الجهد فوق الأقصى). سمح للعضلة بالاسترخاء لمدة 3 دقائق بين كل تحفيز. بعد الانتهاء من إجراء التحفيز ، تم قياس وزن وطول العضلات. تم حساب القوة المحددة عن طريق تطبيع القوة المطلقة إلى منطقة المقطع العرضي للعضلات بأكملها ، والتي يتم حسابها على أنها الوزن مقسوما على الطول وباستخدام ثابت كثافة العضلات المحدد مسبقا (1.056 kg / m−3)21. لقد أظهرنا أن EDLs التمثيلية المحقونة والكهربائية لها استجابات تيتانية مماثلة عند 100 هرتز مقارنة بالتحكم في العضلات غير المحقونة أو الكهربية (الشكل 2A والشكل 2B). وجدنا أن قوة الكزاز العضلية ، وقوة الكزاز المحددة ، والوقت اللازم لذروة التوتر ، ونصف وقت الاسترخاء لم يتم اختراقها في EDL المحقون والكهربائي مقارنة بالتحكم الذي لم يمسه أحد (الجدول 1). تظهر بياناتنا أن تعبير البروتين الذي يؤثر على الانقباض يمكن تعديله باستخدام الكهربية في EDL دون التسبب في آثار ضارة.

Figure 1
الشكل 1: كهربية pcDNA3-EGFP كافية لامتصاص الحمض النووي في عضلة TA و EDL. أ) المقاطع العرضية التمثيلية من ضوابط TA و EDL (حقنها بناقل التحكم و 125 فولت / سم كهربائي) و GFP (حقن مع pcDNA3-EGFP و 125 فولت / سم كهربائي). شريط مقياس 50 ميكرومتر B) مقطع عرضي تمثيلي من EDL يوضح كفاءة النقل. شريط المقياس 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الحقن والكهربية لا يضر بوظيفة العضلات. منحنيات القوة الكزازية التمثيلية عند 100 هرتز من A) EDL غير المحقون / الكهربائي (التحكم) و B) EDL المحقون / الكهربائي (GFP). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

التحكم (ن = 3) GFP (ن = 3) قيمة p
FO (ز) 34.13 ± 1.15 35.87 ± 1.55 0.1918
sFO (كيلو نيوتن / م2) 691.56 ± 45.80 660.00 ± 33.61 0.3917
TTP (ثانية) 0.249 ± 0.0203 0.247 ± 0.0197 0.9084
RT1/2 (ثانية) 0.035 ± 0.0035 0.033 ± .0031 0.6458
التحكم - غير المحقون / غير الكهربيين ؛ GFP حقن مع pcDNA3-EGFP وكهربائية. القيم هي متوسط ± SD. p = 0.05 تعتبر مهمة. F0- قوة الكزاز الخام عند 100 هرتز ، sF0-قوة الكزاز المحددة عند 100 هرتز ، TTP - الوقت إلى الذروة عند 1 هرتز ، RT1/2 - الوقت إلى نصف الاسترخاء عند 1 هرتز.

الجدول 1: انقباض العضلات بالكامل من التحكم مقابل EDLs الكهربائي. جدول يوضح أن معلمات القوة العضلية المختلفة لا تتعرض للخطر في EDLs المحقونة / الكهربائية (GFP) مقارنة بعناصر التحكم غير المحقونة / غير الكهربية. F0 = قوة الكزاز عند 100 هرتز ، sF0 = قوة الكزاز المحددة عند 100 هرتز ، TTP = وقت ذروة التوتر عند 1 هرتز ، RT1/2 = نصف وقت الاسترخاء. اختبار t للطالب ؛ الدلالة عند p = 0.05. ن = 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في الجسم الحي ، يعد نقل الجينات في العضلات الهيكلية المعززة بالكهرباء أداة مفيدة وبسيطة نسبيا لتعديل تعبير البروتين في العضلات. لقد أظهرنا الخطوات المطلوبة لتحقيق نقل فعال للجينات في عضلات EDL و TA وأثبتنا أن قياس الانقباض في EDL قابل للتطبيق بعد الإجراء. لا تتطلب هذه التقنية ناقلات فيروسية أكثر تعقيدا وتسمح بمقارنة منطقة المقطع العرضي لألياف العضلات المنقولة وغير المنقولة في عضلة واحدة. أحد القيود المفروضة على هذا الإجراء هو أن كفاءة امتصاص البناء لم تكن كاملة وظلت بعض الألياف العضلية غير منقولة.

لا تقتصر الإجراءات التي تمت مناقشتها على كهربية ناقلات التعبير. لقد أظهرنا سابقا أنه يمكن تحقيق ضربة قاضية للبروتين باتباع نفس الإجراءات ، ولكن باستخدام إما siRNA أو shRNA في الجسم الحي14. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام تركيبات المراسل لقياس النشاط النسخي للجينات المستهدفة2،4،22. تسمح هذه الأدوات بمعالجة بروتينات متعددة في وقت واحد في عضلة هيكلية واحدة ، مع إعطاء الباحث أيضا خيار قياس التغييرات النسخية بسهولة. يمكن أيضا نقل العضلات الهيكلية بشكل مشترك مع تعبير أو متجه sh/siRNA ومراسل فلورسنت. وقد أظهرت الدراسات أن ما يزيد عن 95٪ من ألياف العضلات التي تأخذ متجها واحدا سوف تأخذ أيضا متجها آخر23. هذا مفيد عندما تكون الإنشاءات الموسومة غير قابلة للحياة. يمكن إجراء تجارب مماثلة في عضلات مختلفة ، بما في ذلك النعل ، gastrocnemius ، رباعي الرؤوس ، و flexor digitorum brevis ، من بين أمور أخرى24. لا يقتصر الإجراء على الفئران. تم استخدام الفئران على نطاق واسع لنقل الجينات العضلية ، ولكن ينبغي النظر في التغيرات في حجم الحقن ، وتركيز الحمض النووي ، ومعلمات الكهربية. الأهم من ذلك ، تنخفض كفاءة نقل الجينات عند تطبيق الكهربية على مناطق واسعة ، وقد تتطلب العضلات الأكبر حجما حقن متعددة24.

يمكن استخدام ما بعد نقل الجينات لدراسة مجموعة متنوعة من الحالات الفسيولوجية والفسيولوجية المرضية. المحددات الرئيسية لفعالية هذا الإجراء التي يجب مراعاتها هي كفاءة نقل الدم للبناء المطلوب ومدة الدراسة. في حين لوحظ زيادة التعبير عن البروتين لمدة تصل إلى 270 يوما بعد12 الكهربائي ، فقد أظهرت الدراسات أن هناك انخفاضا في التعبير بمرور الوقت13,25. إن بساطة وفعالية هذا الإجراء تجعله قابلا للتطبيق بشكل كبير على دراسة فسيولوجيا العضلات الهيكلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

B.A.H. و D.L.W لا تدعيان أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

اي

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-0 Nylon suture (non-absorbable) Ethicon 662G Suture to close skin incision
50µl Hamilton syringe Hamilton 80501 microsyringe
C57BLl/6NHsd mice Envigo 044 12 week-old female mice used for experimentation
Caliper Electrode BTX 45-0102 1.0cm x 1.0cm stainless steel
Dynamic Muscle Control Data Acquisition/analysis Aurora Scientific 605A Software used for muscle contractility measurement and analysis
ECM 830 Electroporation System BTX 45-0662 electroporator
EndoFree Plasmid Maxi Kit Qiagen 12362 Plasmid purification kit
Extra Narrow Scissors Fine Science Tools 14088-10 Scissors for blunt dissection
Force Transducer Aurora Scientific 407A To measure force from EDL
Micro-Masquito Hemastats Fine Science Tools 13010-12 Hemastats for surturing
pcDNA3.1 mammalian expression vector Fisher Scientific V79020 Control Vector
pcDNA3-EGFP expression plasmid Addgene 13031 Plasmid for GFP expression
Semken curved forceps Fine Science Tools 11009-13 Forceps for surgery
Surgical blades stainless steel no. 10 Becton Dickinson 37 1210 Scalpel blades
Tissue-Tek O.C.T. media VWR 25608-930 Freezing media for histology
Wheat Germ Agglutinin- Texas Red Thermo-Fisher Scientific W21405 Membrane staining for muscle cross section

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dodd, S., Hain, B., Judge, A. Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats. Biogerontology. 10, 605-611 (2009).
  2. Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse. Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).
  3. Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. Hsp27 inhibits IKKβ-induced NF-κB activity and skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).
  4. Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication. American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).
  5. Houston, F. E., et al. Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).
  6. Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy. The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).
  7. Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy. The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).
  8. Blaveri, K., et al. Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers. Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).
  9. Fewell, J. G., et al. Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation. Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).
  10. Wolff, J. A., et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).
  11. Aihara, H., Miyazaki, J. Gene transfer into muscle by electroporation in vivo. Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).
  12. Mir, L. M., et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).
  13. Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function. Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).
  14. Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).
  15. Schertzer, J. D., Lynch, G. S. Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation. Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).
  16. Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).
  17. Hain, B. A., et al. Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).
  18. Hain, B. A., et al. REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice. Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).
  19. Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).
  20. Waning, D. L., et al. Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice. Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).
  21. Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Reports. 4, 732 (2015).
  22. Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70. American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).
  23. Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo. Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).
  24. Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle. Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).
  25. Molnar, M. J., et al. Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles. Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).

Tags

علم الأحياء ، العدد 182 ،
كهربية الحمض النووي البلازميد في العضلات الهيكلية للفأر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hain, B. A., Waning, D. L.… More

Hain, B. A., Waning, D. L. Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (182), e63916, doi:10.3791/63916 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter